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Chemistry

Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

Published: June 20, 2020 doi: 10.3791/60945
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Summary

L'obiettivo generale del protocollo è quello di preparare oltre un milione di goccioline di femminiter ordinate, uniformi, stabili e biocompatibili su un substrato di 1 cm2 planari che può essere utilizzato per la sintesi proteica priva di cellule.

Abstract

I progressi nella risoluzione spaziale e nella sensibilità di rilevamento della strumentazione scientifica consentono di applicare piccoli reattori per la ricerca biologica e chimica. Per soddisfare la domanda di microreattori ad alte prestazioni, abbiamo sviluppato un dispositivo FemDA (Femtoliter droplet array) ed esemplificato la sua applicazione in reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) massicciamente parallele. Più di un milione di goccioline uniformi sono state prontamente generate all'interno di un'area delle dimensioni di un dito utilizzando un protocollo di sigillamento dell'olio in due fasi. Ogni goccia era ancorata in una microcamera femtolare composta da un fondo idrofilo e da una parete laterale idrofobica. La struttura ibrida idrofilo-in-idrofobico e gli oli e i surfactants di tenuta dedicati sono fondamentali per mantenere stabilmente la soluzione femtoliter aqueous nello spazio femtoliter senza perdita di evaporazione. La configurazione femtoliter e la semplice struttura del dispositivo FemDA hanno permesso un consumo minimo di reagenti. La dimensione uniforme dei reattori a goccia ha reso convincenti e affidabili le misurazioni quantitative e temporali su larga scala. La tecnologia FemDA ha correlato la resa proteica della reazione CFPS con il numero di molecole di DNA in ogni goccia. Abbiamo semplificato le procedure relative alla microfabbricazione del dispositivo, alla formazione delle goccioline del femtoltro e all'acquisizione e all'analisi dei dati microscopici dell'immagine. Il protocollo dettagliato con il basso costo di funzionamento ottimizzato rende la tecnologia FemDA accessibile a tutti coloro che hanno impianti standard di pulizia e un microscopio a fluorescenza convenzionale al proprio posto.

Introduction

I ricercatori utilizzano i reattori per eseguire reazioni biochimiche. Ci sono sforzi significativi che sono stati fatti per ridurre le dimensioni del reattore e aumentare la produttività sperimentale al fine di ridurre il consumo di reagente migliorando al contempo l'efficienza del lavoro. Entrambi gli aspetti mirano a liberare i ricercatori da un carico di lavoro pesante, riducendo i costi e accelerando la ricerca e lo sviluppo. Abbiamo una chiara tabella di marcia storica sullo sviluppo delle tecnologie dei reattori dal punto di vista dei volumi di reazione e della produttività: singoli becher/flask/test-tube, tubi milliliter, tubi microliter, nanotubi microliter 8 tubi, microliter 96/384/1536-bene piastra, e reattori microfluidici nanoliter/picoliter/picoliter/11,2,3,4,5,6,7. Analogo al ridimensionamento delle dimensioni delle caratteristiche dei transistor sui chip di circuito integrati nell'industria dei semiconduttori negli ultimi decenni, i microreattori bio/chimici stanno attraversando la riduzione del volume e l'integrazione del sistema. Tali strumenti su piccola scala hanno avuto un profondo impatto sulla biologia sintetica basata su cellule o senza cellule, sulla bioproduzione e sulla prototipazione e lo screening ad alta produttività8,9,10,1111,12. Questo documento descrive il nostro recente sforzo sullo sviluppo di una tecnologia unica di array di gocciolini e dimostra la sua applicazione in CFPS13, una tecnologia fondamentale per la biologia sintetica e le comunità di screening molecolare14. In particolare, forniamo intenzionalmente un protocollo ottimizzato e a basso costo per rendere il dispositivo FemDA accessibile a tutti. Il protocollo a basso costo e facile da gestire per il dispositivo miniaturizzato contribuirebbe agli scopi educativi delle università e contribuirebbe a diffondere la tecnologia.

FemDA prepara le goccioline di femtoter ad una densità ultraelevata di 106 per 1 cm2 su un substrato di vetro planare. Abbiamo rivestito un polimero idrofobico, CYTOP15, sul substrato di vetro e inciso selettivamente (rimosso) CYTOP in posizioni predefinite per generare un array a microcamera sul substrato. Così, la microcamera risultante è composta da una parete laterale idrofobica (CYTOP) e un fondo idrofilo (vetro). Quando scorre in sequenza acqua e olio sulla superficie modellata, l'acqua può essere intrappolata e sigillata nelle microcamere. La struttura idrofila-in-idrofobica è vitale per respingere l'acqua al di fuori delle microcamere, isolare i singoli microreattori e mantenere una piccola soluzione acquosa all'interno dello spazio femtolitro. La proprietà unica è stata applicata con successo per la preparazione di goccioline acqua-in-olio e lipidi bistrato microcomogni16,17. Rispetto al prototipo del dispositivo16,abbiamo prima ottimizzato il processo di microfabbricazione per realizzare una rimozione completa del polimero CYTOP e una completa esposizione del fondo di vetro. CYTOP è un fluoropolimero speciale con una tensione superficiale estremamente bassa (19 mN/m) inferiore a quella dei materiali convenzionali di microreattore come vetro, plastica e silicone. Le sue buone prestazioni ottiche, elettriche e chimiche sono già state utilizzate nel trattamento superficiale di dispositivi microfluidici18,19,20,21,22,23,24. Nel sistema FemDA, per ottenere una buona bagnatura dell'olio sulla superficie CYTOP, la tensione superficiale dell'olio deve essere inferiore a quella della superficie solida25. In caso contrario, l'olio liquido a contatto con la superficie solida tende a diventare sferico piuttosto che diffondersi sulla superficie. Inoltre, abbiamo scoperto che alcuni oli di perfluorocarburi popolari (ad esempio, 3M FC-40)16 e oli idrofluoroetering (ad esempio, serie 3M Novec) possono sciogliere CYTOP a causa della morfologia amorfo di CYTOP, che è fatale per la misurazione quantitativa e sarebbe discutibile in termini di contaminazione incrociata tra le goccioline. Fortunatamente, abbiamo identificato un olio biocompatibile ed ecologico che mostra una tensione superficiale inferiore (< 19 mN/m)13. Abbiamo anche trovato un nuovo surfactant che può sciogliere nell'olio selezionato e funzionare in una bassa concentrazione (0.1%, almeno 10 volte inferiore a quelli precedentemente segnalati popolari26,27)13. L'interfaccia acqua/olio risultante può essere stabilizzata dal surfactant. A causa dell'elevato tasso di evaporazione dell'olio, seguendo il filo con l'olio, abbiamo applicato un altro olio biocompatibile e rispettoso dell'ambiente per sostituire il primo a sigillare le microcamere. Chiamiamo il primo olio (ASAHIKLIN AE-3000 con 0,1 wt % SURFLON S-386) il "olio a filo" e il secondo olio (Fomblin Y25) l'"olio di sgelazione", rispettivamente.

La strategia di sigillamento dell'olio in due fasi può realizzare una solida formazione dell'array di goccioline femtoliter in pochi minuti e senza strumentazione sofisticata. A causa del problema dell'evaporazione, è stato considerato difficile generare microreattori più piccoli dei volumi di picoliter28. FemDA ha affrontato questo problema ottimizzando sistematicamente i materiali e i processi utilizzati per la preparazione di microreattori/goccioline. Diverse caratteristiche degne di nota delle goccioline risultanti includono l'alta uniformità (o monodispersità), la stabilità e la biocompatibilità su scala femtolare. Il coefficiente di variazione (CV) del volume delle goccioline è solo del 3% (senza correzione della vignettatura per le immagini microscopiche), il più piccolo CV tra le piattaforme di goccioline al mondo, che garantisce una misurazione altamente parallela e quantitativa. La goccia di femtolitro è stabile per almeno 24 ore senza contaminazione incrociata tra le goccioline a temperatura ambiente, il che è prezioso per una misurazione affidabile del percorso temporale. Per quanto riguarda la biocompatibilità, siamo riusciti a sintetizzare varie proteine da un DNA modello a copia singola nella goccia femtolitro, che in precedenza era stata considerata difficile o inefficiente29,30. Sarebbe degno di chiarire perché alcune proteine in grado di essere sintetizzate nel FemDA non possono essere sintetizzate in altri sistemi di goccioline. FemDA non era solo un avanzamento tecnico, ma ha anche realizzato una misurazione quantitativa senza precedenti in grado di correlare la resa proteica (come riflesso dall'intensità di fluorescenza della gocciolina) al numero di molecole di DNA modello in ogni goccia. Di conseguenza, l'istogramma dell'intensità di fluorescenza delle goccioline dei CFPS con sede a FemDA ha mostrato una distribuzione discreta che può essere ben montata da una somma di distribuzioni gaussiane di intervalli picco-picco uguali. Inoltre, la probabilità di comparsa di goccioline contenenti diversi numeri di molecole di DNA era perfetta per una distribuzione di Poisson31. Così, la diversa resa proteica in ogni goccia può essere normalizzata in base alla distribuzione discreta. Questa caratteristica critica ci permette di separare le informazioni sull'attività ezimatica dall'intensità apparente, che non è ancora disponibile con altre piattaforme di microreattore. I sistemi di smistamento microfluidici esistenti per cellule microfluidiche sono abili nello smistamento completamente automatico e sono bravi a concentrare i campioni, ma a volte possono produrre solo un istogramma relativamente ampio o a coda lunga nell'aspetto analitico32,33. Il nostro sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatibile stabilisce un nuovo punto di riferimento e un elevato standard analitico nel campo dello sviluppo di microreattori.

Gli oli e i surfactants che potrebbero essere utilizzati per la preparazione delle goccioline sono ancora molto limitati34. La combinazione di ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 stabilita a FemDA è un nuovo membro del crescente arsenale dell'interfaccia fisiochimica tra la fase acquosa e la fase dell'olio13. La nuova interfaccia in FemDA è fisicamente stabile, chimicamente inerte, e biologicamente compatibile con la trascrizione complessa, traduzione, e macchinare di modifica post-traduzione per molti tipi di proteine13. Sarebbe piuttosto interessante trovare una proteina che non può essere sintetizzata nelle impostazioni delle goccioline. Inoltre, il risparmio sui costi dei reagenti è più evidente nel sistema di gocciolina del femtolitro rispetto a quello dei sistemi di reattori nanoliter e picoliter35,36. In particolare, ci sarebbe spesso un grande volume morto, che è causato principalmente da tubi o forniture esterne, nei sistemi microfluidici di generazione di gocciolini, ma non nel nostro FemDA. Il formato della matrice è favorito anche dalla caratterizzazione microscopica ripetuta e dettagliata (simile alla cosiddetta analisi ad alto contenuto) per ogni singolo reattore37, piuttosto che una sola istantanea per un oggetto in rapido movimento. La scala femtobotera ha permesso l'integrazione di oltre un milione di reattori su un'area grande di un dito, mentre lo stesso numero di reattori nanollitri (se esiste) richiede un'area di metro quadrato, il che sarebbe indubbiamente poco pratico per la produzione o l'uso di tale sistema.

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Protocol

1. Microfabbricazione del substrato di matrice a microcamera femtolare

NOTA: condurre il seguente esperimento di microfabbricazione in una camera pulita. Indossare guanti e un abito da camera pulita prima di entrare nella camera pulita.

  1. Pulizia del substrato di vetro di copertura
    1. Impostare il vetro di copertura su una barra di rivestimento in vetro di copertura. Sonicare il vetro di copertura in idrossido di sodio 8 M (NaOH) per 15 min a temperatura ambiente (RT).
      AVVISO: NaOH in alte concentrazioni è altamente pericoloso per la pelle e gli occhi. Maneggiare delicatamente senza spruzzi.
    2. Estrarre il rack dalla soluzione NaOH e risciacquare il vetro di copertura utilizzando l'acqua per dieci volte. Conservare il vetro di copertura nell'acqua pura.
      NOTA: Scartare i rifiuti alcalini nel serbatoio designato. La soluzione NaOH può essere riciclata alla bottiglia originale e utilizzata fino a cinque volte.
    3. Asciugare ogni pezzo di vetro di copertura con una pistola ad aria alta.
    4. Cuocere il vetro di copertura essiccato su una piastra calda a 200 gradi centigradi per 5 min. Mantenere coerente l'orientamento del lato superiore del substrato di vetro durante i seguenti processi di manipolazione.
  2. Silanizzazione della superficie vetrata
    1. Reimpostare il vetro di copertura pulito su un rack di colorazione secca.
    2. Aggiungere 150 mL di etanolo in un becher PTFE. Utilizzare un ago (22 G x 70 mm) dotato di siringa da 1 mL per disegnare 0,075 mL di (3-aminopropyl)triethoxysilane e iniettarlo immediatamente all'etanolo (cioè 0,05 vol %). Tirare e spingere la siringa più volte per sciacquare l'interno della siringa. Mescolare la soluzione con l'ago per renderla omogenea.
      NOTA: (3-aminopropyl)triethoxysilane può essere conservato a temperatura ambiente e 1 pressione atm per due anni con una tenuta stretta. L'etanolo assoluto deve essere ben sigillato dopo l'uso. Si sconsiglia di utilizzare reagenti scaduti.
    3. Incubare il vetro di copertura nella soluzione di ammisorsione 0,05 vol % per 1 h a RT.
    4. Sciacquare il vetro di copertura con acqua pura per cinque volte. Conservare il vetro di copertura nell'acqua pura.
      NOTA: Scartare i rifiuti nel serbatoio designato.
    5. Asciugare ogni pezzo di vetro di copertura con la pistola ad aria alta.
    6. Mettere tutto il vetro di copertura essiccato su un foglio di alluminio. Cuocere il vetro di copertura sulla piastra calda a 80 gradi centigradi per 5 min.
  3. Perfluoropolimero a spin CYTOP
    1. Posizionare il vetro di copertura su un mandrino a vuoto personalizzato di un rivestimento di spin (Figura 1A). Accendere l'interruttore a vuoto per fissare il substrato di vetro.
      NOTA: Il design del mandrino a vuoto è fondamentale per un rivestimento uniforme di polimero viscoso sul substrato rettangolare (24 mm x 32 mm) e sottile (0,13-0,17 mm) (Figura 1A). Abbiamo scoperto che uno stadio campione rettangolare con più fori (48 fori, ciascuno con diametro di 1 mm) che si collegava al canale a vuoto funzionava meglio del palco rotondo con un singolo foro centrale.
    2. Spogli 70-90 l di tipo-A polimero CYTOP al centro del substrato di vetro. Immediatamente spin-coat il polimero (Figura 1B).
      NOTA: La condizione di rivestimento di spin (3.400 giri/m, 30 s) fornisce uno spessore di 3 m. Utilizzare la micropipetta progettata per il liquido viscoso. Tenere la micropipetta in posizione verticale per fare in modo che il polimero cada quasi perfettamente cerchio sul substrato. Una bolla d'aria viene spesso generata all'interno della punta della pipetta quando lo stantuffo si muove verso il basso. Non far cadere l'ultima goccia di CYTOP con la bolla.
    3. Raccogliere il vetro rivestito con le dita che tengono gli angoli del substrato di vetro, e metterlo su un foglio di alluminio.
    4. Ripetere i passaggi da 1.3.1-1.3.3 per ricoprire tutti i pezzi rimanenti del vetro di copertura.
    5. Cuocere il vetro rivestito a 80 gradi centigradi per 30 min e poi a 200 gradi per 1 ora.
      NOTA: Questa lavorazione cura completamente il CYTOP e lega in modo covalente il CYTOP alla superficie del vetro. Coprire l'area di cottura con un coperchio in foglio di alluminio per evitare la polvere potenziale durante il lungo processo di cottura, se necessario.
    6. Togliere il vetro di copertura rivestito CYTOP dalla piastra calda e raffreddare fino a RT. Raccogliere con attenzione ogni pezzo di vetro rivestito e ispezionarlo per vedere se è correttamente rivestito. Eliminare il substrato che esibisce un rivestimento inomogeneo.
      NOTA: La superficie di un CYTOP ben rivestito dovrebbe apparire piatta senza modelli arcobaleno irregolari(Figura 1C). L'ispezione visiva da un angolo adeguato può rapidamente giudicare la planarità e la qualità del rivestimento. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  4. Fotoresist di rivestimento a spin
    1. Posizionare il vetro di copertura rivestito in CYTOP sul mandrino a vuoto (vedere il passaggio 1.3.1) dello strato di spin coater. Accendere l'interruttore a vuoto per fissare il vetro di copertura.
    2. Cadere 0,2-0,3 mL di fotoresist al centro del substrato. Immediatamente girare-coat il fotoresist a 6.000 rpm per 60 s.
      NOTA: Non far cadere l'ultima goccia del fotoresist con bolle. Se l'coater di spin supporta una maggiore velocità di rotazione, la velocità di rotazione potrebbe essere fino a 7.500 rpm per ottenere un rivestimento più sottile. La bassa energia superficiale di CYTOP impedisce che la maggior parte dei fotoresisti venga aderente alla sua superficie. Se il fotoresist di P4903 non è disponibile, il fotoresist di P4620 è una buona alternativa.
    3. Raccogliere il substrato rivestito con due dita che tengono gli angoli del substrato. Pulire il fotoresist in eccesso vicino al bordo del substrato (spesso chiamato come rimozione del bordo o EBR) utilizzando un tergicristallo pulito inonolo(Figura 1D). Posizionare il substrato sul foglio di alluminio.
      NOTA: L'acetone NON è raccomandato per EBR.
    4. Ripetere i passaggi 1.4.1-1.4.3 per rivestire il fotoresist per i restanti pezzi di vetro di copertura rivestito in CYTOP. Raccogliere ogni pezzo di vetro rivestito e ispezionarlo per vedere se è correttamente rivestito.
      NOTA: La superficie di un fotoresist ben rivestito dovrebbe apparire piatta senza modelli irregolari (Figura 1D). L'ispezione visiva da un angolo adeguato può rapidamente giudicare la planarità e la qualità del rivestimento. Il substrato che presenta rivestimenti inomogenei può essere riciclato attraverso il lavaggio con acetone, 2 propanol e H2O in sequenza e riutilizzato.
    5. Cuocere il substrato rivestito a 110 gradi centigradi per 5 min sulla piastra calda.
    6. Rimuovere il substrato rivestito dalla piastra calda e raffreddare fino a RT. Lasciare riposare per 30 min ad un'umidità relativa del 40%-60% per la reidratazione del fotoresist.
      NOTA: H2O è necessario per la seguente reazione fotochimica. Il photoresist al forno ha perso il contenuto H2O all'interno del photoresist. Il processo di reidratazione permette di assorbire H2O dall'aria. L'umidità relativa inferiore al 20% o superiore all'80% non è adatta per il processo di reidratazione.
  5. Fotolitografia
    1. Durante il tempo di attesa della reidratazione (vedere il passaggio 1.4.6), avviare l'allineatore della maschera. Riscaldare la sorgente luminosa. Caricare la fotomaschera cromata.
      NOTA: Seguire il manuale di istruzioni per utilizzare l'allineatore della maschera. La fotomaschera può essere fabbricata tramite litografia a fascio di elettroni (EB) se l'impianto EB è disponibile. In alternativa, la fotomaschera può essere esternalizzata a una società locale.
    2. Caricare il substrato reidratato (dopo aver terminato la fase 1.4.6) sul mandrino (Figura 1E).
    3. Impostare i parametri di esposizione. Esporre il substrato per 25 s con un'intensità UV di 13 mW/cm2 (h-line) in modalità di contatto sottovuoto. Quindi scaricare il substrato e impostarlo sul rack di colorazione vetro di copertura (lo stesso rack utilizzato nel passaggio 1.1.1).
    4. Ripetere i passaggi da 1.5.2-1.5.3 per esporre i pezzi rimanenti del substrato reidratato.
  6. Sviluppo
    1. Sviluppare il substrato per 5 min per dissolvere il fotoresist esposto (Figura 1F). Durante il quale, scuotere delicatamente il rack nello sviluppatore una volta al momento di 4 minuti.
      NOTA: lo sviluppatore è stato A 300 MIF. Gli sviluppatori alternativi di alcaline (ad es., 400 K) sono generalmente applicabili per lo sviluppo, ma dovrebbero richiedere l'ottimizzazione delle condizioni di sviluppo (ad esempio, tempo, temperatura, agitazione). NON utilizzare becher di vetro come contenitore per sviluppatori.
    2. Sciacquare il substrato con acqua pura per dieci volte. Conservare il vetro di copertura nell'acqua pura.
      NOTA: Scartare lo sviluppatore nel serbatoio designato.
    3. Asciuga accuratamente ogni pezzo di substrato con la pistola ad aria alta.
  7. Incisione io-ioattivo reattiva
    1. Collocare il substrato essiccato (dal punto 1.6.3) nella camera di reazione della macchina RIE (Reactive-ion etching).
      NOTA: Secondo la regola di manutenzione della struttura, la macchina RIE può essere sempre accesa o spenta ogni volta. Se l'interruttore era spento, accendere l'interruttore secondo il manuale.
    2. Incidere il CYTOP fotoresist-scoperto con il plasma O2 (Figura 1G).
      NOTA: la condizione RIE era la seguente. O2 portata del gas: 50 mccm; pressione della camera: 10.0 Pa; Potenza RF: 50 W; tempo di incisione: 27 min. Il tempo di incisione è stato ottimizzato per l'incisione completa dello spessore di 3 m di CYTOP.
    3. Raccogliere ogni pezzo di substrato dalla camera di reazione utilizzando la pinzetta e posizionarli sul rack di colorazione vetro di copertura.
      NOTA: Secondo la regola di manutenzione della struttura, la camera di reazione può richiedere un breve processo di pulizia del plasma O2 (ad esempio, il tempo di incisione: 5 min) per mantenere la camera di reazione pulita dopo ogni corsa.
  8. Rimozione di photoresist e pulizia
    1. Sonicare il substrato in acetone per 5 minuti a RT per sciogliere il fotoresist rimanente.
    2. Sonicare il substrato in 2-propanol per 5 min a RT.
    3. Sciacquare il substrato con acqua pura per cinque volte. Sonicare il substrato per 5 minuti a RT. Rinse il campione utilizzando acqua pura per altre cinque volte. Tenere il substrato in acqua pura.
    4. Asciugare ogni pezzo di substrato con la pistola ad aria alta (Figura 1H).
      NOTA: Il substrato può essere conservato in un piatto di Petri di plastica. Il substrato fabbricato è strutturalmente stabile a RT per almeno un anno. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
    5. Caratterizzare il profilo superficiale del substrato come-preparato mediante microscopia confocale a scansione laser tridimensionale (3D), interferometria della luce bianca (o interferometria di scansione della coerenza) o microscopia elettronica a scansione. Utilizzare il rispettivo software per misurare il diametro e la profondità delle microcamere risultanti.
      NOTA: Il campione può essere riutilizzato per altri esperimenti dopo la caratterizzazione con il microscopio confocale a scansione laser 3D non distruttivo e non distruttivo o interferometro a luce bianca. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Preparazione del microcanale polidimetilsioxane (PDMS)

NOTA: NON indossare guanti di lattice per gestire PDMS. Invece, indossare guanti di polietilene (PE).

  1. Fare il master microcanale
    1. Tagliare un nastro adesivo adesivo adesivo adesivo adesivo Pellicola Kapton in una forma a microcanale definita (3 mm x 19 mm) utilizzando una fresa per il desktop.
      NOTA: Il nastro Kapton era n. 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), con un'altezza del canale di 135 m. La taglierina desktop STIKA utilizza un plugin (disponibile sul sito Web Roland: https://www.rolanddga.com) di Adobe Illustrator per eseguire il taglio in base al disegno nel file Adobe Illustrator. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
    2. Attaccare ogni nastro Kapton tagliato sul fondo piatto di un piatto Petri. Il piatto Petri standard da 90 mm può ospitare 12 pezzi del nastro.
      NOTA: La struttura di rilievo funge da master per lo stampaggio della replica di PDMS. Premere delicatamente la superficie del nastro con una pinzetta se ci sono bolle d'aria inserite tra il nastro e il substrato della teglia Petri. In alternativa, la classica litografia morbida può essere applicata per preparare il maestro su un wafer di silicio38. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  2. Curare la resina PDMS nel piatto Petri con motivi a nastro
    1. Indossare nuovi guanti PE e trasferire 2,5 g di agente curante di SYLGARD 184 elastomer in silicone utilizzando una pipetta di plastica usa e getta nel becher di plastica specificato (Figura 2A).
    2. Trasformati in nuovi guanti e trasferisci 25 g della base prepolimerica di SYLGARD 184 in silicone utilizzando una siringa usa e getta da 50 mL nel bicchiere di plastica sopra.
      NOTA: Modificare i guanti qui presenti per evitare la potenziale contaminazione incrociata dell'agente di polimerità alla base.
    3. Utilizzare un mixer di deaerazione per mescolare e deaerare la miscela (programma: 3 min miscelazione seguita da 2 min deaeration).
      NOTA: Se il mixer di deaerazione non è disponibile, una miscela agitata manualmente (per circa 15 min) può essere degassata in una camera a vuoto.
    4. Versare la miscela PDMS nella parabola Petri a nastro (Figura 2B). Impostare il piatto Petri in una mini camera a vuoto e deperare la miscela PDMS per 1-3 h(Figura 2C).
      NOTA: Se l'aria rimane nella miscela PDMS dopo 1 h, togliere il piatto Petri dalla camera a vuoto, rompere la bolla d'aria con un gonfiere d'aria, quindi rimettere la piastra Petri nella camera a vuoto e continuare il processo di deaerazione.
    5. Mettere il piatto Petri in un forno a 60 gradi durante la notte per curare il PDMS(Figura 2D).
      NOTA: Anche se l'aumento della temperatura può ridurre il tempo di stagionatura, la temperatura massima che può essere tollerata dal piatto Petri in polistirolo senza deformazione fisica è di circa 60 gradi centigradi.
  3. Replica dello stampaggio del canale PDMS
    1. Sbucciare l'elastomer PDMS curato dal piatto Petri(Figura 2E).
    2. Tagliare ogni pezzo di blocchi di canale PDMS utilizzando una fresa a cavi piatti (Figura 2F).
    3. Posizionare l'elastomer PDMS su un tappetino di taglio rivolto verso l'alto. Pernottare un foro ad ogni estremità del canale utilizzando un punzone di biopsia (Figura 2G).
    4. Pulire la superficie del canale PDMS con nastro adesivo. Quindi avvolgere la resina PDMS in un altro pezzo di nastro adesivo per mantenerlo pulito prima dell'uso. Conservare il canale PDMS preparato in un piatto Petri pulito.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Assemblaggio del dispositivo di matrice a microcamera femtoliter

  1. Mettere alcuni pezzi di tergicristalli puliti imbevuti d'acqua lungo la parete interna di un piatto Petri per fare una camera umidificante semplificata. Posizionare la resina PDMS coperta dal nastro scozzese nella camera umidificante e sigillare la camera con pellicola di paraffina. Incubare per almeno 3 ore ma non più di un giorno.
    NOTA: PDMS è un materiale poroso che consente al gas di passare attraverso la resina39. La struttura porosa del PDMS porta ad un assorbimento di molecole d'acqua dall'ambiente circostante fino a raggiungere un equilibrio. Questo pretrattamento riempie i pori del PDMS con vapore acqueo e può reprimere in modo significativo l'evaporazione delle goccioline acquose adiacenti al bordo del canale PDMS.
  2. Togli il nastro scozzese dalla resina del PDMS. Posizionare il canale PDMS sull'area della matrice microcamera del substrato (Figura 2H).
    NOTA: la resina PDMS aderisce in modo reversibilmente alla superficie CYTOP. Premere delicatamente il blocco PDMS con una pinzetta per rimuovere eventuali bolle d'aria tra la resina PDMS e il substrato, se esistente.
  3. Inserire una punta di pipetta non filtrata da 200 l una delle quali in uno (come presa) dei fori del canale PDMS.
    NOTA: il livello di adesione tra PDMS e CYTOP è limitato. Per evitare la deformazione fisica della resina PDMS e il distacco del canale PDMS dalla superficie, non inserire la punta della pipetta troppo in profondità.

4. Soluzione di reazione di caricamento sul dispositivo assemblato

  1. Mettere un supporto microtubo di alluminio sul ghiaccio. Prechill l'olio di scarico (olio ASAHIKLIN AE-3000 mescolato con 0,1 wt % surfLON S-386 surfactant) in un microtubo da 1,5 ml sul supporto in alluminio.
  2. Metti un altro blocco di alluminio sul ghiaccio.
  3. Preparazione della soluzione di reazione CFPS
    1. Preparare la soluzione di reazione CFPS in un tubo PCR. Mescolare ogni componente del kit CFPS, un DNA modello diluito (come esemplificato qui dalla proteina fluorescente mNeonGreen40 e Escherichia coli fosforo41),e altri componenti necessari in base alle esigenze specifiche (ad esempio, inibitore di RNase, substrato fluorogenico, chaperone).
      NOTA: Il DNA del modello utilizzato per CFPS deve essere preparato secondo le istruzioni del kit CFPS corrispondente. In questa dimostrazione è stato applicato un sistema di espressioni basato su T742. Poiché il consumo di reagenti nel dispositivo FemDA è piuttosto ridotto, 10 -L è abbastanza grande da riempire l'intero canale PDMS.
    2. Per la sintesi delle proteine fluorescenti mNeonGreen, mescolare i componenti nel seguente ordine: aggiungere 2,7 litri di nuclease-free H2O a un 6 aliquote della soluzione A (dal kit CFPS); aggiungere 0,3 l di inibitore di RNase; aggiungere 1,5 l di soluzione DI DNA modello diluito; mescolare brevemente e trasferire la miscela a una aliquota di 4,5 l di soluzione B (dal kit CFPS).
      NOTA: Il volume totale è 15. Poiché la quantità di ogni aliquota è proporzionale al volume totale della miscela finale, un volume totale inferiore a 10 -L può comportare un volume troppo piccolo (< 0,2 -L) di alcuni componenti.
    3. Per la sintesi del fosfofofanosi alcalina, mescolare i componenti nel seguente ordine: aggiungere 1,2 - L di H2O a 6 - L della soluzione A; aggiungere 0,3 l di inibitore di RNase; aggiungere 0,6 l di potenziatore di legame disulfide 1 e 2 (da un kit); aggiungiamo 0,3 l di 5 mM 6,8-difluoro-4-metilbelliferyl fosfato (DiFMUP); aggiungere 1,5 l di soluzione di DNA; mescolare brevemente e trasferire la miscela a 4,5 l di soluzione B.
      NOTA: Nell'analisi del fosfoculosi alcalino, il substrato fluorogenico DiFMUP può produrre 6,8 difluoro-7-idrossio-4-methylcoumarin (DiFMU) su scissione ezimatica del gruppo di fosfati terminale.
  4. Disegnare 10 l della miscela utilizzando una punta di pipetta non filtrata da 200 litri. Inserire la punta della pipetta nel foro di ingresso (fare riferimento al passaggio 3.3) del canale PDMS. Spingere verso il basso sullo stantuffo per iniettare la soluzione al canale fino a quando non trabocca dalla presa (dove un'altra punta pipetta è già stata inserita al passaggio 3.3).
  5. Separare la pipetta dalla punta della pipetta e tenere queste due punte pipette ancora inserite nell'uscita e nella presa.
    NOTA: Evitare di generare bolle d'aria durante la pipettatura. Non lasciare il pollice dallo stantuffo fino a separare la pipetta dalla punta della pipetta per evitare il riflusso della soluzione all'interno del canale PDMS.

5. Generazione di matrice di gocce di femtolitri (FemDA) per CFPS

  1. Trasferire l'intero set del dispositivo assemblato al blocco di alluminio pre-freddo (vedere il passaggio 4.2). Confermare con attenzione che l'area della matrice a microcamera si trasformi rapidamente da traslucido (Figura 2I) a trasparente (Figura 2J).
    NOTA: La soluzione di reazione CFPS non può entrare direttamente nelle microcamere. La solubilità dell'aria nell'acqua è inversamente proporzionale alla temperatura. L'aria intrappolata si dissolverà nella soluzione dopo che il dispositivo è stato spostato da RT a bassa temperatura. La modifica della trasparenza è un comodo indicatore visivo per giudicare se la soluzione entra nelle microcamere.
  2. Disegnare 30 l dell'olio a filo preraffreddato (vedere il punto 4.1) e trasferire immediatamente l'olio nella punta della pipetta inserita dall'ingresso dalla sua apertura superiore. L'olio di lavaggio si sposta nel canale ed estrude la soluzione di reazione in eccesso situata al di fuori delle microcamere. Ogni microcamera è isolata dall'olio di scarico.
    NOTA: L'interfaccia mobile tra la soluzione di reazione e l'olio a filo è visibile, il che aiuta le persone a osservare il movimento del fluido all'interno del canale. La soluzione estrusa può essere raccolta nel tubo precedente, immagazzinata a 4 gradi centigradi, e riutilizzata per un altro dispositivo FemDA o una reazione di massa parallela (nel microtubi o in una piastra di microtiteri).
  3. Pre-disegnare 30 - L di olio di guaritura (Fomblin Y25) a una punta di pipetta filtrata da 200 l. Appendi la pipetta in posizione verticale da qualche parte.
  4. Rimuovere contemporaneamente le due punte pipette inserite (vedere i passaggi 3.3 e 4.4) dal dispositivo. Spostare immediatamente il dispositivo dal blocco di alluminio al parafilm.
    NOTA: Utilizzare una pinzetta per fissare (ma tenere lontano dall'area del canale) il dispositivo sul blocco di alluminio durante il periodo di rimozione delle punte pipette.
  5. Inserire immediatamente la punta pipetta pronta contenente l'olio di guarnizione (vedere il punto 5.3) nell'ingresso del canale PDMS e iniettare l'olio nel canale fino a quando non trabocca dalla presa.
    NOTA: eseguire questo passaggio non appena si sposta il dispositivo in RT. Per evitare il riflusso all'interno del canale, non lasciare il pollice dallo stantuffo fino a quando l'olio di guarnizione non trabocca dalla presa. L'olio di scarico evapora immediatamente dopo lo spostamento fuori dalla presa del canale, mentre il seguente olio di tenuta si accumula nella presa a causa della sua perdita di evaporazione estremamente bassa.
  6. Separare la pipetta dalla punta della pipetta e quindi rimuovere la punta della pipetta dal dispositivo. Pulire la superficie PDMS utilizzando un pezzo del tergicristallo pulito e quindi applicare una nuova goccia di olio di sigillazione all'uscita e alla presa, rispettivamente. Le goccioline di femtolino sono sigillate in microcamere individuali dall'olio.
    NOTA: Utilizzare una pinzetta per fissare (ma tenere lontano dall'area del canale) il canale PDMS sul substrato durante il periodo di rimozione della punta della micropipetta.
  7. Pulire l'umidità accumulata sulla superficie inferiore del vetro di copertura. Il dispositivo FemDA, preparato, è ora pronto per l'incubazione e l'imaging microscopio.

6. Imaging a microscopia

  1. Avviare un microscopio a fluorescenza invertito. Attendere la stabilizzazione (raffreddamento) della fotocamera. Utilizzare un obiettivo di immersione dell'olio 60x o 100x. Impostare il dispositivo FemDA sul palco motorizzato. Impostare i parametri di imaging.
    NOTA: i parametri di imaging includono il percorso del file, i canali di imaging, i filtri, i tempi di esposizione (in generale, 100 ms sono sufficienti; il tempo più breve o più lungo è possibile anche in base alle specifiche della fotocamera) e l'intensità della luce.
  2. Trova il piano focale. Regolare la posizione dell'asse z dell'obiettivo e fissare il piano focale utilizzando un sistema di messa a fuoco automatica interna. Impostare l'area di interesse (ROI; cioè, x, asse y) da immaginare.
    NOTA: I principali produttori di microscopi (Nikon, Olympus, zeiss, Leica) offrono la possibilità di integrare il sistema di autofocus con il microscopio. Questo sistema di messa a fuoco automatica è necessario per mantenere costante il piano focale durante l'imaging automatico multi-area. I ROI coprono l'area FemDA nel canale PDMS.
  3. Acquisire le immagini a fluorescenza. Cattura un singolo fotogramma di un'immagine di colore brillante (BF) dismessa per ogni ROI. NON modificare l'ordine e le coordinate dei ROI durante l'imaging dei diversi canali.

7. Analisi dei dati immagine

NOTA: Analizzare i dati immagine utilizzando un plugin fatto in casa (chiamato "FemDA") basato su Fiji (http://fiji.sc) per estrarre l'intensità di fluorescenza di ogni goccia43. Installare la versione corretta di Fiji in base al sistema operativo. Fiji supporta la maggior parte dei formati di file di immagine (ad esempio, il file nd2 dal microscopio Nikon, file czi dal microscopio zeiss) utilizzando un plug-in build-in "Bio-Formati".

  1. Installazione plug-in
    1. Copia e incolla il file del plugin (che è disponibile su richiesta all'autore corrispondente o tramite il seguente link istituzionale: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) nella cartella "plugins" delle Fiji.
    2. Avviare il software Fiji; il plugin "FemDA" si trova nel menu a discesa "Plugins" delle Fiji.
  2. Pre-elaborazione dei dati immagine
    1. Aprire l'immagine BF dismessa (vedere il passaggio 6.3). Fare clic su Processo . Sottrai sfondo... per rimuovere sfondi continui uniformi di ogni fotogramma dei dati immagine (Figura 4B). Fare clic su Processo . Proprietà Filters . Mediana per ridurre il rumore di ogni fotogramma dei dati dell'immagine (Figura 4C).
    2. Fare clic su Immagine . Proprietà Adjust (Regolare) Soglia per controllare e separare il primo piano (indicando le microcamere) dallo sfondo (che indica l'area al di fuori delle microcamere) di ogni fotogramma dei dati dell'immagine (inserti ingranditi nella Figura 4A-C).
      NOTA: Selezionare un algoritmo appropriato dall'elenco a discesa nella finestra Soglia in modo che solo le aree a microcamera, così come i bordi di ogni microcamera, possano essere identificate ed evidenziate come primo piano. In particolare, la maggior parte dei bordi evidenziati deve essere continua senza spazi.
  3. Determinazione delle coordinate delle gocciole
    1. Fare clic su Plugins Proprietà FemDA . FemDA Analysis per aprire l'interfaccia utente grafica (GUI) del plugin personalizzato (metà superiore della Figura 4D).
    2. Immettere il numero minimo e massimo approssimativo di pixel di una singola microcamera. Immettere la circolarità minima e massima prevista (0: forma arbitraria; 1: cerchio perfetto) delle microcamere. Immettere il numero di fotogramma del fotogramma iniziale e del fotogramma finale.
    3. Fate clic su Genera ROI sulla GUI per rilevare ogni microcamera e i ROI rilevati correttamente vengono visualizzati in una finestra popup ROITable.
    4. Tornare alla finestra Analisi FemDA e fare clic sul pulsante Applica maschera ROI per verificare se le microcamere sopra i frame sono state rilevate correttamente (in basso a sinistra di Figura 4D). In caso contrario, modificarne alcuni e ripetere la selezione di Genera ROI e Applica maschera ROI. In caso affermativo, andare al passaggio successivo.
      NOTA: Ci possono essere pochissime microcamere che non possono essere identificate come ROI (vedi la metà inferiore della Figura 4D) da qualsiasi algoritmo della soglia a causa del contrasto insufficiente tra il primo piano e lo sfondo. Non è problematico dal punto di vista statistico.
  4. Estrazione dell'intensità della fluorescenza
    1. Aprire l'immagine a fluorescenza e portarla in primo piano. Fare nuovamente clic su Applica maschera ROI per applicare i ROI determinati all'immagine a fluorescenza (in basso a destra della figura 4D).
    2. Selezionare One-Shot per l'analisi di un'immagine finale (come esemplificato con i dati mNeonGreen) o Time-Lapse per l'analisi di un percorso temporale (come esemplificato con i dati di fosforasi alcalina).
    3. Immettere 100 nella casella Numero di pixel superiori significa che solo i primi 100 pixel di ogni ROI verranno utilizzati per calcolare l'intensità media della goccia corrispondente. Se si immette 0 nel numero di pixel superiori,verranno utilizzati tutti i pixel di ogni ROI per calcolare l'intensità media dell'elenco a goccia corrispondente.
      NOTA: Ci può essere una deriva di diversi pixel tra il BF e le immagini a fluorescenza, il che significa che alcuni pixel all'interno dei ROI possono appartenere allo sfondo dell'immagine a fluorescenza. Quindi, il plugin fornisce un'opzione per specificare il numero di pixel classificati in alta intensità per il calcolo dell'intensità media di ogni goccia.
    4. Per l'analisi dell'immagine del punto finale (ad esempio, selezionare One-Shot al passaggio 7.4.2), fare clic sul pulsante Misura intensità per calcolare l'intensità media di tutte le goccioline rilevate. La TABELLA ROITable viene aggiornata con i nuovi dati dell'immagine a fluorescenza. Nel frattempo, un istogramma viene visualizzato in una nuova finestra popup istogramma (Figura 4E).
      NOTA: la modifica delle dimensioni del contenitore nella casella Numero collocazione può ottimizzare la visualizzazione dell'istogramma. Un raccordo a una somma di distribuzioni gaussiane può essere realizzato nella GUI sviluppata. La finestra di registro popup di Fiji visualizza i risultati del montaggio. In alternativa, esportare i dati facendo clic sul pulsante salva come testo ed eseguire varie analisi statistiche con altri software ( Figura4F, G).
    5. Per l'analisi dell'immagine del corso temporale (ad esempio, selezionare Time-Lapse al passaggio 7.4.2), la finestra popup è Intensity Time Course anziché Istogramma, che contiene un istogramma corrispondente a un punto temporale specifico e a un grafico di intensità temporale (Figura 5). I dati testuali possono anche essere esportati utilizzando il menu File della finestra popup.

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Representative Results

Il processo di microfabbricazione consiste nella pulizia del substrato, nella funzionalizzazione della superficie, nel rivestimento CYTOP, nella fotolitografia, nell'incisione a secco, nella stripping fotoresista e nella pulizia finale. È importante sottolineare che il protocollo presentato ha permesso la rimozione completa del polimero civetta ciforo idrofobico all'interno delle microcamere Figura 3A), producendo una struttura idrofilo-in-idrofobico altamente parallela su un substrato di vetro di copertura standard. Con l'aiuto del protocollo di tenuta dell'olio, la dimensione uniforme delle goccioline risultanti è stata verificata incapsulando la soluzione fluorescente nelle microcamere (Figura 3B). L'intensità di fluorescenza estratta utilizzando il software sviluppato è un buon indicatore della dimensione delle goccioline. Il CV dell'intensità della fluorescenza, 3%, riflette la distribuzione ristretta della dimensione delle goccioline sull'intera matrice (Figura 3C). L'immagine 3D ricostruita dalla microscopia confocale ha mostrato anche il volume costante delle gocciolamenti nel tempo (Figura 3D, Film supplementare 1)44. In confronto, un olio FC-40 ampiamente utilizzato ha generato le goccioline che presentano una differenza di diverse pieghe nell'intensità della fluorescenza45. Le goccioline formate in FemDA erano stabili a RT per almeno 24 ore (Figura 3E). L'alta qualità delle goccioline alla fine ha costituito la base della misurazione quantitativa.

I dati ad alta velocità effettiva richiedono strumenti di analisi dei dati ad alta velocità effettiva46,47. Il plugin sviluppato notevolmente semplificato e accelerato l'analisi dei dati immagine. Sulla base della teoria dell'elaborazione delle immagini digitali48, l'immagine BF dismessa può essere binarizzata e utilizzata per fornire le informazioni sulle coordinate di ogni goccia dopo la correzione dello sfondo e la riduzione del rumore (Figura 4A-C). Questa idea ha reso possibile la localizzazione precisa delle goccioline scure.

La proteina fluorescente mNeonGreen è stata sintetizzata in FemDA. Il DNA del modello con una concentrazione di 0,05 molecole per gocciolamento è stato distribuito casualmente in ogni goccia per avviare la sintesi proteica con reazioni di trascrizione e traduzione senza cellule accoppiate. Poiché il numero medio di molecole di DNA per gocciolata era inferiore a 1, alcune goccioline contenevano zero DNA modello, mentre altre contenevano una o più molecole di DNA. Dopo 6 ore di incubazione a RT, l'immagine del punto finale è stata catturata al microscopio. I dati dell'immagine dello stack sono stati analizzati dal software sviluppato con l'aiuto dell'immagine BF dismessasimultanea( Figura 4A-E). L'intensità di fluorescenza di ogni goccia è una misura della resa proteica nella goccia corrispondente. L'istogramma delle intensità di fluorescenza ha mostrato una distribuzione discreta ed è stato ben montato da una somma di distribuzioni gaussiane di intervalli picco-picco uguali (Figura 4F), che ha fortemente suggerito un'occupazione di diversi numeri di molecole di DNA per gocciolamento. Simile al ripetuto gioco di lancio di monete, il numero di eventi casuali indipendenti che si verificano è matematicamente descritto dalla distribuzione di Poisson. La probabilità di trovarsi di goccioline contenenti numeri diversi (fino a 3 in questo esempio) di molecole di DNA è stata perfetta per una distribuzione di Poisson (P - e-e -s sx k / k!, dove il numero medio previsto di molecole di DNA per goccia e k è il numero effettivo di molecole di DNA in una goccia) con una media di 0,05 molecole di DNA per gocciolamento (Figura 4G)31, come previsto per una distribuzione di DNA casuale. Poiché la concentrazione di carico della soluzione di DNA del modello era la stessa dell'ultima soluzione montata su z (cioè 0,05), l'efficienza di reazione cfPS nel nostro FemDA era del 100% (o vicino al 100%). In altre parole, una singola molecola di DNA è sufficiente per innescare la reazione CFPS nella goccia femtolofale in modo efficiente.

La reazione CFPS del fosfofofano alcalina è stata registrata ogni 5 minuti. Il software sviluppato supporta anche l'analisi dei dati del corso di tempo (Figura 5). La reazione fluorogenica accoppiata ha mostrato una distribuzione discreta simile dell'intensità di fluorescenza delle goccioline nei punti temporali precedenti. I risultati dell'istogramma hanno anche verificato un'occupazione di diversi numeri di molecole di DNA nella goccia. L'intensità della fluorescenza alla fine confluì ad un valore insieme al graduale esaurimento del substrato fluorogenico DiFMUP.

Figure 1
Figura 1: Processo di microfabbricazione del substrato di microcamera ad altissima densità. (A) Disegno tecnico del mandrino a vuoto personalizzato. Unità: mm. (B) CYTOP spessore della pellicola vs dati della velocità di rotazione. (C) Rivestimento spin del perfluoropolimero CYTOP su un substrato di vetro silanizzato. Le fotografie hanno mostrato un buon esempio di rivestimento omogeneo e un cattivo esempio di rivestimento inomogeneo, rispettivamente. La freccia nera indicava la posizione specifica della pellicola CYTOP inomogenea. (D) Rivestimento di spin del fotoresist sul substrato rivestito di CYTOP. Dopo il rivestimento di spin, il fotoresist vicino al bordo del substrato deve essere rimosso utilizzando un tergicristallo pulito inonolioso (foto intermedia). Le fotografie hanno mostrato un buon esempio di rivestimento omogeneo e un cattivo esempio di rivestimento inomogeneo, rispettivamente. La freccia bianca indicava la posizione specifica della pellicola fotoresist inomogenea. (E) Esposizione del fotoresist rivestito mediante un aligner maschera. (F) Sviluppo del fotoresist esposto in uno sviluppatore. La parte esposta del fotoresist è solubile nella soluzione per sviluppatori. (G) Incisione reattiva-ione di CYTOP. Il CYTOP scoperto è stato rimosso dal plasma O2. (H)Rimozione della maschera fotoresist. Il fotoresist è stato rimosso da acetone. Il substrato è stato pulito utilizzando 2-propanol e H2O. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Preparazione e utilizzo del dispositivo a microcamera. (A) Pesare l'agente di polimero e prepolimero della PDMS. (B) Versare la miscela mescolata e deaerata in un piatto Petri a nastro. C'erano alcune bolle d'aria appena generate nella miscela di polimeri. (C) Dealare nuovamente la miscela in una camera a vuoto. Le bolle d'aria stavano salendo e scoppiando sulla superficie superiore. (D) La resina PDMS deaerata e curata. (E) Staccare l'elastomero del PDMS curato dal piatto Petri. (F) Tagliare ogni pezzo di blocchi di canale PDMS utilizzando una fresa a cavi piatti. (G) Fori di punzonatura ad ogni estremità del canale PDMS utilizzando un punzone biopsia. (H) Il dispositivo assemblato. La resina PDMS può aderire alla superficie CYTOP. (I) Area della matrice microcamerante traslucida all'interno del canale PDMS riempita con la soluzione acquosa prima del raffreddamento. (J) Area trasparente della matrice microcamera all'interno del canale PDMS dopo il raffreddamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: goccioline di femministie ultrauniformi e ultra-stabili. (A) Scansione laser 3D microscopia confocale per il substrato fabbricato. Le microcamere cilindriche nell'immagine di esempio mostravano un'altezza di 3 m e un diametro di 4 m. (B) Goccioline di femminiter uniformi su una vasta area della gamma planare. Solo un'area parziale dell'intera matrice è stata mostrata qui. In ogni goccia è stata sigillata una soluzione fluorescente (10 -M ATTO-514). (C) La distribuzione delle dimensioni delle goccioline su un intero array. L'intensità della fluorescenza è stata utilizzata come indicatore della dimensione delle goccioline. Il CV era solo del 3%. (D) Misurazione volumetrica utilizzando i dati confocal z-stack del percorso temporale. Il volume delle goccioline sopra l'array è stato dato dal software al microscopio (NIS-Elements, Nikon). (E) Recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento. Dopo il primo fotogramma, diverse goccioline sono state completamente fotosbiancate utilizzando un fascio laser confinato di un microscopio confocale. La loro intensità di fluorescenza è stata registrata per 24 h, e non è stato osservato alcun recupero di fluorescenza (linea rossa). L'intensità di fluorescenza di altre goccioline non fotosbiancate nello stesso campo visivo è stata registrata nella linea nera. Le barre di errore (colori traslucidi) erano 1 SD per ogni punto temporale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Procedura di analisi dei dati dell'immagine microscopica del punto finale. L'immagine di campo luminoso disinnescata è stata utilizzata per estrarre la coordinata di ogni microcamera/gocciolamenti. In base alla differenza di intensità tra il bordo delle microcamere (come primo piano) e altre aree (come sfondo), il bordo continuo e quasi circolare può essere estratto dallo sfondo. A causa della distribuzione in background non uniforme nel campo visivo (A), è in genere necessaria una pre-elaborazione dell'immagine per migliorare la qualità dell'output binario. Dopo aver sottratto lo sfondo (B), lo sfondo di ogni fotogramma è stato uniformemente. Empiricamente, il valore di input nel " Raggio dellapalla rotante" (passaggio 1) era 20-50 per le immagini da 2048 pixel e 10-20 per 512 pixel x 512 pixel. Maggiore è il valore, più breve è il tempo di elaborazione. Per ridurre il disturbo nell'immagine sottratta allo sfondo, applicate un filtro mediano all'immagine (C). In generale, il valore di input nel Raggio (passaggio 3) era 1-2 pixel. Come mostrato nell'inserto ingrandito, l'immagine ingrandita e filtrata può essere ben binaria utilizzando il plug-in di soglia di compilazione in modo che il primo piano corrispondente ai bordi e la regione di interesse (ROI) possa essere riconosciuto con precisione. Il rilevamento dei ROI per tutti i fotogrammi dell'immagine è stato effettuato utilizzando il plugin fatto in casa Installato FemDA Analysis (D). Le dimensioni in pixel (passaggi 5 e 6) e la circolarità (passaggi 7 e 8) delle ROI, i fotogrammi che vogliamo inserire nel calcolo (passaggi 9 e 10) sono stati definiti manualmente in base ai dati effettivi. Dopo aver fatto clic su Genera ROI (passaggio 11) e in attesa, è stata determinata la coordinata di ogni ROI tra i fotogrammi di input. Dopo aver fatto clic sulla maschera Applica ROI (passaggio 12), ogni ROI rilevato è stato racchiuso ed evidenziato da una linea gialla. Dopo aver aperto l'immagine a fluorescenza e aver fatto nuovamente clic sulla maschera Applica ROI, all'immagine a fluorescenza è stata applicata la maschera ROIs determinata. Il numero di pixel superiori (passaggio 14) ha specificato il numero di pixel classificati con intensità superiore di ogni ROI per il calcolo dell'intensità media delle rispettive goccioline. Dopo aver fatto clic su Misura intensità (passaggio 15) e attesa, l'istogramma è stato generato (E). L'istogramma può essere dotato di una somma di distribuzioni gaussiane utilizzando i parametri disponibili nella finestra dell'istogramma. In alternativa, i dati sull'intensità media possono essere esportati in un file di testo (passaggio 16) e analizzati da altri software (F). (G) La probabilità di comparsa di goccioline contenenti diversi numeri di molecole di DNA nell'array specificato. L'istogramma (colore grigio) è stato ben montato da una distribuzione di Poisson (linea tratteggiata rossa) con una media di 0,05 molecole di DNA per goccioline, come previsto per una distribuzione casuale delle molecole di DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi dei dati dell'immagine microscopica del corso temporale. I ROI rilevati (dopo i passaggi da 1 a 12 della figura 4) sono stati applicati direttamente ai dati del corso cronologico. Nel passaggio 13 della figura 4selezionare Time-lapse e immettere l'intervallo di tempo effettivo (in minuti) tra fotogrammi adiacenti in Time-interval [min]. Dopo aver fatto clic su Intensità misura (passaggio 15 della figura 4) e in attesa, sono stati generati il grafico di intensità temporale e l'istogramma (come figura 4E). La posizione Hist specificava il punto temporale dell'istogramma, che veniva mostrato come una linea rossa verticale. Il plugin supporta anche la specifica dei colori per ogni linea di traccia. Giallo: 0 DNA; blu era 1 DNA; rosso: 2 DNA; nero: 3 DNA. I dati del corso cronologico possono anche essere esportati in un file di testo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmato supplementare 1. Clicca qui per scaricare questo film. 

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Discussion

La misurazione altamente quantitativa basata sulle goccioline altamente uniformi, stabili e biocompatibili di FemDA ha permesso la distribuzione discreta, caratteristica unica del nostro studio diversa dalle altre. Abbiamo sistematicamente ottimizzato e dettagliato i processi di microfabbricazione e formazione delle goccioline in questo documento. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo stabilito.

In primo luogo, il rivestimento uniforme del polimero CYTOP altamente viscoso sul substrato rettangolare di vetro sottile determina in gran parte la qualità del substrato risultante. Data la distanza di lavoro generalmente breve della lente obiettivo con ingrandimento elevato (vedere la fase 6.1), è necessario utilizzare il vetro di copertura sottile. Un rivestimento a rotazione di alta qualità su un substrato sottile e flessibile è generalmente difficile. Non abbiamo ancora testato tutti i possibili disegni, ma abbiamo scoperto che il mandrino a vuoto multi-foro con la stessa dimensione rettangolare funzionava bene per il rivestimento di spin. È importante far cadere il polimero CYTOP al centro del substrato di vetro di copertura e avviare immediatamente il rivestimento di spin (vedere il punto 1.3.2). Il grado della difficoltà è meno legato alla forma del substrato, ma alla viscosità del polimero. La linea di prodotti CYTOP offre diverse concentrazioni del pacchetto disponibile in commercio. Il diluente di accompagnamento nella confezione può essere utilizzato anche per diluire il prodotto originale ad una viscosità inferiore, se necessario. CYTOP 816 che abbiamo usato nell'esperimento è il prodotto commerciale con la più alta concentrazione in grado di sciogliere stabilmente il polimero nel solvente. Il rivestimento più spesso richiede una minore velocità di rotazione o più giri di rivestimento e stagionatura. Un grafico di spessore caratteristico rispetto alla curva della velocità di rotazione è altamente raccomandato quando si utilizza un nuovo rivestimento di spin in un nuovo ambiente.

In secondo luogo, l'umidità appropriata della camera pulita è fondamentale per la fotolitografia ideale e la rimozione completa del fotoresist nella posizione specificata. La reazione fotochimica nella fotolitografia utilizza H2O come uno dei reanti. Tuttavia, il softbake alla temperatura superiore alla temperatura di ebollizione di H2O rimuove il contenuto di H2O dal fotoresist rivestito. Il fotoresist "essiccato" deve prendere tempo per assorbire H2O di nuovo dall'aria (vedi passo 1.4.6). Questo punto è spesso trascurato. Dato che molti laboratori possono avere solo alcune strutture per la pulizia semplificate senza controllo dell'umidità, l'umidità fluttuerebbe drasticamente durante la stagione o verrebbe influenzata dalle condizioni meteorologiche. Una soluzione a basso costo consiste nell'utilizzare un umidificatore o un deumidificatore per uso domestico nella camera pulita. Lo strato CYTOP completamente esposto dopo lo sviluppo può essere rimosso in modo selettivo e completamente da RIE, esponendo completamente il fondo di vetro. Alla fine, la struttura ibrida del fondo di vetro idrofilo e della parete laterale civetta CYTOP idrofobica è importante per intrappolare stabilmente la soluzione acquosa allo spazio femtolitro.

In terzo luogo, gli oli appena trovati (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) e surfactant (SURFLON S-386) hanno mostrato prestazioni di sigillamento senza precedenti per il reattore fluoropolimero13. L'iniezione dell'olio di scarico deve essere effettuata sul blocco metallico piatto refrigerato (vedere il punto 5.2); in caso contrario, non è possibile formare goccioline vicino all'ingresso del canale. L'iniezione del secondo olio di saltellazione può essere effettuata a RT (vedi fase 5.5). Questi oli e surfactants non sono mai stati utilizzati nella ricerca biologica prima d'ora. Per il momento non sono state trovate alternative migliori. Per ampliare l'arsenale dell'utile combinazione di oli e surfactants per la preparazione delle goccioline, il nuovo membro degli oli (o quelli simili nella stessa linea di prodotti) e il surfactant (o quelli simili nella stessa linea di prodotti) sono degni di cercare di essere applicati nei sistemi di goccioline microfluidiche.

Qui ci sono due punti aggiuntivi da notare. Uno è il fatto che c'è un ritardo tra i ROI durante l'imaging a microscopia. Il tempo totale di imaging per un ciclo dipende principalmente dalle dimensioni dell'array e dall'ingrandimento dell'obiettivo. Anche il tempo di esposizione, la velocità dell'otturatore e la velocità di movimento dello stadio motorizzato sono fattori minori. Come regola generale, l'imaging di 106 goccioline con un ingrandimento di oltre 60 anni richiederebbe almeno 10-20 minuti. Questo inevitabile lasso di tempo introduce alcuni errori nell'analisi dei dati, che dovrebbero sempre essere presi in considerazione. L'altro è il fatto che il numero totale di goccioline su un singolo substrato non supererebbe 108–109, aumentando anche la densità delle goccioline o riducendo la dimensione individuale della gocciolina. Questo perché la dimensione del substrato di vetro che può essere gestito dall'aligner della maschera (per wafer da 4 pollici) è limitata. Aumentare ulteriormente le dimensioni del vetro di copertura non è raccomandato perché un substrato di vetro grande, sottile e fragile è difficile da gestire.

FemDA può essere considerato come una piastra microtitera super miniaturizzata. Eventuali reazioni biochimiche che sono state effettuate in piastre di microtitori 96-bene potrebbe essere cercato di condurre utilizzando FemDA. Può sicuramente essere utilizzato per la misurazione dell'attività enzimatica senza complicata purificazione delle proteine. Potrebbe anche essere compatibile con la reazione a catena polimerasi digitale (PCR digitale) e l'analisi immunosorbenaria digitale legata agli enzimi (ELISA) digitale31,49. Il piccolo volume, l'array di grandi dimensioni e l'elevata stabilità porterebbero alcuni vantaggi rispetto ai metodi di bioanalisi digitale esistenti. Il sistema FemDA in grado di risolvere diversi numeri di molecole di DNA modello nelle goccioline di femtolitro ha già mostrato la potenza sullo screening accurato delle proteine13. FemDA è un nuovo sistema di compartimentazione in vitro in grado di evolvere rapidamente una varietà di enzimi. Con i progressi della bioinformatica e delle tecniche di costruzione delle librerie, l'era di una rapida creazione on-demand di proteine ad alte prestazioni sarà sicuramente venuta.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal numero di sovvenzione JP18K14260 di JSPS KAKENHI e dal bilancio dell'Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia della Terra dei Animali. Ringraziamo Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) per aver fornito le strutture di caratterizzazione. Ringraziamo Ken Takai (JAMSTEC) per il supporto software commerciale. La microfabbricazione è stata condotta presso Takeda Sentanchi Supercleanroom, L'Università di Tokyo, sostenuta da "Nanotechnology Platform Program" del Ministero dell'Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia (MEXT), Giappone, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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Chimica Numero 160 Microfabbricazione gocciolina femtolitro sintesi proteica priva di cellule proteina fluorescente enzima singola molecola distribuzione di Poisson analisi delle immagini compartimentazione in vitro
Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo
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Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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