Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Массив капли Femtoliter для массивно параллельного синтеза белка от одиночных молекул дна

Published: June 20, 2020 doi: 10.3791/60945
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Summary

Общая цель протокола состоит в том, чтобы подготовить более миллиона упорядоченных, однородных, стабильных и биокомсуатимных капель фемтолитров на 1 см2 планарного субстрата, который может быть использован для синтеза белка без клеток.

Abstract

Достижения в области пространственного разрешения и чувствительность к обнаружению научных приборов позволяют применять небольшие реакторы для биологических и химических исследований. Чтобы удовлетворить спрос на высокопроизводительные микрореакторы, мы разработали устройство для капель femtoliter (FemDA) и стали примером его применения в массово параллельных реакциях на синтез белка без клеток (CFPS). Более одного миллиона однородных капель были легко сгенерированы в области размером с палец с помощью двухступенчатого протокола уплотнения масла. Каждая капля была поставлена на якорь в микрохоморе femtoliter, состоящей из гидрофильных дна и гидрофобной боковины. Гибридная гидрофильная в гидрофобной структуре и выделенные герметичные масла и сурфаканты имеют решающее значение для стабильного сохранения эффективного раствора в пространстве фемтолитров без потери испарения. Конфигурация фемтолитров и простая структура устройства FemDA позволили минимальное потребление реагентов. Равномерное измерение капельных реакторов сделало крупномасштабные количественные и временные измерения убедительными и надежными. Технология FemDA соотнесла выход белка реакции CFPS с количеством молекул ДНК в каждой капле. Мы упростили процедуры микрофабрики устройства, формирования капель фемтолитров, а также приобретения и анализа микроскопических данных изображения. Подробный протокол с оптимизированной низкой стоимостью работы делает технологию FemDA доступной для всех, кто имеет стандартные помещения для очистки и обычный флуоресценционный микроскоп на своем месте.

Introduction

Исследователи используют реакторы для проведения би/химических реакций. Предпринимаются значительные усилия по уменьшению размеров реактора и увеличению экспериментальной пропускной способности в целях снижения потребления реагентов при одновременном повышении эффективности работы. Оба аспекта направлены на освобождение исследователей от большой нагрузки, снижение затрат и ускорение научных исследований и разработок. У нас есть четкая историческая дорожная карта о развитии реакторных технологий с точки зрения объемов реакции и пропускной способности: одиночные стаканы/колба/тест-трубы, миллилитровые трубки, микролитровые трубки, микролитр 8-трубчатые полоски, микролитр 96/384/1536-ну пластины, и микрофлуидные нанолитые/пиколитр/фемтотир реакторы1,2,,3,4,5,6,7. По аналогии с сокращением размера функции транзисторов на интегральных микросхемах в полупроводниковой промышленности в последние десятилетия, био/химические микрореакторы проходят через сокращение объема и системную интеграцию. Такие мелкомасштабные инструменты оказали глубокое влияние на клеточной или клеточной синтетической биологии, биоучтумагажества, и высокой пропускной способности прототипирования и скрининга8,9,10,11,12. В этой статье описаны наши недавние усилия по разработке уникальной технологии массива капель и демонстрирует его применение в CFPS13, фундаментальной технологии для синтетической биологии и молекулярного скрининга сообществ14. В частности, мы намеренно предоставляем оптимизированный и недорогой протокол, чтобы сделать устройство FemDA доступным для всех. Недорогой и простой в обращении протокол для миниатюрного устройства будет способствовать образовательным целям университетов и поможет распространению технологии.

FemDA готовит капли фемтолитров при сверхвысокой плотности 106 на 1 см2 на планарном стеклянном субстрате. Мы покрыли гидрофобный полимер, CYTOP15, на стеклянном субстрате и выборочно травления (удалены) CYTOP на предопределенных позициях для создания микропамббер массива на субстрате. Таким образом, полученная микрохожная находится в гидрофобной боковине (CYTOP) и гидрофильной нижней (стеклянной). При последовательном течет вода и масло по узорной поверхности, вода может быть захвачена и запечатана в микрочастам. Гидрофильные в гидрофобной структуре имеет жизненно важное значение для отражения воды за пределами микрокамберов, изоляции отдельных микрореакторов и сохранения крошечного aqueous раствора внутри пространства фемторитера. Уникальное свойство было успешно применено для подготовки капель в масле и липидных биспаретов16,,17. По сравнению с прототипом устройства16,мы сначала оптимизировали процесс микрофабрикации, чтобы реализовать полное удаление полимера CYTOP, а также полную экспозицию дна стекла. CYTOP является специальным фторполимером с чрезвычайно низким поверхностным натяживанием (19 мн/м) ниже, чем у обычных микрореакторных материалов, таких как стекло, пластмассы и силикон. Его хорошие оптические, электрические и химические характеристики уже были использованы в поверхностной обработке микрофлюидных устройств18,,19,20,,21,,22,23,24. В системе FemDA, для достижения хорошего смачивания нефти на поверхности CYTOP, поверхностное натяжение масла должно быть ниже, чем у твердой поверхности25. В противном случае жидкое масло, соприкасающееся с твердой поверхностью, имеет тенденцию становиться сферическим, а не распространяется по поверхности. Кроме того, мы обнаружили, что некоторые популярные перфторуглеродные масла (например, 3М ФК-40)16 и гидрофторетерные масла (например, серия 3M Novec) могут растворить CYTOP в результате аморфной морфологии CYTOP, которая является фатальной для количественного измерения и будет сомнительной с точки зрения перекрестного загрязнения среди капель. К счастью, мы определили биосовместимые и экологически чистые масла, демонстрирующие более низкое (Зтт; 19 мН/м) поверхностное натяжение13. Мы также нашли новый сурфактант, который может растворяться в выбранном масле и функционировать в низкой концентрации (0,1%, по крайней мере в 10 раз ниже, чем ранее сообщалось популярных26,27)13. Полученный интерфейс воды/масла может быть стабилизирован сурфактантом. Из-за высокой скорости испарения масла, после заподлицо с маслом, мы применили другое биосовместимое и экологически чистое масло, чтобы заменить первое, чтобы запечатать микрочабры. Мы называем первое масло (ASAHIKLIN AE-3000 с 0,1 WT % SURFLON S-386) «флеш-маслом», а второе масло (Fomblin Y25) «уплотниющим маслом», соответственно.

Двухступенчатая стратегия уплотнения масла может реализовать надежное формирование массива капли femtoliter в течение нескольких минут и без сложных приборов. Из-за проблемы испарения, было сочтено сложным для создания микрореакторов меньше, чем пиколитикон объемов28. FemDA рассмотрела этот вопрос путем систематической оптимизации материалов и процессов, используемых для подготовки микрореакторов/капель. Некоторые примечательные особенности результирующей капли включают высокую однородность (или монодисперсность), стабильность и биосовместимость в масштабе фемтолитров. Коэффициент вариации (CV) объема капель составляет всего 3% (без коррекции виньетирования для микроскопических изображений), наименьшее резюме среди капельных платформ в мире, которое обеспечивает высоко параллельные и количественные измерения. Капли фемтолитров стабильны в течение по крайней мере 24 часов без перекрестного загрязнения среди капель при комнатной температуре, что ценно для надежного измерения времени курса. Что касается биосовместимости, нам удалось синтезировать различные белки из одной копии шаблона ДНК в капли фемтолитров, которые ранее считались трудными или неэффективными29,30. Было бы достойно выяснить, почему некоторые белки, способные быть синтезированы в FemDA не могут быть синтезированы в других системах капель. FemDA не только технический прогресс, но и реализован беспрецедентно количественные измерения, которые могут соотнести выход белка (как это отражено интенсивностью флуоресценции капель) на количество шаблонных молекул ДНК в каждой капельке. В результате гистограмма интенсивности флуоресценции капель от CFPS на основе FemDA показала дискретное распределение, которое может быть красиво установлено на сумму гауссианской дистрибутивов равных интервалов пик-пик- до пика. Кроме того, вероятность возникновения капель, содержащих разные числа молекул ДНК, идеально подходила для распределенияПуассона 31. Таким образом, различные урожаи белка в каждой капле могут быть нормализованы на основе дискретного распределения. Эта важная функция позволяет отделить информацию о ферментативной активности от очевидной интенсивности, которая еще не была доступна с другими платформами микрореакторов. Существующие микрофлюидные клетки / капли сортировок системы квалифицированы в полностью автоматической сортировки и хорошо концентрировать образцы, но иногда может только выход относительно широкий или длиннохвостый гистограмма в аналитическом аспекте32,33. Наша высококолическая и биосовместимая система FemDA устанавливает новый эталон и высокий аналитический стандарт в области разработки микрореакторов.

Масла и сурфактанты, которые могут быть использованы для приготовления капель по-прежнему очень ограничены34. Сочетание ASAHIKLIN AE-3000 и SURFLON S-386, созданного в FemDA, является новым членом растущего арсенала физиохимического интерфейса между аквеимой фазой и фазой13масла. Новый интерфейс в FemDA физически стабилен, химически инертен и биологически совместим со сложной транскрипцией, переводом и посттранстрансловальной модификацией для многих видов белков13. Было бы довольно привлекательным, чтобы найти белок, который не может быть синтезирован в настройках капель вместо. Кроме того, экономия реагентов более очевидна в системе капель фемтотир, чем в нанолитых и пиколитовых реакторных системах35,,36. В частности, часто будет большой мертвый объем, который в основном вызван трубами или внешними поставками, в системах генерации капель микрофлюид, но не в нашей FemDA. Формат массива также благоприятствует повторной и подробной микроскопической характеристике (по аналогии с так называемым анализом высокого содержания) для каждого реактора37,а не только одним моментальным снимком для быстро движущегося объекта. Масштаб фемторитера позволил интегрировать более одного миллиона реакторов на площади размером с палец, в то время как такое же количество реакторов нанолилитров (если она существует) требует площади более квадратного метра, что, несомненно, было бы нецелесообразно производить или использовать такую систему.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Микрофабрика субстрата микрокамббера femtoliter

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите следующий эксперимент микрофабрика в уборной. Носите перчатки и костюм для уборки перед входом в уборную.

  1. Очистка крышки стеклянный субстрат
    1. Установите крышку стекла на крышку стекла окрашивание стойки. Sonicate крышку стекла в 8 М гидроксида натрия (NaOH) в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
      ВНИМАНИЕ: NaOH в высоких концентрациях очень опасен для кожи и глаз. Аккуратно обработайте его без каких-либо всплеск.
    2. Возьмите стойку из раствора NaOH и промойте крышку стекла с помощью воды в течение десяти раз. Храните крышку стекла в чистой воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отбросьте щелочные отходы в назначенный резервуар. Решение NaOH можно перерабатывать в оригинальную бутылку и использовать до пяти раз.
    3. Высушите каждый кусок крышки стекла с пневматическим ударом пушки.
    4. Выпекать высушенный стакан крышки на горячей тарелке при температуре 200 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Держите ориентацию верхней стороны стеклянного субстрата последовательной во время следующих процессов обработки.
  2. Силанизация стеклянной поверхности
    1. Сбросьте очищенное стекло крышки на сухую стойку окрашивания.
    2. Добавьте 150 мл этанола в стакан PTFE. Используйте иглу (22 G x 70 мм), оборудованную 1 мЛ шприц, чтобы нарисовать 0,075 мл (3-аминопропил) триэтоксисилана и немедленно ввести его в этанол (т.е. 0,05 тыс. т.). Вытяните и нажмите шприц несколько раз, чтобы промыть внутри шприца. Перемешать раствор с иглой, чтобы сделать его однородным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (3-аминопропил) триэтоксисилана может храниться при комнатной температуре и 1 атм давление в течение двух лет с жесткой уплотнения. Абсолютный этанол должен быть плотно запечатан после использования. Мы не рекомендуем использовать просроченные реагенты.
    3. Инкубировать крышку стекла в 0,05 vol % % аминосилана раствор для 1 ч на RT.
    4. Промыть крышку стекла с помощью чистой воды в течение пяти раз. Храните крышку стекла в чистой воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отбросьте отходы в назначенный резервуар.
    5. Высушите каждый кусок крышки стекла с пневматическим ударом пушки.
    6. Поместите все высушенные крышки стекла на алюминиевой фольге. Выпекать крышку стекла на горячей тарелке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
  3. Спин-покрытие CYTOP перфторополимер
    1. Поместите крышку стекла на индивидуальные вакуумные патрон спина пальто (Рисунок 1A). Включите вакуумный переключатель, чтобы исправить стеклянный субстрат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция вакуумного патрона имеет решающее значение для равномерного покрытия вязкого полимера на прямоугольном (24 мм и 32 мм) и тонком (0,13-0,17 мм) субстрате(рисунок 1A). Мы обнаружили, что прямоугольный образец этапе с несколькими отверстиями (48 отверстий, каждый с 1 мм диаметром), подключение к вакуумному каналу работал лучше, чем круглая стадия с одним центральным отверстием сделал.
    2. В центре стеклянного субстрата опустите 70-90 мл полимера типа A CYTOP. Немедленно спин-шерсть полимера(рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние спин-покрытия (3400 об/мин, 30 с) обеспечивает толщину 3 мкм. Используйте микропиетту, предназначенную для вязкой жидкости. Держите микропипетт в вертикальном положении, чтобы полимер падение почти идеально круг на субстрате. Воздушный пузырь часто генерируется внутри кончика пипетки, как поршень движется вниз. Не уронить последнюю каплю CYTOP с пузырем.
    3. Возьмите в сторону покрытием стекло пальцами, держащими углы стеклянного субстрата, и поместите его на алюминиевую фольгу.
    4. Повторите шаги 1.3.1-1.3.3, чтобы спина-пальто все оставшиеся части крышки стекла.
    5. Выпекать стакан с покрытием при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут, а затем при температуре 200 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта обработка полностью лечит CYTOP и ковалентно связь CYTOP на поверхности стекла. Обложка области выпечки с крышкой из алюминиевой фольги, чтобы избежать потенциальной пыли во время длительного процесса выпечки, если это необходимо.
    6. Снимите МОЗООотно-покрытый крышкой из плиты и охладите до RT. Тщательно возьмите каждый кусок покрытого стекла и осмотрите его, чтобы увидеть, правильно ли оно покрыто. Откажитесь от субстрата, демонстрирующего неоднородное покрытие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность красиво покрытием CYTOP должна выглядеть плоской без нерегулярных радуги, как узоры (Рисунок 1C). Визуальный осмотр под правильным углом может быстро судить о плоскости, а также качество покрытия. Протокол можно приостановить здесь.
  4. Спин-покрытие фотореалист
    1. Поместите стекло крышки с покрытием CYTOP на вакуумный патрон (см. шаг 1.3.1) спинового пальто. Включите вакуумный выключатель, чтобы зафиксировать крышку стекла.
    2. Падение 0,2-0,3 мл фотореалиста в центре субстрата. Сразу спин-шерсть фотореалиста при 6000 об/мин за 60 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не уроньте последнюю каплю фотореалиста с пузырьками. Если спин пальто поддерживает более высокую скорость спина, скорость спина может быть до 7500 об/мин для достижения более тонкого покрытия. Низкая поверхностная энергия CYTOP предотвращает присоединение большинства фоторесим к ее поверхности. Если фотореалист АЗ P4903 недоступен, фотореалист АЗ P4620 является хорошей альтернативой.
    3. Возьмите покрытый субстрат двумя пальцами, держащими углы субстрата. Протрите избыток фотореалиста возле края субстрата (часто называемого удалением миской воды или ЕБР) с помощью пропитаемого этанолом чистого стеклоочистителя(рисунок 1D). Поместите субстрат на алюминиевую фольгу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетон НЕ рекомендуется для ЕБРР.
    4. Повторите шаги 1.4.1-1.4.3, чтобы спин-пальто фотореалист для остальных частей МОЗООП покрытие стекла. Возьмите каждый кусок стекла с покрытием и проверить его, чтобы увидеть, если он правильно покрытием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность красиво покрытием фотореалист должен выглядеть плоским без нерегулярных моделей (Рисунок 1D). Визуальный осмотр под правильным углом может быстро судить о плоскости, а также качество покрытия. Субстрат, демонстрирующий неоднородное покрытие, может быть переработан путем мытья с ацетоном, 2-пропанолом и H2O в последовательности, и повторно.
    5. Выпекать покрытие субстрата при температуре 110 градусов по Цельсию в течение 5 минут на плите.
    6. Снимите покрытый субстрат с плиты и охладите до RT. Давайте стоять 30 мин при относительной влажности 40%-60% для регидратации фотореалиста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: H2O необходим для следующей фотохимической реакции. Запеченный фотореалист потерял содержание H2O внутри фоторесиста. Процесс регидратации позволяет H2O поглощаться из воздуха. Относительная влажность ниже 20% или выше 80% не подходит для процесса регидратации.
  5. Фотолитография
    1. Во время ожидания регидратации (см. шаг 1.4.6) запустите выравнивание маски. Разогрейте источник света. Загрузите хромированную фотомаск.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкции для работы с маской выравнивания. Фотомаск может быть изготовлен с помощью литографии электронного луча (EB), если объект EB доступен. Кроме того, фотомаск может быть передана на аутсорсинг местной компании.
    2. Загрузите регидратированный субстрат (после финиша шаг 1.4.6) на патрон(рисунок 1E).
    3. Установите параметры экспозиции. Выставить субстрат на 25 с интенсивностью УФ-излучения 13 мВт/см2 (h-line) в режиме вакуумно-контакта. Затем выгрузите субстрат и установите его на крышку стеклянной окрашивающей стойкой (та же стойка используется в шаге 1.1.1).
    4. Повторите шаги 1.5.2-1.5.3, чтобы выявить оставшиеся части регидратированного субстрата.
  6. Развития
    1. Разработайте субстрат в течение 5 минут, чтобы растворить разоблаченный фоторесист(рисунок 1F). Во время которого аккуратно встряхните стойку у разработчика один раз в точку времени 4 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разработчиком был АЗ 300 MIF. Альтернативные щелочные разработчики (например, АЗ 400 К) обычно применимы для разработки, но должны требовать оптимизации условий разработки (например, времени, температуры, агитации). НЕ используйте стеклянные стаканы в качестве контейнера разработчика.
    2. Промыть субстрат с помощью чистой воды в десять раз. Храните крышку стекла в чистой воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Откажитесь от разработчика к назначенному танку.
    3. Тщательно высушите каждый кусок субстрата с пневматическим ударом пушки.
  7. Реактивно-ионный офорт
    1. Поместите высушенный субстрат (от шага 1.6.3) в реакционную камеру машины реактивно-иона (RIE).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с правилом технического обслуживания объекта, машина RIE может быть либо всегда, либо выключаться каждый раз. Если выключатель был выключен, включите выключатель в соответствии с руководством.
    2. Etch фоторесвист-расчехленный CYTOP с плазмой O2 (Рисунок 1G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условие RIE было следующим. O2 скорость потока газа: 50 см; давление камеры: 10.0 Па; Мощность РФ: 50 Вт; время офорта: 27 мин. Время офорта было оптимизировано для полного травлирования 3 мкм толщиной CYTOP.
    3. Возьмите каждый кусок субстрата из реакционой камеры с помощью пинцета и поместите их на крышку стеклянной окрашивающей стойке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с правилом технического обслуживания объекта, камера реакции может потребовать короткого O2 плазменной очистки процесса (например, время травсы: 5 мин), чтобы держать камеру реакции чистой после каждого запуска.
  8. Удаление фоторесиста и очистка
    1. Sonicate субстрата в ацетон в течение 5 минут на RT, чтобы растворить оставшихся фоторезиста.
    2. Sonicate субстрата в 2-пропанол в течение 5 минут на RT.
    3. Промыть субстрат с помощью чистой воды в течение пяти раз. Sonicate субстрата в течение 5 минут на RT. Промыть образец с помощью чистой воды еще пять раз. Держите субстрат в чистой воде.
    4. Высушите каждый кусок субстрата с пневматическим ударом пушки (Рисунок 1H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субстрат можно хранить в пластиковой чашке Петри. Изготовленный субстрат структурно стабилен на RT, по крайней мере один год. Протокол можно приостановить здесь.
    5. Охарактерировый профиль подготовленного субстрата — трехмерным (3D) лазерным сканированием конфокальной микроскопии, интерферометрией белого света (или когерентной сканированием интерферометрии) или сканирующей электронной микроскопией. Используйте соответствующее программное обеспечение для измерения диаметра и глубины полученных микрохем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец может быть повторно обнаружен для других экспериментов после характеристики с бесконтактным и неразрушающим 3D лазерным сканированием конфокального микроскопа или белого светоинтерферометра. Протокол можно приостановить здесь.

2. Приготовление микроканала полидилсилоксана (PDMS)

ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ носите латексные перчатки для обработки PDMS. Вместо этого, носить полиэтиленовые (PE) перчатки.

  1. Создание микроканаля мастера
    1. С помощью настольного резака с двойным покрытием пленки Kapton вырежьте микроканальную ленту с двойным покрытием Kapton в определенную (3 мм x 19 мм) форму микроканаля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лента Kapton была No 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), в результате чего высота канала 135 мкм. Настольный резак STIKA использует плагин (доступен с веб-сайта Roland: https://www.rolanddga.com) Adobe Illustrator для запуска резки в соответствии с рисунком в файле Adobe Illustrator. Протокол можно приостановить здесь.
    2. Stick каждый разрез Kapton ленты на плоском дне чашки Петри. Стандартная 90-мм чашка Петри может вместить 12 кусков ленты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рельефная структура служит мастером для реплики литья PDMS. Нажмите на поверхность ленты осторожно с помощью пинцета, если есть какие-либо пузырьки воздуха зажатой между лентой и подложкой чашки Петри. Кроме того, классическая мягкая литография может быть применена для подготовки мастера на кремниевой пластине38. Протокол можно приостановить здесь.
  2. Лечение смолы PDMS в ленточный петри блюдо
    1. Носите новые перчатки PE, и передать 2,5 г отлечающего агента SYLGARD 184 силикона эластомера с помощью одноразового пластикового пипетки в указанный пластиковый стакан (Рисунок 2A).
    2. Превратитетесь в новые перчатки и перенесите 25 г преполимерной базы SYLGARD 184 силиконового эластомера с помощью одноразового 50-мЛ шприца в вышеуказанный пластиковый стаканчик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение перчатки здесь, чтобы предотвратить потенциальное перекрестное загрязнение отверждения агента на базу.
    3. Используйте деаэрацивный миксер, чтобы смешивать и деаэрировать смесь (программа: 3 мин смешивания следуют 2 мин деаэрации).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если деаэрационный смеситель недоступен, вручную взволнованная (около 15 мин) смесь может быть дегазация в вакуумной камере.
    4. Налейте смесь PDMS в ленту узором Петри блюдо (Рисунок 2B). Установите чашку Петри в мини-вакуумную камеру и деарат pdMS смесь для 1-3 ч (Рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо воздух остается в смеси PDMS после 1 ч, возьмите чашку Петри из вакуумной камеры, разорвать воздушный пузырь с помощью воздуходувки, а затем положить блюдо Петри обратно в вакуумную камеру и продолжить процесс деаэрации.
    5. Поместите чашку Петри в духовку при температуре 60 градусов по Цельсию на ночь, чтобы вылечить PDMS (Рисунок 2D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя повышение температуры может сократить время лечения, максимальная температура, которая может быть допущена по полистирола Петри блюдо без физической деформации составляет около 60 градусов по Цельсию.
  3. Реплика формования канала PDMS
    1. Очистите вылеченный PDMS эластомер из чашки Петри (Рисунок 2E).
    2. Отрежьте каждый кусок блоков канала PDMS с помощью плоского кабеля резак (Рисунок 2F).
    3. Поместите Elastomer PDMS на режущий коврик, обращенный к стороне канала вверх. Пробить отверстие на каждом конце канала с помощью биопсии удар (Рисунок 2G).
    4. Очистите поверхность канала PDMS скотчем. Затем оберните смолы PDMS в другой кусок скотч ленты, чтобы держать его в чистоте перед использованием. Храните подготовленный канал PDMS в чистой чашке Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.

3. Сборка фемтолитрового микрохамберного массива

  1. Поместите несколько кусочков пропитанных водой чистых стеклоочистителей вдоль внутренней стены чашки Петри, чтобы сделать упрощенную увлажняющую камеру. Поместите смолу PDMS, покрытую скотчем, в увлажняющую камеру и запечатайте камеру с помощью парафиновой пленки. Инкубировать не менее 3 ч, но не более чем на день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS является пористым материалом, который позволяет газу проходить через смолу39. Пористая структура PDMS приводит к поглощению молекул воды из окружения до достижения равновесия. Эта предварительная обработка заполняет поры PDMS водяным паром и может значительно подавить испарение аквимовых капель, прилегающих к краю канала PDMS.
  2. Сними скотч с смолы PDMS. Расположите канал PDMS на области массива микрокамббера субстрата(рисунок 2H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смола PDMS реверсивно прилипает к поверхности CYTOP. Нажмите блок PDMS осторожно с помощью пинцета, чтобы удалить любые пузырьки воздуха между смолой PDMS и субстратом, если он существует.
  3. Вставьте 200-х мл нефильтрованного наконечника пипетки к одному (как выход) отверстий канала PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прочность сцепления между PDMS и CYTOP ограничена. Чтобы избежать физической деформации смолы PDMS, а также отсоединения канала PDMS от поверхности, не вставляйте наконечник пипетки слишком глубоко.

4. Загрузка решения реакции на собранное устройство

  1. Положите алюминиевую микротрубку на лед. Prechill флеш-масло (ASAHIKLIN AE-3000 масло смешивается с 0,1 WT % SURFLON S-386 сурфактант) в 1,5 мл микротрубки на алюминиевой подставке.
  2. Положите еще один алюминиевый блок на лед.
  3. Подготовка решения реакции CFPS
    1. Подготовьте раствор реакции CFPS в трубке ПЦР. Смешайте каждый компонент aliquot комплекта CFPS, разбавленный шаблон ДНК (как свидетельствует здесь флуоресцентный белок mNeonGreen40 и Escherichia coli щелочной фосфатазы41) раствор, и другие необходимые компоненты в соответствии с конкретными потребностями (например, RNase, фторгенный субстрат, сопровождающий).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон ДНК, используемый для CFPS, должен быть подготовлен в соответствии с инструкцией соответствующего комплекта CFPS. Эта демонстрация применяется T7 основе системы выражения42. Поскольку потребление реагентов в устройстве FemDA довольно небольшое, 10 мл достаточно большой, чтобы заполнить весь канал PDMS.
    2. Для синтеза флуоресцентного белка mNeonGreen смешайте компоненты в следующем порядке: добавьте 2,7 л нуклеазы H2O к 6-х аликоту раствора А (из комплекта CFPS); добавить 0,3 л ингибитора RNase; добавить 1,5 л разбавленного шаблона ДНК-раствора; кратко перемешать и передать смесь в 4,5-х м aliquot раствора B (из комплекта CFPS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем составляет 15 мл. Поскольку количество каждого аликоты пропорционально общему объему конечной смеси, общий объем менее 10 мл может привести к слишком небольшому объему (Зтл; 0,2 л) некоторых компонентов.
    3. Для синтеза щелочной фосфатазы смешайте компоненты в следующем порядке: добавьте 1,2 л H2O к 6 мл раствора А; добавить 0,3 л ингибитора RNase; добавить 0,6 л дисульфидного усилителя облигаций 1 и 2 (из комплекта); добавить 0,3 л 5 мл 6,8-дифтор-4-метилумбеллиферил фосфат (DiFMUP); добавить 1,5 мл ДНК раствора; кратко перемешать и передать смесь в 4,5 мл раствора B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе щелочной фосфатазы, флюорогенный субстрат DiFMUP может производить высоко флуоресцентные 6,8-дифтор-7-гидрокси-4-метилкоумарин (DiFMU) при ферментативном расщеплении терминальной фосфатной группы.
  4. Составите 10 мл смеси с помощью 200-х фильтруемого наконечника пипетки. Вставьте наконечник пипетки к отверстию входа (обратитесь к шагу 3.3) канала PDMS. Нажмите вниз на поршень, чтобы ввести решение канала, пока он не переполняет от розетки (где другой наконечник пипетки уже был вставлен на шаг 3.3).
  5. Отделите пипетка от наконечника пипетки и держите эти два наконечника пипетки все еще вставленными в вход и розетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте генерации пузырьков воздуха во время трубы. Не оставляйте большой палец от поршень до отделения пипетки от наконечника пипетки, чтобы предотвратить обратный поток раствора внутри канала PDMS.

5. Генерация массива капли фемтолитров (FemDA) для CFPS

  1. Перенесите весь комплект собранного устройства в предварительно охлажденный алюминиевый блок (см. шаг 4.2). Тщательно подтвердите, что область массива микрокамббера быстро превращается из полупрозрачного(рисунок 2I)в прозрачный (Рисунок 2J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решение реакции CFPS не может прямо войти в микрочастамы. Растворимость воздуха в воде обратная пропорция к температуре. Захваченный воздух растворится в растворе после того, как устройство было перемещено с RT на низкую температуру. Изменение прозрачности является удобным визуальным индикатором, чтобы судить о том, входит ли решение в микростаб.
  2. Нарисуйте 30 мл предварительно охлажденного флеш-масла (см. шаг 4.1), и немедленно перенесите масло в вставленный наконечник пипетки с его верхнего отверстия. Флеш-масло перемещается в канал и выдавливает избыток реакционого раствора, расположенного за пределами микрокамберов. Каждая микрокамбера изолирована флеш-маслом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Видим движущийся интерфейс между раствором реакции и флеш-маслом, который помогает людям наблюдать за движением жидкости внутри канала. Экструдированный раствор можно собирать в предыдущую трубку, хранить при 4 градусах Цельсия и повторно испровываться для другого устройства FemDA или параллельной реакции навалом (в микротрубке или пластине микротитера).
  3. Предварительно нарисуйте 30 мл уплотнительного масла (Fomblin Y25) до наконечника фильтрованной пипетки на 200 мл. Повесьте пипетки в вертикальном положении где-то.
  4. Одновременно снимите с устройства два вставленных наконечника пипетки (см. шаги 3.3 и 4.4). Немедленно переместите устройство с алюминиевого блока на парапленку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пинцет, чтобы исправить (но держаться подальше от области канала) устройство на алюминиевом блоке в период удаления пипетки советы.
  5. Немедленно вставьте готовый наконечник пипетки, содержащий уплотнительное масло (см. шаг 5.3) в вход канала PDMS, и введите масло в канал, пока он не переполнится из розетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг, как только перемещение устройства на RT. Чтобы предотвратить обратный поток внутри канала, не оставляйте большой палец от поршень до тех пор, пока уплотнетельное масло переполнения из розетки. Флеш-масло испаряется сразу после выхода из розетки канала, в то время как следующее уплотнетельное масло накапливается в розетке из-за его крайне низкой потери испарения.
  6. Отделите пипетки от наконечника пипетки, а затем удалите наконечник пипетки с устройства. Очистите поверхность PDMS с помощью части чистого стеклоочистителя, а затем применить новую каплю герметичного масла на вход и розетку, соответственно. Капли фемтолитров запечатаны в отдельные микрочамбы маслом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пинцет, чтобы исправить (но держаться подальше от области канала) канал PDMS на субстрате в период удаления микропиетт наконечник.
  7. Протрите влагу, накопленную на нижней поверхности крышки стекла. В качестве подготовленного устройства FemDA теперь готов к инкубации и микроскопии.

6. Микроскопия изображений

  1. Запустите перевернутый флуоресценционный микроскоп. Дождитесь стабилизации (охлаждения) камеры. Используйте объектив для погружения в масло 60x или 100x. Установите устройство FemDA на моторизованной сцене. Установите параметры изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры изображения включают в себя путь файла, каналы визуализации, фильтры, время экспозиции (в целом, 100 мс достаточно; короче или больше времени также возможно в соответствии со спецификацией камеры), и интенсивность света.
  2. Найдите фокусную плоскость. Отрегулируйте положение z-оси объектива и зафиксируйте фокусную плоскость с помощью внутренней системы автофокусировки. Установить интересующий регион (ROI; т.е., x, y-axis) для изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основные производители микроскопов (Nikon, Olympus, Зейсс, Leica) все предоставляют возможность интеграции системы автофокусировки с микроскопом. Эта система автофокусировки необходима для поддержания постоянной фокусной плоскости во время автоматической многозонной визуализации. ROIs охватывает область FemDA в канале PDMS.
  3. Захват изображений флуоресценции. Захват одного кадра дефокусированного изображения яркого поля (BF) для каждого рентабельности инвестиций. НЕ меняйте порядок и координаты ROIs при визуализации различных каналов.

7. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте данные изображения с помощью домашнего плагина (под названием "FemDA") на основе Фиджи (http://fiji.sc), чтобы извлечь интенсивность флуоресценции каждой капли43. Установите правильную версию Фиджи в соответствии с операционной системой. Фиджи поддерживает большинство форматов файлов изображений (например, файл nd2 из микроскопа Nikon, файл czi из микроскопа Зейсс) с помощью плагина "Bio-Formats".

  1. Установка плагина
    1. Копировать и вставлять плагин файл (который доступен по запросу соответствующего автора или через следующую институциональную ссылку: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) в Фиджи "плагины" папку.
    2. Запуск программного обеспечения Фиджи; плагин "FemDA" можно найти в выпадаемом меню "Plugins" Фиджи.
  2. Предварительная обработка данных изображений
    1. Откройте дефокусированное изображение BF (см. шаг 6.3). Нажмите Процесс (ru) Вычесть фон ... для удаления гладких непрерывных фонов каждого кадра данных изображения(рисунок 4B). Нажмите Процесс (ru) Фильтры Медиана для уменьшения шума каждого кадра данных изображения(рисунок 4C).
    2. Нажмите изображение Отрегулируйте Порог для проверки и разделения переднего плана (с указанием микрокамберов) от фона (с указанием области за пределами микрокамберов) каждого кадра данных изображения (увеличенные вставки на рисунке 4A-C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите правильный алгоритм из списка выпадах в окне Порога, чтобы только области микрокамб, а также края каждой микрохемы, можно было идентифицировать и выделить в качестве переднего плана. В частности, большинство выделенных краев должны быть непрерывными без зазоров.
  3. Определение координат капли
    1. Нажмите Плагины Фемда FemDA Анализ, чтобы открыть графический пользовательский интерфейс (GUI) настроенного плагина (верхняя половина рисунок 4D).
    2. Введите приблизительное минимальное и максимальное количество пикселей одной микрохемы. Ввод ожидаемого минимума и максимальной круговой (0: произвольная форма; 1: идеальный круг) микрочасс. Введите номер кадра стартового кадра и конечного кадра.
    3. Нажмите Генерировать РЕНТАБЕЛЬНОСТЬ инвестиций на графический интерфейс для обнаружения каждого микрохомоста, и успешно обнаруженные ROI отображаются в всплывающем окне ROITable.
    4. Вернуться к окну FemDA Анализ и нажмите кнопку Применить маску ROI, чтобы проверить, если микрокамберы над кадрами были надлежащим образом обнаружены (ниже слева от рисунка 4D). Если нет, изменить некоторые из них и повторить нажав генерировать рентабельность инвестиций и применить roi-маску. Если да, перейдите к следующему шагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Там может быть очень мало микрочемберов, которые не могут быть хорошо определены как рентабельность инвестиций (см. нижнюю половину рисунка 4D) любым алгоритмом Порога из-за недостаточного контраста между передним планом и фоном. Это не проблематично в статистической точке зрения.
  4. Извлечение интенсивности флуоресценции
    1. Откройте изображение флуоресценции и доведите его до фронта. Нажмите Применить маску ROI снова применять определяется ROIs на изображение флуоресценции (ниже справа от рисунка 4D).
    2. Выберите один выстрел для анализа изображения конечной точки (как по примеру данных mNeonGreen) или Time-Lapse для анализа данных тайм-курса (как это пример с щелочными данными фосфатазы).
    3. Ввод 100 в коробке Количество верхних пикселей означает, что только 100 лучших пикселей каждого РЕНТАБЕЛЬНОСТИ будут использоваться для расчета средней интенсивности соответствующей капли. Если вход 0 в число верхних пикселей,все пиксели каждого рентабельности будут использоваться для расчета средней интенсивности соответствующей капли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Между изображениями BF и флуоресценции может быть дрейф в несколько пикселей, что означает, что некоторые пиксели в РОВ могут принадлежать фону изображения флуоресценции. Таким образом, плагин предоставляет возможность указать количество пикселей с высокой интенсивностью для расчета средней интенсивности каждой капли.
    4. Для анализа изображения конечной точки (т.е. выберите One-Shot на шаге 7.4.2), нажмите кнопку Измерения интенсивности, чтобы вычислить среднее интенсивность всех обнаруженных капель. ROITable обновляется новыми данными с изображения флуоресценции. Между тем, гистограмма отображается в новом всплывающем окне гистограммы (рисунок 4E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение размера ячейки в поле Номер бин может оптимизировать отображение гистограммы. В разработанном GUI может быть выполнена установка на сумму гауссиана. Всплывающее окно журнала Фиджи отображает примерочные результаты. Кроме того, экспортировать данные, нажав кнопку сохранить как текст и проводить различные статистические анализы с другим программным обеспечением (Рисунок 4F, G).
    5. Для анализа изображения тайм-курса (т.е. выберите Time-Lapse на шаге 7.4.2), всплывающее окно Время интенсивности курс вместо гистограммы, который содержит гистограмму, соответствующую определенной временной точки и время интенсивности участка (Рисунок 5). Текстовые данные также могут быть экспортированы с помощью меню файла всплывающего окна.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Процесс микрофабрики состоит из очистки субстрата, функционализации поверхности, покрытия CYTOP, фотолитографии, сухого офорта, фоторезисторной зачистки и окончательной очистки. Важно отметить, что представленный протокол позволил полностью удалить гидрофобный полимер CYTOP внутри микромамбовки Рисунок 3A), производя очень параллельную гидрофильные-гидрофобные структуры на стандартной крышке стеклянного субстрата. С помощью протокола уплотнения масла, равномерное измерение результирующего капельки было проверено путем инкапсуляции флуоресцентного раствора в микрокамберах(рисунок 3B). Интенсивность флуоресценции, извлеченная с помощью разработанного программного обеспечения, является хорошим показателем размера капель. CV интенсивности флуоресценции, 3%, отражает узкое распределение размера капель по всему массиву(рисунок 3C). Реконструированное 3D изображение из конфокальной микроскопии также показало последовательный объем капель с течениемвремени (Рисунок 3D, Дополнительный фильм 1)44. Для сравнения, широко используемое масло FC-40 генерируется капли, демонстрирующие несколько раз разницу в интенсивности флуоресценции45. Сформированные капли в FemDA были стабильными на RT, по крайней мере 24 часов (Рисунок 3E). Высокое качество капель в конечном итоге легло в основу количественного измерения.

Высокопроизводительные данные требуют высокопроизводительных инструментов анализа данных46,,47. Разработанный плагин значительно упростил и ускорил анализ данных изображений. На основе теории цифровой обработки изображений48, дефокусированный BF изображение может быть binarized и используется для обеспечения координации информации каждой капли после фоновой коррекции и снижения шума (Рисунок 4A-C). Эта идея сделала возможной точную локализацию темных капель.

Флуоресцентный белок mNeonGreen был синтезирован в FemDA. Шаблон ДНК с концентрацией 0,05 молекул на капельку был случайным образом распределен в каждую капельу, чтобы инициировать синтез белка с помощью клеточной транскрипции и реакций перевода. Поскольку среднее количество молекул ДНК на капельку было меньше 1, некоторые капли содержали нулевой шаблон ДНК, в то время как другие содержали одну или несколько молекул ДНК. После 6 часов инкубации в RT, изображение конечной точки было захвачено с помощью микроскопа. Данные изображения стека были проанализированы разработанным программным обеспечением с помощью параллельного дефокусированного изображения BF(рисунок 4A-E). Интенсивность флуоресценции каждой капли является мерой урожайности белка в соответствующей капле. Гистограмма интенсивности флуоресценции показала дискретное распределение и была хорошо приспособлена суммой гауссиаских распределений равных пиковых до пиковых интервалов(Рисунок 4F),который настоятельно предлагал заполняемость различных чисел молекул ДНК на капельку. Подобно повторяющейся игре с переворачивания монет, количество независимых случайных событий, которые происходят, математически описано распределением Пуассона. Вероятность возникновения капель, содержащих различные числа (до 3 в данном примере) молекул ДНК, идеально подходила для распределения Пуассона (P йе -q q q / k!, где ожидается среднее количество молекул ДНК на капельку и k является фактическое количество молекул ДНК в капле) в среднем 0,05 молекулы ДНК на капельу (Рисунок 4G)31, как ожидается, для случайного распределения молекул ДНК. Поскольку концентрация загрузки решения ДНК шаблона была такой же, как и окончательная установка (т.е. 0,05), эффективность реакции CFPS в нашем FemDA составляла 100% (или около 100%). Другими словами, одной молекулы ДНК достаточно, чтобы вызвать реакцию CFPS в капли фемтотитера эффективно.

Реакция CFPS щелочной фосфатазы была записана каждые 5 минут. Разработанное программное обеспечение также поддерживает анализ данных временного курса(рисунок 5). Связанная фторгенная реакция показала аналогичное дискретное распределение интенсивности флуоресценции капель в более ранних точках времени. Результаты гистограммы также подтвердили заполняемость различных чисел молекул ДНК в капле. Интенсивность флуоресценции в конечном итоге сходились к значению наряду с постепенным истощением фторгенного субстрата DiFMUP.

Figure 1
Рисунок 1: Процесс микрофабрики субстрата микрокамберного массива сверхвысокой плотности. () Техническийрисунок настраиваемого вакуумного патрона. Единица: мм. (B) толщина пленки CYTOP против данных о скорости вращения. (C) Спин-покрытие перфторополимера CYTOP на силанизированном стеклянном субстрате. Фотографии показали хороший пример однородного покрытия и плохой пример неоднородного покрытия, соответственно. Черная стрелка указала на конкретное положение inhomogeneous ЦИТОП пленки. (D) Спин-покрытие фоторезиста на субстрате с покрытием CYTOP. После спин-покрытия фотореалист возле кромки субстрата должен быть удален с помощью пропитанного этанолом чистого стеклоочистителя (средняя фотография). Фотографии показали хороший пример однородного покрытия и плохой пример неоднородного покрытия, соответственно. Белая стрелка указала на конкретное положение неоднородной фотореалистской пленки. (E) Воздействие фотореалиста с покрытием с помощью выравнивания маски. (F) Развитие разоблаченных фоторезиста в разработчике. Обнажёная часть фоторесиста растворима в решении разработчика. (G) Реактивно-ионный офорт CYTOP. Обнаруженный CYTOP был удален плазмой O2. (H)Удаление фоторезистской маски. Фотореалист был удален ацетоном. Субстрат был очищен с помощью 2-пропанола и H2O. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Подготовка и использование устройства микрокамберного массива. (A) Взвешивание лечебного агента и prepolymer PDMS. (B) Заливки смешанной и деаэрированной смеси в лентой узором Петри блюдо. В полимерной смеси появились недавно сгенерированные пузырьки воздуха. (C) Деярирование смеси снова в вакуумной камере. Воздушные пузыри поднимались и лопались на верхней поверхности. (D) Деаэрированная и вылеченная смола PDMS. (E) Пилинг от вылеченного PDMS эластомер из чашки Петри. (F) Отрезав каждый кусок PDMS блока канала с помощью плоского кабеля резак. (G) Пробивая отверстия на каждом конце канала PDMS с помощью биопсии удар. (H) Собранное устройство. Смола PDMS может прилипать к поверхности CYTOP. (I) Прозрачная область микропамббера внутри канала PDMS, наполненного aqueous раствором перед охлаждением. (J)Прозрачная область микрокамббер массива внутри канала PDMS после охлаждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Ультра-равномерные и ультра-стабильные капли фемтолитров. ()3D лазерное сканирование confocal микроскопии изображений для изготовленного субстрата. Цилиндрические микрокамберы на рисунке на примере показали высоту 3 мкм и диаметр 4 мкм. (B) Равномерные капли фемтолитров на большой площади планарного массива. В настоящем документе была показана лишь частичная область всего массива. В каждой капле был запечатан флуоресцентный раствор (10 м ATTO-514). (C) Распределение размеров капель по всему одному массиву. Интенсивность флуоресценции использовалась в качестве индикатора размера капель. Резюме было только 3%. (D)Объемные измерения с использованием confocal z-stack данных тайм-курса. Объем капель по массиву был дан программное обеспечение микроскопа (NIS-Elements, Nikon). (E) Восстановление флуоресценции после фотоблека. После первого кадра несколько капель были полностью фотолесучены с помощью ограниченного лазерного луча конфокального микроскопа. Их интенсивность флуоресценции была зарегистрирована в течение 24 ч, и не было отмечено восстановление флуоресценции (красная линия). Интенсивность флуоресценции других нефотографированных капель в том же поле зрения была зафиксирована в черной линии. Бары ошибок (прозрачные цвета) были 1 SD для каждой точки времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Процедура анализа микроскопических данных изображений конечной точки. Дефокусированный ярко-полевой образ использовался для извлечения координат всех микрочабров/капель. На основе разницы интенсивности между краем микрочабров (на переднем плане) и другими областями (в качестве фона) непрерывная и почти круговая кромка может быть извлечена из фона. Из-за неравномерного распределения фона по полю зрения(A),некоторые изображения предварительной обработки, как правило, требуется для улучшения качества динаризации вывода. После вычитания фона(B),фон каждого кадра был обметен. Эмпирически входное значение врадиусе «Роллинг шар»(шаг 1) составляло 20-50 для 2048 пикселей и 2048 пикселей и 10-20 для 512 пикселей и 512 пикселей изображений. Чем больше значение, тем короче время обработки. Чтобы уменьшить шум на изображении с фоном, нанесите медианный фильтр на изображение(C). В целом значение ввода в Радиусе (шаг 3) составляло 1-2 пикселя. Как показано в увеличенной вставке, фоновое и фильтрованное изображение может быть красиво бинаризовано с помощью плагина порога сборки, так что передний план, соответствующий краям, а также области интересов (ROIs) может быть точно распознан. Обнаружение ROIs для всех кадров изображения было осуществлено с помощью установленного самодельного плагина FemDA Analysis (D). Размер пикселя (шаги 5 и 6) и круговорота (шаги 7 и 8) ROIs, кадры, которые мы хотим ввести в расчет (шаги 9 и 10), были вручную определены в соответствии с фактическими данными. После нажатия генерации рентабельности инвестиций (шаг 11) и ожидания, координаты каждого рентабельности инвестиций через входные кадры были определены. После нажатия маски Применить ROI (шаг 12), каждый обнаруженный рентабельность инвестиций был заключен и выделен желтой линией. После открытия изображения флуоресценции и повторного нажатия маски Применительно к МАС на изображение флуоресценции была применена определенная маска ROIs. Количество верхних пикселей (шаг 14) указывает количество пикселей с высокой интенсивностью каждого рентабельности для расчета средней интенсивности соответствующих капель. После нажатия интенсивность измерения (шаг 15) и ожидания, гистограмма была создана (E). Гистограмма может быть оснащена суммой гауссианской дистрибутивов с использованием параметров, доступных в окне гистограммы. Кроме того, данные о средней интенсивности могут экспортироваться в текстовый файл (шаг 16) и анализироваться другим программным обеспечением(F). (G) Вероятность возникновения капель, содержащих различные числа молекул ДНК в данном массиве. Гистограмма (серый цвет) была хорошо приспособлена распределением Пуассона (красная пунктирной линии) со средним количеством молекул ДНК на капельку, как и ожидалось для случайного распределения молекул ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ микроскопических данных изображений временного курса. Обнаруженные ОИ (следующие шаги 1-12 рисунка 4)были непосредственно применены к данным временного курса. В шаге 13 рисунка 4,выберите промежуток времени и введите фактический интервал времени (в минутах) между смежными рамками в интервале времени . После нажатия интенсивность измерения (шаг 15 рисунок 4) и ожидания, график интенсивности времени и гистограмма (так же, как рисунок 4E) были созданы. Позиция Hist указала точку времени гистограммы, которая была показана как вертикальная красная линия. Плагин также поддерживает указание цветов для каждой линии трассировки. желтый: 0 ДНК; синий был 1 ДНК; красный: 2 ДНК; черный: 3 ДНК. Данные временного курса также могут быть экспортированы в текстовый файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный фильм 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Высококоличественное измерение, основанное на высоко однородной, стабильной и биосовместимых каплях в FemDA, позволило дискретное распределение, уникальная особенность нашего исследования, отличающаяся от других. Мы систематически оптимизировали и подробно описали процессы микрофабрики и капель в настоящем документе. В установленном протоколе есть несколько важных шагов.

Во-первых, равномерное покрытие высоковязкого полимера CYTOP на прямоугольном тонком стеклянном субстрате во многом определяет качество полученного субстрата. Учитывая обычно короткое рабочее расстояние объективного объектива с высоким увеличением (см. шаг 6.1), необходимо использовать тонкое покрытие стекла. Высококачественное спин-покрытие на тонком и гибком субстрате, как правило, сложно. Мы еще не проверили все возможные проекты, но обнаружили, что мульти-отверстие вакуумный патрон с тем же прямоугольным измерением действительно хорошо работал для спин-покрытия. Важно сбросить полимер CYTOP в центр крышки стеклянного субстрата и немедленно запустить спин-покрытие (см. шаг 1.3.2). Степень сложности в меньшей степени связана с формой субстрата, но вязкость полимера. Линейка продуктов CYTOP предлагает несколько различных концентраций коммерчески доступного пакета. Сопровождающее дилюент в упаковке также может быть использовано для разбавления оригинального продукта до более низкой вязкости, если это необходимо. CYTOP 816, который мы использовали в эксперименте, является коммерческим продуктом с самой высокой концентрацией, способным стабильно растворять полимер в растворителе. Более толстое покрытие требует более низкой скорости вращения или нескольких раундов покрытия и лечения. Участок характерной толщины против кривой скорости спина настоятельно рекомендуется при использовании нового спинового покрытия в новой среде.

Во-вторых, соответствующая влажность уборной имеет решающее значение для идеальной фотолитографии, а также полного удаления фоторезиста в указанном положении. Фотохимическая реакция в фотолитографии использует H2O в качестве одного из реагентов. Тем не менее, softbake при температуре выше, чем температура кипения H2O удаляет H2O содержание с покрытием фоторезиста. "Высушенный" фотореалист должен занять время, чтобы снова поглотить H2O из воздуха (см. шаг 1.4.6). Этот момент часто упускается из виду. Учитывая, что многие лаборатории могут иметь только некоторые упрощенные объекты очистки без контроля влажности, влажность будет колебаться резко в течение сезона или будут зависеть от погоды. Недорогим решением является использование увлажнителя домашнего использования или обезвоживания в уборной. Полностью открытый слой CYTOP после разработки может быть выборочно и полностью удален RIE, полностью обнажая дно стекла. В конце концов, гибридная структура гидрофильного дна стекла и гидрофобной боковой стенки CYTOP имеет важное значение для стабильного захвата aqueous решение фемтолитрового пространства.

В-третьих, недавно найденные масла (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) и сурфактант (SURFLON S-386) показали беспрецедентную герметичность для фторполимерного реактора13. Инъекция флеш-масла должна осуществляться на охлажденном плоском металлическом блоке (см. шаг 5.2); в противном случае капли возле входного канала не могут быть сформированы. Инъекцию второго герметичного масла можно провести на RT (см. шаг 5.5). Эти масла и сурфактанты никогда не использовались в биологических исследованиях раньше. На данный момент не найдено более эффективных альтернатив. Для расширения арсенала полезного сочетания масел и сурфактантов для подготовки капель, новый член масла (или аналогичные в той же линейке продуктов) и сурфактант (или аналогичные в той же линейке продуктов) достойны попытки быть применены в микрофлюидных капель систем.

Вот два дополнительных момента, чтобы заметить. Одним из них является тот факт, что существует временной лаг среди ROIs во время микроскопии изображений. Общее время визуализации для одного цикла в основном зависит от размера массива и увеличения объективного объектива. Время экспозиции, скорость затвора и скорость движения моторизованной ступени также являются незначительными факторами. Как правило, визуализация 106 капель при увеличении 60 "по крайней мере потребует 10-20 минут. Это неизбежное временное лаг приводит к некоторым ошибкам в анализе данных, которые всегда следует принимать во внимание. Другой заключается в том, что общее количество капель на одном субстрате не превысит 108-109,даже увеличивая плотность капель или уменьшая индивидуальный размер капельки. Это потому, что размер стеклянного субстрата, который может быть обработан выравниванием маски (для 4-дюймовых вафель) ограничен. Дальнейшее увеличение размера крышки стекла не рекомендуется, потому что большой, тонкий и хрупкий стеклянный субстрат трудно справиться.

FemDA можно рассматривать как супер миниатюрные микротитр пластины. Любые биохимические реакции, которые были проведены в 96-м колодце микротитерных пластин можно было бы попытаться провести с помощью FemDA. Он, безусловно, может быть использован для измерения активности ферментов без сложной очистки белка. Она также может быть совместима с цифровой полимеразной цепной реакцией (цифровой ПЦР) и цифровым иммуносорбентным анализом, связанным с ферментами (цифровой ELISA)31,49. Небольшой объем, большой массив и высокая стабильность принесут некоторые преимущества по сравнению с существующими цифровыми методами биоанализа. Система FemDA, способная разрешать различные числа шаблонных молекул ДНК в каплях фемтолитров, уже показала силу при точном скрининге белка13. FemDA - это новая система разобщенности in vitro, способная быстро развивать различные ферменты. С достижениями в области биоинформатики и технологии библиотечного строительства, эра быстрого создания по требованию высокопроизводительных белков, безусловно, придет.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI грантовый номер JP18K14260 и бюджет Японского агентства по морской науке и технике. Мы благодарим Сигэру Дегучи (JAMSTEC) и Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) за предоставление объектов по характеристике. Мы благодарим Кена Такаи (JAMSTEC) за коммерческую поддержку программного обеспечения. Микрофабрикация была проведена в Такеда Sentanchi Supercleanroom, Университет Токио, при поддержке "Нанотехнологии Платформа программа" Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT), Япония, Грант номер JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. , Pearson. New York, NY. (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Tags

Химия Выпуск 160 Микрофабрика капелька фемтотитер синтез белка без клеток флуоресцентный белок фермент одномалые распределение Пуассона анализ изображений разобщенизация in vitro
Массив капли Femtoliter для массивно параллельного синтеза белка от одиночных молекул дна
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura,… More

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter