Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Trækkraft kraft mikroskopi til undersøgelse B Lymfocyt Aktivering

Published: July 23, 2020 doi: 10.3791/60947
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Institut Curie, PSL Research University, INSERM U932, 2Laboratoire Interdisciplinaire de Physique, Université Joseph Fourier (Grenoble 1)

Summary

Her præsenterer vi en protokol, der anvendes til at udføre trækkraft mikroskopi eksperimenter på B-celler. Vi beskriver fremstillingen af bløde polyacrylamid geler og deres funktionalisering, samt dataindsamling på mikroskop og et resumé af dataanalyse.

Abstract

Trækkraftmikroskopi (TFM) muliggør måling af kræfter, der produceres af en celle på et underlag. Denne teknik udleder trækkraft målinger fra en eksperimentelt observeret forskydning felt produceret af en celle trækker på en elastisk substrat. Her tilpassede vi TFM til at undersøge den rumlige og tidsmæssige struktur af kraftfeltet udøvet af B-celler, når det aktiveres ved antigenindrengning af B-cellereceptoren. Gel stivhed, perletæthed, og protein funktionalisering skal optimeres til undersøgelse af relativt små celler (~ 6 μm), der interagerer med, og reagere specifikt på ligands for celleoverflade receptorer.

Introduction

B-celler er de antistofproducerende celler i immunsystemet. For at aktivere det adaptive immunrespons erhverver de først antigenet i oprindelig form (dvs. ikke-forarbejdet) gennem en specifik receptor kaldet B-cellereceptor (BCR)1. Denne proces sker i lymfeknude B-cellezonen. Selv om nogle antigener kan nå B-cellen gennem lymfevæsker, de fleste antigener, især med høj molekylvægt (> 70 kDa, som er grænsen størrelse for lymferør) er faktisk præsenteret i deres oprindelige form på overfladen af et antigen præsenterer celle (APC), typisk en subcapsular sinus makrofag eller follikulær dendritisk celle, gennem lectin eller Fc receptorer (ikke-specifikke). Kontakten med denne celle fører til dannelsen af en immun synapse, hvor BCR udøver kraft på APC-associerede antigener. Bindingen af et antigen til BCR initiere BCR signalering, som kan aktivere kraft-genererende mekanismer. Disse kræfter kan være vigtige for at forstærke BCR signalering, men er også afgørende for B-celler til at udtrække og derefter internalisere antigenet.

Nylige undersøgelser har vist, at BCR faktisk er mekanosensitiv2. Stivere underlag fremkalderf.eks. Desuden kraft genereret på immun synapse trækker på enkelte BCRs at sonde sin affinitet til antigen og dermed sikre affinitet diskrimination4. Det er derfor interessant at undersøge B-cellernes mekaniske respons på antigenpræsentationen og dissekere dette respons med hensyn til type receptorer, der er impliceret (IgG/IgM)5, adhæsionsmolekyler (integrinligaler) eller i farmakologisk og genetisk modificerede celler (dvs. hæmning af et protein nedstrøms for BCR-signalering eller cytoskelet dynamik)6.

En enkel metode til at observere en celles reaktion på et substrat af fysiologisk stivhed og samtidig forsøgskræfter, der udøves på substratet, er Traction Force Microscopy (TFM). TFM består i at observere forskydningsfeltet, der frembragtes af cellen, og som trækker i et elastisk underlag. Oprindeligt blev deformationen af gelen observeret gennem rynker af elastomeren selv ved fase-kontrast mikroskopi7, men indsættelsen af fluorescens mikroperler som fiducial markører tilladt for bedre opløsning og er siden blevet standard8. Denne metode er blevet brugt til at undersøge trækkraft kraft udøves af klæbende celler, væv, og endda organoider indlejret i geler. Der er udviklet flere variationer af TFM9, herunder, kombination med superresolutionmikroskopi (dvs.10 eller SRRF11), ændring af gelens brydningsindeks for at muliggøre TIRF-mikroskopi12, erstatning af perler med nanotrykte mønstre13og anvendelse af nanopæle i stedet for flad overflade14. For en komplet gennemgang af disse variationer, se Colin-York et al.15.

Den protokol, der præsenteres her, beskriver en procedure til måling af kræfter, der udøves af B-celler på et antigenbelagt substrat. Disse kræfter anvendes på liganderne (antigen) for at gruppere dem og efterfølgende udtrække dem fra det antigen-præsenterende substrat. Vi har tilpasset standard TFM-protokollen for at efterligne stivheden af fysiologiske antigen-præsenterende substrater, størrelsen og den relevante belægning til B-cellerne. Denne protokol giver mulighed for undersøgelse af flere celler samtidigt og kan bruges sammen med fluorescensmikroskopi teknikker og kemiske behandlinger. Men det har ikke til formål at sonde enkelt molekyle kraft målinger, for hvilke optiske pincet16, molekylær spændingsonder 17,18, biomembrane kraftsonder 19, og atomare kraft mikroskopi20 er mere egnede teknikker. Sammenlignet med andre enkeltcellekraftmålingsmetoder (f.eks. mikropipetter21 eller mikroplader22) giver TFM mulighed for rekonstruktion af et komplet kort over de kræfter, der udøves ved synapsen med en opløsning på ~300 nm. Dette er nyttigt til at identificere spatio-tidsmæssige mønstre i de kræfter, der udøves på overfladen, og da gelen er kompatibel med konfokal billeddannelse, at korrelere dem med rekruttering af specifikke proteiner (for eksempel cytoskeleton og signalering proteiner).

Selvom 3D TFM er mulig, er det ikke kompatibelt med stivheden og opsætningen, vi brugte. Deformationer i 3D er opnåelige af andre mere komplekse opsætninger såsom fremspring kraft mikroskopi (AFM scanning en deformerbar membran, hvor cellerne erbelagt) 23,24 og elastisk resonator interferens stress mikroskopi (ERISM, en gel fungerer som resonating hulrum for lys og fremhæve deformationer af substrat med nøjagtighed af et par nanometer)25. Selv om disse teknikker er meget lovende, har de endnu ikke været ansat i B-celler. Andre typer af TFM, såsom på nanopæle14, kunne bruges til at have mere reproducerbare substrater. Men denne geometri er ikke tilpasset til bløde celler, da cellen interpenetrates søjlerne, hvilket komplicerer analysen. Denne fremgangsmåde er faktisk blevet anvendt i T-celler til at observere cellens evne til at opbygge strukturer omkring søjlerne26.

På trods af sin enkelhed, TFM ved hjælp af polyacrylamid geler giver mulighed for samtidig observation af mange celler og kan nemt og billigt gennemføres i ethvert laboratorium udstyret med en bænk og en epifluorescens mikroskop (selv om vi anbefaler konfokal / spinning disk).

For at efterligne den fysiologiske stivhed af en APC, vi brugte polyarylamid geler med en stivhed på ~ 500 Pa27 og funktionaliseret gelen med aktiverende antigener. I denne protokol, vi funktionaliseret overfladen af polyacryamide gel med høne æg lysozym (HEL). Dette giver mulighed for måling af kræfter genereret ved stimulering af BCR gennem engagement af antigen bindingsstedet. Brugen af dette antigen og de HEL-specifikke B-celler fra MD4-mus sikrer en relativt ensartet kraftgenerering som reaktion på antigennation28. Men andre molekyler (såsom anti-IgM til B6 mus) kan podes på gelen, men de kræfter, der genereres i disse tilfælde kunne være mere heterogene og mindre intens. Da B-celler er små celler (diameter ~ 6 μm), er antallet af perler blevet optimeret til at være maksimal, men stadig sporbar. For store celler, der udøver ~ kPa kræfter på deres substrater, kan man opnå tilfredsstillende resultater ved hjælp af relativt sparsomme perler eller udfører simple partikel billede velocimetry (PIV) at rekonstruere deformation feltet. Men for små celler som B lymfocytter, der udøver stress så lille som ~ 50 Pa, brug af enkelt partikel sporing er påkrævet (partikel tracking velocimetry, PTV) for at opnå den ønskede nøjagtighed, når rekonstruere deformation feltet. For pålideligt at spore perler individuelt, forstørrelsen af den objektive linse skal være mindst 60x og dens numeriske blænde omkring 1,3. Gelerne skal således være relativt tynde (<50 μm), ellers er perlerne ikke synlige, da de er over målsætningens arbejdsafstand.

Hovedprotokollen består af tre sektioner: gel forberedelse, gel funktionalisering og billeddannelse; yderligere to sektioner er valgfrie og er dedikeret til antigenekstraktionskvantificering og billeddannelse af lysstofrør.

Protocol

1. Gel forberedelse

  1. Silanisering af gelstøtten
    1. Aktiver dækslet eller glasbundet petriskål (som vil blive brugt som gelstøtte) med en UV-lampe i 2 min (vent 30 s før eksponering for UV-lampen for at undgå udsættelse for resterende ozon).
    2. Silanize dækslæbet/glasbundet fad med 200 μL aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) i 5 min. Dette vil forberede støtten til den kovale binding af gelen.
    3. Vask dækslet/glasbundet med ultra rent vand grundigt.
    4. Tør dækslæbet/glasbundet med vakuumaspiration.
  2. Forberedelse af 18mm coverslip bruges til at flade gel
    1. For at forberede coverslips, først sætte dem i en keramisk coverslip indehaveren. Sæt derefter dæksletholderen i et lille bægerglas (50 ml) og hæld silikonerende reagens (opbevaret ved 4 °C, genanvendeligt) over dækslerne, og sørg for at dække dem helt.
    2. Dæk bægerglasset med aluminiumsfolie og inkuber i 3 min ved stuetemperatur. Når du venter, skal du fylde et stort bægerglas (500 ml) med ultra rent vand. Efter 3 minutters inkubation i silikonerende reagens overføres dækslæbholderen med dækslingsæber til vandbægerglasset.
    3. Skyl dækslerne grundigt med ultra rent vand, tør dem godt og hold dem på papirservietter. Du opnår de bedste resultater ved straks at gå videre til næste afsnit.
  3. Gel polymerisering
    1. For geler på 0,5 kPa blandes 75 μL 40 % acrylamid med 30 μL 2 % bisalakamid (krydslinker) og 895 μL fosfatbustemt saltvand (PBS). Denne forblanding kan opbevares i op til en måned ved 4 °C.
    2. Til 167 μL af 0,5 kPa gel premix, tilsæt 1% (1,67 μL) af perler, vortex og sonikere i 5 min i et bad sonicator (standard bænk ultralyd renere med magt på 50-100 W og frekvens 40 kHz). Hold blandingen beskyttet mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie.
      BEMÆRK: Forblandingen polymeriseres ikke, før initiatoren (TEMED) er tilsat.
    3. For at katalysere polymerisering tilsættes 1% (1,67 μL) af 10% w/v ammoniumpersulfat (APS).
    4. For at indlede polymerisering, tilsættes 0,1% (0,2 μL) N, N,N', N′-Tetramethylendiamin (TEMED). Bland med en pipette. Når APS og TEMED er blevet tilføjet, gelen hurtigt polymeriserer så gå hurtigt til gel støbning.
  4. Gel støbning
    1. Pipet 9 μL gelblanding på hver dækslæb/glasbundsskål (fald i midten, Figur 1A)
    2. Anbring silaniseret/hydrofobe coverslip og flad gelen (Figur 1B). Tryk på dækslet ved hjælp af en betrækslip for at sikre, at gelen breder sig over hele dækslet (Figur 1C), indtil den begynder at sive ud.
    3. Inverter dækslæbet/glasbundet skålen i en stor petriskål, og bank den på bænken for at tvinge perler, der går mod geloverfladen (Figur 1D).
    4. Dæk med aluminiumsfolie og lad i 1 time at polymerisere ved stuetemperatur i et fugtigt kammer (dvs. sætte et vådt væv over skålen for at forhindre fordampning).
    5. Efter 1 time tilsættes PBS til prøven for at lette udløsning af dækslæb. Fjern forsigtigt dækslæbet med en nål (belægningen med forskellige silaner skal gøre det nemt at afskalle dækslæbet af gelen, figur 1E).
    6. Lad gelen blive i PBS.
      BEMÆRK: Geler kan nu opbevares i PBS ved 4 °C i 5-7 dage, men det anbefales at bruge dem inden for 48 timer.

2. Gel funktionalisering

  1. Der forbereds sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoatopløsning (Sulfo SANPAH) ved 0,5 mg/ml i 10 mM HEPES-buffer. Dette kan opbevares ved 4 °C dækket med aluminiumsfolie i op til en uge.
  2. Aspirere PBS fra geler.
  3. Der tilsættes 150 μL Sulfo SANPAH til gelen ved stuetemperatur (Figur 1F).
  4. Udsæt gelen for UV-behandling i 2 min. for at fotoaktivere sulfo SANPAH's steder og få den til at holde sig til geloverfladen.
  5. Vask med PBS tre gange (Figur 1G).
  6. Gentag trin 2.2-2.5.
  7. Der tilsættes 250 μL HEL (100 μg/ml) til hver gel og inkuberes natten over i et fugtigt kammer ved 4 °C natten over, mens den er dækket med aluminiumsfolie (Figur 1H).
  8. Hel antigen fjernes og vaskes med PBS tre gange.
    BEMÆRK: HEL fungerer både som et antigen og som et vedhæftningsmolekyle. Det kan erstattes af andre molekyler, der binder sig til receptoren (f.eks. en antimuse-IgM, Bovine Serum Albumin, Ovalbumin) eller blandes med integrinligaander (f.eks. Hvis det er nødvendigt, antigenekstraktion kan observeres med en fluorescerende version af HEL (opnået ved farvning af molekylet med et proteinmærkningssæt, se trin 4). Bemærk, at en given koncentration i bulk muligvis ikke giver samme overfladekoncentration på gelen som på glasset: Dette skal kvantificeres med sekundær farvning, hvis der kræves direkte sammenligning.

3. Celleindlæsning og billeddannelse

  1. Før billeddannelse fjernes PBS fra gelerne og tilsættes 500 μL B-cellemedier (RPMI 1640, 10% dekompileret føtal kalveserum, 1% penicillin-streptomycin, 2% natriumpyruvat, 50uM Mercaptoethanol og 1X ikke-essentielle aminosyrer) og lad dem ytrere over for RT.
  2. Forberedelse af celler
    1. Rens primære B-celler fra milten i henhold til en negativ udvælgelsesprotokol (se Materialetabel). Typisk endeligt B celle udbytte er omkring 1 x 107 celler. Koncentrat dette til 3 x 106 celler / ml i B celle medium (RPMI-1640 suppleret med 10% føtal kalv serum, 1% penicillin-streptomycin, 0,1% mercaptoethanol og 2% natriumpyruvat).
    2. Celler opbevares efter behov i op til 6 timer ved 4 °C.
    3. Hold cellerne ved 37 °C i 30 minutter før billedopkøb.
  3. Imaging
    1. Brug et konfokalt mikroskop med termisk og (muligvis) CO2-styring.
      BEMÆRK: Uanset om der anvendes et konfokalt eller spinding-diskmikroskop, er det vigtigt at bruge et objektivt/pinhole, der gør det muligt for en pixelstørrelse <200 nm at spore perlerne komfortabelt i analysefasen (f.eks. 60x, NA 1.3). Epifluorescensmikroskopi kan også bruges, men det giver lavere signal til støj forhold og kan gøre individuelle perle sporing hårdere.
    2. To hovedlag af perler vises på bunden og toppen af gelen. Fokuser på gelplanet.
      BEMÆRK: En flot gel vises som en stjernehimmel, med perler omtrent ensartet fordelt på samme plan.
    3. Program erhvervelsen i 30 min med en rammehastighed på 5 s (dette kan tilpasses eksperimentets behov, f.eks erhverve andre farver, erhverve z stack, osv.)
    4. Aspirere medierne fra gelen, så omkring 200 μL medier på gelen. Placer gelen på mikroskopet og find overfladelaget af perler og et dejligt jævnt område på gelen.
    5. Tilsæt 80 μL celler (undgå at røre ved gelen for at bevare fokus).
    6. Sørg for, at fokus stadig er korrekt, og at celler kan ses faldende i området (under transmitteret lys). Start erhvervelsen, før cellerne når gelen.
    7. I tilfælde af utilsigtet kontakt med gel, vibrationer eller fokusdrift skal du justere fokus.
      BEMÆRK: Det er afgørende at indsamle et billede af den afslappede gel, og dette kan være ethvert billede taget før ankomsten af cellerne på gelen.

4. Fluorescerende HEL-ekstraktionseksperiment

  1. Forbered fluorescerende HEL ved at binde en fluorescerende farvestof (af en anden farve end perlerne en såsom Alexa 555), se tabel over materialer.
  2. I trin 2.7 skal konventionel HEL erstattes med den fluorescerende HEL.
  3. Ansk af billeder med lav belysningsindstillinger eller lav billedhastighed (f.eks. 2 billeder i minuttet) for at undgå fotoblegning.
  4. For at kvantificere HEL-udtrækning beregnes den intensitet, der er integreret over celleområdet for hver ramme I(t), korrigeret og normaliseret med intensiteten I(0) af ramme 0 i henhold til formlen:
    Equation 1
    BEMÆRK: Antigenet, der er konjugeret med en fluorofil, er ikke synlig (sandsynligvis på grund af dæmpning af fluorofore ved geloverfladen), men tilstedeværelsen på gelen kan verificeres med et anti-HEL og et fluorescerende sekundært antistof. Det kan kontrolleres, at fluorophore faktisk er fluorescerende, når løsrevet ved stripning det fra gelen med en coverslip belagt med anti-HEL og afsløre det med en sekundær fluorescerende antistof (på coverslip)6. Signalet af det ekstraherede antigen er meget svagt og er undertiden maskeret ved utæt af perlerne. Hvis man kun er interesseret i antigenekstraktion, anbefales det at forberede gelen uden perler (spring trin 1.3.2 og 1.4.3 over).

5. Fluorescensbilleddannelse

  1. Der opnås fluorescerende B-celler ved at rense B-celle fra milt af genetisk modificerede mus som udført for den vilde type (f.eks. fra Lifeact-GFP eller Myosin II GFP-mus).
  2. Til billeddannelseslysorescerende celler skal der (hvis det er muligt) anvendes et roterende diskmikroskop med en vandnedsænkningsafstand 40x-100x mål.
  3. Hold eksponeringens varighed og billedhastighed lav for at undgå blegning.
    BEMÆRK: Punktspredningsfunktionen i Z forringes stærkt af tilstedeværelsen af gelen, og derfor foreslår vi at bruge et mål for vandsænkning. Levende opretstående mikroskopi med vanddypningsmål lider af stærke sfæriske afvigelser forårsaget af tilstedeværelsen af den (sfæriske) celle (og cellekerne) i emissionsvejen.

6. Analyse

BEMÆRK: Dataanalyse udføres generelt ved først at korrigere hele stakken for afdrift, finde perlerne i hver ramme, spore deres bevægelser med hensyn til en referenceramme (taget i mangel af celler), interpolere forskydningsfeltet og vende problemet for at opnå stress ved hjælp af Fourier transform29. Til dette formål foreslår vi at bruge en kombination af ImageJ Macro og MATLAB programmer downloades fra et online repository30.

  1. Åbn filmen i ImageJ som stak af billeder
  2. Kør makroen "Crop_and_save.ijm"
    1. Vælg de interesseområder (ROI) med værktøjet "Rektangel", og føj dem til listen over investeringsafkast ved hjælp af nøglen "t".
    2. Når du beskærer cellen, skal du sørge for at inkludere et område på mindst 5-10 pixels immobile perler. Udelad celler, der er for tæt på grænserne eller andre celler fra analysen. Når du er færdig klik på 'OK'.
    3. Makroen foreslår en maske af cellen: hvis dette er tilfredsstillende klik på "OK". Hvis det ikke er tilfredsstillende, skal du klikke på "Ikke ok" og derefter manuelt vælge et lukket område med et valgværktøj (f.eks.
  3. Åbn MATLAB og kør "TFM_v1.m".
    1. Indtast de nødvendige parametre: især kontrollere billedet egenskaber (pixel størrelse, tidsinterval for erhvervelse) og gel egenskaber (Young modulus E, Poisson forholdet).
    2. Referencebilledet er som standard indstillet til at være det første. Indstil den til en anden ramme, hvis det er nødvendigt, eller indstil den til "0" for at indlæse en ekstern fil.
    3. Find softwarens udgange i den samme mappe som den oprindelige fil (for en beskrivelse se den User_notice.pdf fil). Dette omfatter et foreløbigt spor af perlerne ("FILENAME.fig"), et plot af kontraktile energi over tid ("FILENAME_energy.fig"), en tabel over flere mængder integreret over cellen (energi, område, øjeblikke, osv.) "FILENAME_finaltable.mat", en struktur, der indeholder forskydning og kraft felt, film af perle, forskydning felt, stress og energi (der kan åbnes med enhver avi læser).
      BEMÆRK: I inputparametrene er "Vinduesstørrelse" det vindue, som forskydningen interpoleres over, og dermed den endelige opløsning af stress- og forskydningsfeltet. Dette er indstillet til nogle få (som standard fire) pixel. Det er ikke tilrådeligt at reducere dette, da det kunstigt ville øge opløsningen ved at interpolere regioner, hvor der ikke er nogen perler.

Representative Results

I betragtning af cellernes størrelse er algoritmer, der udtrækker forskydningskortet over perlerne via korrelative teknikker (såsom partikelbillede velocimetry) generelt ikke særlig præcise. Men afhængigt af graden af den nødvendige opløsning, kan man nemt opnå kvalitative resultater ved hjælp af en gratis Fiji / ImageJ plugin31,32. Mens denne fremgangsmåde er tilstrækkelig til at sammenligne stimulerende versus ikke-stimulerende forhold, anbefaler vi for en grundig analyse at bruge vores software downloades fra et online repository30, der sporer perlerne individuelt og giver forskydning feltkort på et givet tidspunkt som interpolation af de enkelte perleforskydninger33. Flere kvantificeringer er mulige på dette punkt. For eksempel (ved at antage forskydningen er forårsaget kun af stress tangential til gel overflade) softwaren giver også stress på hvert punkt forårsager, at specifikke forskydning kort. Dette er en form for "inversion problem": forskydning på et vist punkt afhænger af summen af alle de kræfter, der anvendes over de andre punkter. Den "inversion algoritme" tager hensyn til de fysiske parametre for substratet: dens stivhed (Young modulus) og Poisson forholdet. Direkte algoritmer er typisk meget præcise, men beregningsmæssigt dyre. Algoritmer baseret på Fourier transformere, ligesom vores, udføre hovedsagelig en deconvolution i Fourier plads og er mere effektive, men tilbøjelige til nogle fejl (primært på grund af interpolation trin). Disse algoritmer kræver generelt indstilling af en parameter, der forhindrer små lokale (og potentielt artefaktiske) forskydninger til at blive for relevant i beregningen af stressfeltet (Tikhonov legalisering parameter8,29; Variablen "Legalisering" i dialogvinduet. her har vi typisk sat svarende til 5 x 10-19). For mere avanceret fortolkning og analyse, såsom spatio-tidsmæssige korrelationer, lokale bevægelser, korrelationer med fluorescerende kanaler, anbefaler vi samarbejde med eksperter på området. For en gennemgang af beregningsmetoder se Schwarz et al.9.

Som nævnt ovenfor, korrekte perle billeder ligne en "stjernehimmel", en ensartet og tilfældig fordeling af lyse pletter (Figur 2A). Data og analyse er ikke pålidelige, når antallet af perler er for lavt (Figur 2B), eller billedet er ude af fokus (Figur 2C). Når B-cellerne har lagt sig på overfladen af gelen, begynder perlerne under cellerne at bevæge sig på grund af trækkraften fra cellen på gelen. Rammer, som perlerne ikke kan spores til, skal kasseres.

Som en kontrol er det muligt at observere ved øjet bevægelsen af perler sammenligne "referencerammen", typisk den ene forud for den første kontakt af cellen med substratet. Der kan opnås omtrentlige resultater fra enkeltpartikelsporingen (f.eks. Analysen giver en segmentering af perlerne i referencebilledet ("FILENAME.fig") som et kontrolelement.

Med den software, vi foreslår, kan man opnå forskydning (Figur 3B) og stress felt (vektoren af den lokale stress på hver pixel og hvert tidspunkt punkt opnået ved inversion fra forskydning feltet, Figur 3C). Skalarprodukt af forskydnings- og kraftfelterne, der er integreret på celleområdet, giver det samlede arbejde, som cellen udøver på substratet (figur 4A). Denne beregning kræver masken af cellen, der blev introduceret i trin 6.2 i protokollen.

For at sammenligne to biologiske tilstande (som aktivering af HEL versus ikke-aktiverende substrat BSA eller vildtype versus knock-out) er det nyttigt at beregne den gennemsnitlige kurve (Figur 4B) eller, endnu mere syntetisk, en gennemsnitlig værdi i forhold til de sidste tidspunkter (20 min), hvor energien når et plateau (Figur 4C). Når de rumlige oplysninger om kræfterne er relevant, er det muligt at sammenligne enkelte tidspunkter for hver betingelse (figur 4D). Se Kumari et al.6 for dybere analyse.

Et eksempel på fluorescensantigenudvindingstidsforfald er vist i figur 5A: fluorescenssignalers progressive udseende ved synapse indikerede antigenafmonterelse fra gelen. Den gennemsnitlige ekstraktionskurve med konfidensinterval (standardfejl af middelværdien) over 15 celler er vist i figur 5B.

Figure 1
Figur 1: Skematisk fremvisning af gelens præparat og funktionalisering. Trin er beskrevet i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Tre eksempler på perlebilleder af forskellige kvaliteter. (A) Eksempel på perlebillede med det korrekte signal til støj-forhold og den korrekte tæthed. (B) Eksempler på billeder med et for utilstrækkeligt antal perler og(C)ude af fokus plan. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Behandling af billederne for at udtrække kraftfeltet. (A) Eksempel på et billede af perlerne (omridset af cellen i hvid, udvundet fra transmissionsbilledet), perlesporing på tid t = 5 min (rød overlejring) og forskydning (pile) i forhold til tid t = 0 min (skalalinje 5 μm). (B) Interpoleret forskydning felt (repræsenteret som vektor pilekogger og størrelsesorden kort, pile er proportional med forskydning [nm]; se farvelinjen til højre); bund: et glattere billede af omfanget (opnået ved interpolation med en bicubic funktion). (C)Stress felt fra forskydning felt i panel B (repræsenteret som vektor pilekogger og størrelsesorden kort; pile er proportional med forskydning stress [Pa]; se farvelinjen til højre); bund: et glattere billede af omfanget (opnået ved interpolation med en bicubic funktion). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på oplysninger, der kan udtrækkes fra kraft- og forskydningsfelter. (A) Eksempel på udviklingen af energi i tide for en enkelt celle: En plateaufase (fremhævet med grå) dukker op efter ca. 10 min.( B) Sammenligning af de gennemsnitlige energikurver og(C)af de relative plateauniveauer for 65 celler, der er belagt med HEL (aktiverende) belagt gel og 35 celler på BSA-belagt gel (median ± interkvartilintervaller, blev anvendt til statistisk signifikans). d) Tidsforfaldsfarvekort over stress for HEL- og BSA-tilstand både størrelsesorden og pilekogger plots er vist. Disse billeder er blevet tilpasset fra Kumari et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på forsøg med fluorescerende antigen. (A) Tidsforfald af ekstraktionen af fluorescerende HEL (nedenfor: procentdel af maksimum, skalabar = 3μm). (B) Antigen indsamling over tid (Mean ± SEM, n = 15). Disse billeder er blevet tilpasset fra Kumari et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den TFM-metode, der er beskrevet her, giver mulighed for systematisk undersøgelse af B-cellernes aktive mekaniske egenskaber. I forbindelse med B-celler, dette er relateret til evnen til at udtrække og internalisere antigenet. Sammenlignet med andre TFM-metoder er den protokol, der præsenteres her, enkel og temmelig reproducerbar: stivheden, målt ved indrykning af en glasmekrosfære og ved hjælp af Hertz-model, er mellem 400 og 600 Pa. Lignende protokoller er blevet anvendt med succes ikke kun forB-celler 35, men også for T-celler36. I forhold til nanopæle (også anvendt til T-lymfocytter37)giver det en flad homogen overflade, og resultaterne er derfor lettere at fortolke, da gelens interaktion hovedsageligt er begrænset til at være tangentielt til overfladen.

Den protokol, vi beskrev, giver adgang til den spatiotemporale dynamik i de kræfter, der udøves af B-celler på antigen-præsenterende substrater. På det rumlige niveau giver dette oplysninger om lokalisering af kræfter, og i kombination med fluorescensmikroskopi gør det muligt for eksperimentatoren at korrelere lokale kræfter med tilstedeværelsen af specifikke molekyler (dvs. komponenter i cytoskeleton eller BCR-signalkaskade). På det tidsmæssige plan er det muligt at integrere mængder (f.eks. total energi eller total stress) for at give én værdi pr. tidspunkt og reducere støjen. Dette giver mulighed for observation af udviklingen af trækkraft i tid (vækst og plateau) og tilstedeværelsen af pulsatile mønstre.

Kritiske eksperimentelle aspekter for analysen beskrives som følgende. i) Celletæthed: For at udføre en korrekt analyse skal cellerne være tilstrækkeligt adskilte. Vi anser en celle for at kunne analyseres, hvis den har en tom region af sin egen størrelse omkring den. (ii) Transmissionsbillede: Det er tilrådeligt at indsamle mindst et transmissionsbillede af cellerne under forsøget, der skal anvendes som maske i analysen. (iii) Antal perler i billedet: Vi foreslår kun at analysere billeder, hvor antallet af perler i synapsen er mellem 30 og 200 (dvs. 1-8 perler/μm²). Lavere tætheder giver ikke mulighed for tilstrækkelig kortforskydningsrekonstruktion. Høje perletætheder gør enkelt partikelsporing upålidelig. iv) Antallet af perler skal være konstant under forsøget. udsving kan dog forekomme på grund af små variabiliteter i billeddannelsesforholdene (især i perler, der er for tæt på hinanden). Fokusdrift, hvis det sker, skal korrigeres, og problematiske rammer skal kasseres. (v) Gelkvalitet: Geler med for mange revner, variabilitet i perlerfordeling eller geler, der er for tykke, skal kasseres. vi) Afhængigt af celletypen kan celler på sene tidspunktspunkter (>300 billeder) efter gentagne eksponeringer lide fototoksiske virkninger. Det er tilrådeligt at køre programmet på en maske blottet for celler som en "baseline" skal sammenlignes med data. Dette giver en størrelse af støjniveauet udelukkende på grund af forsøgsbetingelserne.

Geler, der anvendes til at måle trækkraft kraft i klassisk vedhæftning giver mulighed for undersøgelse af processer, der opstår på fokale vedhæftning (actin strømme og rekruttering af signalering molekyler)-de punkter, hvor kræfteranvendes 38,39. Kræfter ved synapsen påføres dog ikke ved hjælp af fokale sammenvoksninger. Den spatiotemporale mønster af kraft generation på B-celle immun synapse er ikke blevet kvantitativt undersøgt ved hjælp af denne metode indtil for nylig. Ved hjælp af TFM observerede vi for første gang kraftmønstret ved B-cellens immunsynapse, som præsenteret i vores seneste undersøgelse6, hvilket åbnede opmuntrende perspektiver i studiet af lymfocytter.

Især denne metode anvender et billede taget før ankomsten af cellerne på gelen som et referencebillede for kraftberegningen. Sædvanlige TFM-protokoller foreslår at tage referencebilledet i slutningen af eksperimentet, efter at have løsnet cellerne med trypsin; Dette gør det muligt for eksperimentatoren at lede efter en region, der er rig på celler. Selv om dette er muligt her også, trypsin er temmelig ineffektiv til at frigøre B-celler fra antigen-belagt gel, man nødt til at vente længe på løsrivelse og risikoen for gel modifikation og bevægelser (der gør hele datasættet unexploitable) er højere.

Den metode, der præsenteres her, er fleksibel og kan anvendes til at undersøge effekten af andre signaler ved immunsynapsen, da den giver mulighed for podning af andre proteiner på geloverfladen (f.eks. er integrinligands og immunglobuliner testet) og endda fluorescerende antigen (se afsnit 4). Desuden forbliver cellerne tilgængelige for eksperimentatoren til narkotikabehandling og lokale rensninger. Endelig er metoden også kompatibel med billeddannende faste celler. Til disse observationer anbefales det at lave gelen på en dækslæb, plette cellerne, lime dækslen på et dias og først derefter tilføje monteringsmedier og en anden dækslæb. Observation vil derefter ske med gelen på toppen for at undgå nedbrydning af billedet gennem gelen.

Mulige faldgruber er variabiliteten i gel i polymerisering og belægning. Polymeriseringsproblemer skyldes hovedsageligt kvaliteten af initiativtageren/katalysatoren. Desuden kan gelen puste, især hvis den ikke anvendes lige efter montering. Dette problem synes ikke at dramatisk påvirke de mekaniske egenskaber af gelen, men det kan gøre perlelaget utilgængelig for målet, effektivt at gøre gelen ubrugelig. Vi anbefaler, at du tilbereder ekstra geler til hver tilstand, når dette problem opstår. Der kan også være en vis variation i belægningen, og det er afgørende at have friskfortyndet Sulfo SANPAH.

Afslutningsvis har vi beskrevet en enkel, billig og reproducerbar metode til at måle de kræfter, der udøves af B-celler på den immunologiske synapse, når den aktiveres af BCR ligand. Det kan tilpasses til at studere reaktionen på andre ligander og andre former for lymfocytter (hukommelse B-celler, T-celler, osv.) med brug af den korrekte receptor ligand.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker M. Bolger-Munro for kritisk læsning og anerkende Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie og PICT-IBiSA, Institut Curie, Paris, medlem af Frankrig-BioImaging nationale forskningsinfrastruktur, for støtte i billederhvervelse og Curie Animal Facility. PP blev støttet af CNRS. AK og JP blev støttet af Paris Descartes PhD fellowship og Ecole Doctorale FIRE-Program Bettencourt. Dette projekt blev finansieret med tilskud til PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy) og AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) Sigma-Aldrich 281778 Store aliquoted, protected from humidity
40% Acrylamide Solution Biorad 1610140
Alexa555 microscale protein labeling kit Molecular Probes A30007
Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
B cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi Biotec 130-090-862
B-mercaptoethanol Gibco 31350-010
2% Bis Solution Biorad 161-0142
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100-812-C
Coverslip 18mm VWR 631-1580
Fetal calf serum PAA A15-151 Decomplemented (40min @56°C)
Fluorodishes FD35 World Precision Instruments, Inc FD35100
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red Molecular Probes F8807
Hen Egg Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Stocked in aliquote 100mg/ml
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermofisher/Gibco 11140035
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) Euromedex 50406-B
PBS (Phosfate Buffer Saline) Gibco 10010-015
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-010
RMPI 1640 – Glutamax I Thermofisher 61870-010
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2
Sodium pyruvate Gibco 11360-039
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yuseff, M. -I., Pierobon, P., Reversat, A., Lennon-Duménil, A. -M. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nature Reviews. Immunology. 13 (7), 475-486 (2013).
  2. Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
  3. Shaheen, S., Wan, Z., et al. Substrate stiffness governs the initiation of B cell activation by the concerted signaling of PKCβ and focal adhesion kinase. eLife. 6, (2017).
  4. Natkanski, E., et al. B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities. Science. 340 (6140), 1587-1590 (2013).
  5. Wan, Z., Chen, X., et al. The activation of IgM- or isotype-switched IgG- and IgE-BCR exhibits distinct mechanical force sensitivity and threshold. eLife. 4, (2015).
  6. Kumari, A., Pineau, J., et al. Actomyosin-driven force patterning controls endocytosis at the immune synapse. Nature Communications. 10 (1), 2870 (2019).
  7. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  8. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
  9. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11), Pt B 3095-3104 (2015).
  10. Colin-York, H., Shrestha, D., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  11. Stubb, A., Laine, R. F., Guzmán, C., Henriques, R., Jacquemet, G., Ivaska, J. Fluctuation-Based Super-Resolution Traction Force Microscopy. BioRxiv. , (2019).
  12. Gutierrez, E., Tkachenko, E., et al. High refractive index silicone gels for simultaneous total internal reflection fluorescence and traction force microscopy of adherent cells. Plos One. 6 (9), 23807 (2011).
  13. Bergert, M., Lendenmann, T., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, 12814 (2016).
  14. Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection. Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).
  15. Colin-York, H., Fritzsche, M. The future of traction force microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 1-5 (2018).
  16. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), 8204-8213 (2017).
  17. Spillane, K. M., Tolar, P. DNA-Based Probes for Measuring Mechanical Forces in Cell-Cell Contacts: Application to B Cell Antigen Extraction from Immune Synapses. Methods in Molecular Biology. 1707, 69-80 (2018).
  18. Stabley, D. R., Jurchenko, C., Marshall, S. S., Salaita, K. S. Visualizing mechanical tension across membrane receptors with a fluorescent sensor. Nature Methods. 9 (1), 64-67 (2011).
  19. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  20. Hinterdorfer, P., Dufrêne, Y. F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy. Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).
  21. Sawicka, A., Babataheri, A., et al. Micropipette force probe to quantify single-cell force generation: application to T-cell activation. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3229-3239 (2017).
  22. Desprat, N., Guiroy, A., Asnacios, A. Microplates-based rheometer for a single living cell. Review of Scientific Instruments. 77 (5), 055111 (2006).
  23. Labernadie, A., Bouissou, A., et al. Protrusion force microscopy reveals oscillatory force generation and mechanosensing activity of human macrophage podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
  24. Bouissou, A., Proag, A., et al. Protrusion force microscopy: A method to quantify forces developed by cell protrusions. Journal of Visualized Experiments. (136), 57636 (2018).
  25. Kronenberg, N. M., Liehm, P., et al. Long-term imaging of cellular forces with high precision by elastic resonator interference stress microscopy. Nature Cell Biology. 19 (7), 864-872 (2017).
  26. Basu, R., Whitlock, B. M., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
  27. Bufi, N., Saitakis, M., et al. Human Primary Immune Cells Exhibit Distinct Mechanical Properties that Are Modified by Inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
  28. Goodnow, C. C., Crosbie, J., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
  29. Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  30. MBPPlab/TFM_v1: Software for Time dependent Traction Force Microscopy. , Available from: https://github.com/MBPPlab/TFM_v1 (2019).
  31. Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  32. ImageJ plugins by Qingzong TSENG. , Available from: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ (2019).
  33. Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
  34. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Wang, J., Lin, F., et al. Profiling the origin, dynamics, and function of traction force in B cell activation. Science Signaling. 11 (542), (2018).
  36. Hui, K. L., Balagopalan, L., Samelson, L. E., Upadhyaya, A. Cytoskeletal forces during signaling activation in Jurkat T-cells. Molecular Biology of the Cell. 26 (4), 685-695 (2015).
  37. Bashour, K. T., Gondarenko, A., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2241-2246 (2014).
  38. Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. The Journal of Cell Biology. 183 (6), 999-1005 (2008).
  39. Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194104 (2010).

Tags

Bioengineering Bioengineering bløde geler trækkraft antigen biofysik immunologi B-celler
Trækkraft kraft mikroskopi til undersøgelse B Lymfocyt Aktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumari, A., Pineau, J.,… More

Kumari, A., Pineau, J., Lennon-Duménil, A. M., Balland, M., Pierobon, P. Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation. J. Vis. Exp. (161), e60947, doi:10.3791/60947 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter