Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التقليدية BODIPY Conjugates ليعيش الخلية فائقة القرار المجهر وتتبع جزيء واحد

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

يمكن استخدام الاقترانات التقليدية BODIPY للخلية الحية جزيء واحد المجهري ة توطين (SMLM) من خلال استغلال بهم تشكيل عابرة، والأحمر تحول الدولة الخافتات. نحن نقدم بروتوكول SMLM الأمثل لتتبع وحل الدهون المحايدة دون الخلوية والأحماض الدهنية في الثدييات الحية وخلايا الخميرة على مقياس طول nanoscopic.

Abstract

تقنيات المجهر توطين جزيء واحد (SMLM) التغلب على حد الحيود البصري من المجهر الفلوري التقليدية ويمكن حل الهياكل داخل الخلايا وديناميات الجزيئات الحيوية مع ~ 20 نانومتر الدقة. ومن الشروط الأساسية لـ SMLM الفلوروفوريات التي تنتقل من حالة مظلمة إلى حالة فلورية من أجل تجنب التداخل الزمني للنقاط التي تعمل على نشر النقاط في كل من آلاف إطارات الحصول على البيانات. BODIPYs هي الأصباغ الراسخة مع العديد من المتجانسات المستخدمة في المجهر التقليدي. ينتج عن التكوين العابر للديمنات الأرضية ذات الحالة الأرضية التي تحولت من BODIPY (DII)انبعاثات جزيء واحد مشرقة تمكن من إجراء المجهر توطين جزيء واحد (SMLM). هنا نقدم بروتوكول بسيط ولكن تنوعا لSMLM مع الاقتران اتبوبي التقليدية في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. ويمكن استخدام هذا الإجراء للحصول على صور فائقة الدقة وتتبع حالات بودي ديالثاني واحدة لاستخراج المعلومات الزمنية spatio من الاقترانات BODIPY. نحن نطبق هذا الإجراء لحل قطرات الدهون (LDs) ، والأحماض الدهنية ، والليسوسومافي ة الخميرة الحية وخلايا الثدييات على مقياس طول النانسكوبي. وعلاوة على ذلك، ونحن نظهر قدرة التصوير متعددة الألوان مع الأصباغ BODIPY عند استخدامها جنبا إلى جنب مع تحقيقات الفلورسنت الأخرى. تظهر نتائجنا التمثيلية التوزيع المكاني التفاضلي وحركة الأحماض الدهنية BODIPY والدهون المحايدة في الخميرة في ظل ظروف التغذية والصيام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول الأمثل لSMLM مع مئات من المجمعات المتاحة تجاريا BODIPY وهو مورد مفيد لدراسة العمليات البيولوجية على مقياس النانو أبعد بكثير من تطبيقات هذا العمل.

Introduction

ظهرت تقنيات المجهر المجهري ة ذات الجزيء الواحد (SMLM) مثل المجهر الضوئي لإعادة البناء العشوائي (STORM) والمجهر التوطين المنشط بالصور (PALM) كطرق لتوليد صور فائقة الدقة مع معلومات تتجاوز حد الحيود البصري لآبي1،2 ولتتبع ديناميكيات الجزيئات الحيوية المفردة3،4. أحد متطلبات المسابير المتوافقة مع SMLM هو القدرة على التحكم في عدد الفلوروبورورس النشط في أي وقت لتجنب التداخل المكاني لوظائف انتشار النقاط (PSF). في كل من الآلاف من إطارات الحصول على البيانات ، يتم تحديد موقع كل فلوروفوريس الفلورسنت مع ~ 20 نانومتر الدقة عن طريق تركيب وظيفة انتشار نقطة المقابلة. تقليديا، وقد تم التحكم في وامض على قبالة من الفلوروفوراس من خلال تبديل الضوئي stochastic1،,2،,5 أو الناجمة كيميائيا الوميض الجوهرية6. وتشمل النهج الأخرى التنشيط المستحث للفلوروجين اتّلى على ربط عابر لبروتين الفلوروجين المنشط7،,8 والربط غير الملزم للبرمجة من oligomers الحمض النووي المسمى في الفلورسة الانعكاسية الداخلية الكلية (TIRF) أو إثارة ورقة الضوء9. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن استراتيجية جديدة ومتعددة الاستخدامات لـ SMLM10 التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا مع تغير اللون الأحمر (DII)حالات البورون التقليدية دي بيروميثان (BODIPY) التي تتجاور11،12،13 تتشكل بشكل عابر وتصبح متحمسة على وجه التحديد ويتم اكتشافها مع أطوال موجية ذات تحول أحمر.

BODIPYs هي الأصباغ المستخدمة على نطاق واسع مع مئات من المتغيرات التي تسمية على وجه التحديد المقصورات دون الخلوية والجزيئات الحيوية14،15،16. بسبب سهولة استخدامها وتطبيقها في الخلايا الحية ، تتوفر متغيرات BODIPY تجاريًا للتنظير المجهري التقليدي للفلورسينس. هنا ، نحن نصف بروتوكول مفصل والأمثل حول كيفية مئات من المتاحة تجاريا BODIPY conjugates يمكن استخدامها ليعيش الخلية SMLM. من خلال ضبط تركيز مونومرات BODIPY وعن طريق تحسين قوى الليزر الإثارة ، يتم الحصول على معلمات التصوير وتحليل البيانات والصور عالية الدقة عالية الدقة وبيانات تتبع الجزيء الواحد في الخلايا الحية. عند استخدامها بتركيز منخفض (25-100 nM)، يمكن استخدام الاقترانات بوديبي في وقت واحد لSMLM في القناة الحمراء التحول وللمجهرية الفلورية التقليدية القرابة في قناة الانبعاثات التقليدية. يمكن تحليل بيانات الجزيء الواحد التي تم الحصول عليها لتحديد التنظيم المكاني للهياكل غير المتنقلة واستخراج الحالات المنحلة للجزيئات في الخلايا الحية17. توافر تحقيقات BODIPY في كل من الأشكال الخضراء والحمراء يسمح للتصوير متعدد الألوان عند استخدامها في المزيج الصحيح مع الفلوروفوريات الأخرى المتوافقة.

في هذا التقرير، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل للحصول على وتحليل البيانات الخلية الحية SMLM باستخدام BODIPY-C12،BODIPY (493/503)، BODIPY-C12 الأحمر وlysotracker-الأخضر في ألوان متعددة. نحن حل الأحماض الدهنية والدهون محايدة في الخميرة الحية وخلايا الثدييات مع ~ 30 نانومتر القرار. ونحن نثبت كذلك أن خلايا الخميرة تنظيم التوزيع المكاني للأحماض الدهنية المضافة خارجيا اعتمادا على حالتها الأيضية. نجد أن وأضاف BODIPY الأحماض الدهنية (FA) التوطين إلى التحمية الإندوسلية (ER) وقطرات الدهون (LDs) في ظل ظروف تغذية في حين BODIPY-FAs تشكل مجموعات غير LD في غشاء البلازما عند الصيام. كما نقوم بتوسيع نطاق تطبيق هذه التقنية إلى صورة الليسوسوماوسومات والمواد LDs في خلايا الثدييات الحية. لدينا بروتوكول الأمثل لSMLM باستخدام الاقترانات BODIPY التقليدية يمكن أن يكون موردا مفيدا لدراسة العمليات البيولوجية على مقياس النانو مع عدد لا يحصى من الاتزان اتّهاب ة BODIPY المتاحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: لاستنساخ الخميرة ووضع العلامات الذاتية يرجى الرجوع إلى المنشور الأخير10.

1. إعداد عينات خلايا الخميرة للتصوير

  1. إعداد ثقافة السائل بين عشية وضحاها من سلالة الخميرة w303. باستخدام عصا خشبية معقمة، بقعة كمية صغيرة من خلايا الخميرة من لوحة أجار التي تحتوي على استخراج الخميرة-peptone-dextrose في أنبوب ثقافة مع ~ 2 مل من dextrose الاصطناعية كاملة (SCD) المتوسطة. احتضان الأنبوب بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز في 270 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
  2. إجراء تخفيف 1:50 صباحي للخلايا في SCD. استمر في استزراع الخلايا المخففة لمدة 4 ساعة عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز 270 دورة في الدقيقة ، مما يسمح للخلايا بالنمو في مرحلة الأسي والوصول إلى كثافة بصرية (OD) تبلغ ~ 0.6.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف الإجراء هنا اعتماداً على الحالة الأيضية التي يتم دراستها. لا تتطلب الاتزانات BODIPY خلايا في مرحلة النمو الأسي. ومع ذلك ، كن مدركًا للفلور الفلورية من الخلايا الميتة خلال المرحلة الثابتة ، حيث يمكن أن يسبب إشارة خلفية قوية جدًا لتحليل انبعاثات BODIPY-DII واحدة.
  3. لدراسة خلايا الصيام، وتنمو ثقافة الخميرة لمدة 2 أيام دون تبادل وسائل الإعلام.
  4. في ~ 30 دقيقة قبل طلاء الخلايا، واحتضان غطاء زجاجي غرفة مع 80 ميكرولتر من 0.8 ملغ/ مل معقم Concanavalin A (كونا) في H2O deionized في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، اغسل زجاج الغلاف ثلاث مرات بH2O المنتأين.
  5. في ~ 30 دقيقة قبل التصوير، ماصة الخلايا على زجاج الغلاف غرفة، مع الحجم الصحيح من SCD الطازجة لتحقيق كثافة بصرية من ~ 0.12 (عادة 60 ميكرولتر ثقافة الخميرة في OD ~ 0.6 في 240 ميكرولتر SCD). السماح للخلايا تسوية والالتزام سطح كونا لمدة 30 دقيقة.
  6. إضافة الاقتران بودي المطلوب مباشرة إلى زجاج الغلاف غرفة بتركيز النهائي من ~ 100 nM.
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى تجربة تحسين تركيز BODIPY اعتماداً على الكثافة المحلية BODIPYs في مقصورة خلوية معينة.

2. إعداد خلايا الثدييات لتصوير SMLM

  1. الحفاظ على خلايا U2OS الثدييات في DMEM غير الفلورية مع 10٪ مصل البقر الجنين، 4 mM الجلوتامين، 1 mM بيروفات الصوديوم والمضادات الحيوية البنسلين-العقديات 1٪ في قارورة T25.
    ملاحظة: يمكن أيضًا الحفاظ على الخلايا في DMEM مع مصل البقر الجنيني بنسبة 10٪ والمضادات الحيوية البنسلين-العقديات، ومع ذلك، يجب تبادل الوسط قبل التصوير مع محلول غير فلوري.
  2. تقسيم الخلايا في 70-80٪ التقاء 1:5 في بئر واحد من لوحة 8 بئر. ثقافة الخلايا في لوحة 8 بئر لمدة 12 إلى 24 ساعة قبل التصوير.
  3. إضافة BODIPY-C12، LysoTracker الأخضر أو أي اقتران BODIPY أخرى في تركيز نهائي من 100 nM (حلول الأسهم في كبريتيد ثنائي ميثيل [DMSO]) 10 دقيقة قبل التصوير. يمكن أن تختلف هذه المرة استناداً إلى التجربة المطلوبة.
    ملاحظة: يمكن إجراء التصوير في درجة الحرارة المحيطة (23 درجة مئوية) باستخدام محلول تصوير الخلايا الحية. ومع ذلك، التصوير في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 مع DMEM غير الفلورية مختلطة مع 10٪ مصل البقري الجنيني، 4 mM الجلوتامين، 1 mm بيروفات الصوديوم والمضادات الحيوية البنسلين-العقديات 1٪ ويفضل للحفاظ على الخلايا أقرب إلى الظروف الفسيولوجية وجعل استنتاجات بيولوجية.

3- إعداد المعدات

  1. قم بتركيب مجموعات التصفية المناسبة في مسار الانبعاثات استنادًا إلى لون الانبعاثات لـ BODIPY المستخدم.
    ملاحظة: مرآة ديكهرويك رباعية النطاقات (zt/405/488/561/640rdc) أولاً يفصل الإثارة عن ضوء الانبعاثات. ثم يتم تقسيم الانبعاثات الخضراء (525 نانومتر) والانبعاثات الحمراء (595 نانومتر) بواسطة مقسم شعاع تمريرة طويلة الديكهرويك (T562lpxr) تليها مرشحات تمرير الفرقة ET525/50 في القناة الخضراء وET 595/50 في القناة الحمراء. ثم يتم عرض القناتين إلى مناطق مختلفة من نفس رقاقة الكاميرا. وبالمثل، يتم تقسيم الانبعاثات الحمراء (595 نانومتر) والانبعاثات الحمراء البعيدة أولاً بواسطة مقسم شعاع طويل التمرير (FF652-Di01) متبوعاً بمرشحات تمرير الفرقة ET 610/75 في الأحمر وFF731/137 في القناة الحمراء البعيدة.
  2. بدوره على المجهر، مرحلة المجهر، وأشعة الليزر (488 نانومتر، 561 نانومتر) والكاميرا. هنا يتم استخدام المجهر مقلوب مع نظام التركيز المثالي وكاميرا EMCCD تبريد إلى -68 درجة مئوية.
  3. إضافة قطرة من زيت الغمر على الهدف المجهر.
  4. افتح برنامج Hal4000 (انظر جدول المواد)الذي يتحكم في ضوء LED للتصوير الميداني الساطع وقوى الليزر ومصاريع الليزر وإعدادات الكاميرا للتصوير. تعيين مكاسب EMCCD إلى 30 ودرجة حرارة الكاميرا إلى -68 درجة مئوية. إعداد الكاميرا والبرامج المقابلة لتسجيل الأفلام في 20 هرتز.
    ملاحظة: تنطبق هذه التقنية على أي مجهر واسع المجال قادر على التصوير المجهري للتعريب (PALM) والمجهر الضوئي (STORM) الذي يتم تنشيطه ضوئيًا. قد تختلف البرامج المقابلة.
  5. بدوره على سخان مرحلة المجهر وتعيينها إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية وإلى مستوى CO2 من 5٪. ضبط طوق التصحيح الهدف وفقا لذلك.
  6. قم بتركيب العينة على مرحلة المجهر وركز حتى يشارك نظام التركيز. نقل المرحلة باستخدام وحدة تحكم المرحلة حتى تظهر خلايا صحية في مجال العرض.
    ملاحظة: للتصوير بخلايا الخميرة في درجة حرارة الغرفة، ليست هناك حاجة لتشغيل سخان أو CO2 التحكم.
  7. بدوره على الليزر المناسب لإثارة مونومرات وكذلك dimers. لBODIPY الخضراء أو LysoTracker الخضراء، ونحن نستخدم ليزر 561 نانومتر لإثارة الدول DII لSMLM وليزر 488 نانومتر لإثارة مونومرات للفلورسينس التقليدية.
    ملاحظة: لBODIPY الأحمر، واستخدام ليزر 640 نانومتر لإثارة الدول DII لSMLM وليزر 561 نانومتر لإثارة مونومرات للفلورسرينس التقليدية. لBODIPY الأحمر، وضبط 561 نانومتر و 640 نانومتر سلطات الليزر لتصور الفلورسال السائبة في القناة الحمراء ورشقات نارية جزيء واحد في القناة الحمراء البعيدة. الطاقة النموذجية ل561 نانومتر ~ 0.06 W/cm2 و ~ 5 كيلوواط / سم2 ل640 نانومتر. لBODIPY الخضراء، نتوقع أن نرى أيضا الفلورسال التقليدية في قناة الانبعاثات الخضراء تحت 561 نانومتر الإثارة. لBODIPY الأحمر، نتوقع أن نرى الفلورسين التقليدية في القناة الحمراء تحت 640 نانومتر الإثارة. تنشأ هذه الإشارة من الانبعاثات المضادة لستوكس ، والتي تصبح مفيدة لصور التعريب المشترك المونومر / خافت مع الإثارة المستمرة بالليزر.

4 - الحصول على البيانات

  1. تحميل تسلسل مصراع الليزر لإثارة مونومرات وكذلك dimers.
    ملاحظة: نحن عادة استخدام تسعة إطارات إثارة جزيء واحد في 561 نانومتر تليها إطار الإثارة التقليدية واحدة في 488 نانومتر. وهذا يوفر إشارة أكثر إشراقا الفلورسيز التقليدية ويتجنب تسرب آخر 488 نانومتر الفلوروفور ينقب مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في قناة الكشف عن جزيء واحد الأحمر في تطبيقات التصوير متعددة الألوان. بدلاً من ذلك، قم بتشغيل الليزر 561 نانومتر بشكل مستمر ويعتمد على الانبعاثات المضادة لستوكس للصور التقليدية في قناة الطول الموجي الأقصر.
  2. ضبط قوى الليزر بحيث يتم الكشف عن رشقات نارية الفلورسينس جزيء واحد في قناة الانبعاثات الحمراء تحول تحت 561 نانومتر الإثارة، ويظهر الفلورسال التقليدية في قناة الانبعاثات الخضراء مع 488 نانومتر الإثارة. وسوف تكون قوى الليزر النموذجية من ليزر 561 نانومتر حوالي 0.8-1 كيلوواط /سم2 لSMLM، و 0.035-0.07 W/cm2 لليزر 488 نانومتر في وضع التصوير الفلوري التقليدي.
  3. اختر مجلد ًا للأفلام وسجل إطارات الاستحواذ 5,000-20,000 لجمع عمليات تعريب كافية لإعادة بناء الصور فائقة الدقة.
  4. الانتقال إلى حقول عرض مختلفة وتكرار الخطوات المذكورة أعلاه لجمع البيانات من المزيد من الخلايا.

5- تحليل البيانات وتتبع الجزيء الواحد

  1. تحميل الفيلم في برنامج تحليل SMLM.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي برنامج18. نحن نستخدم INSIGHT (انظر جدول المواد)وعبر التحقق من صحة النتائج باستخدام البرنامج المساعد ThunderSTORM19 لimageJ (فيجي).
  2. شاشة الفيلم بصريا وضبط إعدادات التباين مثل أن التئم الفلور سيوم واحد الوميض مرئية. إذا لزم الأمر تقييد المنطقة أو نطاق الإطار لتحليل البيانات SMLM إذا كانت أجزاء من العينة تفلور باستمرار.
  3. تعيين معلمات تحديد جزيء واحد للتركيب مع 2D غاوسي PSFs (ROI: 7 × 7 بكسل مع حجم بكسل 160 نانومتر، عرض 260-650 نانومتر، ارتفاع > 50 فوتون). بصريا الشاشة من خلال بعض الإطارات المثال للتحقق من معلمات تحديد الهوية والكشف بشكل موثوق عن رشقات نارية الفلورالية جزيء واحد متميزة (انظر الشكل 1C).
    ملاحظة: يمكن تعديل بعض معلمات التعريف مثل الارتفاع والعرض قليلاً لتحسين التعرف على إشارات الفلورسان الجزيء الواحد المتصورة بصرياً.
  4. إجراء تحليل صورة SMLM مع معلمات التعريف الأمثل ثم تقديم كل جزيء واحد كغاوسي 2D الذي يتم ترجيح عرضه من قبل الجذر التربيعي العكسي لعدد الفوتونات المكتشفة.
  5. تقييم جودة البيانات. استخدم نطاقات الإطار المقيدة لمراقبة توزيعات الجزيء الواحد في حالات أكثر تحديدًا في الوقت المناسب. وهذا يمكن أن تفسر حركة العضيات أثناء الحصول على البيانات.
  6. لمزيد من التحليل للتوزيع المكاني وديناميات توزيعات الجزيء، قم بتصدير قائمة الجزيئات التي تم الحصول عليها التي تحتوي على إحداثيات وإطارات المظهر والفوتون اتّهاب وارتفاعات التوطين. استيراد قائمة الجزيئات في إجراءات التحليل الكتابي المخصصة.
  7. للحصول على معلومات مكانية لتوزيع جزيء واحد، قم بحساب وظيفة التوزيع الشعاعي ة (ص)، والتي تمثل كثافة التعريب كدالة للمسافة الشعاعية20. للحصول على (ص)، احسب مسافات فريدة من نوعها من جميع الإعدادات، قم بإنشاء الرسم البياني مع صناديق تتركز في صi مع ارتفاع H (ri)ومع عرض dr وتقسيمها على 2μri*dr؛ (ri)= H (r i)/ο(ri+dr)2-ri2).i ويمكن بعد ذلك استخدام وظيفة التوزيع الشعاعي للقياس الكمي ومقارنة درجة التجميع وكذلك الحجم المميز للمجموعات.
  8. للحصول على معلومات ديناميكية حول انتشار الجزيئات، ربط التعريبات التي تظهر على سبيل المثال ضمن 3 بكسل (0.48 ميكرومتر) في إطارات اكتساب البيانات المتتالية لإنشاء آثار جزيء واحد.
    ملاحظة: تعتمد مسافة الربط على انتشار الجزيئات وكثافة التعريب. يمكن تقدير المسافة القصوى للربط من خلال تحليل كثافة التعريب في كل إطار21،22. تم تحديد متوسط الكثافة على أنه 0.043 توطين لكل ميكرومتر2; وبالتالي كان نصف قطر 0.48 ميكرون ضمن كثافة منخفضة بما فيه الكفاية لضمان عدم ربط جزيئات مختلفة معا.
  9. متوسط عمليات الإزاحة لأوقات التأخر المختلفة من آثار متعددة تدوم ثلاث مرات تأخير على الأقل لإنشاء إزاحة مربعة متوسطة (MSD) مقابل مؤامرة. تناسب منحنى MSD مقابل. ΟT مع المعادلة MSD = 4DΟt +2 لحساب معامل الانتشار المتوسط D3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا ، نقدم إعداد عينة الأمثل ، وحيازة البيانات وتحليلها إجراءات لSMLM باستخدام الاقتران BODIPY على أساس البروتوكول أعلاه(الشكل 1A). لإثبات مثال على سير العمل للحصول على وتحليل البيانات SMLM، ونحن توظيف BODIPY (493/503) في الخميرة لحل LDs تحت حد الحيود البصري(الشكل 1B-F). أمثلة على طرق التصوير متعددة الألوان المختلفة من BODIPY بالتزامن مع تحقيقات أخرى مثل GFP ، يتم عرض mEos2 في الشكل 2. نحن التلاعب الحالة الأيضية في الخميرة عن طريق زراعتها في نفس الوسط ل ~ 48 ساعة وتبين أن BODIPY-C12 أشكال مجموعات غير LD غير متحركة في محيط الخلية عند الصيام على النقيض من دمجها في LDs تحت ظروف تغذية(الشكل 3). لزيادة توسيع قدرة SMLM من الاقتران BODIPY لخلايا الثدييات، ونحن صورة BODIPY-C12 وLysoTracker الخضراء في خلايا U2OS الحية(الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: التحسين من SMLM الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام الأصباغ BODIPY. (أ)سير العمل لتحسين إشارات الفلور الجزيء واحد ومعالجة البيانات SMLM بعد من الاقترانات BODIPY. (ب)صورة LED (يسار)، صورة الفلورسينس التقليدية (الأوسط، الإثارة: 488 نانومتر، الانبعاثات: 525 نانومتر) وصورة مضادة للستوكس (يمين، إثارة: 561 نانومتر، انبعاث: 525 نانومتر) من خلايا الخميرة الملطخة بعلامة LD BODIPY (493/503). (C)إطارات SMLM واحدة تظهر singe BODIPY DII الباعثين (الإثارة: 561 نانومتر، الانبعاثات: 595 نانومتر) بكثافة منخفضة جدا (يسار)، الكثافة المثلى (الأوسط) والكثافة العالية جدا (يمين). (د)تحسين معلمات تحليل SMLM. مع عتبة عدد الفوتون عالية جدا، البرنامج يفتقد إشارات جزيء واحد صالح (يسار)، ويكتشف جميع الجزيئات مع عتبة الفوتون الأمثل (الأوسط) ويكتشف التعريب كاذبة مع عتبات الفوتون منخفضة جدا (يمين). (E)SMLM صورة BODIPY (493/503) يحل حجم LDs (اليسار، التكبير) مع متوسط قطر 125 نانومتر. (و)تتبع جزيء واحد يكشف عن انتشار محصور من BODIPY (493/503) داخل LDs (يسار). يتم استخدام التتبعات لحساب منحنى MSD مقابل الوقت، الذي يعرض السلوك الفرعي المنعزل داخل LDs (يمين). شريط المقياس = 1 ميكرومتر، التكبير = 100 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التصوير SMLM متعدد الألوان باستخدام الاقتران اتزوجي بودي في الخلايا الحية. (أ)الصورة التقليدية لـ BODIPY-C12 تحت 488 نانومتر الإثارة (يسار). صورة SMLM المقابلة باستخدام الدول DII من BODIPY-C12 تحت 561 نانومتر الإثارة (الأوسط) والتكبير (يمين) الكشف عن BODIPY-C12 في LDs الناشئة.(B)صورة الفلورسينس التقليدية من ER المسمى مع Sec63-GFP تحت 488 نانومتر الإثارة (يسار). سجلت في وقت واحد صورة الفلورسينس التقليدية من BODIPY-C12 الأحمر مع 561 نانومتر الإثارة (الأوسط) وSMLM صورة باستخدام 640 نانومتر الإثارة (يمين). (C)متتابعة من لونين SMLM التصوير من Sec63-mEos2 وBODIPY-C12 الخضراء DII الدول. أولاً ، يتم تصوير mEos2 مع تنشيط صور عالي 405 نانومتر و561 نانومتر إثارة (يسار) تليها عملية اكتساب بيانات طويلة دون تنشيط 405 نانومتر (وسط). شريط مقياس = 1 ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توزيع الأحماض الدهنية التفاضلية عند الصيام في خلايا الخميرة. (أ)التخطيطي يصف حالات التمثيل الغذائي المختلفة (حالة التغذية والصيام) على أساس مدة النمو في متوسط SCD. ب) صور الفلورسال التقليدية (أعلى) تظهر أن بودي-C12 الأحمر يشارك في التوطين مع BODIPY (493/503) في ظل ظروف تغذية تشير إلى الاندماج في LDs. تظهر صورة SMLM (أسفل، يسار) كثيفة بودي-C12 puncta في LDs وآثار جزيء واحد (أسفل، يمين) تظهر نشر على طول الأغشية الخلوية. (C)تحت حالة الصيام، تشكل BODIPY-C12 puncta في محيط الخلية التي لا تشارك في التوطين مع LDs (العلوي: اليسار، الوسط، أسفل اليسار). تحل صورة SMLM البوثا والآثار المحصورة لـ BODIPY-C12 الأحمر (أسفل، يمين). (D)تظهر وظيفة التوزيع الشعاعي (يسار) تجمعًا أعلى من BODIPY-FAs عند الصيام. الإزاحة المتوسطة مربع مقابل الوقت مؤامرة من تتبع جزيء واحد (يمين) يؤكد شل عمل بودي-C12 عند الصيام. شريط المقياس = 1 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصوير الأصباغ BODIPY في خلايا U2OS الثدييات الحية. (أ)صورة الفلورسينس التقليدية (يسار) من BODIPY-C12 في 488 نانومتر الإثارة. تظهر صورة SMLM المقابلة باستخدام حالات DII (يمين) في 561 نانومتر الإثارة التوزيع النانوي للولايات DII في خلية U2OS. تظهر الإنمجموعات تكبير قطرات الدهون (شريط المقياس = 500 نانومتر). (ب)الصورة التقليدية للليسوسومافي ة خلايا U2OS باستخدام اللون الأخضر LysoTracker في 488 نانومتر الإثارة (يسار). صورة SMLM المقابلة من الليسوسومات غير المتحركة (الحق، شريط مقياس = 5 ميكرون) في 561 نانومتر الإثارة. Inset: صورة SMLM من حيود بصري ًا محدود الليسوسوم (شريط المقياس 100 نانومتر). تم تسجيل صور BODIPY-C12 في محلول تصوير الخلايا الحية عند درجة حرارة 23 درجة مئوية. تم تسجيل صور الليسوسوسوم باستخدام LysoTracker الأخضر في DMEM غير الفلورية مع 10٪ مصل البقري الجنيني، 4 mM الجلوتامين، 1 mm بيروفات الصوديوم و 1٪ المضادات الحيوية البنسلين-العقديات في 37 درجة مئوية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول ، أظهرنا كيف يمكن استخدام الاقترانات التقليدية BODIPY للحصول على صور SMLM مع ترتيب تحسن الحجم في الاستبانة المكانية. ويستند هذا الأسلوب على استغلال الحالات التي تم الإبلاغ عنها سابقا، والأحمر تحول DII من الأصباغ بودي التقليدية، والتي تشكل بشكل عابر من خلال لقاءات ثنائية الجزيئية. يمكن أن تكون هذه الدول متحمسة على وجه التحديد واكتشفت مع الأطوال الموجية الحمراء المتغيرة ومتناثرة وقصيرة الأجل بما فيه الكفاية لSMLM. من خلال ضبط تركيز مونومرات BODIPY جنبا إلى جنب مع معلمات الليزر ، يمكن تحقيق كثافة مثالية من التعريب والإشارة إلى الضوضاء. حلنا التوزيع داخل الخلايا والتنقل من نظائر الأحماض الدهنية والدهون محايدة مع ~ 30 نانومتر القرار (صيغة طومسون النظرية) في خلايا الخميرة الحية في ظل ظروف تغذية والصيام. وجدنا أيضًا أن 40٪ من حالات BODIPY DII تبقى لمدة اثنين أو أكثر من إطارات الحصول على البيانات عند 20 هرتز ، مما يتيح تتبع الجزيء الواحد لتحديد قدرتها على الحركة في ظل ظروف مختلفة. تظهر نتائجنا التوطين التفاضلي والتنقل في BODIPY-FAs عند الصيام وتقترح آلية حماية ضد السمية الدهنية. قدرتنا على تتبع جزيئات BODIPY واحدة وحل حجم LDs وBODIPY-FA puncta تحت حد الحيود البصري تحت حالات التمثيل الغذائي المختلفة هو ممكن فقط مع قدرة SMLM المتقدمة من الاقترانات بوديبي التقليدية. الآليات الجزيئية الدقيقة والمسارات التي تنطوي عليها التنظيم المكاني لتوزيع الأحماض الدهنية والاحالة هي موضوع دراساتنا المستقبلية. وعلاوة على ذلك، قمنا بتوسيع قدرة SMLM من الاقتران BODIPY التقليدية لخلايا الثدييات الحية عن طريق حل بوديب-FAs والليسوسومافي خلايا U2OS.

باستخدام الدول DII من الاقترانات BODIPY التقليدية لSMLM له مزايا على تحقيقات أخرى منذ مئات من المتغيرات BODIPY المختلفة متوفرة تجاريا أن تسمية جزيئات محددة أو مقصورات الخلوية في الخلايا الحية. إعداد العينة سهل مثل إضافة الصبغة بتركيزات منخفضة (~ 100 nM) قبل التصوير دون أي غسيل. على النقيض من غيرها من بالم / STORM المسابير التي تبيض مع مرور الوقت ، لم تتأثر مونومرات BODIPY بإثارة ولاياتها DII وبالتالي توفر مصدرًا لا يستنفد أبدًا تقريبًا لإشارات الجزيء الواحد في التصوير على المدى الطويل. منذ Dالثاني الدول تنشأ بسبب لقاءات ثنائية الجزيئية عفوية, SMLM باستخدام الدول DII لا يتطلب أي عازلة المضافة خارجيا للحث وامض23. وبالمثل، ليست هناك حاجة لتنشيط الصور عالية الطاقة كما هو مطلوب لإصدارات BODIPY القابلة للتنشيط الصور حديثا24 أو SMLM من بعض الأصباغ BODIPY التقليدية21، والتي يمكن أن تكون ضارة لصحة الخلايا أثناء التصوير على المدى الطويل25،26. وعلاوة على ذلك، فإن SMLM مع الدول DII يخلق قمع الخلفية المتأصلة من التحقيقات غير التفاعل على وجه التحديد بسبب الاعتماد التربيعي للدول DII على تركيز مونومر. لذلك ، يتم تحقيق تباين أعلى في صور SMLM مقارنة بالمجسات التقليدية التي يتم اكتشاف إشارة أحادية.

BODIPYs تحمل خافت المضادة ستوكس الفلورسينس التي تمكن من إثارة مونومرات وdimers مع ليزر واحد في قوة الإثارة عالية. من ناحية، يمكن استغلال هذه الخاصية للفلورسينس التقليدية في وقت واحد والتصوير SMLM لتتبع وحل الهياكل المتحركة. من ناحية أخرى ، فإنه يجعل من الصعب الجمع بين دول BODIPY DII مع تحقيقات أخرى للتصوير متعدد الألوان حيث تحتل إشارة BODIPY قناتين للانبعاثات. ومع ذلك ، التصوير متعدد الألوان ممكن عندما يتم اختيار المسابير بعناية كما هو موضح في الشكل 2B مع Sec63-GFP و BODIPY-C12 الأحمر. وبالمثل، تسلسلي اثنين من لون SMLM ممكن مع غيرها من الصور لتنشيط المسابير مثل mEos2 كما هو مبين في الشكل 2C. مجموعات أخرى ممكنة لSMLM اثنين من الألوان تشمل استخدام المتجانسات BODIPY الخضراء و640 نانومتر منفعل الأصباغ مثل JF646 ملزمة إلى علامة الهالة27.

باختصار ، قدمنا بروتوكولًا مثاليًا لـ SMLM باستخدام الأصباغ التقليدية BODIPY للتحقيق في التوزيع الزمني للأحماض الدهنية والدهون المحايدة والليسوسوماعلى نطاق طول النانوم في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. مع تعديلات طفيفة، يمكن أن يكون هذا البروتوكول قابلة للتطبيق على قدم المساواة لSMLM مع مئات من الاقترانات BODIPY الأخرى عبر أنواع مختلفة من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح متنافسة.

Acknowledgments

وقد دعم البحث الوارد في هذا المنشور المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R21GM127965.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 160، المجهر الفلوري، المجهر فائق الدقة، تتبع جزيء واحد، المجهر توطين جزيء واحد، بودي، ديماترز الدولة الأرض، الخميرة، خلايا الثدييات
التقليدية BODIPY Conjugates ليعيش الخلية فائقة القرار المجهر وتتبع جزيء واحد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, S., Banerjee, C.,… More

Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter