Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Konventionelle BODIPY konjugatter til Live-Cell Super-Resolution mikroskopi og Single-Molecule Tracking

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

Konventionelle BODIPY konjugatter kan bruges til live-celle enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM) gennem udnyttelse af deres forbigående danner, rød-forskudt jord tilstand dimers. Vi præsenterer en optimeret SMLM protokol til at spore og løse subcellulære neutrale lipider og fedtsyrer i levende pattedyr og gær celler på nanoskopisk længde skala.

Abstract

Enkelt molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM) teknikker overvinde den optiske diffraktion grænse for konventionel fluorescens mikroskopi og kan løse intracellulære strukturer og dynamikken i biomolekyler med ~ 20 nm præcision. En forudsætning for SMLM er fluorophores, at overgangen fra en mørk til en fluorescerende tilstand for at undgå spatio-tidsmæssig overlapning af deres punkt spredning funktioner i hver af de tusindvis af dataindsamling rammer. BODIPYs er veletablerede farvestoffer med mange konjugatter, der anvendes i konventionel mikroskopi. Den forbigående dannelse af rød-forskudt BODIPY jord-tilstand dimers (DII)resulterer i lyse enkelt molekyle emission muliggør enkelt molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM). Her præsenterer vi en enkel, men alsidig protokol for SMLM med konventionelle BODIPY konjugatter i levende gær og pattedyrceller. Denne procedure kan bruges til at erhverve super-opløsning billeder og til at spore enkelt BODIPY-DII stater til at udtrække spatio-tidsmæssige oplysninger om BODIPY konjugater. Vi anvender denne procedure til at løse lipiddråber (LDs), fedtsyrer og lysosomer i levende gær og pattedyrceller på nanoskopisk længdeskala. Desuden demonstrerer vi multifarvebilleddannelsesevnen med BODIPY farvestoffer, når de anvendes sammen med andre fluorescerende sonder. Vores repræsentative resultater viser den differentierede rumlige fordeling og mobilitet af BODIPY-fedtsyrer og neutrale lipider i gær under fodrede og fastende forhold. Denne optimerede protokol til SMLM kan bruges med hundredvis af kommercielt tilgængelige BODIPY konjugater og er en nyttig ressource til at studere biologiske processer på nanoskala langt ud over anvendelserne af dette arbejde.

Introduction

Enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM) teknikker såsom stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM) og foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) er opstået som metoder til at generere super-opløsning billeder med oplysninger ud over Abbe's optiske diffraktion grænse1,2 og til sporing af dynamikken i enkelt biomolekyler3,4. Et af kravene til sonder, der er kompatible med SMLM, er evnen til at kontrollere antallet af aktive fluororer til enhver tid for at undgå rumlig overlapning af deres punktspredningsfunktioner (PSF). I hver af de tusindvis af dataerhvervelsesrammer bestemmes placeringen af hver fluorescerende fluorores med ~20 nm præcision ved at montere den tilsvarende punktspredningsfunktion. Traditionelt er on-off blinkende af fluorofores blevet kontrolleret gennem stokastiske fotoswitching1,2,5 eller kemisk induceret iboende blinker6. Andre metoder omfatter induceret aktivering af fluorogener ved forbigående binding til et fluorogenaktiverende protein7,8 og den programmerbare binding-unbinding af mærket DNA-oligomer i total intern refleksionfluorid (TIRF) eller lysark excitation9. For nylig rapporterede vi en ny og alsidig mærkning strategi for SMLM10, hvor tidligere rapporteret rød-flyttet dimeric (DII)stater konventionelle bor di-pyromethan (BODIPY) konjugatter11,,12,13 er forbigående danner og bliver specifikt ophidset og opdaget med rød-forskudt bølgelængder.

BODIPYs er udbredte farvestoffer med hundredvis af varianter, der specifikt mærke sub-cellulære rum og biomolekyler14,15,16. På grund af deres brugervenlighed og anvendelighed i levende celler, er BODIPY varianter kommercielt tilgængelige for konventionel fluorescens mikroskopi. Her beskriver vi en detaljeret og optimeret protokol om, hvordan de hundredvis af kommercielt tilgængelige BODIPY konjugater kan bruges til live-celle SMLM. Ved at indstille koncentrationen af BODIPY monomerer og ved at optimere excitation laser beføjelser, billeddannelse og data analyse parametre, høj kvalitet super-opløsning billeder og enkelt molekyle tracking data opnås i levende celler. Når bodipy konjugatter anvendes ved lav koncentration (25-100 nM), kan de samtidig anvendes til SMLM i den rødforskudte kanal og til korreleret konventionel fluorescensmikroskopi i den konventionelle emissionskanal. De opnåede enkeltmolekyledata kan analyseres for at kvantificere den rumlige organisering af immobile strukturer og for at udtrække molekylernes diffusive tilstande i levende celler17. Tilgængeligheden af BODIPY sonder i både grønne og røde former giver mulighed for multi-farve billeddannelse, når de anvendes i den rigtige kombination med andre kompatible fluorophores.

I denne rapport, giver vi en optimeret protokol til at erhverve og analysere live-celle SMLM data ved hjælp af BODIPY-C12,BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rød og lysotracker-grøn i flere farver. Vi løser fedtsyrer og neutrale lipider i levende gær og pattedyrceller med ~ 30 nm opløsning. Vi viser endvidere, at gærceller regulerer den rumlige fordeling af eksternt tilsatte fedtsyrer afhængigt af deres metaboliske tilstand. Vi finder, at tilsat BODIPY-fedtsyrer (FA) lokalisere til endoplasmic reticulum (ER) og lipid dråber (LDs) under fodret forhold, mens BODIPY-FAs form ikke-LD klynger i plasmamembranen ved fastende. Vi udvider yderligere anvendelsen af denne teknik til billedlysomer og lysosomer i levende pattedyrceller. Vores optimerede protokol til SMLM ved hjælp af konventionelle BODIPY konjugater kan være en nyttig ressource til at studere biologiske processer på nanoskala med de utallige tilgængelige BODIPY konjugater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: For gær kloning og endogene tagging henvises til vores seneste publikation10.

1. Forberedelse af gærcelleprøver til billeddannelse

  1. Forbered en flydende natten kultur af en w303 gær stamme. Ved hjælp af en steril træpind, spot en lille mængde gær celler fra en agar plade, der indeholder gær ekstrakt-peptone-dextrose i en kultur rør med ~ 2 ml syntetisk komplet dextrose (SCD) medium. Røret inkuberes natten over i en rystende inkubator ved 270 omdrejninger i minuttet og 30 °C.
  2. Udfør en 1:50 morgen fortynding af cellerne i SCD. De fortyndede celler fortsætter med at besynde 4 timer ved 30 °C i en 270 omrystningsinkubator på 270 omdr./min., således at cellerne kan vokse i eksponentiel fase og opnå en optisk massefylde (OD) på ~0,6.
    BEMÆRK: Proceduren kan variere her afhængigt af hvilken metabolisk tilstand er ved at blive undersøgt. BODIPY konjugatter kræver ikke celler i den eksponentielle vækstfase. Men være bevidste om autofluorescens fra døde celler i den stationære fase, da det kan forårsage et baggrundssignal for stærk til at analysere enkelt BODIPY-DII udledere.
  3. For at studere fastende celler, vokse gær kultur i 2 dage uden udveksling af medier.
  4. Ved ~30 min før plettering af cellerne inkuberes et kammerdækglas med 80 μL 0,8 mg/ml steril Concanavalin A (ConA) ved stuetemperatur.2 Efter 30 min vaskes coverglasset tre gange med deioniseret H2O.
  5. På ~ 30 min før billeddannelse, pipette cellerne på chambered coverglass, med den korrekte mængde frisk SCD at opnå en optisk tæthed på ~ 0,12 (typisk 60 μL gær kultur på OD ~ 0,6 i 240 μL SCD). Lad cellerne falde til ro og klæbe til ConA overfladen i 30 min.
  6. Tilsæt den ønskede BODIPY konjugat direkte til det chambered coverglass i en endelig koncentration på ~ 100 nM.
    BEMÆRK: Et BODIPY koncentrationsoptimeringseksperiment kan være nødvendigt afhængigt af BODIPYs lokale tæthed i et bestemt cellulært rum.

2. Forberedelse af pattedyrceller til SMLM-billeddannelse

  1. PattedyrS-U2OS-cellerne bevares i ikke-fluorescerende DMEM med 10 % føtalt kvægserum, 4 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 1% penicillin-streptomycinantibiotika i en T25-kolbe.
    BEMÆRK: Celler kan også holdes i DMEM med 10% føtalt kvæg serum og 1% penicillin-streptomycin antibiotika, men mediet skal udveksles før billeddannelse med en ikke-autofluorescerende opløsning.
  2. Opdel cellerne ved 70-80% sammenløb 1:5 i en enkelt brønd af en 8-brønds plade. Cellerne i 8-brøndspladen kultur i 12 til 24 timer før billeddannelse.
  3. Tilsæt BODIPY-C12, LysoTracker Green eller enhver anden BODIPY konjugat i en endelig koncentration på 100 nM (stamopløsninger i dimethylsulfoxid [DMSO]) 10 min før billeddannelse. Denne tid kan variere baseret på det ønskede eksperiment.
    BEMÆRK: Billeddannelse kan udføres ved omgivelsestemperatur (23 °C) ved hjælp af levende cellebilleddannelsesopløsning. Billeddannelse ved 37 °C og 5% CO2 med ikke-fluorescerende DMEM blandet med 10% føtalt kvægserum, 4 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 1% penicillin-streptomycinantibiotika foretrækkes at holde cellerne tættere på fysiologiske tilstande og til at drage biologiske konklusioner.

3. Forberedelse af udstyr

  1. Monter de relevante filtersæt i emissionsstien baseret på den emissionsfarve, der anvendes.
    BEMÆRK: Et kvadratisk dichroic spejl (zt/405/488/561/640rdc) adskiller først excitationen fra emissionslyset. Den grønne emission (525 nm) og den røde emission (595 nm) opdeles derefter af en dichroic long-pass beam splitter (T562lpxr) efterfulgt af båndpasfiltre ET525/50 i den grønne kanal og ET 595/50 i den røde kanal. De to kanaler projiceres derefter til forskellige områder af den samme kamerachip. På samme måde opdeles den røde emission (595 nm) og den helt røde emission først af en dichroic long-pass beam splitter (FF652-Di01) efterfulgt af båndpasfiltre ET 610/75 i den røde og FF731/137 i den langt røde kanal.
  2. Tænd for mikroskop, mikroskop fase, lasere (488 nm, 561 nm) og kamera. Her anvendes et omvendt mikroskop med et perfekt fokussystem og et EMCCD-kamera, der afkøles til -68 °C.
  3. Tilsæt en dråbe nedsænkningsolie på mikroskopet mål.
  4. Åbn Hal4000-softwaren (se Tabel over Materialer), der styrer LED-lyset for lysfeltsbilleddannelse, laserkræfter, laserskodder og kameraindstillinger til billedbehandling. Indstil EMCCD forstærkning til 30 og kameraets temperatur til -68 °C. Forbered kameraet og den tilsvarende software til at optage film på 20 Hz.
    BEMÆRK: Denne teknik gælder for alle wide-field mikroskop i stand til foto-aktiveret lokalisering mikroskop (PALM) og stokastiske optisk rekonstruktion mikroskop (STORM) imaging. Tilsvarende software kan variere.
  5. Tænd mikroskopet fase varmelegeme og sæt den til en temperatur på 37 °C og til en CO2 niveau på 5%. Juster den objektive korrektionskrave i overensstemmelse hermed.
  6. Monter prøven på mikroskopstadiet og fokuser indtil fokussystemet går i indgreb. Flyt scenen ved hjælp af scenecontrolleren, indtil der vises raske celler i synsfeltet.
    BEMÆRK: Til billeddannelse med gærceller ved stuetemperatur er det ikke2 nødvendigt at tænde for varmeapparatet eller CO 2-styringen.
  7. Tænd for de relevante lasere til excitation af monomerer samt dimers. For BODIPY grøn eller LysoTracker grøn, bruger vi en 561 nm laser til at ophidse DII stater for SMLM og en 488 nm laser til at ophidse monomerer for konventionel fluorescens.
    BEMÆRK: For BODIPY rød, bruge en 640 nm laser til at ophidse DII stater for SMLM og en 561 nm laser til at ophidse monomerer for konventionel fluorescens. For BODIPY rød, justere 561 nm og 640 nm laser beføjelser til at visualisere bulk fluorescens i den røde kanal og enkelt molekyle brister i den langt røde kanal. Den typiske effekt for 561 nm er ~0,06 W/cm2 og ~5 kW/cm2 til 640 nm. For BODIPY grøn, forventer at også se konventionel fluorescens i den grønne emission kanal under 561 nm excitation. For BODIPY rød, forventer at se konventionel fluorescens i den røde kanal under 640 nm excitation. Dette signal opstår fra anti-Stokes emission, som bliver nyttigt for monomer / dimer co-lokalisering billeder med kontinuerlig laser excitation.

4. Dataindsamling

  1. Indlæs laser lukkersekvenser til excitation af monomerer samt dimers.
    BEMÆRK: Vi bruger typisk ni enkeltmolekyle excitation rammer ved 561 nm efterfulgt af en konventionel excitation ramme ved 488 nm. Dette giver en lysere konventionel fluorescens signal og undgår lækage af en anden 488 nm excitable fluorophore såsom grønne fluorescerende protein (GFP) i den røde enkelt-molekyle detektionskanal i multi-farve billeddannelse applikationer. Alternativt skal du tænde for 561 nm laser kontinuerligt og stole på anti-Stokes emission for konventionelle billeder i den kortere bølgelængde kanal.
  2. Tune laser beføjelser således, at enkelt molekyle fluorescens brister detekteres i den rød-forskudt emissionskanal under 561 nm excitation, og konventionel fluorescens vises i den grønne emission kanal med 488 nm excitation. Typiske laserkræfter for 561 nm laser vil være omkring 0,8-1 kW/cm2 for SMLM, og 0,035-0,07 W/cm2 for 488 nm laser i den konventionelle fluorescens imaging mode.
  3. Vælg en destinationsmappe til film, og optag 5.000-20.000 anskaffelsesrammer for at indsamle nok lokaliseringer til rekonstruktion af billeder i superopløsning.
  4. Flyt til forskellige synsfelter, og gentag ovenstående trin for at indsamle data fra flere celler.

5. Dataanalyse og sporing af et enkelt molekyle

  1. Indlæs filmen i en SMLM-analysesoftware.
    BEMÆRK: Enhver software18 kan bruges. Vi bruger INSIGHT (se tabellen over materialer) og krydsvalidere resultaterne ved hjælp af ThunderSTORM19 plugin til imageJ (Fiji).
  2. Visuelt screene filmen, og juster kontrastindstillinger, så fluorescens blinkende med et enkelt molekyle blinker. Hvis det er nødvendigt, begrænses området eller rammeområdet for SMLM-dataanalyse, hvis dele af prøven kontinuerligt fluorescerende.
  3. Angiv enkelt molekyleidentifikationsparametre for montering med 2D Gaussiske PSF'er (ROI: 7 x 7 pixel med pixelstørrelse 160 nm, bredde 260-650 nm, højde > 50 fotoner). Visuelt screene gennem nogle eksempelrammer for at kontrollere identifikationsparametrene og for pålideligt at detektere de forskellige fluorescensudbrud med et enkelt molekyle (se figur 1C).
    BEMÆRK: Visse identifikationsparametre såsom højde og bredde kan justeres en smule for at optimere genkendelsen af visuelt opfattede enkeltmolekylefluoridesignaler.
  4. Udfør SMLM billedanalyse med de optimerede identifikationsparametre, og gør derefter hvert enkelt molekyle som en 2D Gaussian, hvis bredde vægtes af den inverse kvadratrod af det fundne antal fotoner.
  5. Vurder kvaliteten af dataene. Brug begrænsede rammeområder til at observere enkelte molekylefordelinger på mere specifikke tilfælde i tid. Dette kan forklare organelle bevægelse under dataindsamling.
  6. For yderligere at analysere den rumlige fordeling og dynamik af molekylets fordelinger, eksportere den opnåede molekyle liste, der indeholder koordinater, rammer af udseende, fotoner, bredder og højder af lokaliseringer. Importer molekylelisten i brugerdefinerede skriftlige analyseprocedurer.
  7. For at opnå geografisk information om enkeltmolekylefordelingen beregnes radialfordelingsfunktionen ρ(r), som repræsenterer lokaliseringstætheden som funktion af radialafstanden20. For at opnå ρ (r), beregne unikke par-wise afstande af alle lokaliseringer, konstruere histogrammet med spande centreret på ri med højde H(ri)og med en bredde dr og dividere med 2πri* dr; (ρ(ri)= H(ri)/π(ri+dr)2-ri2). Radialfordelingsfunktionen kan derefter bruges til at kvantificere og sammenligne graden af klyngedannelse samt klyngernes karakteristiske størrelse.
  8. For at opnå dynamiske oplysninger om udbredelsen af molekyler skal du forbinde lokaliseringer, der for eksempel vises inden for 3 pixel (0,48 μm) i fortløbende dataindsamlingsrammer for at skabe enkelte molekylespor.
    BEMÆRK: Den sammenkædning afstand vil afhænge af udbredelsen af molekyler og tætheden af lokaliseringer. Den maksimale sammenkædningsafstand kan estimeres ved at analysere tætheden af lokaliseringer i hver ramme21,22. Den gennemsnitlige massefylde blev bestemt til 0,043 lokaliseringer pr.μm 2; således var en radius på 0,48 μm inden for en tilstrækkelig lav tæthed til at sikre, at forskellige molekyler ikke var forbundet.
  9. Gennemsnittet af forskydningerne for forskellige forsinkelsestider Δt fra flere spor, der varer mindst tre lag gange for at skabe et gennemsnitligt firkantet forskydning (MSD) vs. Δt-plot. Sæt MSD vs. Δt-kurven på plads med lignings-MSD = 4DΔt + σ2 for at beregne den gennemsnitlige diffusionskoefficient D3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her præsenterer vi en optimeret prøveforberedelse, dataindsamling og analyse procedure for SMLM ved hjælp af BODIPY konjugatter baseret på protokollen ovenfor (Figur 1A). For at demonstrere et eksempel på arbejdsgangen for at erhverve og analysere SMLM-data anvender vi BODIPY (493/503) i gær til at løse LD'er under den optiske diffraktionsgrænse (Figur 1B-F). Eksempler på de forskellige multifarvede billedbehandlingstilstande i BODIPY sammen med andre sonder som FFP, mEos2 er vist i figur 2. Vi manipulerer den metaboliske tilstand i gær ved at dyrke dem i samme medium for ~ 48 h og viser, at BODIPY-C12 former immobile ikke-LD klynger i celle periferien ved fastende i modsætning til deres inkorporering i LYS under fodret betingelser (Figur 3). For yderligere at udvide SMLM kapacitet BODIPY konjugater til pattedyr celler, vi billede BODIPY-C12 og LysoTracker-grøn i levende U2OS celler (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: A Optimering af SMLM-dataindsamling og -analyse ved hjælp af BODIPY-farvestoffer. (B) LED-billede (venstre), konventionel fluorescens billede (midt, excitation: 488 nm, emission: 525 nm) og anti-Stokes billede (højre, excitation: 561 nm, emission: 525 nm) af gærceller farves med LD markør BODIPY (493/503). (C) Enkelt SMLM rammer viser singe BODIPY DII udledere (excitation: 561 nm, emission: 595 nm) ved for lav densitet (venstre), optimal tæthed (midten) og for høj densitet (højre). (D) Optimering af SMLM-analyseparametre. Med en for høj foton tal tærskel, softwaren savner gyldige enkelt molekyle signaler (venstre), registrerer alle molekyler med en optimal foton tærskel (midten) og registrerer falske lokaliseringer med for lave foton tærskler (højre). (E) SMLM billede af BODIPY (493/503) løser størrelsen af LDs (venstre, zoom) med en middeldiameter på 125 nm. (F) Single molekyle tracking afslører begrænset diffusion af BODIPY (493/503) inde ID'er (venstre). Sporinger bruges til at beregne MSD vs. tidskurven, som udviser sub-diffusiv adfærd i LD'er (højre). Vægtlinje = 1 μm, zoom = 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Multifarvet SMLM-billeddannelse ved hjælp af BODIPY-konjugatter i levende celler. A Tilsvarende SMLM billede ved hjælp af DII tilstande bodipy-C12 under 561 nm excitation (i midten) og zoom (højre) afslørende BODIPY-C12 i nye LDs. (B) Konventionel fluorescens billede af ER mærket med Sec63-GFP under 488 nm excitation (venstre). Samtidig registreres konventionelle fluorescens billede af BODIPY-C12 rød med 561 nm excitation (midt) og SMLM billede ved hjælp af 640 nm excitation (højre). (C) Sekventiel to-farve SMLM billeddannelse af Sec63-mEos2 og BODIPY-C12 grønne DII stater. For det første er mEos2 afbildet med høj 405 nm foto-aktivering og 561 nm excitation (venstre) efterfulgt af lang dataindsamling uden 405 nm aktivering (i midten). Vægtlinje = 1 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Differentieret fedtsyrefordeling ved faste i gærceller. (A) Skematisk beskriver forskellige metaboliske tilstande (fodret og fastende tilstand) baseret på varigheden af væksten i SCD medium. B) Konventionelle fluorescens billeder (øverst) viser, at BODIPY-C12 røde co-lokaliserer med BODIPY (493/503) under fodret forhold, der angiver inkorporering i LYS. SMLM billedet (nederst, venstre) viser tætte BODIPY-C12 puncta i LDs og enkelt molekyle spor (lavere, højre) udviser diffusion langs cellulære membraner. (C) Under fastende tilstand, BODIPY-C12 former punktforma i cellen periferien, der ikke co-lokalisere med LDs (øvre: venstre, midten, nederste venstre). SMLM billedet løser punktta og lukkede spor af BODIPY-C12 rød (nederst, højre). (D) Radialfordelingsfunktionen (venstre) viser højere klyngedannelse af BODIPY-FA'er ved fastende. Den gennemsnitlige-firkantede forskydning vs tid plot af enkelt molekyle tracking (højre) bekræfter immobilisering af BODIPY-C12 ved fastende. Vægtstang = 1 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Billeddannelse af BODIPY farvestoffer i levende pattedyr U2OS celler. (A) Konventionel fluorescens billede (venstre) af BODIPY-C12 ved 488 nm excitation. Det tilsvarende SMLM-billede ved hjælp af DII-tilstande (til højre) ved 561 nm excitation viser den nanoskopiske fordeling af DII-tilstande i U2OS-celle. Indlægerne viser forstørrelser af lipiddråber (skalabar = 500 nm). (B) Konventionelt billede af lysosomer i U2OS-celler ved hjælp af LysoTracker grøn ved 488 nm excitation (venstre). Det tilsvarende SMLM-billede af immobile lysosomer (højre, skalabar = 5 μm) ved 561 nm excitation. Indsat: SMLM-billede af et optisk diffraktionsbegrænset lysosom (skalabjælke 100 nm). Bodipy-C12-billederne blev optaget i levende cellebilleddannelsesopløsning ved 23 °C. Billederne af lysosomer, der anvendte LysoTracker green, blev registreret i ikke-fluorescerende DMEM med 10% føtalt kvægserum, 4 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 1% penicillin-streptomycinantibiotika ved 37 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol demonstrerede vi, hvordan konventionelle BODIPY konjugatter kan bruges til at opnå SMLM billeder med en størrelsesorden forbedring i rumlig opløsning. Denne metode er baseret på at udnytte tidligere rapporterede, rød-forskudt DII stater af konventionelle BODIPY farvestoffer, som forbigående form gennem bi-molekylære møder. Disse stater kan være specifikt ophidset og opdaget med rød-forskudt bølgelængder og er sparsomme og kortvarig nok til SMLM. Ved at indstille koncentrationen af BODIPY monomerer sammen med laser parametre, en optimal tæthed af lokaliseringer og signal-til-støj kan opnås. Vi løste den intracellulære fordeling og mobilitet af fedtsyrer analoger og neutrale lipider med ~ 30 nm opløsning (teoretisk Thompson's formel) i levende gær celler under fodret og fastende forhold. Vi fandt også, at ~ 40% af BODIPY DII stater ophold på for to eller flere dataindsamling rammer på 20 Hz, så enkelt-molekyle tracking til at kvantificere deres mobilitet under forskellige forhold. Vores resultater viser den differentierede lokalisering og mobilitet bodipy-FA'er ved faste og foreslår en beskyttelsesmekanisme mod lipotoksicitet. Vores evne til at spore enkelt BODIPY molekyler og til at løse størrelsen af LDs og BODIPY-FA puncta under den optiske diffraktion grænse under forskellige metaboliske tilstande er kun muligt med den udviklede SMLM kapacitet konventionelle BODIPY konjugater. De nøjagtige molekylære mekanismer og veje, der er involveret i den rumlige regulering af fedtsyrefordelingen og optagelsen, er genstand for vores fremtidige undersøgelser. Desuden har vi udvidet SMLM-kapaciteten af konventionelle BODIPY konjugatter til levende pattedyrceller ved at løse BODIPY-FAs og lysosomer i U2OS celler.

Brug DII stater konventionelle BODIPY konjugatter til SMLM har fordele i forhold til andre sonder, da hundredvis af forskellige BODIPY varianter er kommercielt tilgængelige, at mærke specifikke molekyler eller cellulære rum i levende celler. Prøveforberedelsen er lige så let som at tilsætte farvestoffet ved lave koncentrationer (~100 nM) før billedbehandling uden vask. I modsætning til andre PALM / STORM sonder, blegemiddel over tid, er BODIPY monomerer upåvirket af excitation af deres DII stater og derfor give en næsten aldrig nedbrydende kilde til enkelt molekyle signaler i langsigtet billeddannelse. Da DII stater opstår på grund af spontane bi-molekylære møder, SMLM bruger DII stater kræver ingen eksternt tilføjet buffer til at fremkalde blinkende23. Tilsvarende er der ikke behov for højenergi foto-aktivering som krævet for nyligt syntetiseret foto-aktivatre BODIPY versioner24 eller SMLM af nogle konventionelle BODIPY farvestoffer21, som kan være skadelige for celle sundhed under langsigtede billeddannelse25,26. Desuden skaber SMLM med DII stater en iboende baggrund undertrykkelse af ikke-specifikt interagerende sonder på grund af den kvadratiske afhængighed af DII stater på monomer koncentration. Derfor opnås en højere kontrast i SMLM-billeder sammenlignet med traditionelle sonder, hvis monomeriske signal registreres.

BODIPYs udviser en svag anti-Stokes fluorescens, der muliggør excitation af monomerer og dimers med en enkelt laser ved høj excitation magt. På den ene side kan denne egenskab udnyttes til samtidig konventionel fluorescens og SMLM-billeddannelse til at spore og løse bevægelige strukturer. På den anden side gør det det sværere at kombinere BODIPY DII stater med andre sonder til multi-farve billeddannelse som BODIPY signal indtager to emissionskanaler. Det er dog muligt at billeddiagnostiske i flere farver, når sonderne vælges omhyggeligt som vist i figur 2B med Sec63-GFP og BODIPY-C12 rød. Tilsvarende sekventiel to-farve SMLM er muligt med andre foto-aktivarbare sonder som mEos2 som vist i figur 2C. Andre mulige kombinationer for to-farve SMLM omfatter brugen af grønne BODIPY konjugatter og en 640 nm excitable farvestoffer såsom JF646 bundet til glorie tag27.

Sammenfattende har vi præsenteret en optimeret protokol for SMLM ved hjælp af konventionelle BODIPY farvestoffer til at undersøge spatio-tidsmæssige fordeling af fedtsyrer, neutrale lipider og lysosomer på nanoskopisk længde skala i levende gær og pattedyr celler. Med mindre ændringer kan denne protokol også være gældende for SMLM med hundredvis af andre BODIPY konjugater på tværs af forskellige celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forskningen rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tildeling nummer R21GM127965.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Tags

Biokemi Fluorescensmikroskopi Super-opløsning mikroskopi single-molekyle tracking single-molekyle lokalisering mikroskopi BODIPY jord-tilstand dimers gær pattedyr celler
Konventionelle BODIPY konjugatter til Live-Cell Super-Resolution mikroskopi og Single-Molecule Tracking
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, S., Banerjee, C.,… More

Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter