Summary
Conventionele BODIPY conjugaten kunnen worden gebruikt voor live-cel single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) door de exploitatie van hun tijdelijk vormende, rood verschoven grond staat dimers. We presenteren een geoptimaliseerd SMLM-protocol om subcellulaire neutrale lipiden en vetzuren in levende zoogdier- en gistcellen op nanoscopische lengteschaal te volgen en op te lossen.
Abstract
Single molecule lokalisatie microscopie (SMLM) technieken overwinnen de optische diffractie limiet van conventionele fluorescentie microscopie en kan intracellulaire structuren en de dynamiek van biomoleculen met ~ 20 nm precisie op te lossen. Een voorwaarde voor SMLM zijn fluoroforen die de overgang van een donkere naar een fluorescerende toestand om spatio-temporele overlap van hun point spread functies in elk van de duizenden data acquisitie frames te voorkomen. BODIPYs zijn gevestigde kleurstoffen met tal van conjugaten gebruikt in conventionele microscopie. De voorbijgaande vorming van rood-verschoven BODIPY grond-staat dimers (DII) resulteert in heldere single molecule emissie waardoor single molecule lokalisatie microscopie (SMLM). Hier presenteren we een eenvoudig maar veelzijdig protocol voor SMLM met conventionele BODIPY conjugaten in levende gist- en zoogdiercellen. Deze procedure kan worden gebruikt om beelden met superresolutieII te verkrijgen en om afzonderlijke BODIPY-D II-toestanden te volgen om spatio-temporele informatie van BODIPY-verenigwonden te extraheren. We passen deze procedure toe om lipidedruppels (ID's), vetzuren en lysosomen in levende gist- en zoogdiercellen op te lossen op nanoscopische lengteschaal. Bovendien tonen we de multi-color imaging vermogen met BODIPY kleurstoffen bij gebruik in combinatie met andere fluorescerende sondes. Onze representatieve resultaten tonen de differentiële ruimtelijke verdeling en mobiliteit van bodipy-vetzuren en neutrale lipiden in gist onder gevoede en nuchtere omstandigheden. Dit geoptimaliseerde protocol voor SMLM kan worden gebruikt met honderden commercieel beschikbare BODIPY conjugaten en is een nuttige bron om biologische processen op nanoschaal tot ver buiten de toepassingen van dit werk te bestuderen.
Introduction
Single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) technieken zoals stochastische optische reconstructie microscopie (STORM) en foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) zijn ontstaan als methoden voor het genereren van super-resolutie beelden met informatie buiten abbe's optische diffractie limiet1,2 en voor het bijhouden van de dynamiek van singlemolecules3,4. Een van de vereisten voor sondes die compatibel zijn met SMLM is de mogelijkheid om het aantal actieve fluoroforen op elk gewenst moment te controleren om ruimtelijke overlappingen van hun point spread-functies (PSF) te voorkomen. In elk van de duizenden data-acquisitie frames, de locatie van elke fluorescerende fluorofoforen wordt vervolgens bepaald met ~ 20 nm precisie door montage van de bijbehorende point-spread functie. Traditioneel is het aan-uit knipperen van fluoroforen gecontroleerd door stochastische fotoswitching1,2,5 of chemisch geïnduceerde intrinsieke knipperende6. Andere benaderingen zijn de geïnduceerde activering van fluorogenen bij tijdelijke binding aan een fluorogeneactiverend eiwit7,8 en de programmeerbare binding-unbinding van gelabelde DNA-oligomeren in totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) of lichtbladexcitatie9. Onlangs rapporteerden we een nieuwe en veelzijdige etikettering strategie voor SMLM10 waarin eerder gemeld rood-verschoven dimeric (DII)staten van conventionele boor di-pyrometan (BODIPY) vervoeging11,12,13 zijn tijdelijk vormen en worden specifiek opgewonden en gedetecteerd met rood-verschoven golflengten.
BODIPYs zijn veel gebruikte kleurstoffen met honderden varianten die specifiek label sub-cellulaire compartimenten en biomoleculen14,15,16. Vanwege hun gebruiksgemak en toepasbaarheid in levende cellen, zijn BODIPY-varianten commercieel beschikbaar voor conventionele fluorescentiemicroscopie. Hier beschrijven we een gedetailleerd en geoptimaliseerd protocol over hoe de honderden commercieel verkrijgde BODIPY-veren kunnen worden gebruikt voor live-cel SMLM. Door de concentratie van BODIPY monomeren af te stemmen en door de excitatielaserkrachten, beeldvormings- en data-analyseparameters te optimaliseren, worden hoogwaardige superresolutiebeelden en trackinggegevens van één molecuul verkregen in levende cellen. Bij gebruik bij lage concentratie (25-100 nM) kunnen BODIPY-conjugaten gelijktijdig worden gebruikt voor SMLM in het roodverschuivde kanaal en voor correlerende conventionele fluorescentiemicroscopie in het conventionele emissiekanaal. De verkregen gegevens van één molecuul kunnen worden geanalyseerd om de ruimtelijke organisatie van immobiele structuren te kwantificeren en de verspreidingstoestanden van moleculen in levende cellen17te extraheren. De beschikbaarheid van BODIPY-sondes in zowel groene als rode vormen zorgt voor multi-color imaging bij gebruik in de juiste combinatie met andere compatibele fluoroforen.
In dit rapport bieden we een geoptimaliseerd protocol voor het verkrijgen en analyseren van live-cel SMLM-gegevens met behulp van BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rood en lysotracker-groen in meerdere kleuren. We lossen vetzuren en neutrale lipiden op in levende gist- en zoogdiercellen met ~ 30 nm resolutie. We tonen verder aan dat gistcellen de ruimtelijke verdeling van extern toegevoegde vetzuren reguleren, afhankelijk van hun metabole toestand. We vinden dat toegevoegde LICHAAMSvetzuren (FA) lokaliseren naar het endoplasmatische reticulum (ER) en lipide druppels (ID's) onder gevoede omstandigheden, terwijl BODIPY-FAs vormen niet-LD clusters in het plasmamembraan bij het vasten. We breiden de toepassing van deze techniek verder uit naar beeldlysosomen en ID's in levende zoogdiercellen. Ons geoptimaliseerde protocol voor SMLM met behulp van conventionele BODIPY conjugaten kan een nuttige bron zijn om biologische processen op nanoschaal te bestuderen met de talloze beschikbare BODIPY-vervoeging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Voor gist klonen en endogene tagging verwijzen wij u naar onze recente publicatie10.
1. Bereiding van gistcelmonsters voor beeldvorming
- Bereid een vloeibare nachtelijke cultuur van een w303 gist stam. Met behulp van een steriele houten stok, spot een kleine hoeveelheid gistcellen uit een agar plaat met gist extract-peptone-dextrose in een cultuur buis met ~ 2 mL van synthetische complete dextrose (SCD) medium. Incubeer de buis 's nachts in een schuddende couveuse bij 270 tpm en 30 °C.
- Voer een 1:50 ochtendverdunning van de cellen in SCD uit. Blijf de verdunde cellen 4 uur bij 30 °C kweken in een 270 rpm schuddende incubator, waardoor de cellen in exponentiële fase kunnen groeien en een optische dichtheid (OD) van ~0,6 kunnen bereiken.
OPMERKING: De procedure kan hier variëren, afhankelijk van welke metabole toestand wordt bestudeerd. BODIPY-conjugaten vereisen geen cellen in de exponentiële groeifase. Echter, bewust zijn van autofluorescentie van dode cellen tijdens de stationaire fase, omdat het kan leiden tot een achtergrond signaal te sterk om enkele BODIPY-DII zenders te analyseren. - Voor het bestuderen van vastencellen, groeien de gistcultuur voor 2 dagen zonder uitwisseling van media.
- Op ~30 min voorafgaand aan het platbeteren van de cellen, incuberen een chambered coverglass met 80 μL van 0,8 mg/mL steriel Concanavaline A (ConA) in gedeïoniseerde H2O bij kamertemperatuur. Na 30 min, was de coverglass drie keer met gedeïized H2O.
- Op ~30 min voor beeldvorming, pipet de cellen op de chambered coverglass, met het juiste volume van verse SCD om een optische dichtheid van ~ 0,12 (meestal 60 μL gist cultuur bij OD ~ 0,6 in 240 μL SCD). Laat de cellen 30 minuten op het ConA-oppervlak afeffen.
- Voeg de gewenste BODIPY conjugaat direct toe aan de chambered coverglass bij een uiteindelijke concentratie van ~100 nM.
OPMERKING: Afhankelijk van de lokale dichtheid van bodipys in een bepaald cellulair compartiment kan een experiment met lichaamsconcentratieoptimalisatie vereist zijn.
2. Bereiding van zoogdiercellen voor SMLM-beeldvorming
- Onderhoud de zoogdier-U2OS-cellen in niet-fluorescerende DMEM met 10% foetaal runderserum, 4 mM glutamine, 1 mM natriumpyruvaat en 1% penicilline-streptomycine antibiotica in een T25-kolf.
OPMERKING: Cellen kunnen ook worden gehandhaafd in DMEM met 10% foetale runderserum en 1% penicilline-streptomycine antibiotica, maar het medium moet worden uitgewisseld voordat beeldvorming met een niet-autofluorescente oplossing. - Splits de cellen op 70-80% samenvloeiing 1:5 in een enkele put van een 8-well plaat. Kweek de cellen in de 8-put plaat voor 12 tot 24 uur voor beeldvorming.
- Voeg BODIPY-C12, LysoTracker Green of een andere BODIPY conjugaat toe bij een uiteindelijke concentratie van 100 nM (stockoplossingen in dimethylsulfoxide [DMSO]) 10 min voor beeldvorming. Deze tijd kan variëren op basis van het gewenste experiment.
OPMERKING: Beeldvorming kan worden uitgevoerd bij omgevingstemperatuur (23 °C) met behulp van live celbeeldvormingsoplossing. Beeldvorming bij 37 °C en 5% CO2 met niet-fluorescerende DMEM gemengd met 10% foetale runderserum, 4 mM glutamine, 1 mM natriumpyruvaat en 1% penicilline-streptomycine antibiotica heeft de voorkeur om cellen dichter bij fysiologische omstandigheden te houden en biologische conclusies te trekken.
3. Voorbereiding van apparatuur
- Monteer de juiste filtersets in het emissiepad op basis van de emissiekleur van de gebruikte bodipy.
LET OP: Een quad-band dichroic spiegel (zt/405/488/561/640rdc) scheidt eerst de excitatie van het emissielicht. De groene emissie (525 nm) en rode emissie (595 nm) worden vervolgens gesplitst door een dichroic long-pass beam splitter (T562lpxr) gevolgd door band-pass filters ET525/50 in het groene kanaal en ET 595/50 in het rode kanaal. De twee kanalen worden vervolgens geprojecteerd op verschillende gebieden van dezelfde camera chip. Ook de rode emissie (595 nm) en de ver-rode emissie worden eerst gesplitst door een dichroic long-pass beam splitter (FF652-Di01), gevolgd door band-pass filters ET 610/75 in het rood en FF731/137 in het verre rode kanaal. - Zet de microscoop, microscoop podium, lasers (488 nm, 561 nm) en camera. Hier wordt een omgekeerde microscoop met een perfect scherp focussysteem en een EMCCD camera gekoeld tot -68 °C gebruikt.
- Voeg een druppel onderdompelingsolie toe aan de microscoopdoelstelling.
- Open de Hal4000-software (zie de tabel van materialen)die het LED-licht regelt voor heldere veldbeeldvorming, laservermogens, laserluiken en camera-instellingen voor beeldvorming. Stel de EMCCD-versterking in op 30 en de cameratemperatuur op -68 °C. Bereid de camera en bijbehorende software voor om films op 20 Hz op te nemen.
OPMERKING: Deze techniek is van toepassing op elke breedveldmicroscoop die in staat is om foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) en stochastische optische reconstructie microscopie (STORM) beeldvorming. De bijbehorende software kan variëren. - Zet de kachel van de microscoop aan en zet deze in op een temperatuur van 37 °C en op een CO2-niveau van 5%. Pas de objectieve correctiekraag dienovereenkomstig aan.
- Monteer het monster op de microscoop fase en focus totdat het scherpstelsysteem in dienst neemt. Verplaats het werkgebied met de fasecontroller totdat gezonde cellen in het gezichtsveld worden weergegeven.
OPMERKING: Voor beeldvorming met gistcellen bij kamertemperatuur is het niet nodig om de verwarming of CO2-regeling in te schakelen. - Zet de juiste lasers aan voor de excitatie van monomeren en dimers. Voor BODIPY groen of LysoTracker groen, gebruiken we een 561 nm laser om DII staten te prikkelen voor SMLM en een 488 nm laser om monomeren te prikkelen voor conventionele fluorescentie.
OPMERKING: Gebruik voor BODIPY-rood een laser van 640 nm om DII-toestanden op te wekken voor SMLM en een 561 nm-laser om de monomeren op te wekken voor conventionele fluorescentie. Voor BODIPY rood, pas de 561 nm en 640 nm laser bevoegdheden om bulk fluorescentie visualiseren in het rode kanaal en enkele molecuul uitbarstingen in de ver-rode kanaal. Het typische vermogen van 561 nm is ~0,06 W/cm2 en ~5 kW/cm2 voor 640 nm. Voor BODIPY groen, verwachten ook conventionele fluorescentie te zien in het groene emissiekanaal onder 561 nm excitatie. Voor BODIPY rood, verwachten conventionele fluorescentie te zien in het rode kanaal onder 640 nm excitatie. Dit signaal komt voort uit anti-Stokes emissie, die nuttig wordt voor monomeer / dimer co-lokalisatie beelden met continue laser excitatie.
4. Gegevensverwerving
- Laad laser sluitersequenties voor de excitatie van monomeren en dimers.
OPMERKING: We gebruiken meestal negen enkele molecule excitatieframes bij 561 nm, gevolgd door een conventioneel excitatieframe op 488 nm. Dit biedt een helderder conventioneel fluorescentiesignaal en voorkomt lekken van nog eens 488 nm prikkelbare fluorofofre zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) in het rode detectiekanaal met één molecuul in multi-color imaging-toepassingen. U ook de 561 nm laser continu inschakelen en vertrouwen op de anti-Stokes-emissie voor conventionele beelden in het kortere golflengtekanaal. - Stem de laserkrachten zodanig af dat enkelmolecuulfluorescentieuitbarstingen worden gedetecteerd in het roodverschuivde emissiekanaal onder 561 nm excitatie, en conventionele fluorescentie verschijnt in het groene emissiekanaal met 488 nm excitatie. Typische laserkrachten van de 561 nm laser zal ongeveer 0,8-1 kW/cm2 voor SMLM, en 0,035-0,07 W/cm2 voor de 488 nm laser in de conventionele fluorescentie imaging modus.
- Kies een doelmap voor films en neem 5.000-20.000 acquisitieframes op om voldoende lokalisaties te verzamelen voor het reconstrueren van afbeeldingen met superresolutie.
- Ga naar verschillende weergavevelden en herhaal de bovenstaande stappen om gegevens uit meer cellen te verzamelen.
5. Data-analyse en single-molecule tracking
- Laad de film in een SMLM-analysesoftware.
LET OP: Elke software18 kan worden gebruikt. We gebruiken INSIGHT (zie de tabel van materialen)en valideren de resultaten met behulp van de ThunderSTORM19 plugin voor imageJ (Fiji). - Screen de film visueel en pas contrastinstellingen zodanig aan dat vloeiend knipperen met één molecuul zichtbaar is. Beperk indien nodig het gebied of het framebereik voor SMLM-gegevensanalyse als delen van het monster continu fluorescerend zijn.
- Stel identificatieparameters voor één molecuul in voor montage met 2D Gaussian PSFs (ROI: 7 x 7 pixels met pixelgrootte 160 nm, breedte 260-650 nm, hoogte > 50 fotonen). Screen visueel door enkele voorbeeldframes om de identificatieparameters te controleren en om de afzonderlijke fluorescentieuitbarstingen van één molecuul betrouwbaar te detecteren (zie figuur 1C).
OPMERKING: Bepaalde identificatieparameters zoals hoogte en breedte kunnen enigszins worden aangepast om de herkenning van visueel waargenomen fluorescentiesignalen van één molecuul te optimaliseren. - Voer SMLM-beeldanalyse uit met de geoptimaliseerde identificatieparameters en maak vervolgens elk molecuul als een 2D Gaussian waarvan de breedte wordt gewogen door de omgekeerde vierkantswortel van het gedetecteerde aantal fotonen.
- Beoordeel de kwaliteit van de gegevens. Gebruik beperkte framebereiken om afzonderlijke molecuulverdelingen in meer specifieke gevallen in de tijd te observeren. Dit kan rekening houden met organelle beweging tijdens het verwerven van gegevens.
- Om de ruimtelijke verdeling en dynamiek van de moleculeverdelingen verder te analyseren, exporteert u de lijst met verkregen moleculen met de coördinaten, de vormkaders, de fotonen, de breedtes en de hoogten van de lokalisaties. Importeer de lijst met moleculen in aangepaste schriftelijke analyseprocedures.
- Bereken voor het verkrijgen van ruimtelijke informatie van de verdeling van één molecuul de radiale verdelingsfunctie ρ(r), die de dichtheid van lokalisaties vertegenwoordigt als functie van de radiale afstand20. Om ρ(r) te verkrijgen, berekent u unieke paarsafstanden van alle lokalisaties, bouwt u het histogram met bakken gecentreerd op ri met hoogte H(ri)en met een breedte dr en delen door 2πri*dr; (ρ(ri) = H(r i)/π(ri+dr)2-ri2).i De radiale distributiefunctie kan vervolgens worden gebruikt om de mate van clustering en de karakteristieke grootte van clusters te kwantificeren en te vergelijken.
- Om dynamische informatie over de verspreiding van moleculen te verkrijgen, koppelt u lokalisaties die bijvoorbeeld binnen 3 pixels (0,48 μm) verschijnen in opeenvolgende data-acquisitieframes om sporen van één molecuul te maken.
OPMERKING: De koppelingsafstand is afhankelijk van de verspreiding van moleculen en de dichtheid van lokalisaties. De maximale koppelingsafstand kan worden geschat door de dichtheid van lokalisaties in elk frame21,22teanalyseren . De gemiddelde dichtheid werd vastgesteld op 0,043 lokalisaties per μm2; aldus was een straal van 0.48 μm binnen een laag genoeg dichtheid om ervoor te zorgen dat de verschillende molecules niet werden verbonden samen. - Gemiddeld de verplaatsingen voor verschillende vertragingstijden Δt van meerdere sporen die ten minste drie vertragingstijden duren om een gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD) vs. Δt-plot te creëren. Pas de MSD vs. Δt curve aan bij de vergelijking MSD = 4DΔt + σ2 om de gemiddelde diffusiecoëfficiënt D3te berekenen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier presenteren we een geoptimaliseerde monstervoorbereiding, gegevensverwerving en analyseprocedure voor SMLM met behulp van BODIPY-vervoeging op basis van het bovenstaande protocol(figuur 1A). Om een voorbeeld van de workflow voor het verkrijgen en analyseren van SMLM-gegevens aan te tonen, gebruiken we BODIPY (493/503) in gist om LDs op te lossen onder de optische diffractielimiet(figuur 1B-F). Voorbeelden van de verschillende multi-color imaging modi van BODIPY in combinatie met andere sondes zoals GFP, mEos2 worden weergegeven in figuur 2. We manipuleren de metabole toestand in gist door ze te kweken in hetzelfde medium voor ~ 48 uur en tonen aan dat BODIPY-C12 vormen immobiele niet-LD clusters in cel periferie bij het vasten in tegenstelling tot hun integratie in ID's onder gevoede omstandigheden (Figuur 3). Om de SMLM-capaciteit van BODIPY-conjugaten verder uit te breiden naar zoogdiercellen, geven we het beeld BODIPY-C12 en LysoTracker-green in levende U2OS-cellen(figuur 4).
Figuur 1: Optimalisatie van SMLM data acquisitie en analyse met behulp van BODIPY kleurstoffen. (A) Workflow voor het optimaliseren van single molecule fluorescentie signalen en nabewerking van de SMLM gegevens van BODIPY vervoeging. (B) LED-beeld (links), conventionele fluorescentie beeld (midden, opwinding: 488 nm, emissie: 525 nm) en anti-Stokes beeld (rechts, opwinding: 561 nm, emissie: 525 nm) van gistcellen gekleurd met de LD marker BODIPY (493/503). (C) Enkele SMLM-frames met singe BODIPY D II-uitstoters (excitatie: 561 nm, emissie: 595 nm) bij een te lage dichtheid (links), optimale dichtheid (midden) en een te hoge dichtheid (rechts).II (D) Optimalisatie van SMLM-analyseparameters. Met een te hoge drempel voor fotonnummer mist de software geldige signalen van één molecuul (links), detecteert alle moleculen met een optimale fotondrempel (midden) en detecteert valse lokalisaties met te lage fotondrempels (rechts). (E) SMLM-afbeelding van BODIPY (493/503) lost de grootte van id's (links, zoom) op met een gemiddelde diameter van 125 nm. (F) Single molecule tracking onthult beperkte verspreiding van BODIPY (493/503) in ID's (links). Traces worden gebruikt om de MSD vs. tijdcurve te berekenen, die subdiffusief gedrag vertoont in LDs (rechts). Schaalbalk = 1 μm, zoom = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Multi-color SMLM imaging met behulp van BODIPY conjugaten in levende cellen. (A) Conventionele afbeelding van BODIPY-C12 onder 488 nm excitatie (links). Overeenkomstige SMLM-afbeelding met behulp van DII-toestanden van BODIPY-C12 onder 561 nm excitatie (midden) en zoom (rechts) onthullen bodipy-C12 in opkomende LDs. (B) Conventionele fluorescentie beeld van de ER gelabeld met Sec63-GFP onder 488 nm excitatie (links). Tegelijkertijd opgenomen conventionele fluorescentie beeld van BODIPY-C12 rood met 561 nm excitatie (midden) en SMLM beeld met behulp van 640 nm excitatie (rechts). (C) Sequentiële tweekleurige SMLM-beeldvorming van Sec63-mEos2 en BODIPY-C12 groene D II-toestanden.II Ten eerste wordt mEos2 afgebeeld met hoge 405 nm foto-activatie en 561 nm excitatie (links), gevolgd door lange data-acquisitie zonder 405 nm activering (midden). Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Differentiële vetzuurverdeling bij vasten in gistcellen. (A) Schematisch beschrijven van verschillende metabolische toestanden (gevoed en vasten toestand) op basis van de duur van de groei in het SCD-medium. B) Conventionele fluorescentiebeelden (boven) tonen aan dat bodipy-C12 rode co-localizes met BODIPY (493/503) onder gevoede omstandigheden die de integratie in ID's aangeven. De SMLM-afbeelding (onder, links) toont dichte BODIPY-C12 puncta in LDs en single molecule traces (onder, rechts) vertonen diffusie langs cellulaire membranen. (C) Onder nuchtere toestand vormt BODIPY-C12 puncta in de celperiferie die niet co-localiseren met ID's (linksboven, midden, linksonder). De SMLM afbeelding lost de puncta en beperkte sporen van BODIPY-C12 rood (onder, rechts). (D) De radiale verdelingsfunctie (links) toont een hogere clustering van BODIPY-FAs bij het vasten. De gemiddelde-vierkante verplaatsing vs. tijd plot van single molecule tracking (rechts) bevestigt immobilisatie van BODIPY-C12 bij het vasten. Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Beeldvorming van lichaamskleurstoffen in levende zoogdier U2OS-cellen. (A) Conventionele fluorescentiebeeld (links) van BODIPY-C12 bij 488 nm excitatie. De bijbehorende SMLM-afbeelding met DII-toestanden (rechts) bij 561 nm excitatie toont de nanoscopische verdeling van DII-toestanden in de U2OS-cel. De insets tonen vergrotingen van lipidedruppels (schaalbalk = 500 nm). (B) Conventionele afbeelding van lysosomen in U2OS cellen met LysoTracker groen op 488 nm excitatie (links). Het bijbehorende SMLM-beeld van immobiele lysosomen (rechts, schaalbalk = 5 μm) bij 561 nm excitatie. Inzet: SMLM-beeld van een optisch beperkte diffractie (schaalbalk 100 nm). De BODIPY-C12 beelden werden opgenomen in live celbeeldvormingsoplossing bij 23 °C. De beelden van lysosomen die LysoTracker groen gebruiken, werden geregistreerd in niet-fluorescerende DMEM met 10% foetale runderserum, 4 mM glutamine, 1 mM natriumpyruvaat en 1% penicilline-streptomycine antibiotica bij 37 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol hebben we aangetoond hoe conventionele BODIPY-conjugaten kunnen worden gebruikt om SMLM-beelden te verkrijgen met een orde van grootteverbetering in ruimtelijke resolutie. Deze methode is gebaseerd op het exploiteren vanII eerder gerapporteerde, rood verschoven D II-toestanden van conventionele LICHAAMSkleurstoffen, die zich tijdelijk vormen door middel van bimoleculaire ontmoetingen. Deze toestanden kunnen specifiek worden opgewekt en gedetecteerd met rood-verschoven golflengten en zijn schaars en van korte duur genoeg voor SMLM. Door de concentratie van BODIPY monomeren samen met laserparameters af te stemmen, kan een optimale dichtheid van lokalisaties en signaal-ruis worden bereikt. We losten de intracellulaire verdeling en mobiliteit van vetzuur analogen en neutrale lipiden met ~ 30 nm resolutie (theoretische Thompson's formule) in levende gistcellen onder gevoed en vasten voorwaarden. We vonden ook dat ~ 40% van de BODIPY DII-toestanden twee of meer data-acquisitieframes op 20 Hz blijft gebruiken, waardoor het bijhouden van een molecuul hun mobiliteit onder verschillende omstandigheden kan kwantificeren. Onze resultaten tonen de differentiële lokalisatie en mobiliteit van BODIPY-FAs bij het vasten en suggereren een beschermingsmechanisme tegen lipotoxiciteit. Ons vermogen om enkele BODIPY moleculen te volgen en om de grootte van LDs en BODIPY-FA puncta op te lossen onder de optische diffractie limiet onder verschillende metabole toestanden is alleen mogelijk met de ontwikkelde SMLM vermogen van conventionele BODIPY conjugaten. De exacte moleculaire mechanismen en trajecten die betrokken zijn bij de ruimtelijke regulatie van de vetzuurverdeling en -opname zijn het onderwerp van onze toekomstige studies. Verder hebben we de SMLM-capaciteit van conventionele BODIPY-vervoeging uitgebreid met levende zoogdiercellen door het oplossen van BODIPY-FAs en lysosomen in U2OS-cellen.
HetII gebruik van D II-toestanden van conventionele BODIPY-conjugaten voor SMLM heeft voordelen ten opzichte van andere sondes, omdat honderden verschillende BODIPY-varianten commercieel beschikbaar zijn die specifieke moleculen of cellulaire compartimenten in levende cellen labelen. Het monster voorbereiding is net zo eenvoudig als het toevoegen van de kleurstof bij lage (~ 100 nM) concentraties voor beeldvorming zonder wassen. In tegenstelling tot andere PALM / STORM sondes die bleken na verloop van tijd, BODIPY monomeren worden niet beïnvloed door de opwinding van hun DII staten en dus een bijna nooit uitputtende bron voor enkele molecuul signalen op lange termijn imaging. Aangezien DII staten ontstaan als gevolg van spontane bi-moleculaire ontmoetingen, SMLM met behulp van DII staten vereist geen extern toegevoegde buffer te induceren knipperen23. Evenzo is er geen behoefte aan high-energy foto-activering zoals vereist voor nieuw gesynthetiseerde foto-activatable BODIPY versies24 of SMLM van sommige conventionele BODIPY kleurstoffen21, die schadelijk kunnen zijn voor de gezondheid van de cel tijdens de lange termijn imaging25,26. Bovendien creëert SMLMII met D II-toestanden een inherente achtergrondonderdrukking van niet-specifiek interagerende sondes vanwege de kwadratische afhankelijkheid van DII-toestanden van de monomeerconcentratie. Daarom wordt een hoger contrast bereikt in SMLM-beelden in vergelijking met traditionele sondes waarvan het monomeersignaal wordt gedetecteerd.
BODIPYs vertonen een zwakke anti-Stokes fluorescentie die de opwinding van monomeren en dimers met een enkele laser bij hoge excitatiekracht mogelijk maakt. Aan de ene kant kan deze eigenschap worden benut voor gelijktijdige conventionele fluorescentie en SMLM-beeldvorming om bewegende structuren te volgen en op te lossen. Aan de andere kant, het maakt het moeilijker om BODIPY DII staten te combineren met andere sondes voor multi-color imaging als de BODIPY signaal neemt twee emissiekanalen. Multi-color imaging is echter mogelijk wanneer sondes zorgvuldig worden gekozen zoals weergegeven in figuur 2B met Sec63-GFP en BODIPY-C12 rood. Op dezelfde manier is sequentiële tweekleurige SMLM mogelijk met andere foto-activatable probes zoals mEos2 zoals weergegeven in figuur 2C. Andere mogelijke combinaties voor tweekleurige SMLM zijn het gebruik van groene BODIPY conjugaten en een 640 nm prikkelbare kleurstoffen zoals JF646 gebonden aan de halo tag27.
Samengevat hebben we een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor SMLM met conventionele LICHAAMSkleurstoffen om de spatio-temporele verdeling van vetzuren, neutrale lipiden en lysosomen te onderzoeken op de nanoscopische lengteschaal in levende gist- en zoogdiercellen. Met kleine wijzigingen kan dit protocol ook van toepassing zijn op SMLM met honderden andere BODIPY-vervoegingsvormen in verschillende celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Het onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder awardnummer R21GM127965.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
