Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

기존의 BODIPY 접합체는 일시성형, 적색 이동 접지 상태 이량체의 착취를 통해 살아있는 세포 단분자 국소화 현미경 검사법(SMLM)에 사용될 수 있습니다. 우리는 나노스코프 길이 척도에서 살아있는 포유류 및 효모 세포에서 세포내 중성 지질과 지방산을 추적하고 해결하기 위해 최적화된 SMLM 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

단 하나 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM) 기술은 전통적인 형광 현미경 검사법의 광학 회절 한계를 극복하고 ~ 20 nm 정밀도로 세포 내 구조 및 생체 분자의 역학을 해결할 수 있습니다. SMLM의 전제 조건은 수천 개의 데이터 수집 프레임에서 포인트 확산 함수의 주공간적 중복을 피하기 위해 어두운 상태에서 형광 상태로 전환하는 형광단입니다. BODIPYs는 기존의 현미경 검사법에 사용되는 수많은 접합체가있는 잘 확립 된 염료입니다. 적색 이동 BODIPY 접지 상태 이량체 (DII)의과도 형성은 밝은 단일 분자 방출을 가능하게하여 단일 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM)을 가능하게합니다. 여기에서 우리는 살아있는 효모 및 포유류 세포에 있는 전통적인 BODIPY 접합체를 가진 SMLM를 위한 간단하 그러나 다재다능한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 초고해상도 이미지를 획득하고 단일 BODIPY-DII 상태를 추적하여 BODIPY 접합체의 주공간 적 정보를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 나노 스코프 길이 규모에서 살아있는 효모 및 포유류 세포에서 지질 방울 (LDs), 지방산 및 리소좀을 해결하기 위해이 절차를 적용합니다. 또한 다른 형광 프로브와 함께 사용할 경우 BODIPY 염료로 멀티 컬러 이미징 기능을 시연합니다. 우리의 대표적인 결과는 보디피 지방산과 효모의 중성 지질의 차등 공간 분포 와 이동성을 보여줍니다. SMLM에 대한 이 최적화된 프로토콜은 수백 개의 상용 BODIPY 접합체와 함께 사용할 수 있으며 이 작업의 적용을 훨씬 뛰어넘는 나노 스케일에서 생물학적 공정을 연구하는 데 유용한 리소스입니다.

Introduction

단 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM) 스토크 광학 재건 현미경 검사법 (STORM) 및 광 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM)과 같은 기술은 아베의 광학 회절 한계1,,2 및 단일 생체 분자의 역학을 추적하기위한 정보로 초고해상도 이미지를 생성하는 방법으로등장3,,4. SMLM과 호환되는 프로브에 대한 요구 사항 중 하나는 포인트 확산 함수(PSF)의 공간 중복을 피하기 위해 언제든지 활성 형광단의 수를 제어하는 기능입니다. 각각의 데이터 수집 프레임에서 각 형광형광단의 위치는 해당 포인트 확산 함수를 피팅하여 ~20nm 정밀도로 결정됩니다. 전통적으로, 형광의 온-오프 깜박임은 위성 광 전환1,2,2,5 또는 화학적으로 유도된 본질적인 깜박임6을통해 제어되었습니다. 다른 접근법은 불소-활성화 단백질7,,8 및 프로그램가능한 결합-전체 내부 반사 형광(TIRF) 또는 광 시트여기(lightsheet) 9에 표지된 DNA 올리고머의 과도 결합시 플루오로겐의 유도된 활성화를 포함한다. 최근, 우리는 SMLM10에 대한 신규하고 다재다능한 라벨링 전략을 보고했는데, 이는 기존의 붕소 디파이메탄(BODIPY) 컨쥬게이트11,,12,,13의 적색 시프트 디메나메(DII)상태를 보고하고 적색 이동 파장에서 특이적으로 흥분되고 검출된다.

BODIPYs는 특히 하위 세포 구획 및 생체 분자14,,15,,16을라벨 변이체의 수백 염료널리 사용된다. 살아있는 세포에 있는 사용의 용이성과 적용성 때문에, BODIPY 이체는 전통적인 형광 현미경 검사법에 대해 상업적으로 유효합니다. 여기서는 상용 BODIPY 컨쥬게이트 수백 개에 대한 상세하고 최적화된 프로토콜을 라이브 셀 SMLM에 사용할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. BODIPY 단량체의 농도를 조정하고 여기 레이저 파워, 이미징 및 데이터 분석 매개 변수를 최적화하여 고품질 의 초고해상도 이미지 및 단일 분자 추적 데이터를 살아있는 세포에서 얻을 수 있습니다. 저농도(25-100 nM)에서 사용될 경우, BODIPY 접합체는 적색 시프트 채널에서 SMLM과 종래의 종래형 형광 현미경 검사법에 대해 동시에 사용될 수 있다. 얻어진 단일 분자 데이터는 움직이지 않는 구조의 공간 조직을 정량화하고 살아있는세포(17)에서분자의 확산 상태를 추출하기 위해 분석될 수 있다. 녹색 및 빨간색 형태의 BODIPY 프로브의 가용성은 다른 호환 형광단과 올바른 조합으로 사용될 때 다색 이미징을 허용합니다.

이 보고서에서는 BODIPY-C12,BODIPY(493/503), BODIPY-C12 빨간색 및 리소트래커-그린을 사용하여 라이브 셀 SMLM 데이터를 여러 색상으로 획득하고 분석하기 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 지방산과 중성 지질을 ~ 30 nm 해상도로 해결합니다. 우리는 또한 효모 세포가 그들의 신진 대사 상태에 따라 외부적으로 추가된 지방산의 공간 분포를 조절한다는 것을 더 보여줍니다. 우리는 BODIPY-fatacids (FA)를 추가한 것이 먹이 조건 하에서 산상성 망상 (ER) 및 지질 방울 (LDs)에 국한되는 반면 BODIPY-FA는 단식 시 플라즈마 막에 비 LD 클러스터를 형성한다는 것을 발견했습니다. 우리는 살아있는 포유류 세포에 있는 리소좀 및 LDs를 심상하기 위하여 이 기술의 응용을 더 확장합니다. 기존의 BODIPY 접합체를 사용하는 SMLM에 대한 당사의 최적화된 프로토콜은 무수히 많은 BODIPY 접합체를 사용하여 나노 스케일에서 생물학적 공정을 연구하는 데 유용한 리소스가 될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

참고 : 효모 복제 및 내생 태그는 최근 간행물10을참조하십시오.

1. 화상 진찰을 위한 효모 세포 견본의 준비

  1. w303 효모 균주의 액체 하룻밤 배양을 준비한다. 멸균 된 나무 막대기를 사용하여 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스트로오스가 함유 된 한천 판에서 소량의 효모 세포를 합성 완전 덱스트로스 (SCD) 배지의 ~ 2 mL의 배양 튜브에 넣습니다. 270 rpm 및 30°C에서 흔들리는 인큐베이터에서 밤새 튜브를 인큐베이션합니다.
  2. SCD에서 세포의 1:50 아침 희석을 수행합니다. 270 rpm 의 흔들림 인큐베이터에서 30°C에서 4시간 동안 희석된 세포를 배양하여, 세포가 지수상에서 성장하고 ~0.6의 광학 밀도(OD)에 도달할 수 있도록 한다.
    참고: 절차는 어떤 신진 대사 상태가 공부되고 있는지에 따라 여기에서 달라질 수 있습니다. BODIPY 접합체는 지수 성장 단계에서 세포를 필요로하지 않는다. 그러나 고정 된 단계 동안 죽은 세포에서 자가 형광을 인식해야하며, 배경 신호가 너무 강해서 단일 BODIPY-DII 방출기를 분석할 수 없습니다.
  3. 금식 세포를 연구하기 위해, 배지 교환없이 2 일 동안 효모 배양을 성장시다.
  4. 세포를 도금하기 전에 ~ 30 분에서, 실온에서 탈이온화H2O에서 0.8 mg / mL의 80 μL의 챔버 커버 글라스를 배양합니다. 30 분 후, 커버 글래스를 탈이온화 된 H2O로 세 번 씻으하십시오.
  5. 이미징 전 ~30분 에서, 챔버커버글라스상의 세포를 피펫으로 하여 ~ 0.12의 광학 밀도를 달성하기 위해 신선한 SCD의 정확한 부피를 갖는다(일반적으로 240 μL SCD에서 OD ~0.6에서 60 μL 효모 배양). 세포가 침전되어 ConA 표면에 30 분 동안 부착시키십시오.
  6. 원하는 BODIPY 컨쥬게이트를 ~100 nM의 최종 농도에서 챔버 커버글래스에 직접 첨가합니다.
    참고: 특정 셀룰러 구획의 BODIPY의 국소 밀도에 따라 BODIPY 농도 최적화 실험이 필요할 수 있습니다.

2. SMLM 화상 진찰을 위한 포유류 세포의 준비

  1. T25 플라스크에서 10% 태아 소 혈청, 4 mM 글루타민, 1 mM 나트륨 피루브산 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제를 사용하여 비형광 DMEM에서 포유류 U2OS 세포를 유지합니다.
    참고: 세포는 또한 10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린 연쇄상 구균 항생제를 가진 DMEM에서 유지될 수 있습니다, 그러나, 매체는 비 자동 형광 용액으로 화상 진찰의 앞에 교환될 필요가 있습니다.
  2. 세포를 70-80% 컨플루언스 1:5로 분할하여 8웰 플레이트의 단일 웰로 분할합니다. 이미징 전에 12~24시간 동안 8웰 플레이트에서 세포를 배양하였다.
  3. BODIPY-C12,리소트래커 그린 또는 기타 BODIPY 컨쥬게이트를 이미징 전에 100 nM(디메틸 설폭사이드 [DMSO]의 재고 용액)의 최종 농도로 추가합니다. 이 시간은 원하는 실험에 따라 달라질 수 있습니다.
    참고: 이미징은 라이브 셀 이미징 솔루션을 사용하여 주변 온도(23°C)에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 37°C 및 5% COMEM을 10% 태아 소 혈청, 4 mM 글루타민, 1 mM 피루바테 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제와 혼합하여 37°C 및 5%CO2에서 이미징은 생리학적 조건에 더 가깝게 세포를 유지하고 생물학적 결론을 내리는 것이 바람직하다.

3. 장비 준비

  1. 사용 중인 BODIPY의 방출 색상에 따라 방출 경로에 적절한 필터 세트를 장착합니다.
    참고: 쿼드 밴드 이색 거울(zt/405/488/561/640rdc)은 먼저 방출 라이트에서 여기를 분리합니다. 녹색 방출(525 nm) 및 적색 방출(595 nm)은 이색 장패스 빔 스플리터(T562lpxr)에 의해 분할된 다음 녹색 채널에서 밴드 패스 필터 ET525/50, 적색 채널의 ET 595/50으로 나눕니다. 그런 다음 두 채널이 동일한 카메라 칩의 다른 영역에 투사됩니다. 유사하게, 적색 방출(595 nm) 및 원적 방출은 먼저 이색장 장패스 빔 스플리터(FF652-Di01)에 의해 분할되고, 그 다음에는 대역 통과 필터 ET ET 610/75가 적색 및 FF731/137로 나뉘어진다.
  2. 현미경, 현미경 단계, 레이저 (488 nm, 561 nm) 및 카메라를 켭니다. 여기서 완벽한 초점 시스템을 갖춘 반전된 현미경과 -68°C로 냉각된 EMCCD 카메라가 사용됩니다.
  3. 현미경 목표에 침지 오일 한 방울을 추가합니다.
  4. 밝은 필드 이미징, 레이저 파워, 레이저 셔터 및 이미징용 카메라 설정을 위해 LED 조명을 제어하는 Hal4000 소프트웨어(재료 표참조)를 엽니다. EMCCD 게인을 30으로 설정하고 카메라 온도를 -68°C로 설정합니다. 20Hz에서 영화를 녹화하기 위해 카메라와 해당 소프트웨어를 준비합니다.
    참고: 이 기술은 광 활성화 국소화 현미경 검사법(PALM) 및 탁상광학 재건 현미경(STORM) 이미징이 가능한 모든 광시야현미경에 적용됩니다. 해당 소프트웨어는 다를 수 있습니다.
  5. 현미경 스테이지 히터를 켜고 37°C의 온도와CO2 수준 5%로 설정합니다. 그에 따라 목표 보정 칼라를 조정합니다.
  6. 현미경 단계에 샘플을 장착하고 초점 시스템이 맞을 때까지 초점을 맞춥니다. 정상 셀이 시야에 나타날 때까지 스테이지 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동합니다.
    참고: 실온에서 효모 세포로 이미징을 할 때히터 또는CO2 컨트롤을 켤 필요가 없습니다.
  7. 단량체뿐만 아니라 디머의 여기에 대한 적절한 레이저를 켭니다. BODIPY 녹색 또는 LysoTracker 녹색의 경우, 우리는 SMLM에 대한 DII 상태를 자극하기 위해 561 nm 레이저와 기존의 형광에 대한 단량체를 자극하는 488 nm 레이저를 사용합니다.
    참고: BODIPY 빨간색의 경우 640 nm 레이저를 사용하여 SMLM의 DII 상태를 자극하고 561 nm 레이저를 사용하여 기존의 형광에 대한 단량체를 자극합니다. BODIPY 빨간색의 경우 561 nm 및 640 nm 레이저 파워를 조정하여 적색 채널에서 벌크 형광을 시각화하고 원적 채널에서 단일 분자 버스트를 시각화합니다. 561 nm의 일반적인 전력은 640 nm의 경우 ~ 0.06 W / cm2 및 ~ 5 kW / cm2입니다. BODIPY 녹색의 경우, 561 nm 여기 하에서 녹색 방출 채널에서 기존의 형광을 볼 것으로 예상됩니다. BODIPY 빨간색의 경우, 640 nm 여기 에서 빨간색 채널에서 기존의 형광을 볼 것으로 예상. 이 신호는 안티 스톡 방출에서 발생, 이는 연속 레이저 여기와 단량체 / 디머 공동 지역화 이미지에 유용하게.

4. 데이터 수집

  1. 단량체뿐만 아니라 디머의 여기레이저 셔터 시퀀스를로드합니다.
    참고: 우리는 일반적으로 561 nm에서 9개의 단일 분자 여기 프레임을 사용하고 488 nm에서 하나의 기존 여기 프레임을 사용합니다. 이것은 더 밝은 전통적인 형광 신호를 제공하고 다중 색깔 화상 진찰 응용에 있는 빨간 단 하나 분자 검출 채널로 녹색 형광 단백질 (GFP)와 같은 또 다른 488 nm 흥분형 형광의 누출을 방지합니다. 또는, 561 nm 레이저를 연속적으로 켜고 더 짧은 파장 채널에서 기존의 이미지에 대한 안티 스톡 방출에 의존한다.
  2. 561 nm 여기 하에서 적색 이동 방출 채널에서 단일 분자 형광 버스트가 검출되도록 레이저 파워를 조정하고, 기존의 형광은 488 nm 여기와 녹색 방출 채널에 나타납니다. 561 nm 레이저의 일반적인 레이저 파워는 SMLM의 경우 약 0.8-1 kW/cm2, 기존 형광 이미징 모드에서 488 nm 레이저의 경우 0.035-0.07 W/cm2입니다. 2
  3. 동영상의 대상 폴더를 선택하고 5,000-20,000개의 수집 프레임을 녹화하여 초고해상도 이미지를 재구성하기에 충분한 지역화를 수집합니다.
  4. 다른 보기 필드로 이동하고 위의 단계를 반복하여 더 많은 셀에서 데이터를 수집합니다.

5. 데이터 분석 및 단일 분자 추적

  1. 영화를 SMLM 분석 소프트웨어에 로드합니다.
    참고: 모든소프트웨어(18)를 사용할 수 있습니다. 우리는 INSIGHT (재료의 표참조)를 사용하고 imageJ (피지)에 대한 썬더 스톰19 플러그인을 사용하여 결과를 교차 검증합니다.
  2. 영상을 시각적으로 가리고 단일 분자 형광 깜박임이 보이지않는 대비 설정을 조정합니다. 필요한 경우 샘플의 일부가 지속적으로 형광되는 경우 SMLM 데이터 분석을 위한 영역 또는 프레임 범위를 제한합니다.
  3. 2D 가우시안 PSF(ROI: 픽셀 크기 160nm, 너비 260-650nm, 높이 > 50광자)로 피팅을 위한 단일 분자 식별 매개변수를 설정합니다. 일부 예제 프레임을 통해 시각적으로 스크리미쳐 식별 파라미터를 확인하고 뚜렷한 단일 분자 형광 버스트를 안정적으로 검출합니다(도 1C참조).
    참고: 높이 및 너비와 같은 특정 식별 매개 변수를 약간 조정하여 시각적으로 인식된 단일 분자 형광 신호의 인식을 최적화할 수 있습니다.
  4. 최적화된 식별 매개변수로 SMLM 이미지 분석을 수행한 다음 각 단일 분자를 감지된 광자 수의 역 제곱근에 의해 폭이 가중되는 2D 가우시안으로 렌더링합니다.
  5. 데이터의 품질을 평가합니다. 제한된 프레임 범위를 사용하여 특정 인스턴스에서 단일 분자 분포를 적시에 관찰합니다. 이것은 데이터 수집 도중 세포기관의 움직임을 설명할 수 있습니다.
  6. 분자 분포의 공간 분포 와 역학을 추가로 분석하려면 좌표, 모양 프레임, 광자, 폭 및 지역화 높이를 포함하는 얻은 분자 목록을 내보냅니다. 사용자 지정 서면 분석 절차에서 분자 목록을 가져옵니다.
  7. 단일 분자 분포의 공간 정보를 얻기 위해, 방사형 분포 함수 θ(r)를 계산하고, 이는 방사형거리(20)의함수로서 국소화의 밀도를 나타낸다. θ (r)를 얻으려면 모든 지역화의 고유 한 쌍 별 거리를 계산하고 높이 H(ri)를 가진 ri를 중심으로 하는 쓰레기통과 폭 dr을 사용하여 히스토그램을 구성하고 2πri* dr로 나눕니다. (θ(i)= H(r i)/π(ri+dr)2-rii2). 그런 다음 방사형 분포 함수를 사용하여 클러스터링의 정도와 클러스터의 특성 크기를 정량화하고 비교할 수 있습니다.
  8. 분자의 확산에 대한 동적 정보를 얻으려면 연속적인 데이터 수집 프레임에서 3픽셀(0.48 μm) 내에 나타나는 지역화를 연결하여 단일 분자 추적을 생성합니다.
    참고: 연결 거리는 분자의 확산과 지역화밀도에 따라 달라집니다. 최대 연결 거리는 각프레임(21,,22)에서지역화의 밀도를 분석하여 추정할 수 있다. 평균 밀도는 μm2당0.043 의 국소화로 결정되었다; 따라서 0.48 μm 반경은 다른 분자가 함께 연결되지 않았는지 확인하기 에 충분한 밀도가 낮았다.
  9. 평균 제곱 변위(MSD) 대 Δt 플롯을 만들기 위해 적어도 3번 의 지연 시간이 지속되는 여러 트레이스의 다른 지연 시간 Δt에 대한 변위를 평균화합니다. MSD = 4DΔt +σ2방정식으로 MSD 대 Δt 곡선을 맞추어 평균 확산 계수D3을계산합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

여기서, 우리는 위의 프로토콜에 기초하여 BODIPY 접합체를 사용하여 SMLM에 대한 최적화된 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석 절차를 제시한다(도1A). SMLM 데이터를 획득하고 분석하기 위한 워크플로우의 예를 설명하기 위해 효모에서 BODIPY(493/503)를 사용하여 광학 회절 한계 미만의 LD를해결합니다(그림 1B-F).-F GFP, mEos2와 같은 다른 프로브와 함께 BODIPY의 상이한 다중 컬러 이미징 모드의 예는 도 2에도시되어 있다. 우리는 효모에서 대사 상태를 ~48 h에 대해 동일한 배지로 성장시킴으로써 조절 상태를 조작하고 BODIPY-C12가 먹이 조건 하에서 LDs로 의한 혼입과 는 대조적으로 금식 시 세포 주변부에서 움직이지 않는 비 LD 클러스터를 형성한다는 것을 보여줍니다(그림 3). BODIPY 접합체의 SMLM 기능을 포유류 세포로 더욱 확장하기 위해, 우리는 살아있는 U2OS 세포에서 BODIPY-C12 및 리소트래커-그린을 이미지화한다(그림4).

Figure 1
그림 1: BODIPY 염료를 사용한 SMLM 데이터 수집 및 분석 최적화( A)BODIPY 접합체에서 SMLM 데이터의 단일 분자 형광 신호 및 사후 처리를 최적화하기 위한 워크플로우. (B)LED 이미지(왼쪽), 종래의 형광 영상(중간, 여기: 488 nm, 방출: 525 nm) 및 안티스톡 이미지(오른쪽, 여기: 561 nm, 방출: 525 nm)로 염색된 효모 세포의 BODIPY(493/503). (C)단일 SMLM 프레임은 너무 낮은 밀도(왼쪽), 최적 밀도(중간) 및 너무 높은 밀도(오른쪽)에서 노래하는 BODIPY DII 방출기(여기: 561 nm, 방출: 595 nm)를 표시합니다. (D)SMLM 분석 매개 변수의 최적화. 너무 높은 광자 수 임계값으로 소프트웨어는 유효한 단일 분자 신호(왼쪽)를 놓치고 최적의 광자 임계값(가운데)으로 모든 분자를 감지하고 너무 낮은 광자 임계값(오른쪽)으로 잘못된 국소화를 감지합니다. (E)BODIPY (493/503)의 SMLM 이미지는 평균 직경이 125 nm인 LD의 크기를 해결합니다(왼쪽, 줌). (F)단일 분자 추적은 LDS (왼쪽) 내부 BODIPY (493/503)의 제한된 확산을 보여줍니다. 추적은 MSD와 시간 곡선을 계산하는 데 사용되며, 이는 LD(오른쪽) 내부에서 하위 확산 동작을 나타냅니다. 배율 막대 = 1 μm, 확대 / 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 살아있는 세포에서 BODIPY 접합체를 이용한 다색 SMLM 이미징. (A)488 nm 여기 에서 BODIPY-C12의 종래이미지(왼쪽). 561 nm 여기 하에서 BODIPY-C12의 DII 상태를 사용하는 해당 SMLM 이미지(가운데) 및 줌(오른쪽)은 신흥 LDS에서 BODIPY-C12를 드러내고있습니다. 보디피-C12 레드의 종래형 형광 영상을 561 nm 여기(가운데)와 SMLM 영상을 640 nm 여기(오른쪽)를 사용하여 동시에 기록하였다. (C)Sec63-mEos2 및 BODIPY-C12 녹색 DII 상태의 순차적 2색 SMLM 이미징. 먼저, mEos2는 405 nm 의 높은 광 활성화 및 561 nm 여기 (왼쪽)로 이미지화되고 405 nm 활성화 (중간)없이 긴 데이터 수집이 뒤따릅니다. 배율 표시줄 = 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 효모 세포에서 금식 시 차등 지방산 분포. (A)SCD 배지에서의 성장 기간에 기초하여 상이한 대사 상태(공급 및 단식 상태)를 설명하는 개략적. B) 기존의 형광 이미지(상단)는 BODIPY-C12 빨간색이 LD에 혼입되었음을 나타내는 공급 조건하에서 BODIPY(493/503)와 공동 지역화한다는 것을 보여줍니다. SMLM 이미지 (아래, 왼쪽)는 LDs에서 조밀한 BODIPY-C12 puncta를 보여주고 단 하나 분자 자취 (아래, 오른쪽) 세포막을 따라 확산을 나타낸다. (C)금식 된 상태에서 BODIPY-C12는 LDs (위 : 왼쪽, 중간, 아래 왼쪽)와 동생하지 않는 세포 주변부에 puncta를 형성합니다. SMLM 이미지는 BODIPY-C12 빨간색(아래, 오른쪽)의 펀타및 제한된 흔적을 해결합니다. (D)방사형 분포 함수(왼쪽)는 금식 시 BODIPY-FA의 더 높은 군집을 보여줍니다. 단일 분자 추적의 평균 제곱 변위 대 시간 플롯(오른쪽)은 금식 시 BODIPY-C12의 고정을 확인합니다. 배율 막대 = 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 살아있는 포유류 U2OS 세포에서 BODIPY 염료의 이미징. (A)488 nm 여기에서 BODIPY-C12의 종래형 형광 이미지(왼쪽). 561 nm 여기에서 DII 상태(오른쪽)를 이용한 상응하는 SMLM 이미지는 U2OS 셀에서 DII 상태의 나노스코프 분포를 나타낸다. 인세트는 지질 방울의 배율을 보여줍니다 (스케일 바 = 500 nm). (B)488 nm 여기에서 LysoTracker 녹색을 사용하여 U2OS 세포에서 리소좀의 종래의 이미지 (왼쪽). 561 nm 여기에서 움직이지 않는 리소좀(오른쪽, 스케일 바 = 5 μm)의 상응하는 SMLM 이미지. 인세트: 광학적으로 회절 한정된 리소좀의 SMLM 이미지(스케일 바 100 nm). BODIPY-C12 이미지를 23°C에서 라이브 셀 이미징 솔루션으로 기록하였다. LysoTracker 녹색을 사용하여 리소좀의 이미지는 37 °C에서 10 % 태아 소 혈청, 4 mM 글루타민, 1 mM 나트륨 피루바테 및 1 % 페니실린 연쇄상 구균 항생제와 비 형광 DMEM에 기록되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜에서는 기존의 BODIPY 접합체를 사용하여 공간 해상도가 상당히 개선된 SMLM 이미지를 얻는 방법을 시연했습니다. 이 방법은 이중 분자 만남을 통해 일시적으로 형성되는 기존의 BODIPY 염료의 이전에 보고된 적색 이동 DII 상태를 악용하는 것을 기반으로 합니다. 이러한 상태는 특히 흥분 하고 적색 이동 파장으로 감지 될 수 있으며 SMLM에 대 한 충분히 희소 하 고 수명이 짧은. 레이저 파라미터와 함께 BODIPY 단량체의 농도를 조정함으로써 현지화 및 신호 대 잡음의 최적의 밀도를 달성할 수 있습니다. 우리는 지방산 유사체와 중성 지질의 세포 내 분포와 이동성을 ~ 30 nm 해상도 (이론적 톰슨의 공식)로 사육 및 단식 조건 하에서 살아있는 효모 세포에서 해결했습니다. 또한 BODIPY DII 상태의 ~40%가 20Hz에서 2개 이상의 데이터 수집 프레임에 머물러 있어 단일 분자 추적이 서로 다른 조건에서 이동성을 정량화할 수 있다는 것을 발견했습니다. 우리의 결과는 금식시 BODIPY-FA의 차동 국소화 및 이동성을 보여주고 지방 독성에 대한 보호 메커니즘을 제안합니다. 단일 BODIPY 분자를 추적하고 다른 대사 상태에서 광학 회절 한계 이하의 LD및 BODIPY-FA puncta의 크기를 해결하는 우리의 능력은 기존의 BODIPY 접합체의 개발 된 SMLM 기능을 통해서만 가능합니다. 지방산 분포 및 섭취량의 공간 조절에 관여하는 정확한 분자 메커니즘과 경로는 향후 연구의 주제입니다. 또한, 우리는 U2OS 세포에서 BODIPY-FA 및 리소좀을 해결하여 기존의 BODIPY 접합체의 SMLM 기능을 살아있는 포유류 세포로 확장했습니다.

SMLM을 위한 전통적인 BODIPY 접합체의 DII 상태를 사용하여 다른 BODIPY 변이체의 수백이 살아있는 세포에 있는 특정 분자 또는 세포 구획을 표지하는 상업적으로 유효하기 때문에 그밖 탐사기에 비해 이점이 있습니다. 시료 제제는 세척 없이 이미징 전에 낮은(~100nM) 농도로 염료를 첨가하는 것만큼 쉽습니다. 시간이 지남에 따라 표백하는 다른 PALM/STORM 프로브와는 달리 BODIPY 단량체는 DII 상태의 흥분에 영향을 받지 않으므로 장기 이미징에서 단일 분자 신호에 거의 고갈되지 않는 소스를 제공합니다. DII 상태는 자발적인 이중 분자 만남으로 인해 발생하기 때문에 DII 상태를 사용하는 SMLM은 깜박임23을유도하기 위해 외부적으로 추가된 버퍼가 필요하지 않습니다. 유사하게, 일부 종래의 BODIPY 염료(21)의 새로 합성된 사진-활성화 가능한 BODIPY버전(24) 또는21SMLM에 필요한 고에너지 광-활성화가 필요하지 않으며, 이는 장기간 이미징 시 세포 건강에 해로울 수 있는25,,26. 더욱이,DII 상태를 가진 SMLM은 단량체 농도상에서DII 상태의 이차 의존성 때문에 비특이적 상호작용 프로브의 고유 배경 억제를 생성한다. 따라서 단일성 신호가 감지되는 기존 프로브에 비해 SMLM 이미지에서 더 높은 콘트라스트가 달성됩니다.

BODIPYs는 희미한 안티 스톡 형광을 나타내어 단일 레이저로 단일 레이저를 흥분시고 흥분시됩니다. 한편, 이 속성은 동시 종래의 형광 및 SMLM 이미징을 사용하여 움직이는 구조를 추적하고 해결할 수 있습니다. 다른 한편으로는, BODIPY 신호가 2개의 방출 채널을 차지하기 때문에 다중 컬러 화상 진찰을 위한 그밖 탐사기와 BODIPY DII 상태를 결합하는 것을 어렵게 만듭니다. 그러나 Sec63-GFP 및 BODIPY-C12 빨간색으로 그림 2B에 표시된 대로 프로브를 신중하게 선택하면 다색 이미징이 가능합니다. 유사하게, 순차적 2색 SMLM은 그림 2C에도시된 바와 같이 mEos2와 같은 다른 광활성 프로브와 함께 가능하다. 2색 SMLM에 대한 다른 가능한 조합은 후광태그(27)에결합된 JF646과 같은 녹색 BODIPY 접합체 및 640 nm 흥분 염료의 사용을 포함한다.

요약하자면, 우리는 살아있는 효모 및 포유류 세포에서 나노스코프 길이 척도에서 지방산, 중성 지질 및 리소좀의 주공간 분포를 조사하기 위해 기존의 BODIPY 염료를 사용하여 SMLM에 대한 최적화된 프로토콜을 제시했습니다. 사소한 수정을 통해 이 프로토콜은 다른 세포 유형에 걸쳐 수백 개의 다른 BODIPY 접합체가 있는 SMLM에도 동일하게 적용될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R21GM127965의 밑에 건강의 국가 학회의 일반 의학의 국가 학회에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Tags

생화학 문제 160 형광 현미경 검사법 초고해상도 현미경 단일 분자 추적 단일 분자 국소화 현미경 BODIPY 지상 상태 이량체 효모 포유류 세포
라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, S., Banerjee, C.,… More

Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter