Summary
Обычные конъюги BODIPY могут быть использованы для живой-клеточной одномолекулярной микроскопии локализации (SMLM) путем эксплуатации их преходящее, красно-сдвигаемых стриеров земли. Мы представляем оптимизированный протокол SMLM для отслеживания и разрешения субклеточных нейтральных липидов и жирных кислот в живых клетках млекопитающих и дрожжей в наноскопической шкале длины.
Abstract
Методы локализации одной молекулы (SMLM) преодолевают оптический предел дифракции обычной флуоресценционной микроскопии и могут разрешать внутриклеточные структуры и динамику биомолекул с точностью 20 нм. Предпосылкой для SMLM являются флюорофоры, которые переходят из темного в флуоресцентное состояние, чтобы избежать пространственно-временного перекрытия их функций точечного распространения в каждом из тысяч кадров для сбора данных. BODIPYs являются устоявшимися красителями с многочисленными конъюгами, используемыми в обычной микроскопии. Переходное образование красно-сдвигающихся димеров НАИППи (DII)приводит к яркому выбросу одной молекулы, позволяющему микроскопию локализации одной молекулы (SMLM). Здесь мы представляем простой, но универсальный протокол для SMLM с обычными спариями BODIPY в живых дрожжах и клетках млекопитающих. Эта процедура может быть использована для получения изображений супер-разрешения и для отслеживания одного состояния BODIPY-DII для извлечения пространственно-временной информации конъюгированных BODIPY. Мы применяем эту процедуру для разрешения липидных капель (ЛД), жирных кислот и лисосомы в живых дрожжах и клетках млекопитающих в наноскопической шкале длины. Кроме того, мы демонстрируем возможность многоцветной визуализации с красителями BODIPY при использовании в сочетании с другими флуоресцентными зондами. Наши репрезентативные результаты показывают дифференциальное пространственное распределение и подвижность БОДИПИ-жирных кислот и нейтральных липидов в дрожжах в условиях кормления и поста. Этот оптимизированный протокол для SMLM может быть использован с сотнями коммерчески доступных конъюгатов BODIPY и является полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне, далеко за пределами применения этой работы.
Introduction
Одномолекулярная локализация микроскопии (SMLM) методы, такие как стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и фото-активированной локализации микроскопии (PALM) появились как методы для генерации супер-разрешение изображения с информацией за пределами оптического дифракции Абба предел1,2 и для отслеживания динамики отдельных биомолекул3,4. Одним из требований к зондам, совместимым с SMLM, является возможность контролировать количество активных фторфоров в любое время, чтобы избежать пространственного перекрытия их функций точечного распространения (PSF). В каждом из тысяч кадров для сбора данных местоположение каждого флуоресцентного флуорофора определяется с точностью 20 нм, устанавливая соответствующую функцию точечного распространения. Традиционно, выключенное мигание фторофоров было контролироваться через стохастические фотопереключения1,,2,,5 или химически индуцированного внутреннего мигает6. Другие подходы включают индуцированной активации флюорогенов при переходных связывания с флюорогеновым активированием белка7,,8 и программируемой связывания-несвязывающей помеченных олигомеров ДНК в общей внутренней флуоресценции отражения (TIRF) или возбуждения светового листа9. Недавно мы сообщили о новой и универсальной стратегии маркировки для SMLM10, в которой ранее сообщалось красно-сдвиной димерической (DII) состояния обычных бор ди-пирометан (BODIPY) конъюгирует11,12,13являются специально возбужденных и обнаружены с красными сдвинутых волн.13
BODIPYs широко используются красители с сотнями вариантов, которые специально этикетки субклеточных отсеков и биомолекул14,15,16. Из-за их простоты использования и применимости в живых клетках, варианты BODIPY коммерчески доступны для обычной флуоресценции микроскопии. Здесь мы описываем подробный и оптимизированный протокол о том, как сотни коммерчески доступных конъюгатов BODIPY могут быть использованы для живых ячеек SMLM. Путем настройки концентрации мономеров BODIPY и оптимизации лазерных функций возбуждения, параметров визуализации и анализа данных, в живых клетках получаются высококачественные изображения суперразрешения и данные слежения за одной молекулой. При использовании при низкой концентрации (25-100 нм), конъюгированные bodiPY могут быть одновременно использованы для SMLM в красно-сдвигаемканале и для корреляционной обычной флуоресценции микроскопии в обычном канале выбросов. Полученные данные одной молекулы могут быть проанализированы для количественной оценки пространственной организации неподвижных структур и извлечения диффузивных состояний молекул в живых клетках17. Наличие зондов BODIPY в зеленых и красных формах позволяет использовать многоцветные изображения при правильном сочетании с другими совместимыми флюорофорами.
В этом отчете мы предоставляем оптимизированный протокол для получения и анализа данных SMLM с живыми ячейками с использованием BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 красного и lysotracker-зеленого цвета в нескольких цветах. Мы разрешаем жирные кислоты и нейтральные липиды в живых дрожжах и клетках млекопитающих с разрешением 30 нм. Мы также демонстрируем, что дрожжевые клетки регулируют пространственное распределение внешних жирных кислот в зависимости от их метаболического состояния. Мы находим, что добавленные БОДИПИ-жирные кислоты (FA) локализуются в эндоплазмический ретикулум (ER) и липидные капли (ЛД) в условиях fed, в то время как BODIPY-FAs образуют не-LD кластеры в плазменной мембране после поста. Мы также расширяем применение этого метода для изображения лизосомы и LDs в живых клетках млекопитающих. Наш оптимизированный протокол для SMLM с использованием обычных конъюгетов BODIPY может быть полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне с множеством доступных конъюги BODIPY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Для клонирования дрожжей и эндогенных пометок пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации10.
1. Подготовка образцов дрожжевых клеток для визуализации
- Подготовьте жидкую ночную культуру штамма дрожжей w303. Используя стерильную деревянную палочку, пятно небольшое количество дрожжевых клеток из агар пластины, содержащей дрожжевой экстракт-пептон-декстрозя в культуре трубки с 2 мл синтетических полной декстроза (SCD) среды. Инкубировать трубку на ночь в трясущихся инкубатора при 270 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
- Выполните 1:50 утреннее разбавление клеток в SCD. Продолжить культуру разбавленных клеток в течение 4 ч при 30 градусах По Цельсия в 270 об/мин встряхивания инкубатора, что позволяет клеткам расти в экспоненциальной фазе и достичь оптической плотности (OD) в 0,6 евро.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может варьироваться здесь в зависимости от того, какое метаболическое состояние изучается. Спряжные клетки BODIPY не требуют клеток в фазе экспоненциального роста. Однако, будьте осведомлены об аутофлооресценции из мертвых клеток во время стационарной фазы, так как это может привести к фоновому сигналу слишком сильным, чтобы анализировать одиночные излучатели BODIPY-DII. - Для изучения клеток натощак, расти дрожжевой культуры в течение 2 дней без обмена средствами массовой информации.
- На 30 минут до покрытия клеток, инкубировать камерные крышки с 80 мг /мл стерильного Конкановалина А (ConA) в деионизированных H2O при комнатной температуре. После 30 минут, мыть крышку три раза с деионизированной H2O.
- На 30 минут до изображения, pipette клетки на камерной крышкой, с правильным объемом свежего SCD для достижения оптической плотности 0,12 (как правило, 60 йл дрожжевой культуры на OD 0,6 в 240 Л SCD). Пусть клетки оседают и придерживаются поверхности ConA в течение 30 минут.
- Добавьте желаемый BODIPY конъюгировать сяплет прямо в камерный покрывало при окончательной концентрации в 100 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент по оптимизации концентрации BODIPY может потребоваться в зависимости от плотности местной плотности BODIPYs в конкретном клеточном отсеке.
2. Подготовка клеток млекопитающих для визуализации SMLM
- Поддержание клеток U2OS млекопитающих в нефлуоресцентных DMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки, 4 мм глутамина, 1 мм натрия пируват и 1% пенициллина-стрептомицина антибиотиков в t25 колбу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки также могут быть сохранены в DMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицин антибиотики, однако, среда должна быть обменяна до изображения с не-автофлуоресцентного раствора. - Разделите клетки на 70-80% встою 1:5 в одном колодце 8-колодца пластины. Культура клетки в 8-колодец пластины от 12 до 24 ч до изображения.
- Добавьте BODIPY-C12, LysoTracker Green или любой другой bodiPY конъюгированный при конечной концентрации 100 нм (запасные растворы в диметилсульфодоксидах »DMSO) 10 мин до изображения. Это время может варьироваться в зависимости от желаемого эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация может быть выполнена при температуре окружающей среды (23 градусов по Цельсию) с помощью решения живой визуализации клеток. Тем не менее, визуализация при 37 КК и 5% CO2 с нелюфлуоресцентными DMEM, смешанными с 10% сыворотки плода, 4 мМ глутамина, 1 мМ пируватом натрия и 1% антибиотиками пенициллин-стрептомицин предпочтительнее держать клетки ближе к физиологическим условиям и делать биологические выводы.
3. Подготовка оборудования
- Установите соответствующие наборы фильтров в пути выбросов на основе цвета выбросов BODIPY используется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Четырехполосное дихроическое зеркало (zt/405/488/561/640rdc) сначала отделяет возбуждение от света выбросов. Зеленый выброс (525 нм) и красные выбросы (595 нм) затем делятся на дихротический сплиттер длиннопроходного луча (T562lpxr), а затем фильтры диапазона ET525/50 в зеленом канале и ET 595/50 в красном канале. Затем эти два канала проецируются на различные области одного и того же чипа камеры. Аналогичным образом, красный излучение (595 нм) и дальнекрасный излучение сначала делятся на дихротический сплиттер длиннопроходного луча (FF652-Di01), за которым следуют фильтры диапазона ET 610/75 в красном и FF731/137 в дальнем красном канале. - Включите микроскоп, стадию микроскопа, лазеры (488 нм, 561 нм) и камеру. Здесь используется перевернутый микроскоп с идеальной системой фокусировки и камерой EMCCD, охлажденая до -68 градусов по Цельсию.
- Добавьте каплю масла погружения на цель микроскопа.
- Откройте программное обеспечение Hal4000 (см. таблицу материалов), которое управляет светодиодным светом для яркой полевой визуализации, лазерных мощностей, лазерных ставней и настроек камеры для визуализации. Установите увеличение EMCCD до 30, а температура камеры до -68 градусов по Цельсию. Подготовьте камеру и соответствующее программное обеспечение для записи фильмов на уровне 20 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применяется к любому широкоугольному микроскопу, способенму микроскопии локальной локализации (PALM) и стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM). Соответствующее программное обеспечение может варьироваться. - Включите обогреватель стадии микроскопа и установите его до температуры 37 градусов по Цельсию и до уровня CO2 5%. Отрегулируйте объективную коррекцию воротник ат... соответственно.
- Установите образец на стадии микроскопа и сосредоточьтесь до тех пор, пока не займется фокусировка системы. Переместите сцену с помощью контроллера сцены до тех пор, пока в поле зрения не появятся здоровые ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации с дрожжевыми клетками при комнатной температуре, нет необходимости включать обогреватель или CO2 управления. - Включите соответствующие лазеры для возбуждения мономеров, а также димеров. Для BODIPY зеленый или LysoTracker зеленый, мы используем 561 нм лазер для возбуждения DII государств для SMLM и 488 нм лазер возбудить мономеров для обычной флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для BODIPY красный, используйте 640 нм лазер для возбуждения DII государств для SMLM и 561 нм лазер, чтобы возбудить мономеров для обычной флуоресценции. Для BODIPY красный, настроить 561 нм и 640 нм лазерные полномочия для визуализации объемной флуоресценции в красном канале и одной молекулы очередей в дальнем красном канале. Типичная мощность для 561 нм составляет 0,06 Вт/см2 и 5 кВт/см2 для 640 нм. Для BODIPY зеленый, ожидать, чтобы также увидеть обычные флуоресценции в зеленом канале выбросов под 561 нм возбуждение. Для BODIPY красный, ожидать увидеть обычные флуоресценции в красном канале под 640 нм возбуждение. Этот сигнал возникает из-за выброса против Стокоса, который становится полезным для мономерных/димерных изображений совместной локализации с непрерывным лазерным возбуждением.
4. Приобретение данных
- Загрузите лазерные последовательности затвора для возбуждения мономеров, а также димеров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем девять одной молекулы возбуждения кадров на 561 нм следуют один обычный эксцитации кадра на 488 нм. Это предлагает более яркий обычный сигнал флуоресценции и позволяет избежать утечки еще 488 нм возбудимых флюорофоров, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) в красный одномолекулярный канал обнаружения в многоцветных приложений изображений. Кроме того, включите 561 нм лазер непрерывно и полагаться на анти-Стокс выбросов для обычных изображений в короткой длины волны канала. - Настройте лазерные силы таким образом, что одиночные молекулы флуоресценции очередей обнаруживаются в красно-сдвинутых канала выбросов под 561 нм возбуждение, и обычные флуоресценции появляется в зеленом канале выбросов с 488 нм возбуждение. Типичные лазерные мощности лазера 561 нм будут составят около 0,8-1 кВт/см2 для SMLM и 0,035-0,07 Вт/см2 для лазера 488 нм в обычном режиме флуоресценции.
- Выберите папку назначения для фильмов и запишите 5000-20 000 кадров для приобретения, чтобы собрать достаточное количество локализаций для восстановления изображений супер-разрешения.
- Перейдите к различным полям зрения и повторите вышеприведенные шаги для сбора данных из большего числа ячеек.
5. Анализ данных и одномолекулярное отслеживание
- Загрузите фильм в программное обеспечение для анализа SMLM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любое программное обеспечение18 может быть использовано. Мы используем INSIGHT (см. Таблицу Материалов)и перепроверяем результаты с помощью плагина ThunderSTORM19 для imageJ (Фиджи). - Визуально экранируйте фильм и настраивайте настройки контрастности таким образом, чтобы одномолекулярная флуоресценция мигает. При необходимости ограничьте область или диапазон кадров для анализа данных SMLM, если части образца непрерывно флуоресцентируются.
- Установите параметры идентификации одной молекулы для установки с 2D гауссианскими PSFs (ROI: 7 x 7 пикселей с размером пикселя 160 нм, шириной 260-650 нм, высотой йgt; 50 фотонов). Визуально экран через некоторые примеры кадры, чтобы проверить параметры идентификации и надежно обнаружить различные одной молекулы флуоресценции очередей (см. Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые параметры идентификации, такие как высота и ширина могут быть слегка скорректированы для оптимизации распознавания визуально воспринимаемых сигналов флуоресценции одной молекулы. - Выполните анализ изображений SMLM с оптимизированными параметрами идентификации, а затем сделать каждую одну молекулу 2D гауссианской, ширина которой взвешена обратным квадратным корнем обнаруженного количества фотонов.
- Оцените качество данных. Используйте ограниченные диапазоны кадров для наблюдения за распределением одной молекулы в более конкретных случаях во времени. Это может объяснить движение органелл ы при получении данных.
- Для дальнейшего анализа пространственного распределения и динамики распределения молекул, экспортировать полученный список молекул, содержащий координаты, рамки внешнего вида, фотоны, ширину и высоту локализаций. Импорт молекулы список в пользовательских письменных процедур анализа.
- Для получения пространственной информации о распределении одной молекулы вычислите функцию радиального распределения, которая представляет плотность локализаций как функцию радиального расстояния20. Чтобы получить q(r), рассчитать уникальные парные расстояния всех локализаций, построить гистограмму с бункерами по центру ri с высотой H (ri) и с шириной д-р и разделить на 2'rяdr; (В(ri) - H (ri)/) (riqdr)2-ri2). Функция радиального распределения может быть использована для количественной оценки и сравнения степени кластеризации, а также характерного размера кластеров.
- Чтобы получить динамическую информацию о диффузии молекул, свяжите локализации, которые появляются, например, в пределах 3 пикселей (0,48 мкм) в последовательных кадрах сбора данных для создания единичных следов молекул.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние соединения будет зависеть от диффузии молекул и плотности локализаций. Максимальное расстояние связующего можно оценить, проанализировав плотность локализаций в каждом кадре21,,22. Средняя плотность была определена в 0,043 локализации на мкм2; таким образом, радиус 0,48 мкм находился в достаточно низкой плотности, чтобы гарантировать, что различные молекулы не были связаны друг с другом. - Среднее смещение для разных времен задержки от нескольких следов продолжительностью не менее трех раз, чтобы создать среднее смещение в квадрате (MSD) по сравнению с сюжетом. Приспособитесь к кривой MSD против qt с уравнением MSD No 4D-t2 для расчета среднего коэффициента диффузии D3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем оптимизированную подготовку образца, процедуру сбора и анализа данных для SMLM с использованием конъюги для BODIPY на основе вышеуказанного протокола(рисунок 1A). Чтобы продемонстрировать пример рабочего процесса для получения и анализа данных SMLM, мы используем BODIPY (493/503) в дрожжах для разрешения LD под оптическим пределом дифракции(рисунок 1B-F). Примеры различных многоцветных режимов изображения BODIPY в сочетании с другими зондами, такими как GFP, mEos2 показаны на рисунке 2. Мы манипулируемым метаболическим состоянием в дрожжах, выращивая их в той же среде для 48 ч и покажем, что BODIPY-C12 образует неподвижные не-LD кластеры на клеточной периферии при посте в отличие от их включения в LDs в условиях fed(Рисунок 3). Для дальнейшего расширения возможностей SMLM BODIPY конъюгирует клетки млекопитающих, мы image caption BODIPY-C12 и LysoTracker-зеленый в живых клетках U2OS (Рисунок 4).
Рисунок 1: Оптимизация сбора и анализа данных SMLM с использованием красителей BODIPY. (A) Рабочий процесс для оптимизации сигналов флуоресценции одной молекулы и после обработки данных SMLM от bodiPY конъюгирует. (B) светодиодное изображение (слева), обычное изображение флуоресценции (средний, возбуждение: 488 нм, выброс: 525 нм) и анти-Стокс изображение (справа, возбуждение: 561 нм, выброс: 525 нм) дрожжевых клеток, окрашенных с LD BODIPY (493/503). (C) Одноместные кадры SMLM, показывающие синге BODIPY DII излучатели (возбуждение: 561 нм, излучение: 595 нм) при слишком низкой плотности (слева), оптимальной плотности (средняя) и слишком высокой плотности (справа). (D) Оптимизация параметров анализа SMLM. При слишком высоком пороге количества фотонов программное обеспечение пропускает допустимые сигналы одной молекулы (слева), обнаруживает все молекулы с оптимальным порогом фотона (средний) и обнаруживает ложные локализации со слишком низкими порогами фотона (справа). (E) SMLM изображение BODIPY (493/503) разрешает размер LDs (слева, зум) со средним диаметром 125 нм. (F) Отслеживание одной молекулы показывает ограниченное диффузии BODIPY (493/503) внутри LDs (слева). Следы используются для вычисления КРИвой времени MSD против времени, которая демонстрирует субдиффузное поведение внутри LD (справа). Шкала бар No 1 мкм, зум 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Многоцветная sMLM-изображение с использованием BODIPY конъюгируется в живых клетках. (A) Обычное изображение BODIPY-C12 под 488 нм возбуждение (слева). Соответствующие SMLM изображения с использованием DII состояния BODIPY-C12 под 561 нм возбуждение (средний) и зум (справа) выявление BODIPY-C12 в новых LDs. (B) Обычные флуоресценции изображение ER помечены Sec63-GFP под 488 нм возбуждение (слева). Одновременно записано обычное флуоресценции изображение bodiPY-C12 красный с 561 нм возбуждение (средний) и SMLM изображение с использованием 640 нм возбуждение (справа). (C) Последовательные двухцветные SMLM изображения Sec63-mEos2 и BODIPY-C12 зеленый DII государств. Во-первых, mEos2 изображен с высокой 405 нм фотоактивации и 561 нм возбуждение (слева) с последующим длительным приобретением данных без активации 405 нм (средний). Шкала бар No 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Дифференциальное распределение жирных кислот при голодании в дрожжевых клетках. (A) Схема, описывающая различные метаболические состояния (кормили и постились состояние) на основе продолжительности роста в среде SCD. B) Обычные флуоресценции изображения (вверху) показывают, что BODIPY-C12 красный совместно локализуется с BODIPY (493/503) в соответствии с фрс условия, указывающие на включение в LDs. На изображении SMLM (ниже, слева) показана плотная puncta BODIPY-C12 в LD и следы одной молекулы (ниже, справа) демонстрируют диффузию вдоль клеточных мембран. (C) При состоянии поста, BODIPY-C12 формы пунктуна в ячейке периферии, которые не совместно локализуются с LDs (верхний: левый, средний, нижний левый). Изображение SMLM разрешает пунктуиру и ограниченные следы красного цвета BODIPY-C12 (ниже, справа). (D) Функция радиального распределения (слева) показывает более высокую кластеризм БОДИПИ-ФА после поста. Средне-квадратное смещение по сравнению с графиком времени отслеживания одной молекулы (справа) подтверждает иммобилизацию BODIPY-C12 после поста. Шкала бар No 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Изображение красителей BODIPY в живых клетках U2OS млекопитающих. (A) Обычное флуоресценция изображение (слева) из BODIPY-C12 на 488 нм возбуждение. Соответствующее изображение SMLM с использованием DII состояний (справа) при возбуждении 561 нм показывает наноскопическое распределение состояний DII в ячейке U2OS. Вставки показывают увеличение липидных капель (шкала бар 500 нм). (B) Обычное изображение лисосомы в клетках U2OS с помощью LysoTracker зеленый на 488 нм возбуждение (слева). Соответствующее изображение SMLM неподвижных лисосомы (справа, шкала бар 5 мкм) при возбуждении 561 нм. Вгеобразие: SMLM изображение оптически дифракции ограниченной лисосомы (шкала бар 100 нм). Изображения BODIPY-C12 были записаны в растворе визуализации живых клеток при 23 градусах Цельсия. Изображения лисосомы с использованием lysoTracker зеленый были записаны в нефлуоресцентных DMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки, 4 мМ глутамин, 1 мМ пируват натрия и 1% пенициллин-стрептомицин антибиотики при 37 градусов по Цельсию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы продемонстрировали, как обычные конъюгированные BODIPY могут быть использованы для получения изображений SMLM с улучшением пространственного разрешения на порядок. Этот метод основан на использовании ранее сообщалось, красно-сдвинутые DII состояния обычных красителей BODIPY, которые временно образуются через двухмолекулярные встречи. Эти состояния могут быть специально возбуждены и обнаружены с красными длинами волн и являются редкими и недолговечными достаточно для SMLM. При настройке концентрации мономеров BODIPY вместе с лазерными параметрами может быть достигнута оптимальная плотность локализации и сигналк-шум. Мы решили внутриклеточное распределение и подвижность аналогов жирных кислот и нейтральных липидов с разрешением 30 нм (теоретическая формула Томпсона) в живых дрожжевых клетках в кормовых и постах условиях. Мы также обнаружили, что 40% государств BODIPY DII остаются на два или более кадров для сбора данных на уровне 20 Гц, что позволяет одномолекулярному отслеживанию количественно осмотреть их мобильность в различных условиях. Наши результаты показывают дифференциальную локализацию и мобильность BODIPY-FAs после поста и предлагают механизм защиты от липотокности. Наша способность отслеживать одиночные молекулы BODIPY и разрешать размер LDs и bodiPY-FA puncta под оптическим пределом дифракции под различными метаболическими состояниями только по возможности с наразвитой способностью SMLM обычных конъюгатов BODIPY. Точные молекулярные механизмы и пути, участвующие в пространственной регуляции распределения и поглощения жирных кислот, являются предметом наших будущих исследований. Кроме того, мы расширили возможности SMLM обычных спряжений BODIPY к живым клеткам млекопитающих, решая БОДИПИ-ФА и лисосомы в клетках U2OS.
Использование DII состояния обычных BODIPY конъюгирует для SMLM имеет преимущества по сравнению с другими зондами, поскольку сотни различных вариантов BODIPY коммерчески доступны, которые маркируют конкретные молекулы или клеточные отсеки в живых клетках. Подготовка образца так же проста, как добавление красителя при низких (100 нм) концентрациях перед визуализацией без промывки. В отличие от других зондов PALM/STORM, которые со временем отбеливают, мономеры BODIPY не подвержены воздействию их dII состояний и, следовательно, обеспечивают почти никогда не истощающий источник для одного молекулярного сигнала в долгосрочной перспективе визуализации. Так как DII государства возникают из-за спонтанных двухмолекулярных встреч, SMLM с использованием DII государства не требует внешнего добавленного буфера, чтобы вызвать мигает23. Аналогичным образом, нет необходимости в высокой энергии фото-активации, как это требуется для вновь синтезированных фото-активируемых версий BODIPY24 или SMLM некоторых обычных красителей BODIPY21, которые могут быть пагубными для здоровья клеток во время долгосрочной визуализации25,26. Кроме того, SMLM с DII государства создает присущий фон подавления неспецифических взаимодействующих зондов из-за квадратной зависимости dII государств на концентрации мономеров. Таким образом, на изображениях SMLM достигается более высокий контраст по сравнению с традиционными зондами, мономерный сигнал которых обнаруживается.
BODIPYs обладают слабой флуоресценцией против Стокса, которая позволяет возбуждать мономеры и димеры одним лазером при высокой мощности возбуждения. С одной стороны, это свойство может быть использовано для одновременной обычной флуоресценции и SMLM-изображения для отслеживания и разрешения движущихся структур. С другой стороны, это затрудняет объединение состояний BODIPY DII с другими зондами для многоцветной визуализации, поскольку сигнал BODIPY занимает два канала выбросов. Тем не менее, многоцветная визуализация возможна, когда зонды тщательно подобраны, как показано на рисунке 2B с Sec63-GFP и BODIPY-C12 красный. Аналогичным образом, последовательный двухцветный SMLM возможен с другими фотоактивируемыми зондами, такими как mEos2, как показано на рисунке 2C. Другие возможные комбинации для двухцветных SMLM включают в себя использование зеленых конъюгированных BODIPY и 640 нм возбудимых красителей, таких как JF646, привязанных к гало-тегу27.
Таким образом, мы представили оптимизированный протокол для SMLM с использованием обычных красителей BODIPY для исследования пространственно-временного распределения жирных кислот, нейтральных липидов и лизосом в наноскопической длине в живых дрожжах и клетках млекопитающих. С незначительными изменениями, этот протокол может быть в равной степени применимы для SMLM с сотнями других спарители BODIPY между различными типами клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Исследование, о проислизировавее в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии R21GM127965.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
