Summary
ここでは、インビトロで感覚神経および運動神経から線維芽細胞およびシュワン細胞を精製する方法を提示する。
Abstract
末梢神経系の主な細胞は、シュワン細胞(SC)および線維芽細胞である。これらの細胞は、神経栄養因子遺伝子発現および他の生物学的プロセスの異なるパターンに関与する感覚および運動表現型を明確に発現し、神経再生に影響を与える。本研究は、高度に精製されたラット感覚および運動SCおよび線維芽細胞をより迅速に得るためのプロトコルを確立した。新生児ラットの腹根(運動神経)と後根(感覚神経)を解離し、細胞を4〜5日間培養し、続いて分化消化と微分付着法を組み合わせて感覚と運動線維芽細胞とSCを分離した。免疫細胞化学とフローサイトメトリー分析の結果、感覚および運動SCおよび線維芽細胞の純度は90%であった。このプロトコルは、多数の感覚および運動線維芽細胞/SCをより迅速に得るために使用することができ、感覚神経および運動神経再生の探索に寄与する。
Introduction
末梢神経系において、神経線維は主に軸索、シュワン細胞(SC)、および線維芽細胞から成り、また、少数のマクロファージ、微小血管内皮細胞、および免疫細胞1を含む。SCは軸索を1:1の比率で包み、エンドニウリウムと呼ばれる結合組織層で囲まれている。その後、軸索を束ねて、ファシクルと呼ばれるグループを形成し、各魅惑は、ペリネリウムとして知られている結合組織層に包まれます。最後に、神経線維全体が、上気圧と呼ばれる結合組織の層に包まれる。このエンドヌリウムでは、全細胞集団は48%のSCで構成され、残りの細胞の大部分は線維芽細胞2を含む。さらに、線維芽細胞は、上聴神経、会陰、および末端3を含むすべての神経区画の重要な構成要素である。多くの研究は、SCおよび線維芽細胞が末梢神経損傷44、5、65後の再生プロセスにおいて重要な役割を果たすことを6示している。末梢神経の切除後、胸部線維芽細胞は、SCと線維芽細胞との間のシグナル伝達経路を介して細胞の並べ替えを調節し、さらに創傷5を通して軸索再成長を導く。末梢神経線維芽細胞は、テナシン-Cタンパク質を分泌し、β1-インテグリンシグナル伝達経路7を介して神経再生中のSCの移動を増強する。しかし、上記の研究で使用されたSCおよび線維芽細胞は、感覚神経と運動神経の両方を含む坐骨神経に由来した。
末梢神経系では、感覚神経(知覚神経)は受容体から中枢神経系(CNS)への感覚シグナル伝達を行い、運動神経(神経)はCNSから筋肉への信号を行う。これまでの研究では、SCは、末梢神経再生,8,9を支持する明確な運動および感覚表現型および分泌神経栄養因子を発現することが示されている。最近の研究によると、線維芽細胞はまた、異なる運動および感覚表現型を発現し、SCs10の移動に影響を与える。このように、運動神経線維芽細胞と感覚神経線維芽細胞/SCの違いを探ると、末梢神経特異的再生の複雑な分子機構を研究することができます。
現在のところ、SCおよび線維芽細胞を精製する方法は多数あり、抗ミトキ薬の適用、抗体媒介性細胞分解11、12、,12シーケンシャルイムノパンニング13およびラミニン皮層14を含む14。しかし、上記の方法はすべて線維芽細胞を除去し、SCのみを保存する。高度に精製されたSCおよび線維芽細胞は、フローサイトメトリー選別技術15によって得ることができるが、それは時間とコストのかかる技術である。そこで本研究では、多数の線維芽細胞やSCをより迅速に得るために、感覚および運動神経線維芽細胞およびSCを精製・単離するための単純な微分消化および微分付着法が開発された。
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Protocol
本研究は南通大学の施設動物ケアガイドラインに従って実施された。動物の被験者を含むすべての手順は、中国江蘇省実験動物管理委員会によって倫理的に承認されました。
1. 運動・感覚神経線維芽細胞とSCの分離と培養
- 中国南通大学実験動物センターが提供する7日前のスプレイグ・ドーリー(SD)ラット(n=4)を使用してください。ラットを5%のイオブルランを含むタンクに2〜3分間入れ、動物がゆっくりと呼吸し、独立した活性を持たなかった後、切断する前に75%エタノールを使用して消毒する。
- はさみを使って背中の皮膚を約3cm切り、脊柱を取り除きます。脊髄を露出させるために、椎管を慎重に開きます。
- 2~3 mLの氷冷D-ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を使用して、60mmペトリ皿に脊髄を維持します。
- 解剖学的構造に基づいて、弁当根(運動神経)を切除し、次に、解剖顕微鏡下で側側根(感覚神経)を切除する。次に、氷冷D-ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)に入れます。
- HBSSを取り外した後、はさみで神経を3〜5mmにスライスし、18〜20分間37°Cで0.25%(w/v)トリプシンの1mLで消化します。次に、10%のウシ胎児血清(FBS)を含むDMEMの3〜4 mLを補って消化を止める。
- 混合物を約10回上下にピペットし、遠心分離機を800xggで5分間ピペットします。その後、上清を捨て、10%FBSを添加したDMEMの2〜3mLで沈殿を中断します。
- 400メッシュフィルターを用いて細胞懸濁液を濾過し、5%CO2の存在下で37°Cで60mmペトリ皿および培養中の細胞2を接種する。培養4~5日後、90%合流に達した後に、0(p0)線維芽細胞およびSCの通路を分離する。
- SCの分離と文化 (図 1)
- 1x PBSを使用して細胞を1回洗います。0.25%(w/v)トリプシン(37°C)の1 mLを60mmペトリ皿あたり1 mL加え、室温で8〜10秒の細胞を消化します。その後、消化を止めるために10%FBSを添加したDMEMの3mLを加えます。
- 混合物を軽く吹き飛ばして、ピペットでSCを取り外します。その後、SCを800 x gで5分間遠心します。
- 上澄みを捨て、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2 μMフォルスコリン、10 ng/mL HRGでDMEMの3mLで沈殿物を中断し、コーティングされていない60mmペトリ皿で細胞を接種します。30〜45分間37°Cで培養した後、線維芽細胞(数個の線維芽細胞はSCで消化される)が皿の底に付着する。
- 上清(SCを含む)を別のポリL-リジン(PLL)コーティングされた培地皿に移し、37°Cで2日間培養します。
- 線維芽細胞の分離と培養(図1)
- SCを取り除いた後(ステップ1.8に示すように)、残りの線維芽細胞を1x PBSで皿に洗い、0.25%(w/v)のトリプシンの1 mLを加えて37°Cで2分間線維芽細胞を消化します。
- DMEMを10%FBSで補って消化を終わらせます。ピペットを使用して繊維芽細胞を吹き、800 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、10%FBSを含むDMEMの2mLで沈殿を懸濁し、次いでコーティングされていない60mmペトリ皿に細胞を接種する。培養後の繊維芽細胞を30〜45分間、37°Cで培養し、皿の底部に付着する。上清を捨てます(数個のSCを含む)。その後、37°Cで37°Cで10%FBSを添加したDMEMの3mLを2日間加え、培養します。
- p1細胞を90%合流に達するまで通過する。その後、セクション1.8と1.9に記載されているように、差動消化と差付着によって再びそれらを浄化します。
- 2日間培養した後にp2線維芽細胞とSCを消化し、免疫細胞化学(ICC)用PLLコーティングスライド上の1 x 105個の数/ウェルで細胞を数え、接種します。
2. 細胞純度の同定のためのICC
- 細胞を37°Cで24時間培養し、運動と感覚線維芽細胞およびSCの差動消化および差動付着後にICC染色を行う。
- 1x PBSでモーターと感覚線維芽細胞とSCを洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(pH 7.4)の200 μL/ウェルで室温で18分間固定します。
- ブロッキングバッファー(5%ヤギ血清を含む0.01 M PBSで0.1%トリトンX-100)でサンプルSCをブロックし、PBS 3thで洗浄した後、37°Cで45分間ブロッキングバッファー(0.01 M PBS)でサンプル線維芽細胞をブロックします。
- ブロッキングバッファーを除去し、次の一次抗体でインキュベートする:マウスモノクローナル抗CD90抗体(線維芽細胞の特定マーカー)(1:1000)線維芽細胞およびマウス抗S100抗体(SC用の特定マーカー)(1:400)のSCの夜間の一晩。
- 一次抗体を捨て、PBS 3thriceで洗浄し、次の二次抗体でインキュベートする:アレクサFluor 594ヤギ抗マウスIgG(1:400)線維芽細胞用、488結合ヤギ抗マウスIgG(1:400)を室温でSC用に1.5時間。
- サンプルをPBSで3回洗浄し、5 μg/mL Hoechst 33342 色素で核を室温で10分間染色します。サンプルを1x PBSで洗い、ガラススライドの取り付け媒体(20 μL/スライド)を使用して取り付けます。
- 各ウェルの3つのランダムなフィールドで共焦点レーザー走査顕微鏡によって細胞写真を撮ります。核細胞とCD90陽性細胞の総数を評価し、S100陽性細胞をそれぞれ算出し、それぞれCD90陽性細胞とS100陽性細胞の割合を計算します。三重で染色を行います。
3. 細胞純度の同定のためのフローサイトメトリー分析(FCA)
- FCA16で前述したように、モータおよび感覚線維芽細胞およびSCの純度を評価する。簡単に言えば、0.25%(w/v)トリプシンでp2モーターと感覚線維芽細胞とSCを消化し、細胞ペレットを再懸濁し、室温で固定媒体に15分間インキュベートします。
- 線維芽細胞およびマウス抗S100抗体(1:400、200μL)のマウスモノクローナル抗CD90抗体(0.1μg/106細胞、200μL)を用いて、透過性培地とプローブを用いて細胞をインキュベートし、それぞれ30分間室温でSCに用いる。
- 488結合ヤギ抗マウスIgGを30分間インキュベートし、FACSキャリバーを使用してフローサイトメトリーを実行し、Cell Questソフトウェアを使用してデータを分析します。
- 488結合ヤギ抗マウスIgG(線維芽細胞群)およびマウスIgG1カッパ[MOPC-21](FITC)-アイソタイプコントロール(SCs群)のみで細胞をインキュベートし、負の対照として機能します。
4. 統計分析
- すべてのデータを手段として提示する±SEM.GraphPad Prism 6.0を使用して非対t-testによってデータの統計的差を評価する。p<0.05 で統計的有意性を設定します。三重ですべてのアッセイを実行します。
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Representative Results
光顕微鏡観察
SCおよび線維芽細胞は、神経組織から一次細胞培養で得られた2つの主要な細胞集団である。1時間の接種後、ほとんどの細胞は皿の底に付着し、細胞形態は円形から楕円形に変化した。24時間培養後、SCは双極形態または三極形態を呈し、その長さは100~200μmの範囲となった。48時間後、細胞の凝集と増殖が起こり、多くの細胞がエンドツーエンド、肩から肩、渦またはフェンスのような配置で凝集した。SCよりも大きい他の線維芽細胞は、平坦で不規則な形状を示した。培養時間が長くなると、SCや線維芽細胞の数は徐々に増加しました。SCは、線維芽細胞の空間間に集結していたか、または線維芽細胞の表面に位置した(図2A、2B)。細胞は、分離線維芽細胞およびSCに対する差分化および微分付着を受ける。8-10sの消化後、SCは丸く現れ、容易に吹き飛ばされ、線維芽細胞は平らで皿の底に付着している(図2C、2D)。2回の差出消化および微分付着後、一次培養SCおよび線維芽細胞を単離し、運動および感覚SCおよび線維芽細胞の典型的な細胞形態が観察された(図2E-2H)。
ICCによる運動・感覚線維芽細胞及びSCの純度評価
この感覚および運動線維芽細胞は、CD90を用いて標識し、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて可視化した(図3A、3D)。細胞核に標識するためにHoechst 33342色素を用いた(図3B,3E)。線維芽細胞免疫染色と核染色の合成画像(図3C、3F)は、CD90およびHoechst共標識細胞の92.51%および92.64%がそれぞれ運動および感覚線維芽細胞に存在していたことを示した(図3G)。
S100を用いてセンサーとモーターSCを標識し、共焦点レーザー走査顕微鏡(図4A,4D)を用いて可視化した。細胞核に標識するためにHoechst 33342色素を用いた(図4B,4E)。SC免疫染色と核染色の合成画像(図4C、4F)は、それぞれ、S100および感覚SCの細胞の91.61%と93.56%の存在を示した(図4G)。
FCAによる感覚・運動線維芽細胞及びSCの純度評価
2回の微分消化および微分付着後、一次培養線維芽細胞およびSCを単離した。図5Aに示すように、運動中および感覚Fb培養中の細胞のほぼ>90%が線維芽細胞であり、M2で示され、残りの<10%(M1で示される)はSCであった。B
図1:官能と運動線維芽細胞およびSCの分離と精製の工程を示す概略図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:(A)一次培養モータ及び(B)官能線維芽細胞及びSCの細胞形態を示す位相対数顕微鏡写真。10 sの消化後、SCの細胞形態は丸く(矢印で示される)、線維芽細胞は平坦なままで、皿の底部に取り付けられました(C:運動線維芽細胞およびSC;D:感覚線維芽細胞およびSC)。差分消化と微分付着後、SCと線維芽細胞を単離し、運動および感覚線維芽細胞の典型的な細胞形態(E:運動線維芽細胞;F:感覚線維芽細胞)およびSC(G:モーターSC;H:感覚的なSC)が示された。(スケールバー:50 μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ICCによる運動および感覚線維芽細胞の純度の同定CD90(AおよびD、赤)に対する抗体による免疫染色を示す培養モータ(A-C)および感覚線維芽細胞(D-F)の蛍光顕微鏡写真、Hoechst 33342核染色(BおよびE、青)の両方の結合(CおよびF)の両方の結合。(G) 培養線維芽細胞の純度の統計分析(スケールバー:100 μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ICCによるモータおよび感覚SCの純度の同定培養されたモータ(A-C)および感覚SC(D-F)の蛍光顕微鏡写真は、S100(AおよびD、赤)に対する抗体による免疫染色をA示し、Hoechst 33342核染色(BおよびE、青)と共に染色(CおよびF)の両方を合体させる。D-F(G)培養SCの純度の統計分析(スケールバー:100μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:FCAによる感覚および運動線維芽細胞およびSCの純度の同定。培養された運動および感覚性線維芽細胞のCD90陽性細胞/S100陽性細胞(M2)の割合を示すFCAグラフ.培養線維芽細胞(A)およびSC(B)の純度の統計分析。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
末梢神経の2つの主要な細胞集団には、SCおよび線維芽細胞が含まれていた。主に培養された線維芽細胞およびSCは、末梢神経の発達および再生の間に線維芽細胞およびSCの生理学を正確にモデル化するのを助けることができる。この研究は、P7ラット坐骨神経細胞がS100陽性SCの約85%、OX7陽性線維芽細胞の13%、OX42陽性マクロファージ13の1.5%しか含まれていないことを示した。線維芽細胞の数はSCより少ないが、線維芽細胞の初期増殖速度はSCよりも速い。したがって、Ara-Cは、多くの研究で線維芽細胞を除去するための最も一般的に使用される抗ミトキシス薬である。しかし、Ara-Cは細胞の有糸分裂に特異的ではなく、分裂の活発な段階でのSCの増殖を阻害することもできる。抗体媒介性細胞化または免疫パンニング法では、線維芽細胞は失われたか死んだ。フローサイトメトリー選別技術は、高純度の線維芽細胞とSCを同時に得るために使用できるが、大量の細胞を必要とし、細胞獲得率は低いままであった。私たちの知る限りでは、これは感覚と運動SCと線維芽細胞の浄化方法を示す最初の研究でした。
本研究では、微分消化と微分付着を逐次的に組み合わせることで、多数の感覚・運動線維芽細胞とSCが同時に得られ、細胞に害を及ぼさない。ICC染色とFCAの結果は、すべての感覚およびモーターSC/線維芽細胞が高純度(>90%)であることを示した。この方法の重要なステップは、差分消化の時間を制御することです。時間が短すぎると、SCを取り外しにくくし、時間が長すぎると、いくつかの線維芽細胞がSCで消化されます。ワイスの研究では、氷冷アキュターゼは線維芽細胞からSCを取り外すために使用されますが、これはトリプシン17よりも高価です。トリプシンによる差動消化は、SCと線維芽細胞の分離を効果的に助けることができる。このプロトコルの制限は、分剖顕微鏡でより多くの練習を必要とする新生児ラットから感覚神経および運動神経を切除することは容易ではないということです。培養のプロトコルは、感覚神経線維芽細胞やSCの生物学的特性を研究し、神経再生を促進するための感覚神経および運動神経再生、または線維芽細胞およびSC移植のメカニズムのために非常に有用である。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(グラント2017YFA0104703)、中国国立自然財団(グラント31500927)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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