Summary
प्रस्तुत प्रोटोकॉल छोटे अणु यौगिकों के एक न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन दो प्रमुख अध्ययन हैं जिन्हें यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग करके किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल न्यूरोनल आकृति विज्ञान का विश्वसनीय विश्लेषण प्रदान करता है जिसमें न्यूराइट लंबाई और सिनैप्टिक प्रोटीन स्थानीयकरण पर संशोधनों के मात्रात्मक माप और छोटे अणु यौगिकों के साथ उपचार पर बहुतायत है। न्यूराइट आउटग्रोथ अध्ययनों में प्रस्तुत विधि के आवेदन के अलावा, न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन उनके संभावित विकासात्मक न्यूरोटॉक्सिसिटी प्रभाव के आधार पर वाणिज्यिक रासायनिक यौगिकों का आकलन, अंतर और रैंक करने के लिए किया जा सकता है।
हालांकि सेल लाइनों आजकल व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान में यौगिक स्क्रीनिंग परख में उपयोग किया जाता है, वे अक्सर आनुवंशिक रूप से और उनके ऊतक मूल से phenotypically अलग । दूसरी ओर, प्राथमिक कोशिकाएं वीवो में देखे गए महत्वपूर्ण मार्कर और कार्यों को बनाए रखते हैं। इसलिए, अनुवाद क्षमता और शारीरिक प्रासंगिकता के कारण कि ये कोशिकाएं न्यूराइट आउटग्रोथ परख की पेशकश कर सकती हैं और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन प्राथमिक मानव कोशिका मॉडल के रूप में मानव तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एचपीपीसी) का उपयोग करने से काफी लाभान्वित हो सकता है।
प्रस्तुत विधि यहां यौगिकों की क्षमता के लिए स्क्रीन करने के लिए मानव तंत्रिका जनक कोशिका व्युत्पन्न न्यूरॉन्स, एक सेल मॉडल बारीकी से मानव जीव विज्ञान का प्रतिनिधित्व का लाभ लेने के द्वारा न्यूराइट आउटग्रोथ और न्यूरोटॉक्सिसिटी प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
Introduction
न्यूराइट विकास न्यूरोनल नेटवर्क और तंत्रिका उत्थान के गठन के लिए मौलिक प्रक्रिया है1, 2,2. एक चोट के बाद, न्यूराइट आउटग्रोथ तंत्रिका तंत्र के उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों और न्यूरोनल,इंजरी3,4,,5,6के परिणामों को बढ़ाने के लिए न्यूरोनल पुनर्योजी गतिविधियों को प्रेरित करने में न्यूराइट आउटग्रोथ भी एक महत्वपूर्ण तत्व है ।
विभिन्न तंत्रिका वंश के उत्पादन में उनकी भेदभाव क्षमता को बनाए रखकर, मानव तंत्रिका जनक कोशिकाएं (एचपीपीसी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) कार्य,और विकास7,8,9के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली प्रदान कर सकती हैं।, प्राथमिक मानव कोशिका मॉडल के रूप में एचएनपीसी की उच्च अनुवादात्मक क्षमता और शारीरिक प्रासंगिकता न्यूराइट आउटग्रोथ से संबंधित दवा खोज स्क्रीनिंग में काफी लाभ प्रदान करती है। हालांकि, उच्च थ्रूपुट परख के लिए प्राथमिक सेल मॉडलों का रखरखाव और स्केलिंग समय लेने वाली और श्रम-प्रधान10, 11,,12,,,13हो सकती है।12
न्यूराइट आउटग्रोथ अध्ययनों में प्रस्तुत विधि के आवेदन के अलावा, न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन एचएनपीसी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का उपयोग करके एक और आवेदन है। हजारों वाणिज्यिक रासायनिक यौगिक हैं जो या तो जांच नहीं की जाती हैं या खराब समझ में आई न्यूरोटॉक्सिटी क्षमता के साथ। इसलिए, विकासात्मक न्यूरोटॉक्सिकिटी को प्रकाश में लाने की उनकी क्षमता के आधार पर मूल्यांकन, अंतर और रैंक यौगिकों का आकलन, अंतर और रैंक यौगिकों के लिए अधिक विश्वसनीय और प्रभावी स्क्रीनिंग प्रयोग उच्च मांग14में है। पर्यावरण में अपरीक्षित यौगिकों की प्रचुरता के साथ - साथ न्यूरोलॉजिकल विकारों की व्यापकता और घटनाओं में वृद्धि के लिए खतरनाक पर्यावरणीय यौगिकों की पहचान करने के लिए अधिक भरोसेमंद और कुशल प्रयोगों का विकास आवश्यक है जो न्यूरोटॉक्सिसिटी15पैदा कर सकते हैं ।
प्रस्तुत विधि का उपयोग मानव तंत्रिका जनक कोशिका-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का लाभ उठाकर यौगिकों की क्षमता के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, जो मानव जीवविज्ञान का बारीकी से प्रतिनिधित्व करने वाला एक सेल मॉडल है।
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Protocol
नैतिकता वक्तव्य: भ्रूण नमूनों एक ऊतक वितरण स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) द्वारा समर्थित कार्यक्रम के माध्यम से सिएटल में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में जंम दोष अनुसंधान प्रयोगशाला से प्राप्त किया गया । जन्म दोष अनुसंधान प्रयोगशाला माता पिता से उचित लिखित सूचित सहमति प्राप्त की और ऊतकों की खरीद वाशिंगटन विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा निगरानी की गई थी । मियामी विश्वविद्यालय में मानव विषय अनुसंधान कार्यालय द्वारा अनुमोदन के साथ सभी कार्य किएगए।
1. मानव तंत्रिका जनक कोशिकाओं की अलगाव और संस्कृति (एचएनपीसी)
- मस्तिष्क के ऊतकों को 100 मिमी पेट्री डिश में रखें और संदंश का उपयोग करके मेनिंग को ध्यान से हटा दें।
- मस्तिष्क के ऊतकों को 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और ट्यूब को धीरे-धीरे उलटा करके पीबीएस के 20 एमएल के साथ इसे दो बार धोएं।
- कोशिका वियोजन समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) और DNase I (10 U/mL) में ऊतक को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए जलमग्न करके एक नई 50 एमएल शंकु नली में मस्तिष्क के ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
- मस्तिष्क कोशिका संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़ें (सामग्री की मेजदेखें) मस्तिष्क के ऊतकों में ट्यूब युक्त और यांत्रिक रूप से एक एकल कोशिका निलंबन बनाने के लिए एक 1000 μL pipet टिप के माध्यम से 20 से 30 बार triturating द्वारा न्यूरोस्फीयर को अलग करें।
- सेल क्लस्टर को हटाने के लिए 70 माइक्रोन सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।
- टेबल 1 में विस्तृत घटकों के साथ पूरक न्यूरोनल सेल कल्चर मीडियम के 5-10 एमएल के साथ प्रदान किए गए एक वेंटेड टी-25फ्लास्क में एकल-कोशिका निलंबन बीज ।
- 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा हेपरिन समाधान को स्टरलाइज करें। विटामिन ए के बिना बी-27 पूरक भेदभाव को उत्प्रेरण किए बिना तंत्रिका जनक और स्टेम कोशिकाओं की खेती के लिए एक सीरम-मुक्त पूरक है।
नोट: मानव तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एचएनपीसी) मानव भ्रूण मस्तिष्क से अलग कर रहे है गर्भपात भ्रूण से एकत्र । संस्कृति में 7-10 दिनों के बाद, तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) मुक्त-फ्लोटिंग न्यूरोस्फीयर उपनिवेश बनाते हैं, जबकि अन्य सेल प्रकार एकल कोशिकाओं के रूप में निलंबन में रहते हैं या फ्लास्क के नीचे से देते हैं। अलग - थलग पड़े एचएनपीसी को कई महीनों के लिए कई महीनों के लिए निलंबित किए गए न्यूरोस्फीयर के रूप में सुसंस्कृत किया जा सकता है8,16,17.
- 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा हेपरिन समाधान को स्टरलाइज करें। विटामिन ए के बिना बी-27 पूरक भेदभाव को उत्प्रेरण किए बिना तंत्रिका जनक और स्टेम कोशिकाओं की खेती के लिए एक सीरम-मुक्त पूरक है।
| राशि | घटक |
| 100 माइक्रोल | ईजीएफ (20 एनजी/एमएल) |
| 100 माइक्रोल | एफजीएफ (10 एनजी/एमएल) |
| 2 एमएल | बी-27, माइनस विटामिन ए (50X) |
| 1 एमएल | एल-एलेनिल-एल-ग्लूटामाइन (100X) (सामग्री की तालिका देखें) |
| 4 माइक्रोन | हेपरिन (2 μg/mL) |
| 96.8 एमएल | न्यूरोनल सेल संस्कृति माध्यम (सामग्री की तालिका देखें) |
तालिका 1. संस्कृति मीडिया के 100 एमएल बनाने के लिए आवश्यक घटक
2. एचएनपीसी पासिंग
- फ्लोटिंग गोले, बड़े और छोटे न्यूरोस्फीयर वाले मीडिया को इकट्ठा करें, और उन्हें 50 एमएल शंकुसंख में स्थानांतरित करें।
नोट: अज्ञात कारणों के कारण, न्यूरोस्फीयर को विभाजित करने का समय 7 दिनों से 30 दिनों तक परिवर्तनशील है। हालांकि, आम तौर पर, जब वे 700-900 माइक्रोन से अधिक व्यास तक पहुंचते हैं तो न्यूरोस्फीयर को पारित करने की आवश्यकता होती है। यह तब होता है जब न्यूरोस्फीयर का केंद्र अंधेरा होना शुरू होता है, जिसे सेल मृत्यु18की उच्च दर का संकेत माना जाता है। - 3 मिनट के लिए 300-400 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा न्यूरोस्फीयर को स्पिन करें।
- ध्यान से सुपरनैंट को एस्पिएरेट करें और फिर 500 माइक्रोल में डिफ्रॉस्टेड सेल डिसोसिएशन रिएजेंट (सामग्रियों की तालिकादेखें) में क्षेत्रों को जलमग्न कर दें।
- 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब 500 माइक्रोट्यूब जोड़कर सेल वियोजन के एलिकोट्स को रिएजेंट बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एंजाइम गतिविधि खोने से बचने के लिए, एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी/मनका स्नान में 5 मिनट के लिए आरटी या गर्म पर पकड़ द्वारा सेल वियोजन अभिवाक गल ।
- क्षेत्रों के घनत्व और आकार के आधार पर, जलमग्न क्षेत्रों को 5-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- न्यूरोस्फीयर को तलछट करने के लिए 5 मिनट के लिए 50 मिलियन शंकु नली और अपकेंद्रित्र पर 50 एमएल शंकु नली और अपकेंद्रित्र युक्त न्यूरोस्फीयर में प्री-गर्म संस्कृति मीडिया के 5-10 एमएल जोड़ें।
- संस्कृति मीडिया के 2 एमसीएल में 1000 माइक्रोट का उपयोग करके, सुपरनेट और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें, जब तक कि सभी न्यूरोस्फीयर एक ही सेल निलंबन में न हों।
नोट: वियोजन नग्न आंखों को दिखाई देगा। वियोजन से पहले, न्यूरोस्फीयर गोले के रूप में होते हैं। वियोजन अभिकर्ण में डूबने के बाद और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके, वे एकल कोशिकाएं बन जाएंगी।- कोशिकाओं की गणना करें और एकल कोशिकाओं को प्लेट करें, संस्कृति मीडिया के 10 एमएल में टी-25 फ्लास्क प्रति 2 से 3 मिलियन कोशिकाएं।
- आधे कल्चर मीडिया को बदलकर हर 3 दिन में कोशिकाओं को खिलाएं।
- फ्लास्क को झुकाकर न्यूरोस्फीयर व्यवस्थित करें ताकि यह अपने नीचे के कोने पर हो। फ्लास्क को लगभग 1-2 मिनट तक स्थिति में रखें जब तक कि न्यूरोस्फीयर तलछट न हो जाएं। फिर आधे मीडिया को धीरे से तय न्यूरोस्फीयर के ऊपर मीडिया में सीरोलॉजिकल पिपेट डालने से आकांक्षी करें । अलग कोशिकाओं को संस्कृति19में 2 से 3 दिनों के बाद क्षेत्रों के रूप में कुल कर सकते हैं ।
3. एचएनपीसी को फ्रीज करना
- संस्कृति मीडिया में डीएमओ को 10% (v/v) की अंतिम एकाग्रता में जोड़कर सेल फ्रीजिंग माध्यम तैयार करें या संवेदनशील सेल प्रकारों (सामग्रियों की तालिकादेखें) के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम का उपयोग करें।
- मीडिया को 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करके और क्षेत्रों को गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करके बड़े क्षेत्रों को सुलझाएं। फिर 200 या 1000 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करके पासेजिंग के लिए बड़े न्यूरोस्फीयर को एक नए 50 एमएल शंकु नली में हटा दें और स्थानांतरित करें।
नोट: 900 माइक्रोन से अधिक व्यास वाले न्यूरोस्फीयर को बड़ा माना जाता है और 500 माइक्रोन से छोटे व्यास वाले लोगों को छोटा माना जाता है। - शेष न्यूरोस्फीयर को 3 मिनट के लिए 300-400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा नीचे स्पिन करें। ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें।
- क्रायोप्रिजर्वेशन रिएजेंट के 1 मिलियन मीटर में 100 क्षेत्रों तक पुनर्व्यवसाय करें और इसे क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें।
- एक सेल फ्रीजिंग कंटेनर में -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें (सामग्री की तालिकादेखें) और इसे दीर्घकालिक भंडारण के लिए अगले दिन तरल नाइट्रोजन में ले जाएं।
नोट: छोटे से मध्यम आकार के न्यूरोस्फीयर (व्यास में 900 माइक्रोन से कम) को फ्रीज करना बेहतर है और बड़े आकार के न्यूरोस्फीयर (व्यास में 900 माइक्रोन से अधिक) या एकल कोशिकाओं को ठंडा करने से बचना बेहतर है। नमूना विगलन के दौरान कोशिका क्षति को कम करने के लिए, गल गए न्यूरोस्फीयर को एक छोटे टी-25 फ्लास्क में बोने से कोशिकाओं को घना रखें।
4. एचएनपीसी का भेदभाव और उपचार
नोट: भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, न्यूरोस्फीयर को एकल कोशिकाओं में अलग किया जाता है, गिना जाता है और फिर 5 दिनों के लिए लेपित प्लेटों पर वरीयता प्राप्त किया जाता है। फिर विभेदित कोशिकाओं को इम्यूनोदाता और फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन से पहले परीक्षण यौगिकों के साथ 24 घंटे के लिए इलाज किया जाता है।
- कोटिंग
- 4-वेल ग्लास चैंबर स्लाइड (8-वेल चैंबर स्लाइड के प्रति कुएं के 140 माइक्रोन) के प्रति पॉली-एल-लिसिन (पीएलएल) के 200 माइक्रोल जोड़ें।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
- पीबीएस के साथ 3x धोएं।
- इसे आरटी (लगभग 30 मिनट के लिए) में सूखने दें।
- 4-वेल ग्लास चैंबर स्लाइड (8-वेल चैंबर स्लाइड के प्रति कुएं के 120 माइक्रोन) लैमिनिन (50 माइक्रोन/एमएल) जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
- पीबीएस के साथ 3x धोएं।
नोट: लेपित कक्ष स्लाइड 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- कोशिकाओं चढ़ाना
- गिनती और प्लेट 80,000 एकल सेल न्यूरोस्फीयर (एक सेल निलंबन में न्यूरोस्फीयर) प्रति अच्छी तरह से 4-वेल चैंबर स्लाइड (8-वेल चैंबर स्लाइड के प्रति अच्छी तरह से 70,000 कोशिकाएं)।
- 4-वेल चैंबर स्लाइड (8-वेल चैंबर स्लाइड के प्रति अच्छी तरह से 250 माइक्रोन मीडिया) के प्रति विभेदन मीडिया के 500μL जोड़ें।
- विभेदन मीडिया को पहले बनाने के लिए, तंत्रिका उत्प्रेरण मीडिया (एनआईएम) बनाने के लिए टेबल 2 में निम्नलिखित घटकों को बाँझ, डिस्पोजेबल कंटेनर में जोड़ें।
- भेदभाव मीडिया बनाने के लिए पिछले चरण में किए गए एनआईएम के तालिका 3 से 48.5 एमएल में निम्नलिखित सामग्री जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए इनक्यूबेट।
- 5 दिनों के बाद, उचित नियंत्रण सहित परीक्षण यौगिकों की वांछित एकाग्रता के साथ मिश्रित ताजा मीडिया के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से आधे मीडिया की जगह से 24 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज करें।
| राशि | घटक |
| 49 एमएल | DMEM/F-12 |
| 0.5 एमएल | N2 पूरक (100X) |
| 0.5 एमएल | एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (100X) |
| 2 माइक्रोन | हेपरिन (2 μg/mL) (स्टॉक कॉन ५० मिलीग्राम/एमएल है) |
तालिका 2.. एनआईएम के 50 एमएल बनाने के लिए आवश्यक घटक
| राशि | घटक |
| 1 एमएल | बी-27 (50X) |
| 500 माइक्रोल | एंटीबायोटिक-एंटीमायकोटिक (100X) |
| 5 माइक्रोन | रेटिनोइक एसिड (0.1 माइक्रोन) |
| 50 माइक्रोन | जीडीएनएफ (10 μg/mL) |
| 50 माइक्रोन | BDNF (10 μg/mL) |
| 5 माइक्रोन | Ascorbic एसिड (०.२ μg/mL) (स्टॉक Conc. 2 मिलीग्राम/एमएल है) नोट: ताजा करने की सिफारिश की । |
| 48.5 एमएल | एनआईएम |
तालिका 3. भेदभाव मीडिया के 50 एमएल बनाने के लिए आवश्यक घटक
5. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी)
नोट: कोशिकाओं को 4% फॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया जाता है। परिव्ययीकरण और अवरुद्ध तो प्रवेश में सुधार और एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए किया जाता है । कोशिकाओं को तो रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड कर रहे हैं । इसके बाद, कोशिकाओं को फ्लोरोसेंटी लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। अंत में, नाभिक को दागने के लिए DAPI का उपयोग करने के बाद, कक्ष स्लाइड लगाए जाते हैं।
- निर्धारण
- धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में मीडिया को आकांक्षी करें।
- 4-वेल चैंबर स्लाइड (8-वेल चैंबर स्लाइड के 250 माइक्रोन प्रति कुएं) के प्रति कुएं के 4% फॉर्मलडिहाइड के 500μL जोड़ें।
- आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
- पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ धीरे-धीरे 2x धोएं।
नोट: निर्धारण के बाद, प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 1 एमएल छोड़कर, संस्कृति स्लाइड को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- सेल पारमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग
- एंटीबॉडी (एबी) बफर बनाने के लिए टेबल 4 में निम्नलिखित घटकों को एक बाँझ, डिस्पोजेबल कंटेनर में जोड़ें।
- सेल पारमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग सॉल्यूशन बनाने के लिए पिछले चरण में बने एबी बफर के साथ टेबल 5 में निम्नलिखित सामग्री मिलाएं।
- 4-वेल चैंबर स्लाइड के प्रति अच्छी तरह से 500 μL जोड़ें और आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: एबी बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
| राशि | घटक |
| 1.75 ग्राम | एनएसीएल (150 mM) |
| 1.2 ग्राम | ट्राइबेस (50 mM) |
| 2 ग्राम | बीएसए 1% |
| 3.6 ग्राम | एल-लिसिन (100 mM) |
| 8 ग्राम | सोडियम अज़ाइड (4%) |
| 200 एमएल | आसुत पानी। नोट: शुरू में 150 एमएल पानी में आवश्यक घटकों को भंग करें, फिर 200 एमएल में समायोजित करें। |
तालिका 4. एंटीबॉडी बफर के 200 एमएल बनाने के लिए आवश्यक घटक
| राशि | घटक |
| 600 माइक्रोल | 20% बकरी सीरम |
| 6 माइक्रोन | 0.2% ट्राइटन-X100 |
| 2394 माइक्रोल | एंटीबॉडी बफर। नोट: शुरू में एबी बफर के 2 एमसीएल में आवश्यक घटकों को भंग करें, और फिर पीएच 7.4 में समायोजित करें। फिर 3 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करने के लिए अधिक एबी बफर जोड़ें और फ़िल्टर स्टरलाइज करें। |
तालिका 5. सेल पारमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग समाधान के 3 एमएल बनाने के लिए आवश्यक घटक
- धुंधला
- पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ 2x धोएं।
- पतला प्राथमिक एंटीबॉडी, एंटी-ए-ट्यूबलिन III (1:200) जोड़ें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (4-वेल चैंबर स्लाइड के 200 माइक्रोल प्रति कुएं) पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
- पीबीएस के साथ 2x धोएं।
- पीबीएस में पतला, फ्लोरोसेंटी लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लोरर 488 (1:500), और प्रकाश से संरक्षित स्थान में आरटी में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट जोड़ें (4-वेल चैंबर स्लाइड के प्रति कुएं में 250 माइक्रोल)
- पीबीएस के साथ 2x धोएं।
- पतला, पीबीएस, DAPI (300 एनएम एकाग्रता) में जोड़ें और प्रकाश से संरक्षित स्थान में आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट (4-वेल चैंबर स्लाइड के 300 माइक्रोल प्रति कुएं)।
- पीबीएस के साथ 3x धोएं।
- निम्नलिखित निर्देशों का उपयोग करते हुए कक्ष स्लाइड माउंट करें।
- टूटे टैब को तोड़कर और गैसकेट और बेस को हटाकर चैंबर स्लाइड के अलावा लें।
- बढ़ते समाधान की एक बूंद जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) 4-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के प्रति अच्छी तरह से । फिर पूरी स्लाइड को कवर करने के लिए कवर स्लाइड का उपयोग करें।
- चिमटी का उपयोग करके और कोण पर, तरल ड्रॉप के बाहरी किनारे से संपर्क करते समय स्लाइड के खिलाफ कवर स्लिप के एक तरफ रखें।
- ध्यान से बढ़ते समाधान पर कवरस्लिप टिप जब यह जगह में कम । बुलबुले के निर्माण से बचें। एक पिपेट टिप लें और इसे कवर स्लिप पर दबा लें। बुलबुले पक्ष की ओर चले जाएंगे।
नोट: बुलबुला गठन कई बार अपरिहार्य है । यदि ऐसा होता है, तो जब तक कुछ हैं, उनके चारों ओर छवि। - समय के इलाज के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। इमेजिंग के दौरान हैंडलिंग में कठिनाई के कारण नॉनकरिंग बढ़ते समाधानों का उपयोग करने से बचें। अन्यथा किनारों पर एक उपयुक्त कवरस्लिप सीलेंट का उपयोग करने के लिए इमेजिंग के दौरान स्लाइडिंग से कवरस्लिप को रोकने की आवश्यकता होती है।
- कवरस्लिप को सील करने के लिए नेल पॉलिश का इस्तेमाल करें और कवर स्लिप के किनारे पर एक छोटी सी लाइन बनाएं। नेल पॉलिश को लगभग 2 मिनट तक सूखने दें।
6. छवि अधिग्रहण, न्यूराइट आउटग्रोथ और फ्लोरेसेंस तीव्रता मात्राकरण
नोट: धुंधला होने के बाद, 20x उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और इलाज कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त करने के लिए 1024 x 1024 पिक्सल की छवि आकार। प्रति हालत जैविक दोहराने के प्रति दो क्षेत्रों से कम से कम छवि लें। फिर न्यूट्रिट लंबाई के मात्राकरण के लिए फिजी इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर (इमेजजे 1.51u) का उपयोग करें। संक्षेप में, प्रत्येक न्यूरॉन के लिए सबसे लंबे समय तक न्यूराइट की लंबाई को मापने और उपचार के प्रति मूल्यों के औसत के बाद, प्रयोगात्मक समूहों और नियंत्रण समूह के बीच साधनों की तुलना करने के लिए स्वतंत्र समूहों के लिए छात्र टी परीक्षण का उपयोग करें ।
नोट: कई वाणिज्यिक (Imaris, Volocity, अमीरा) और खुले स्रोत (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, बर्फीले, KNIME) छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम उपलब्ध हैं । इन कार्यक्रमों में, इमेजजे जैविक छवि विश्लेषण20, 21,21के लिए पसंद का उपकरण बन गया है। https://imagej.net/Introduction पर इमेजजे पोर्टल इमेज प्रोसेसिंग, कोलोकैलाइजेशन, डेक्वोल्यूशन, पंजीकरण, विभाजन, ट्रैकिंग और विज़ुअलाइज़ेशन सहित इमेजजे के बेसिक और बिल्ट-इन कार्यों का पूरी तरह से विवरण प्रदान करने वाली जानकारी का एक उपयोगी स्रोत है।
- फिजी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ न्यूरोनल वृद्धि को मापने
- जैसा कि चित्र 1में दर्शाया गया है , छवि को या तो फिजी सॉफ्टवेयर पर खींचकर और गिराकर या फ़ाइल का चयन करके खोलें । खुला।
- विश्लेषण का चयन करें । उपकरण । आरओआई प्रबंधक,और फिर टूलबार स्ट्रेट में 5वें आइकन पर राइट-क्लिक करें और फ्रीहैंड लाइनपर स्विच करें। वैकल्पिक रूप से, लाइन की चौड़ाई को 10 में बदलने के लिए एक ही आइकन पर डबल-क्लिक करें, और फिर सबसे लंबे न्यूराइट का पता लगाते हैं, जो सेल शरीर के पास शुरू होता है और न्यूराइट की नोक तक विस्तारित होता है।
- आरओआई प्रबंधक को माप जोड़ने और मापा न्यूरॉन को उजागर करने के लिए सीटीआरएल + टी एंड फिर एफ दबाएं। आरओआईमें सभी नंबरों का चयन करें, उपायपर क्लिक करें, सभी गणना की गई लंबाई का चयन करें, और एक स्प्रेडशीट में कॉपी/पेस्ट करें।
- फिजी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ लेबल कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने
- जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है, छवि खोलने के बाद, टूलबार फ्रीहैंड चयनमें4 आइकन पर क्लिक करें। कोशिका का आकार खींचें।
- विश्लेषण का चयन करें । माप निर्धारित करें और निम्नलिखित मूल्यों के लिए चुनें: क्षेत्र, एकीकृत घनत्व, मतलब ग्रे मूल्य । विश्लेषण करें । उपाय (मूल्यों के ढेर के साथ एक पॉप-अप बॉक्स खुलता है)।
- पृष्ठभूमि के रूप में सेल के बगल में एक क्षेत्र का चयन करें (आकार महत्वपूर्ण नहीं है) और फिर विश्लेषण का चयन करें । उपाय। सभी मापा डेटा का चयन करें और एक स्प्रेडशीट में कॉपी/पेस्ट ।
नोट: एकीकृत घनत्व (IntDen) फ्लोरोसेंट तीव्रता का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाने वाला आइटम है। इस अध्ययन में लक्ष्य अणु की फ्लोरोसेंट तीव्रता को शुरू में कोशिका में इसके वितरण का विश्लेषण करने और बाद में विभिन्न उपचारों के तहत लक्ष्य अणु की बहुतायत को निर्धारित करने के लिए मापा जाता है। नतीजतन, उपचार की प्रभावशीलता को मापा जाएगा और नियंत्रण के साथ तुलना की जाएगी।
7. न्यूरोटॉक्सिसिटी असेसमेंट
नोट: परीक्षण यौगिकों की साइटोटॉक्सिकिटी का मूल्यांकन 384-अच्छी प्लेटों (सामग्री की तालिकादेखें) में एक ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जाता है। एचएनपीसी को उसी विधि के बाद तैयार किया जाता है, जिसमें मामूली संशोधनों को छोड़कर "एचएनपीसी का भेदभाव और उपचार" अनुभाग में वर्णित किया गया है। इसके बाद, ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख द्वारा उत्पन्न एक ल्यूमिनेसेंट सिग्नल को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करते हुए मापा जाता है। ल्यूमिनेसेंट सिग्नल सेलुलर एटीपी एकाग्रता के आनुपातिक होते हैं जो प्रत्येक कुएं में मौजूद व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के सीधे आनुपातिक होते हैं।
- कोटिंग
- 384-वेल प्लेट के प्रति अच्छी तरह से पॉली-एल-लिसिन (पीएलएल) के 30 माइक्रोन जोड़ें।
- आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
- पीबीएस के साथ 2x धोएं।
- इसे आरटी (लगभग 30 मिनट के लिए) में सूखने दें।
- 384-वेल प्लेट के प्रति लेमिनिन (50 μg/l) के 30 माइक्रोन जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
- पीबीएस के साथ 2x धोएं।
नोट: लेपित 384-अच्छी प्लेटों को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- कोशिकाओं चढ़ाना
- गिनती और प्लेट 20,000 एकल सेल न्यूरोस्फीयर प्रति अच्छी तरह से 384-वेल प्लेट के 25 माइक्रोन में भेदभाव मीडिया के 25 माइक्रोन में।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए इनक्यूबेट।
- 5 दिनों के बाद, 6x पर तैयार परीक्षण यौगिकों द्वारा 24 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज 5 μL मात्रा में अंतिम वांछित एकाग्रता (अच्छी तरह से 30 μL की अंतिम मात्रा बनाने के लिए)।
- सेल व्यवहार्यता परख
- 384-वेल प्लेट के प्रति ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख रिएजेंट के 30 माइक्रोन जोड़ें।
नोट: प्रत्येक कुएं में मौजूद मात्रा के बराबर ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख रिएजेंट की मात्रा जोड़ें। ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख रिएजेंट और उपयोग करने से पहले आरटी को बराबरी गल। - 2 मिनट के लिए एक प्लेट शेखर पर हिलाएं (सेल लाइसिस को मिलाने और प्रेरित करने के लिए)।
- मिश्रण को 30 एस के लिए 300-400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा नीचे स्पिन करें।
- प्रकाश से संरक्षित स्थान (ल्यूमिनेसेंट सिग्नल को स्थिर करने के लिए) में आरटी में 10 मिनट के लिए 384-अच्छी प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- माइक्रोप्लेट रीडर के साथ चमक रिकॉर्ड करें।
नोट: वेलकेड (10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर) सहित व्यवहार्यता परख के लिए उचित नियंत्रण का उपयोग सकारात्मक और एचबीएसएस के रूप में करें जिसमें डीएमएसओ (0.1% या 0.2% की अंतिम एकाग्रता के साथ) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में।
- 384-वेल प्लेट के प्रति ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख रिएजेंट के 30 माइक्रोन जोड़ें।
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Representative Results
पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग हाल ही में प्रकाशित दो पत्रों22,23में सफलतापूर्वक किया गया है . चित्र 3 एचएनपीसी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के उपयोग को दर्शाता है जो एचडीएसी अवरोधकों के प्रभाव की जांच में एपिजेनेटिक यौगिकों के रूप में न्यूराइट आउटग्रोथ और बाद में छोटे अणु यौगिकों की न्यूरोजेनिक क्षमता के लिए एक मार्कर के रूप में होता है।
इसके अलावा, चित्रा 4 में परीक्षण यौगिकों (एचडीएसी अवरोधकों) की न्यूरोटॉक्ससिटी का मूल्यांकन भी एक साथ 384-वेल प्लेटों में एचएनपीसी को अलग करके किया जाता है, जिसमें न्यूरोटॉक्सिकिटी मूल्यांकन के लिए प्रस्तुत सेल मॉडल (एचएनपीसी) की क्षमता और यौगिकों की उच्च संख्या के लिए न्यूरोटॉक्सिकिटी का परीक्षण करने के लिए स्केल करने की क्षमता दिखाई जाती है।
सरटोर एट अल(चित्रा 5)द्वारा एक अन्य पत्र में, एच 4K5ac की बहुतायत को मापने के लिए न्यूरोनल सेल फ्लोरेसेंस तीव्रता का मापन, एक हिस्टोन मार्क के रूप में, एपिजेनेटिक मोडिफायर यौगिकों के साथ एचएनपीसी से विभेदित न्यूरॉन्स के इलाज के बाद सफलतापूर्वक23का प्रदर्शन किया जाता है। इसके अतिरिक्त, जैसा कि चित्र 6में दर्शाया गया है, एक अप्रकाशित काम में, प्रोटोकॉल का उपयोग छोटे अणु यौगिकों के संभावित सिनैप्टोजेनिक प्रभाव की जांच करने के लिए एक प्रेसिनैप्टिक प्रोटीन, सिनैप्टोफिजिन की कल्पना करने के लिए किया गया है।
चित्रा 1: फिजी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ न्यूरोनल वृद्धि को मापने के लिए एक दृष्टिकोण को दर्शाते हुए कदम-दर-कदम कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: फिजी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ न्यूरोनल कोशिकाओं फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक दृष्टिकोण को दर्शाते हुए कदम-दर-कदम कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: छोटे अणु एपिजेनेटिक यौगिकों के साथ न्यूराइट आउटग्रोथ परख।
(A)हाइड्रोक्सामिक आधारित एचडीएसी अवरोधकों के साथ एचएनपीसी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के उपचार के लिए प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां (20x आवर्धन)। मानव तंत्रिका जनक कोशिकाओं को 5 दिनों के लिए अलग किया जाता है; फिर 0.1% DMSO (नियंत्रण के रूप में), और Trichostatin A, JNJ26481585, SB939, और PCI24781 (परीक्षण यौगिकों के रूप में) के साथ 24 घंटे के लिए इलाज किया। फिर इम्यूनोदाता न्यूरोनल प्रक्रियाओं की कल्पना करने और कोशिका नाभिक की कल्पना करने के लिए न्यूराइट लंबाई और DAPI (नीला) की मात्रा निर्धारित करने के लिए न्यूरोनल-विशिष्ट ए-ट्यूबलिन III एंटीबॉडी (हरा) के साथ किया जाता है। (ख)विभिन्न समूहों में न्यूराइट लेंथ का सांख्यिकीय विश्लेषण। जैसा कि चित्रित किया गया है, सभी परीक्षण यौगिक न्यूराइट आउटग्रोथ को प्रेरित कर सकते हैं। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके न्यूराइट लंबाई का मात्रात्मक विश्लेषण किया जाता है। त्रुटि सलाखों एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं; पी < 0.001, **** पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.0001। इस आंकड़े को बहेरी एट अल22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन।
एचएनपीसी को न्यूराइट आउटग्रोथ परख के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही विधि के अनुसार 384-अच्छी प्लेट में न्यूरॉन्स के लिए वरीयता प्राप्त और विभेदित किया जाता है। इसके बाद 24 घंटे के एक्सपोजर के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर परीक्षण यौगिकों के प्रभाव को मापा जाता है। जैसा कि दिखाया गया है, उपचार पर कोई महत्वपूर्ण विषाक्तता नहीं है। एक तरफा ANOVA डेटा विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है और एक पी मूल्य और लेफ्टिनेंट; 0.05 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता है। इस आंकड़े को बहेरी एट अल22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: RGFP966 मानव तंत्रिका जनक कोशिकाओं से विभेदित न्यूरॉन्स में H4K5ac बढ़ जाती है ।
(A)एचएनपीसी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में डीएमएसओ, आरजी एफएफपी966, या आरजीएफपी966 + जेक्यू1 के साथ उपचार के बाद टबुलिन, डीएपीआई और एच4के5एसी के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। (ख)डीएमएसओ, आरजीएफपी966, या आरजी एफएफपी966 + जेक्यू1 के साथ उपचार के बाद एच4के5ैक की फ्लोरेसेंस तीव्रता का मात्राकरण। त्रुटि सलाखों एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं; पी एंड एलटी; 0.0001। इस आंकड़े को सर्टर एट अल23से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: सिनैप्टिक टर्मिनलों की कल्पना करने के लिए सिनैप्टोफिजिन (लाल) के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग, न्यूरोनल प्रक्रियाओं की कल्पना करने के लिए, और डीएपीआई (नीला) डीएमएसओ (नियंत्रण के रूप में) के साथ उपचार के बाद सेल नाभिक की कल्पना करने के लिए, और एचएनपीसीएस-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में एसबी 9 39 (परीक्षण यौगिक के रूप में) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल परीक्षण यौगिकों के साथ उपचार पर न्यूराइट लंबाई के लिए परीक्षण का वर्णन करने वाले कुछ प्रकाशित कागजात में से एक है। इसके अलावा, हम वर्णन करते हैं कि न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए एचएनपीसी का उपयोग कैसे करें। एचएनपीसी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स पर इस न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन का उपयोग करके, एपिजेनेटिक छोटे अणु यौगिकों, एचडीएसी अवरोधकों की श्रेणी की न्यूरोजेनिक क्षमता, न्यूराइट आउटग्रोथ को प्रेरित करने में22का प्रदर्शन किया जाता है। इसके अलावा, सरटोर एट अल द्वारा प्रस्तुत एक अन्य पेपर में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई एपिजेनेटिक मोडिफायर यौगिकों23के उपचार पर एच 4K5ac, एक हिस्टोन प्रोटीन की फ्लोरेसेंस तीव्रता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
संज्ञानात्मक कार्य न्यूरोनल सर्किट के भीतर उचित तारों और कार्यात्मक कनेक्शन पर निर्भर करता है। न्यूरोडेवलपमेंटल से लेकर मनोरोग विकारों तक मस्तिष्क विकारों के लिए अग्रणी अंतर्निहित रास्तों में विश्वसनीय अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के रूप में न्यूरोनल आकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का विस्तृत और सुसंगत मात्राकरण आवश्यक है। फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग को सेलुलर फेनोटाइप को मिलाने के लिए ख्यात दवा उम्मीदवारों के रूप में छोटे अणु यौगिकों की खोज में एक विशेष रूप से प्रभावी दृष्टिकोण माना जाता है। इस दृष्टिकोण में, केवल एक ही लक्ष्य से पूछताछ करने के बजाय, सेल के सभी घटकों और रास्तों की जांच की जातीहै।
आकार, संरचना और कनेक्टिविटी सहित न्यूरोनल आकृति विज्ञान को न्यूरोनल फ़ंक्शन की प्रमुख विशेषताएं माना जाता है। आनुवंशिक क्षोभ जो न्यूरॉन्स या सिनैप्टिक प्रोटीन स्थानीयकरण और स्तर की आकृति विज्ञान को बदलते हैं, विशेष रूप से रोग पैदा करने वाले म्यूटेशन के विश्लेषण में योगदान दे सकते हैं। इसलिए, न्यूरोनल आकृति विज्ञान25पर पेरिटरबाजेन के प्रभाव का आकलन करने के लिए विश्वसनीय तरीकों की आवश्यकता होती है।
एचएनपीसी, भ्रूण स्तनधारी मस्तिष्क से अलग होते हैं, जो बाद में माइटोजेन्स की उपस्थिति में विट्रो में सुसंस्कृत होते हैं। ये कोशिकाएं न्यूरोस्फीयर से बनी होती हैं जिन्हें फ्लोटिंग सेलुलर एग्रीगेट के रूप में चिह्नित किया जाता है जिसमें तंत्रिका जनक कोशिकाएं और रेडियल ग्लियल कोशिकाएं शामिल होती हैं। एचएनपीसी तंत्रिका तंत्र के कार्य और विकास के लिए एक वांछनीय मॉडल प्रणाली प्रदान करता है , जिसमें विभिन्न तंत्रिका वंश 7,8 ,9,के उत्पादन में उनकी भेदभाव क्षमता को बनाए रखाजाताहै ।9 न्यूराइट संख्या, तीव्रता, लंबाई और चौड़ाई एक साथ सिनैप्टिक विशेषताओं के साथ पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक प्रोटीन संशोधन शामिल हैं, जो न्यूराइट और सिनैप्टिक परिवर्तनों में से हैं जिन्हें यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग करके मज़बूती से और कुशलता से मापा जा सकता है।
ध्यान की कमी अतिसक्रियता विकार और आत्मकेंद्रित जैसे न्यूरोलॉजिकल विकारों की व्यापकता में वृद्धि के कारण, बच्चों पर पर्यावरणीय रसायनों की न्यूरोटॉक्सिकिटी क्षमता एक सार्वजनिक चिंता बनी हुई है15,,26। इसलिए, विश्वसनीय और कुशल न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए एचएनपीसी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की उपयोगिता की भी जांच की जाती है। जैसा कि चित्र 4में प्रदर्शित किया गया है, एचएनपीसी को 384-वेल प्लेटों में न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए अनुकूलित और बढ़ाया जा सकता है।
शुरू किए गए सेल मॉडल के लिए एक आवेदन के रूप में न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन या तो 384-अच्छी प्लेटों में चढ़ाना या कोशिकाओं में अंतर करने से पहले न्यूरोस्फीयर को न्यूरॉन्स में अंतर करके संभव है जबकि न्यूरोस्फीयर को एकल कोशिकाओं के रूप में 384-अच्छी प्लेटों में चढ़ाया जाता है। उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण में, उच्च सटीक पाइपिंग कौशल न्यूरोस्फीयर की सही संख्या चढ़ाना के लिए आवश्यक हैं जो एकल कोशिकाओं में अलग हो जाते हैं और भेदभाव-उत्प्रेरण माध्यम के साथ निम्नलिखित उपचार प्रक्रियाओं के लिए भी। आवश्यक पिपिंग कौशल को ध्यान में रखते हुए, अधिक प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए चढ़ाना से पहले भेदभाव की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) द्वारा थोक सेल छंटाई भी संभावित रूप से उच्च परिशुद्धता पाइपिंग कौशल की आवश्यकता को दरकिनार कोशिकाओं की आवश्यक संख्या को सही ढंग से अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
न्यूरोटॉक्सिकता मूल्यांकन द्वारा न्यूराइट आउटग्रोथ परख शुरू करने की सलाह दी जाती है ताकि एक ही यौगिक की विभिन्न खुराकों के साथ बार-बार न्यूराइट आउटग्रोथ परख से बचा जा सके ताकि गैर-टोक्सिक एकाग्रता तक पहुंच सके। इसलिए, परीक्षण यौगिकों की खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के खिलाफ ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन को मिलाकर न्यूनतम प्रयास के साथ सही खुराक खोजने में परिणाम होगा। ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख एक कोशिका संस्कृति में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका है। विधि सेलुलर मेटाबोलिज्म के संकेतक के रूप में संस्कृति में मौजूद एटीपी के मात्रा पर काम करती है। परख का ऐड, मिक्स और मापना प्रारूप सेल व्यवहार्यता और परीक्षण यौगिकों की साइटोटॉक्सिक्सिटी की जांच करने के लिए एक सरल और त्वरित दृष्टिकोण प्रदान करता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं इस प्रकार हैं। उपलब्धता और अंतर्निहित परिवर्तनशीलता के कारण, शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग25सीमित है। एचएनपीसी में धीमी प्रसार दर है, जो इसके उपयोग को सीमित कर सकती है। न्यूरॉन्स की फ्लोरोसेंट छवियों का मैनुअल बड़े पैमाने पर विश्लेषण समय लेने वाला और प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह के लिए अतिसंवेदनशील है। एचएनपीसी को युवा तंत्रिका कोशिकाओं के रूप में माना जा सकता है, जो किसी व्यक्ति के जीवन में कोशिकाओं में जमा होने वाले आयु से संबंधित एपिजेनेटिक संशोधनों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। चूंकि पुराने व्यक्तियों में न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार होते हैं, इसलिए एचपीपीसी में देर से शुरुआत की स्थितियों के लिए एक उपयुक्त मॉडल होने के लिए पर्याप्त शारीरिक प्रासंगिकता की कमी हो सकती है।
यद्यपि पशु मॉडल और कोशिका रेखाएं आणविक तंत्र को अंतर्निहित रोगों को समझने में मूल्यवान रही हैं, फिर भी उन्होंने मानव चिकित्सा विज्ञान 27 , 28 ,,,29,2930में निष्कर्षों का अनुवाद करने में सीमाएं दिखाई हैं ।28 एचएनपीसी के साथ मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) और मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (hESCs) को विट्रो सेल मॉडल में बेहतर माना जाता है, जो मानव शरीर विज्ञान का पुनर्मूल्यांकन करता है। इसलिए 1, 31 में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, 1, 31 में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हाइप्ससी-और एचएसएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का उपयोग संभावित रूप से न्यूराइट आउटग्रोथ परख और न्यूरोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए दो वैकल्पिक सेल स्रोतों के रूप में भी किया जा सकता है।1,31
अंत में, प्राथमिक मानव कोशिका मॉडल के रूप में एचएनपीसी की उच्च अनुवादात्मक क्षमता और शारीरिक प्रासंगिकता पहले उल्लिखित सीमाओं से अधिक न्यूराइट आउटग्रोथ से संबंधित दवा खोज स्क्रीनिंग और न्यूरोटॉक्ससिटी मूल्यांकन में एक मूल्यवान सहारा प्रदान करती है।
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Disclosures
सभी लेखकों के हितों की कोई संभावित संघर्ष का संकेत मिलता है ।
Acknowledgments
इस शोध को एमएएफ को दिए गए निमाड रिसर्च ग्रांट (940714) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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