Summary
البروتوكول المقدم يصف طريقة لمجرة نوريت خارج و التقييم السمية العصبية من مركبات جزيء صغير.
Abstract
نيوريت مقايسة النمو وتقييم السمية العصبية هما دراستان رئيسيتان يمكن تنفيذها باستخدام الطريقة المعروضة هنا. يوفر هذا البروتوكول تحليلًا موثوقًا للمورفولوجيا العصبية مع قياسات كمية للتعديلات على طول نيوريت وتوطين البروتين المتشابك والوفرة عند العلاج بمركبات جزيء صغيرة. بالإضافة إلى تطبيق الطريقة المعروضة في دراسات النمو النوري، يمكن إجراء تقييم السمية العصبية لتقييم المركبات الكيميائية التجارية وتمييزها وترتيبها استنادًا إلى تأثيرها المحتمل على السمية العصبية التنموية.
على الرغم من أن خطوط الخلايا تستخدم في الوقت الحاضر على نطاق واسع في فحص مجمع في علم الأعصاب، فإنها غالبا ما تختلف وراثيا وphenotypically من أصل الأنسجة الخاصة بهم. الخلايا الأولية، من ناحية أخرى، الحفاظ على علامات هامة والوظائف التي لوحظت في الجسم الحي. ولذلك، نظرا لإمكانات الترجمة وأهمية الفسيولوجية التي يمكن أن تقدم هذه الخلايا neurite مقايسة النمو وتقييم السمية العصبية يمكن أن تستفيد إلى حد كبير من استخدام الخلايا البشرية السلف العصبي (hNPCs) كنموذج الخلية البشرية الأولية.
ويمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا لفحص قدرة المركبات على الحث على النمو العصبي والعصبية من خلال الاستفادة من الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية العصبية البشرية، وهي نموذج خلية يمثل البيولوجيا البشرية بشكل وثيق".
Introduction
نمو نيوريت هو عملية أساسية لتشكيل شبكة الخلايا العصبية وتجديد الأعصاب1,2. بعد الإصابة، النورية خارج يلعب دورا رئيسيا في تجديد الجهاز العصبي. النثر النوري هو أيضا عنصر مهم من الإشارات خارج الخلية في تحفيز الأنشطة التجدد العصبي لتعزيز نتائج الاضطرابات العصبية والإصابات العصبية3,4,5,6.
من خلال الحفاظ على إمكانات التمايز في إنتاج الأنساب العصبية المختلفة ، يمكن أن توفر الخلايا السلف العصبية البشرية (HNPCs) نظامًا نموذجيًا لدراسات وظائف الجهاز العصبي المركزي (CNS) والتنمية7و8و9. توفر الإمكانات الانتقالية العالية والأهمية الفسيولوجية لـ HNPCs كنموذج خلية بشرية أولية ميزة كبيرة في فحوصات اكتشاف الأدوية المرتبطة بالنوبات. ومع ذلك، يمكن أن يكون صيانة وتحجيم نماذج الخلايا الأولية لمجايسات عالية الإنتاجية تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة10،11،12،13.
بالإضافة إلى تطبيق الطريقة المقدمة في دراسات النمو النوري ، تقييم السمية العصبية هو تطبيق آخر باستخدام الخلايا العصبية المشتقة من HNPC. هناك الآلاف من المركبات الكيميائية التجارية التي إما لم يتم فحصها أو مع احتمال السمية العصبية غير مفهومة. ولذلك، فإن تجارب الفحص الأكثر موثوقية وفعالية لتقييم المركبات وتمييزها وترتيبها بناء على إمكاناتها في الحصول على السمية العصبية التنموية هي في ارتفاع الطلب14. إن زيادة انتشار الاضطرابات العصبية وحدوثها إلى جانب وفرة المركبات غير المختبرة في البيئة تستلزم إجراء تجارب أكثر جدارة بالثقة وكفاءة لتحديد المركبات البيئية الخطرة التي قد تشكل السمية العصبية15.
يمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا للفحص لقدرة المركبات على تحفيز النمو العصبي والعصبية من خلال الاستفادة من الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية العصبية العصبية البشرية ، وهي نموذج خلية يمثل علم الأحياء البشري بشكل وثيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاقيات: تم تلقي عينات من الجنين من مختبر أبحاث العيوب الخلقية في جامعة واشنطن في سياتل من خلال برنامج لتوزيع الأنسجة يدعمه المعهد الوطني للصحة (NIH). وحصل مختبر بحوث العيوب الخلقية على موافقة خطية مستنيرة مناسبة من الوالدين، وراقب مجلس الاستعراض المؤسسي لجامعة واشنطن شراء الأنسجة. تم تنفيذ جميع الأعمال بموافقة مكتب أبحاث الموضوعات البشرية في جامعة ميامي8.
1. العزلة وثقافة الخلايا السلف العصبية البشرية (hNPCs)
- ضع أنسجة الدماغ في طبق بيتري 100 مم وقم بإزالة السحايا بعناية باستخدام ملقط.
- نقل أنسجة الدماغ إلى أنبوب مخروطي 50 مل وغسلها مرتين مع 20 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق عكس بلطف الأنبوب.
- احتضان أنسجة المخ في أنبوب مخروطي جديد 50 مل عن طريق غمر الأنسجة في محلول تفكك الخلايا (انظر جدول المواد)وDNase I (10 U/mL) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من الخلايا العصبية المتوسطة ثقافة (انظر جدول المواد)إلى أنسجة الدماغ التي تحتوي على أنبوب وميكانيكيا فصل الخلايا العصبية عن طريق triturating 20 إلى 30 مرات من خلال 1000 μL تلميح الأنابيب لجعل تعليق خلية واحدة.
- قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة مجموعات الخلايا.
- بذور تعليق خلية واحدة في قارورة تي 25 تنفيس المقدمة مع 5-10 مل من الخلايا العصبية المتوسطة ثقافة تستكمل مع مكونات مفصلة في الجدول 1.
- تعقيم محلول الهيبارين عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. الملحق B-27 دون فيتامين (أ) هو تكملة خالية من المصل لزراعة السلف العصبية والخلايا الجذعية, دون إثارة التمايز.
ملاحظة: يتم عزل الخلايا السلف العصبية البشرية (hNPCs) من دماغ الجنين البشري الذي تم جمعه من الجنين المجهض. بعد 7-10 أيام في الثقافة، تشكل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) مستعمرات الأعصاب العائمة، في حين تبقى أنواع الخلايا الأخرى في التعليق كخلايا مفردة أو تعلق على الجزء السفلي من القارورة. يمكن أن تكون مثقفة HNPCs المعزولة كـ neurospheres في التعليق لعدة أشهر8,16,17.
- تعقيم محلول الهيبارين عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. الملحق B-27 دون فيتامين (أ) هو تكملة خالية من المصل لزراعة السلف العصبية والخلايا الجذعية, دون إثارة التمايز.
| المبلغ | مكون |
| 100 ميكرولتر | EGF (20 نانوغرام / مل) |
| 100 ميكرولتر | FGF (10 نانوغرام /مل) |
| 2 مل | B-27، ناقص فيتامين (أ) (50X) |
| 1 مل | L-alanyl-L-الجلوتامين (100X) (انظر جدول المواد) |
| 4 ميكرولتر | الهيبارين (2 ميكروغرام/مل) |
| 96.8 مل | خلية خلية عصبيّة ثقافة وسط (رأيت جدول المواد) |
الجدول 1- الانبعاثات 1000 المكونات المطلوبة لصنع 100 مل من وسائل الإعلام الثقافة
2. تمرير HNPCs
- جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على المجالات العائمة، وsersphers الكبيرة والصغيرة، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
ملاحظة: بسبب أسباب غير معروفة، يكون توقيت تقسيم الـ neurospheres متغيراً من 7 أيام إلى 30 يوماً. ومع ذلك، يجب عموماً تمرير اليابس عندما يصل قطرها إلى قطر أكبر من 700-900 ميكرومتر. هذا عندما يبدأ مركز الغلاف العصبي في التغميق ، والذي يعتبر علامة على ارتفاع معدل موت الخلايا18. - تدور في neurospheres أسفل عن طريق الطرد المركزي في 300-400 س ز لمدة 3 دقائق.
- pirate بعناية عظمى ثم غمر المجالات في 500 μL من مذاب الخلية مفسخة مفكك (انظر جدول المواد).
- جعل aliquots من كاشف تفكك الخلية بإضافة 500 ميكرولتر لكل 1.5 مل microtubes وتخزينها في -20 درجة مئوية. لتجنب فقدان نشاط الإنزيم، اذيب كاشف تفكك الخلايا عن طريق التمسك بـ RT أو الدافئ لمدة 5 دقائق في حمام الماء/الخرز 37 درجة مئوية.
- اعتمادا على كثافة وحجم المجالات، احتضان المجالات المغمورة في 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة.
- إضافة 5-10 مل من وسائل الإعلام ثقافة ما قبل الدافئة إلى neurospheres التي تحتوي على 50 مل أنبوب مخروطية وطاردة مركزية في 300-400 x ز لمدة 5 دقائق لرواسب في neurospheres.
- استلهمي الماصات الفائقة والماصات بلطف صعودا وهبوطا، وذلك باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، في 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة حتى جميع neurospheres في تعليق خلية واحدة.
ملاحظة: سوف يصبح الانفصام مرئياً للعين المجردة. قبل الانفصال، تكون الـ neurospheres في شكل مجالات. بعد غمرها في كاشف الانفصام وعن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، فإنها سوف تصبح خلايا واحدة.- عد الخلايا وطبق الخلايا واحدة، 2 إلى 3 ملايين خلية في قارورة T-25 في 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة.
- تغذية الخلايا كل 3 أيام عن طريق استبدال نصف وسائل الإعلام الثقافة.
- تسوية neurospheres عن طريق يميل قارورة بحيث يكون في الزاوية السفلى. عقد القارورة في الموقف لمدة 1-2 دقيقة حتى الرواسب neurospheres. ثم تُشعّر نصف الوسائط بلطف بإدراج الماصات المصلية في الوسائط فوق الأوساط العصبية المستقرة. يمكن تجميع الخلايا المنفصلة لتشكيل المجالات بعد 2 إلى 3 أيام في الثقافة19.
3- تجميد المراكز الوطنية الهايتية
- إعداد خلية تجميد المتوسطة عن طريق إضافة DMSO إلى الوسائط الثقافة إلى تركيز نهائي من 10٪ (v/v) أو استخدام توسط الحفظ التبريد المتاحة تجاريا لأنواع الخلايا الحساسة (انظر جدول المواد).
- فرز مجالات كبيرة عن طريق نقل وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي 50 مل والسماح للكرة تسوية الجاذبية. ثم إزالة ونقل الاعصاب الكبيرة في أنبوب جديد 50 مل مخروطية ل passaging باستخدام 200 أو 1000 μl أنبوب تلميح.
ملاحظة: تعتبر المغنطيس العصبي الذي يزيد قطره على 900 ميكرومتر كبير، وتعتبر تلك التي يقل قطرها عن 500 ميكرومتر صغيرة. - تدور في المغنطيس العصبي المتبقية إلى أسفل عن طريق الطرد المركزي في 300-400 × ز لمدة 3 دقائق.
- إعادة تعليق ما يصل إلى 100 المجالات في 1 مل من كاشف التبريد والكوندز ونقلها إلى لتبريد.
- تخزين بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية في حاوية تجميد الخلية (انظر جدول المواد)ونقلها إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي لتخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: يفضل تجميد المغنطيس العصبي الصغير والمتوسط الحجم (أقل من 900 ميكرومتر في القطر) وتجنب تجميد الخلايا العصبية الكبيرة الحجم (التي يزيد قطرها عن 900 ميكرومتر) أو الخلايا المفردة. من أجل الحد من تلف الخلايا أثناء ذوبان العينة، والحفاظ على الخلايا كثيفة عن طريق بذر الخلايا العصبية المذابة في قارورة T25 صغيرة.
4- التمايز والمعاملة بين اللجان الوطنية الهايتية
ملاحظة: للحث على التمايز، يتم تصنيف الخلايا العصبية في خلايا مفردة، ويتم عدها ثم البذور على لوحات مغلفة لمدة 5 أيام. ثم يتم علاج الخلايا المتمايزة ل 24 ساعة مع مركبات الاختبار قبل المناعة والتقديس الكمي.
- طلاء
- أضف 200 ميكرولتر من بولي إل ليسين (PLL) لكل بئر من شرائح الحجرة الزجاجية ذات 4 آبار (140 ميكرولتر لكل بئر من شرائح الغرفة 8-جيدا).
- احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- غسل 3x مع برنامج تلفزيوني.
- دعها تجف في RT (لمدة 30 دقيقة).
- أضف 150 ميكرولتر من اللامينين (50 ميكروغرام/مل) في بئر من شرائح الحجرة الزجاجية ذات 4 آبار (120 ميكرولتر لكل بئر من شرائح الغرفة ذات 8 بئر).
- احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- غسل 3x مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يمكن تخزين شرائح الغرف المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
- طلاء الخلايا
- عد وطبقة 80،000 الخلايا العصبية واحدة (neurospheres في تعليق خلية واحدة) في بئر من شرائح غرفة 4-جيدا (70،000 خلية في بئر من شريحة غرفة 8-جيدا).
- إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز في بئر من 4-آبار شريحة الغرفة (250 μL وسائل الإعلام في بئر من شرائح غرفة 8-جيدا).
- لجعل وسائل الإعلام التمايز أولاً، إضافة المكونات التالية في الجدول 2 إلى وعاء عقيمة يمكن التخلص منها لجعل وسائل الإعلام المسببة العصبية (NIM).
- إضافة المكونات التالية في الجدول 3 إلى 48.5 مل من NIM المحرز في الخطوة السابقة لجعل وسائل الإعلام التمايز.
- احتضان لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية.
- بعد 5 أيام، علاج الخلايا لمدة 24 ساعة عن طريق استبدال نصف وسائل الإعلام في كل بئر مع وسائل الإعلام الطازجة مختلطة مع التركيز المطلوب من مركبات الاختبار، بما في ذلك الضوابط المناسبة.
| المبلغ | مكون |
| 49 مل | DMEM/F-12 |
| 0.5 مل | N2 الملحق (100X) |
| 0.5 مل | MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X) |
| 2 ميكرولتر | الهيبارين (2 ميكروغرام/مل) (Conc. الأسهم هو 50 ملغ /مل) |
الجدول 2- المكونات المطلوبة لصنع 50 مل من الـ NIM
| المبلغ | مكون |
| 1 مل | B-27 (50X) |
| 500 ميكرولتر | مضاد حيوي مضاد للمضادات الحيوية (100X) |
| 5 ميكرولتر | حمض الريتينويك (0.1 ميكرومتر) |
| 50 ميكرولتر | GDNF (10 ميكروغرام / مل) |
| 50 ميكرولتر | BDNF (10 ميكروغرام / مل) |
| 5 ميكرولتر | حمض الاسكوربيك (0.2 ميكروغرام/مل) (Conc. Stock Conc. هو 2 ملغ/مل) ملاحظة: يوصى بأن تكون طازجة. |
| 48.5 مل | نيم |
الجدول 3- الانبعاثات 100 من 10 المكونات المطلوبة لصنع 50 مل من وسائل الإعلام التمايز
5. الكيمياء المناعية (ICC)
ملاحظة: يتم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد 4٪ . ثم يتم تنفيذ Permeabilization والحجب لتحسين الاختراق ومنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة. ثم يتم احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها. في وقت لاحق، يتم احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المسماة الفلورسنت. وأخيرا، بعد استخدام DAPI لطخة النواة، يتم تركيب شرائح الغرفة.
- تثبيت
- استلهم بلطف وسائل الإعلام في كل بئر.
- أضف 500 ميكرولتر من 4% فورمالديهايد لكل بئر من شرائح 4-بئر غرفة (250 ميكرولتر لكل بئر من شرائح غرفة 8-جيدا).
- احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
- غسل بلطف 2x مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: بعد التثبيت، من خلال ترك 1 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر، يمكن تخزين الشرائح الثقافة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- عملية منع الخلايا وحظرها
- إضافة المكونات التالية في الجدول 4 إلى وعاء معقمة يمكن التخلص منها لجعل الجسم المضاد (AB) العازلة.
- اخلط المكونات التالية في الجدول 5 مع المخزن المؤقت Ab الذي تم إجراؤه في الخطوة السابقة لجعل حل permeabilization الخلية والحجب.
- أضف 500 ميكرولتر في بئر من شرائح الغرف ذات 4 بئر وينضب لمدة ساعة في RT.
ملاحظة: يمكن تخزين مخزن AB المؤقت عند 4 درجة مئوية.
| المبلغ | مكون |
| 1.75 غرام | NaCl (150 mM) |
| 1.2 غرام | قاعدة تريس بيس (50 mM) |
| 2 غرام | BSA 1% |
| 3.6 غ | L-lysine (100 mM) |
| 8 غ | ازايد الصوديوم (4%) |
| 200 مل | الماء المقطر. ملاحظة: في البداية حل المكونات المطلوبة في 150 مل من الماء، ثم ضبطها إلى 200 مل. |
الجدول 4 - 100 100 دولار المكونات المطلوبة لصنع 200 مل من العازلة الأجسام المضادة
| المبلغ | مكون |
| 600 ميكرولتر | 20% مصل الماعز |
| 6 ميكرولتر | 0.2% تريتون-X100 |
| 2394 ميكرولتر | العازلة المضادة. ملاحظة: في البداية قم بحل المكونات المطلوبة في 2 مل من المخزن المؤقت Ab، ثم قم بضبطها إلى 7.4 درجة PH. ثم إضافة المزيد من المخزن المؤقت لAb لضبط الحجم النهائي من 3 مل وتصفية تعقيم. |
الجدول 5 - 100 100 دولار المكونات المطلوبة لصنع 3 مل من خلية permeabilization و حظر الحل
- تلطيخ
- غسل 2x مع 500 μL من برنامج تلفزيوني.
- إضافة الجسم المضاد الرئيسي المخفف، مضاد β-tubulin الثالث (1:200)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (200 ميكرولتر لكل بئر من شرائح غرفة 4-جيدا). تمييع الجسم المضاد الأساسي في PBS.
- غسل 2X مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة المخفف، في برنامج تلفزيوني، المسمى الفلورسنت الأجسام المضادة الثانوية، اليكسا فلور 488 (1:500)، واحتضان لمدة 2 ساعة في RT في مكان محمي من الضوء (250 ميكرولتر في بئر من شرائح غرفة 4-جيدا)
- غسل 2X مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة المخفف، في برنامج تلفزيوني، DAPI (300 nM التركيز) واحتضان لمدة 5 دقائق في RT في مكان محمي من الضوء (300 ميكرولتر في بئر من الشرائح غرفة 4-جيدا).
- غسل 3x مع برنامج تلفزيوني.
- قم بتركيب شرائح الغرفة باستخدام الإرشادات التالية.
- تأخذ بعيدا الشريحة الغرفة عن طريق كسر علامات التبويب الانفصالية وإزالة طوقا وقاعدة.
- إضافة قطرة واحدة من حل تصاعد (انظر جدول المواد)في بئر من شرائح غرفة 4-جيدا. ثم استخدم شريحة غلاف لتغطية الشريحة بأكملها.
- باستخدام ملاقط وبزاوية، ضع جانبًا واحدًا من الغطاء في زلة على الشريحة أثناء الاتصال بالحافة الخارجية لإسقاط السائل.
- تلميح بعناية coverlip على حل تصاعد عند خفضه في مكانه. تجنب خلق فقاعات. خذ طرف ماصة واضغط عليه على زلة الغطاء. سوف فقاعات الانتقال إلى الجانب.
ملاحظة: تشكيل فقاعة أمر لا مفر منه في بعض الأحيان. إذا حدث ذلك ، صورة من حولهم طالما أن هناك عدد قليل. - اتبع توجيهات الشركة المصنعة لعلاج الوقت. تجنب استخدام حلول التركيب غير المُجَدّة بسبب صعوبة التعامل أثناء التصوير. وإلا فإن استخدام غطاء غطاء مناسب على الحواف مطلوب لمنع انزلاق الغطاء أثناء التصوير.
- لختم الغطاء، واستخدام طلاء الأظافر وجعل خط صغير على حافة زلة الغطاء. دع طلاء الأظافر يجف لمدة 2 دقيقة.
6. الحصول على الصورة، ونتاج نيوريت وتكميم كثافة الفلوريسنس
ملاحظة: بعد تلطيخ، استخدم مجهرًا مشتركًا مع هدف 20x وحجم صورة 1024 × 1024 بكسل للحصول على صور الخلايا المعالجة. التقاط صورة على الأقل من حقلين لكل تكرار بيولوجي لكل حالة. ثم استخدام فيجي برنامج تحليل الصور (ImageJ 1.51u) من أجل تحديد كمي من طول neurite. باختصار، قياس طول أطول نيوريت لكل خلية عصبية وبعد متوسط القيم لكل علاج، استخدم اختبار t للطالب للمجموعات المستقلة لمقارنة الوسائل بين المجموعات التجريبية ومجموعة التحكم.
ملاحظة: العديد من التجارية (Imaris، Volocity، أميرة) ومفتوحة المصدر (Imajej، CellProfiler، Vaa3D، BioImageXD، الجليدية، KNIME) برامج معالجة الصور متوفرة. من بين هذه البرامج ، أصبح ImageJ الأداة المفضلة لتحليل الصور البيولوجية20،21. بوابة ImageJ في https://imagej.net/Introduction هي مصدر مفيد للمعلومات التي توفر وصفاً شاملاً لوظائف ImageJ الأساسية والمدمجة بما في ذلك معالجة الصور والتكلس والتكليس والتكليس والتسجيل والتجزئة والتتبع والتصور.
- قياس نمو الخلايا العصبية مع برنامج تحليل الصور في فيجي
- كما هو موضح في الشكل 1، فتح الصورة إما عن طريق سحب وإسقاط على برامج فيجي أو عن طريق تحديد ملف | مفتوح.
- حدد تحليل | أدوات | مدير ROI، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على رمز5 في شريط الأدوات مباشرة والتبديل إلى خط حر. اختياريا، انقر نقرا مزدوجا فوق نفس الرمز لتغيير عرض الخط إلى 10، ومن ثم تتبع أطول neurite، بدءا بالقرب من جسم الخلية وتمتد إلى غيض من neurite.
- اضغط على Ctrl + T & ثم F لإضافة القياس إلى مدير ROI وتسليط الضوء على الخلايا العصبية المقاسة. حدد جميع الأرقام في عائد الاستثمار، انقر على قياس، وحدد جميع الأطوال المحسوبة ، وانسخ / اللصق في جدول بيانات.
- قياس كثافة الفلوريسنس للخلايا المسماة مع برنامج تحليل الصور في فيجي
- كما هو موضح في الشكل 2، بعد فتح الصورة ، انقر على رمز4 في شريط الأدوات التحديدات اليدوي. رسم شكل الخلية.
- حدد تحليل | تعيين القياسات وتحديد للقيم التالية: مساحة, كثافة متكاملة, متوسط قيمة الرمادي | تحليل | قياس (مربع منبثق مع مجموعة من القيم يفتح).
- حدد منطقة بجوار الخلية كخلفية (الحجم غير مهم) ثم حدد تحليل | قياس. حدد كافة البيانات المقاسة ونسخ/لصق في جدول بيانات.
ملاحظة: الكثافة المتكاملة (IntDen) هي الصنف المستخدم لتحديد الكثافة الفلورية. في هذه الدراسة يتم قياس كثافة الفلورسنت للجزيء الهدف لتحليل توزيعه في الخلية في البداية وتحديد كمية وفرة الجزيء المستهدف في إطار علاجات مختلفة. وبالتالي، سيتم قياس فعالية العلاجات ومقارنتها مع السيطرة.
7- تقييم السمية العصبية
ملاحظة: يتم تقييم السمية الخلوية لمركبات الاختبار في 384-ألواح بئر (انظر جدول المواد)باستخدام مقايسة خلية مضيئة قابلة للحياة (انظر جدول المواد). وتُعد هذه المراكز بنفس الطريقة، باستثناء التعديلات الطفيفة الوارد وصفها في قسم "تمايز ومعاملة الـ هـاءبـات الهـنـبـاتـيـة". في وقت لاحق، يتم قياس إشارة الإنارة التي تم إنشاؤها بواسطة قياس الخلية مضيئة باستخدام قارئ microplate. إشارة الإنارة يتناسب مع تركيز ATP الخلوية التي هي نفسها متناسبة بشكل مباشر مع عدد الخلايا القابلة للحياة الموجودة في كل بئر.
- طلاء
- إضافة 30 ميكرولتر من بولي-إل-ليسين (PLL) في بئر من 384-جيدا لوحة.
- احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
- غسل 2X مع برنامج تلفزيوني.
- دعها تجف في RT (لمدة 30 دقيقة).
- إضافة 30 ميكرولتر من اللامينين (50 ميكروغرام/مل) في بئر من 384-جيدا.
- احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- غسل 2X مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يمكن تخزين ألواح 384-جيدا المغلفة في 4 °C لمدة 1 شهر.
- طلاء الخلايا
- عد وطبقة 20،000 الخلايا العصبية واحدة لكل بئر من 384-جيدا لوحة في 25 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز.
- احتضان لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية.
- بعد 5 أيام، علاج الخلايا لمدة 24 ساعة بواسطة مركبات اختبار أعدت في 6x التركيز النهائي المطلوب في 5 ميكرولتر حجم (لجعل الحجم النهائي من 30 ميكرولتر في بئر).
- الخلية قابلية البقاء المقايسة
- إضافة 30 μL من خلية مضيئة قابلية البقاء مُكَوّن في بئر من 384-جيدا لوحة.
ملاحظة: إضافة وحدة تخزين من مُقدّم قابلية الخلية للإنارة إلى مساوية لحجم التخزين الموجود في كل بئر. ذوبان خلية مضيئة جدوى مُقايسة وتكسير لRT قبل استخدامها. - يهز على لوحة شاكر لمدة 2 دقيقة (لخلط والحث على تحلل الخلية).
- تدور الخليط إلى أسفل عن طريق الطرد المركزي في 300-400 × ز لمدة 30 s.
- احتضان لوحة 384-جيدا لمدة 10 دقيقة في RT في مكان محمي من الضوء (لتثبيت إشارة الإنارة).
- سجل الإنارة مع قارئ microplate.
ملاحظة: استخدام الضوابط المناسبة لقابلية الدامس بما في ذلك Velcade (بتركيز نهائي 10 μM) على النحو الإيجابي وHBSS التي تحتوي على DMSO (مع تركيز نهائي من 0.1٪ أو 0.2٪) كتحكم سالب.
- إضافة 30 μL من خلية مضيئة قابلية البقاء مُكَوّن في بئر من 384-جيدا لوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم استخدام البروتوكول المعروض في المخطوطة بنجاح في ورقتين نشرتامؤخراً 22,23. ويبين الشكل 3 استخدام الخلايا العصبية المشتقة من HNPCs في دراسة تأثير مثبطات HDAC كمركبات غير جينية على امتداد نيوريت كعلامة على نمو نيوريت والقدرة العصبية اللاحقة لمركبات الجزيئات الصغيرة.
وعلاوة على ذلك، في الشكل 4، يتم تقييم السمية العصبية للمركبات المختبرة (مثبطات HDAC) بالتمييز المتزامن للHNPCs في 384 بئراً، مما يبين إمكانات نموذج الخلايا المعروضة (HNPCs) لتقييم السمية العصبية والقدرة على التوسع لاختبار السمية العصبية لعدد أكبر من المركبات.
في ورقة أخرى من Sartor وآخرون (الشكل 5)، وقياس كثافة الخلايا العصبية fluorescence لتحديد مدى وفرة H4K5ac ، كعلامة هيستون ، بعد علاج الخلايا العصبية المتمايزة عن hNPCs مع مركبات التعديل اللاجينية هو أظهر بنجاح23. بالإضافة إلى ذلك، كما هو موضح في الشكل 6، في عمل غير منشور، تم استخدام البروتوكول لتصور بروتين presynaptic، synaptophysin، للتحقق من تأثير synaptogenic ممكن من مركبات جزيء صغير.
الشكل 1: سير العمل خطوة بخطوة يوضح نهج قياس نمو الخلايا العصبية مع برنامج تحليل الصور في فيجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل خطوة بخطوة يوضح نهجًا لقياس كثافة الخلايا العصبية المفلورة مع برنامج تحليل الصور في فيجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقايسة نوريتج مع مركبات غير متجانسة صغيرة.
(أ)ممثل الصور الفلورية (20x التكبير) لعلاج الخلايا العصبية المشتقة من hNPCs مع مثبطات HDAC القائم على الهيدرساميك. يتم تمييز الخلايا السلف العصبية البشرية لمدة 5 أيام; ثم تعامل ل 24 ح مع 0.1٪ DMSO (كتحكم)، وتريتشوستاتين A، JNJ26481585، SB939، وPC24781 (كمركبات الاختبار). ثم يتم تنفيذ المناعة مع الخلايا العصبية الخاصة β-tubulin الثالث الأجسام المضادة (الأخضر) لتصور العمليات العصبية وتحديد أطوال نيوريت وDAPI (الأزرق) لتصور نواة الخلية. (ب) التحليل الإحصائي لطول النوريت في مجموعات مختلفة. كما هو مبين، يمكن لجميع مركبات الاختبار الحث على نوريت outgrowth. يتم التحليل الكمي لطول النوريت باستخدام برنامج ImageJ. تمثل أشرطة الخطأ SEM; p < 0.001, **** p < 0.0001. وقد تم تعديل هذا الرقم من باقري وآخرين22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تقييم السمية العصبية باستخدام مقايسة الخلية الإنارة.
يتم تصنيف hNPCs وتفريقها إلى الخلايا العصبية في لوحة 384-well وفقًا لنفس الطريقة المستخدمة في مقايسة النمو خارج نيوريت. بعد ذلك يتم قياس تأثير مركبات الاختبار على صلاحية الخلايا بعد 24 ساعة من التعرض. كما هو مبين، لا توجد سمية كبيرة على العلاجات. يتم استخدام ANOVA في اتجاه واحد لتحليل البيانات وتعتبر قيمة p < 0.05 ذات أهمية إحصائية. وقد تم تعديل هذا الرقم من باقري وآخرين22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: يزيد RGFP966 H4K5ac في الخلايا العصبية المتمايزة عن الخلايا السلف العصبية البشرية.
(أ)تمثيلي من مناعة تلطيخ من β tubulin, DAPI, وH4K5ac بعد العلاج مع DMSO, RGFP966, أو RGFP966 + JQ1 في الخلايا العصبية المشتقة من HNPCs. (ب)القياس الكمي لشدة الفلور من H4K5ac بعد العلاج مع DMSO، RGFP966، أو RGFP966 + JQ1. تمثل أشرطة الخطأ SEM; p < 0.0001. وقد تم تعديل هذا الرقم من Sartor وآخرون23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تلطّخ الفلوروس المناعي التمثيلي لـ Synaptophysin (أحمر) لتصور المحطات المتشابكة، β tubulin (الأخضر) لتصور العمليات العصبية، وDAPI (الأزرق) لتصور نواة الخلية التالية للعلاج مع DMSO (كتحكم)، وSB939 (كمركب اختبار) في الخلايا العصبية المشتقة من HNPCs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول هو واحد من عدد قليل من الأوراق المنشورة التي تصف اختبار طول نيوريت عند العلاج بمركبات الاختبار. وعلاوة على ذلك، فإننا نصف كيفية استخدام hNPCs لتقييم الخصية خارج نيوريت واعصاب. من خلال الاستفادة من هذا مقايسة النمو النوري وتقييم السمية العصبية على الخلايا العصبية المشتقة من hNPCs ، فإن الإمكانات العصبية لفئة من مركبات الجزيء الصغير اللاجينية ، مثبطات HDAC ، مما يؤدي إلى نمو نيوريت هو موضح22. وعلاوة على ذلك، في ورقة أخرى قدمها Sartor وآخرون، ويستخدم هذا البروتوكول لتحديد كثافة الفلوريسنس من H4K5ac، وهو بروتين هيستون، على العلاج مع العديد من المركبات المعدلة اللاجينية23.
الوظيفة المعرفية تعتمد على الأسلاك السليمة والاتصالات الوظيفية داخل الدوائر العصبية. إن القياس الكمي المفصل والمتناسق لمختلف جوانب مورفولوجيا الخلايا العصبية باعتباره نهج فحص ظاهري أمر ضروري لتحقيق نظرة موثوقة في المسارات الأساسية التي تؤدي إلى اضطرابات الدماغ التي تتراوح من الاضطرابات العصبية النمائية إلى الاضطرابات النفسية. ويعتبر فحص الظاهريات نهجا فعالا بشكل ملحوظ في استكشاف مركبات الجزيئات الصغيرة كمرشحين للمخدرات المفترضة لتعديل النمط الظاهري الخلوي. في هذا النهج، بدلا من استجواب هدف واحد فقط، يتم فحص جميع مكونات ومسارات الخلية24.
تعتبر مورفولوجيا الخلايا العصبية بما في ذلك الشكل, هيكل, والاتصال لتكون السمات الرئيسية لوظيفة الخلايا العصبية. يمكن أن تساهم التشوهات الوراثية التي تغير مورفولوجيا الخلايا العصبية أو توطين البروتين المتشابك ومستوى بشكل ملحوظ في تحليل الطفرات المسببة للأمراض. ولذلك، هناك حاجة إلى طرق موثوقة لتقييم تأثير البيرتلباغن على مورفولوجيا الخلايا العصبية25.
يتم عزل hNPCs ، من الدماغ الثدييات الجنينية ، والتي يتم استزراعها لاحقًا في المختبر في وجود الميتوجين. تتكون هذه الخلايا من الخلايا العصبية التي تتميز بأنها مجاميع خلوية عائمة تتألف من خلايا السلف العصبي وخلايا الدبقية الشعاعية. وHNPCs توفير نظام نموذج مرغوب فيه لوظيفة الجهاز العصبي والتنمية من خلال الحفاظ على إمكاناتها التمايز في إنتاج مختلف النسب العصبية7,8,9. نوريت عدد، وكثافة، وطول، والعرض جنبا إلى جنب مع الخصائص متشابك بما في ذلك قبل وما بعد التعديلات البروتينات متشابك هي من بين التغيرات في نيوريت متشابك التي يمكن أن تكون موثوقة وقياس بكفاءة باستخدام الأسلوب المعروضة هنا.
بسبب زيادة في انتشار الاضطرابات العصبية مثل اضطراب نقص الانتباه فرط النشاط والتوحد، واحتمالات السمية العصبية للمواد الكيميائية البيئية على الأطفال لا تزال مصدر قلق عام15،26. ولذلك، يتم أيضا دراسة قابلية استخدام الخلايا العصبية المشتقة من HNPCs لتقييم السمية العصبية الموثوقة والفعالة. كما هو موضح في الشكل 4،يمكن تكييف مراكز HNPCs وتوسيع نطاقها لتقييم السمية العصبية في 384 بئر.
تقييم السمية العصبية كتطبيق لنموذج الخلية المقدمة هو ممكن من خلال إما التفريق بين الخلايا العصبية في الخلايا العصبية قبل الطلاء في لوحات 384-جيدا أو التمييز بين الخلايا في حين مطلية في 384-جيدا لوحات. وفي النهج الأخير، يلزم مهارات عالية الدقة في تركيب الأنابيب من أجل تحديد العدد الدقيق للفرفات العصبية التي يتم تصنيفها في خلايا مفردة وكذلك لإجراءات العلاج التالية مع وسيط محفز للتمايز. النظر في مهارات الأنابيب المطلوبة، ويوصى التمايز قبل الطلاء لتحقيق المزيد من النتائج القابلة للاستنساخ. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم فرز الخلايا السائبة بواسطة الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS) لفصل بدقة العدد المطلوب من الخلايا التحايل على الحاجة إلى مهارات الأنابيب عالية الدقة.
وينصح لبدء مقايسة خارج نيوريت عن طريق تقييم السمية العصبية لتجنب تكرار مقايسات نوريتوث مع جرعات مختلفة من نفس المركب للوصول إلى التركيز غير سام. ولذلك، فإن الجمع بين تقييم السمية العصبية عن طريق الاستفادة من مقايسة الخلية مضيئة البقاء ضد منحنى الجرعة استجابة من مركبات الاختبار سيؤدي إلى العثور على الجرعة الصحيحة مع الحد الأدنى من الجهد. إن فحص خلية الإنارة هو أسلوب حساس للغاية لتحديد عدد الخلايا القابلة للحياة في خلية. الأسلوب يعمل على كمية ATP موجودة في الثقافة كمؤشر الأيض الخلوي. إضافة، مزيج، وقياس شكل من المقايسة يوفر نهجا بسيطا وسريعا للتحقق من جدوى الخلية والسمية الخلوية من مركبات الاختبار.
10- هناك بعض القيود على البروتوكول المقدم على النحو التالي. نظرا لتوافر وتقلبات متأصلة، واستخدام الخلايا الأولية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية محدودة25. وبارتفاع معدل الانتشار البطيء لللجان الوطنية الهايتية، مما قد يحد من استخدامها. تحليل يدوي واسع النطاق لصور الفلورسنت للخلايا العصبية يستغرق وقتا طويلا وعرضة للتحيز المجرب. ويمكن اعتبار خلايا hNPCs كخلايا عصبية شابة، لا تمثل التعديلات اللاجينية المرتبطة بالعمر التي تتراكم في الخلايا طوال حياة الشخص. بما أن الاضطرابات العصبية تحدث لدى كبار السن، فقد تفتقر الاضطرابات العصبية إلى الأهمية الفسيولوجية الكافية لتكون نموذجاً مناسباً للظروف التي تحدث في وقت متأخر.
على الرغم من أن النماذج الحيوانية وخطوط الخلايا كانت ذات قيمة في فك رموز الآليات الجزيئية الكامنة في الأمراض، فقد أظهرت قيود في ترجمة النتائج إلى علاجات الإنسان27،28،29،30. وتعتبر الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) جنبا إلى جنب مع HNPCs أفضل في نماذج الخلايا المختبرية، وتلخص علم وظائف الأعضاء البشرية. ولذلك hiPSCs - وhESCs - الخلايا العصبية المشتقة يمكن أيضا يحتمل أن تستخدم كمصادر الخلايا البديلة لخبيرة الغدة العصبية تقييم واعصاب ، والاستفادة من البروتوكول المقدم هنا1،31.
في الختام، فإن الإمكانات الانتقالية العالية والأهمية الفسيولوجية لـ HNPCs كنموذج الخلية البشرية الأولية توفر ملاذًا قيمًا في فحوصات اكتشاف المخدرات المرتبطة بالنوبات والتقييمات السمية العصبية التي تفوق القيود المذكورة سابقًا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويشير جميع المؤلفين إلى عدم وجود تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من خلال منحة البحوث NIMAD (940714) التي منحت لـ MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
