Summary
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode für einen Neuriten-Auswuchs-Assay und neurotoxizitätsbewertete kleine Molekülverbindungen.
Abstract
Neuriten-Auswuchs-Assay und Neurotoxizitätsbewertung sind zwei wichtige Studien, die mit der vorgestellten Methode hierin durchgeführt werden können. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Analyse der neuronalen Morphologie zusammen mit quantitativen Messungen von Modifikationen auf Neuritenlänge und synaptische Proteinlokalisierung und Fülle bei der Behandlung mit kleinen Molekülverbindungen. Zusätzlich zur Anwendung der vorgestellten Methode in Neuriten-Auswuchsstudien kann eine Neurotoxizitätsbewertung durchgeführt werden, um kommerzielle chemische Verbindungen auf der Grundlage ihrer potenziellen Entwicklungs-Neurotoxizitätswirkung zu bewerten, zu unterscheiden und zu ordnen.
Obwohl Zelllinien heutzutage in zusammengesetzten Screening-Assays in der Neurowissenschaft weit verbreitet sind, unterscheiden sie sich oft genetisch und phänotypisch von ihrem Gewebeursprung. Primärzellen hingegen behalten wichtige Marker und Funktionen bei, die in vivo beobachtet werden. Aufgrund des Übersetzungspotenzials und der physiologischen Relevanz, dass diese Zellen einen Neuriten-Auswuchs-Assay anbieten könnten, kann die Neurotoxizitätsbewertung erheblich von der Verwendung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen (hNPCs) als primäres menschliches Zellmodell profitieren.
Die vorgestellte Methode hierin kann verwendet werden, um für die Fähigkeit von Verbindungen zu untersuchen, um Neuritenwachstum und Neurotoxizität zu induzieren, indem die Vorteile der menschlichen neuronalen Vorläuferzell-abgeleiteten Neuronen, ein Zellmodell, das eng die menschliche Biologie darstellt."
Introduction
Das Neuritwachstum ist ein Prozess, der für die Bildung des neuronalen Netzwerks und der Nervenregeneration1,2von grundlegender Bedeutung ist. Nach einer Verletzung spielt das Neuritenwachstum eine Schlüsselrolle bei der Regeneration des Nervensystems. Neuritenwachstum ist auch ein wichtiges Element der extrazellulären Signalisierung bei der Induktion neuronaler regenerativer Aktivitäten zur Verbesserung der Ergebnisse bei neurodegenerativen Erkrankungen und neuronalen Verletzungen3,4,5,6.
Durch die Aufrechterhaltung ihres Differenzierungspotenzials bei der Herstellung verschiedener neuronaler Abstammungen könnten menschliche neuronale Vorläuferzellen (hNPCs) ein Modellsystem für Studien der Funktion des zentralnervensystems (ZNS) und der Entwicklung7,8,9. Hohes Translationspotenzial und physiologische Relevanz von hNPCs als primäres menschliches Zellmodell bieten einen erheblichen Vorteil bei neurititbedingten Antik-Entdeckungsscreenings. Die Wartung und Skalierung der primären Zellmodelle für Tests mit hohem Durchsatz kann jedoch zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein10,11,12,13.
Neben der Anwendung der vorgestellten Methode in Neuriten-Auswuchsstudien ist die Neurotoxizitätsbewertung eine weitere Anwendung mit den hNPC-abgeleiteten Neuronen. Es gibt Tausende von kommerziellen chemischen Verbindungen, die entweder nicht untersucht werden oder mit schlecht verstandenem Neurotoxizitätspotenzial. Daher sind zuverlässigere und effektivere Screening-Experimente zur Bewertung, Unterscheidung und Rangfolge von Verbindungen basierend auf ihrem Potenzial, eine Entwicklungsneurotoxizität auszulösen, sehr gefragt14. Die Zunahme der Prävalenz und Inzidenz von neurologischen Störungen zusammen mit der Fülle von ungetesteten Verbindungen in der Umwelt erfordert die Entwicklung von vertrauenswürdigeren und effizienteren Experimenten, um gefährliche Umweltverbindungen zu identifizieren, die Neurotoxizität darstellen können15.
Die vorgestellte Methode hierin kann verwendet werden, um für die Fähigkeit von Verbindungen zu untersuchen, um Neuritenwachstum und Neurotoxizität zu induzieren, indem die Vorteile der menschlichen neuronalen Vorläufer-Zell-abgeleiteten Neuronen, ein Zellmodell, das eng die menschliche Biologie darstellt.
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Protocol
Ethik-Erklärung: Fetale Proben wurden vom Birth Defects Research Laboratory der University of Washington in Seattle über ein Vom National Institute of Health (NIH) unterstütztes Gewebeverteilungsprogramm erhalten. Das Birth Defects Research Laboratory erhielt die entsprechende schriftliche Zustimmung der Eltern in Kenntnis der Sachlage und die Beschaffung von Geweben wurde vom Institutional Review Board der University of Washington überwacht. Alle Arbeiten wurden mit Genehmigung des Human Subject Research Office an der University of Miami8durchgeführt.
1. Isolation und Kultur menschlicher neuronaler Vorläuferzellen (hNPCs)
- Legen Sie das Hirngewebe in eine 100 mm Petrischale und entfernen Sie vorsichtig die Meninges mit Zangen.
- Übertragen Sie das Hirngewebe in ein 50 ml konisches Rohr und waschen Sie es zweimal mit 20 ml PBS, indem Sie das Rohr sanft invertieren.
- Inkubieren Sie das Hirngewebe in einem neuen 50 ml konischen Rohr, indem Sie das Gewebe in eine Zelldissoziationslösung (siehe Materialtabelle)und DNase I (10 U/mL) 10 min bei 37 °C eintauchen.
- Fügen Sie dem Gewebe, das eine Röhre enthält, 5 ml neuronales Zellkulturmedium (siehe Tabelle der Materialien)hinzu und dissoziieren Sie die Neurosphären mechanisch, indem Sie 20 bis 30 Mal durch eine 1000-L-Pipettenspitze trituieren, um eine einzellige Suspension zu bilden.
- Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-m-Zellsieb, um Zellcluster zu entfernen.
- Samen der einzelzelligen Suspension in einem belüfteten T-25-Kolben, der mit 5-10 ml neuronalen Zellkulturmedium versehen ist, ergänzt durch Komponenten, die in Tabelle 1beschrieben sind.
- Sterilisieren Sie die Heparin-Lösung durch Filtration durch einen 0,2-mm-Filter. Die B-27-Ergänzung ohne Vitamin A ist eine serumfreie Ergänzung zur Kultivierung von neuronalen Vorläufern und Stammzellen, ohne Differenzierung zu induzieren.
HINWEIS: Menschliche neuronale Vorläuferzellen (hNPCs) werden aus dem menschlichen fetalen Gehirn isoliert, das von abgetriebenem Fötus gesammelt wurde. Nach 7–10 Tagen in der Kultur bilden neuronale Stammzellen (NSCs) frei schwebende Neurosphärenkolonien, während andere Zelltypen als Einzelzellen in Suspension bleiben oder an den Boden des Kolbens anheften. Die isolierten hNPCs können als Neurosphären in Suspension für mehrere Monatekultiviertwerden 8,16,17.
- Sterilisieren Sie die Heparin-Lösung durch Filtration durch einen 0,2-mm-Filter. Die B-27-Ergänzung ohne Vitamin A ist eine serumfreie Ergänzung zur Kultivierung von neuronalen Vorläufern und Stammzellen, ohne Differenzierung zu induzieren.
| Menge | Komponente |
| 100 l | EGF (20 ng/ml) |
| 100 l | FGF (10 ng/ml) |
| 2 mL | B-27, Minus Vitamin A (50X) |
| 1 ml | L-Alanyl-L-Glutamin (100X) (siehe Materialtabelle) |
| 4 l | Heparin (2 g/ml) |
| 96,8 ml | Neuronale Zellkulturmedium (siehe Materialtabelle) |
Tabelle 1. Komponenten, die für die Herstellung von 100 ml Kulturmedien erforderlich sind
2. Passaging der hNPCs
- Sammeln Sie die Medien, die die schwimmenden Kugeln, große und kleine Neurosphären enthalten, und übertragen Sie sie in eine 50 ml konische Röhre.
HINWEIS: Aus unbekannten Gründen ist der Zeitpunkt für die Aufteilung der Neurosphären von 7 Tagen bis zu 30 Tagen variabel. Im Allgemeinen müssen Neurosphären jedoch durchgesieben werden, wenn sie einen Durchmesser von mehr als 700-900 m erreichen. Dies ist, wenn das Zentrum der Neurosphäre beginnt zu verdunkeln, die als Zeichen einer hohen Rate des Zelltodes18betrachtet wird. - Drehen Sie die Neurosphären durch Zentrifugation bei 300-400 x g für 3 min nach unten.
- Sorgsam den Überstand ansaugen und dann die Kugeln in 500 l aufgetautes Zelldissoziationsreagenz untertauchen (siehe Materialtabelle).
- Machen Sie Aliquots des Zelldissoziationsreagenzdurchfügung durch Zugabe von 500 l pro 1,5 ml Mikroröhren und lagern Sie bei -20 °C. Um den Verlust der Enzymaktivität zu vermeiden, tauen Sie das Zelldissoziationsreagenz auf, indem Sie bei RT halten oder 5 min in einem 37 °C Wasser-/Perlenbad erwärmen.
- Je nach Dichte und Größe der Kugeln die untergetauchten Kugeln bei 37 °C für 5-15 min inkubieren.
- Fügen Sie 5-10 ml vorgewärmte Kulturmedien zu den Neurosphären hinzu, die 50 ml konische Röhre und Zentrifuge bei 300-400 x g für 5 min enthalten, um die Neurosphären zu sedimentieren.
- Aspirieren Sie den Überstand und sanft Pipette auf und ab, mit einer 1000 l Pipette, in 2 ml Kulturmedien, bis alle Neurosphären in einer einzelzelligen Suspension sind.
HINWEIS: Die Dissoziation wird mit bloßem Auge sichtbar. Vor der Dissoziation sind die Neurosphären in Form von Sphären. Nach dem Eintauchen in Dissoziationsreagenz und durch Pipettieren nach oben und unten, werden sie einzelne Zellen.- Zählen Sie die Zellen und platten Sie die einzelnen Zellen, 2 bis 3 Millionen Zellen pro T-25 Kolben in 10 ml Kulturmedien.
- Füttern Sie die Zellen alle 3 Tage, indem Sie die Hälfte der Kulturmedien ersetzen.
- Settle Neurosphären, indem Sie den Kolben so anlehnen, dass er sich an der unteren Ecke befindet. Halten Sie den Kolben in der Position für etwa 1-2 min, bis die Neurosphären Sediment. Dann die Hälfte der Medien sanft ansaugen, indem Sie die serologische Pipette in die Medien über den besiedelten Neurosphären einfügen. Dissoziierte Zellen können nach 2 bis 3 Tagen in Kultur19zu Kugeln aggregieren.
3. Einfrieren der hNPCs
- Bereiten Sie das Zellgefriermedium vor, indem Sie DMSO zu einer Endkonzentration von 10 % (v/v) zu den Kulturmedien hinzufügen oder kommerziell erhältliches Kryokonservierungsmedium für empfindliche Zelltypen verwenden (siehe Materialtabelle).
- Sortieren Sie große Kugeln, indem Sie die Medien in ein 50 ml kegelförmiges Rohr übertragen und die Kugeln durch die Schwerkraft absetzen lassen. Dann entfernen und übertragen Sie die großen Neurosphären in eine neue 50 ml konische Röhre für die Passierung mit einer 200 oder 1000 L Pipettenspitze.
ANMERKUNG: Neurosphären mit einem Durchmesser von mehr als 900 m gelten als groß und die mit einem Durchmesser von weniger als 500 m als klein. - Drehen Sie die verbleibenden Neurosphären durch Zentrifugation bei 300-400 x g für 3 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Bis zu 100 Kugeln in 1 ml Kryokonservierungsreagenz aussetzen und in ein Kryotube übertragen.
- Über Nacht bei -80 °C in einem Zellgefrierbehälter lagern (siehe Materialtabelle)und am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff umziehen.
HINWEIS: Es ist vorzuziehen, kleine bis mittelgroße Neurosphären (mit einem Durchmesser von weniger als 900 m) einzufrieren und das Einfrieren großer Neurosphären (mit einem Durchmesser von mehr als 900 m) oder einzelner Zellen zu vermeiden. Um Zellschäden beim Auftauen der Probe zu reduzieren, halten Sie die Zellen dicht, indem Sie die aufgetauten Neurosphären in einen kleinen T25-Kolben säen.
4. Differenzierung und Behandlung von hNPCs
HINWEIS: Um eine Differenzierung zu induzieren, werden Neurosphären in einzelne Zellen zerlegt, gezählt und dann 5 Tage lang auf beschichteten Platten gesät. Anschließend werden differenzierte Zellen für 24 h mit Testverbindungen vor Immunfärbung und Fluoreszenzquantififizierung behandelt.
- Beschichtung
- Fügen Sie 200 l Poly-L-Lysin (PLL) pro Bohrung von 4-Well-Glaskammer-Dias hinzu (140 l pro Bohrung von 8-Well-Kammer-Dias).
- 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Waschen Sie 3x mit PBS.
- Lassen Sie es bei RT trocknen (für ca. 30 min).
- Fügen Sie 150 l Laminin (50 g/ml) pro Bohrung von 4-Well-Glaskammer-Dias hinzu (120 l pro Bohrung von 8-Well-Kammer-Dias).
- 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Waschen Sie 3x mit PBS.
HINWEIS: Beschichtete Kammerschlitten können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
- Plattieren der Zellen
- Zählen und Plattieren von 80.000 Einzelzell-Neurosphären (Neurosphären in einer Einzelzellsuspension) pro Brunnen von 4-Well-Kammer-Dias (70.000 Zellen pro Brunnen von 8-Well-Kammer-Dia).
- Fügen Sie 500 l Differenzierungsmedien pro Bohrung von 4-Well-Kammerrutsche hinzu (250 L Medien pro Bohrung von 8-Well-Kammerrutschen).
- Um die Differenzierungsmedien zuerst herzustellen, fügen Sie die folgenden Komponenten in Tabelle 2 zu einem sterilen Einwegbehälter hinzu, um die neuronalen induzierenden Medien (NIM) herzustellen.
- Fügen Sie die folgenden Zutaten in Tabelle 3 bis 48,5 ml NIM hinzu, die im vorherigen Schritt gemacht wurden, um die Differenzierungsmedien herzustellen.
- 5 Tage bei 37 °C inkubieren.
- Nach 5 Tagen behandeln Sie die Zellen für 24 h, indem Sie die Hälfte der Medien in jedem Brunnen durch Frischemittel ersetzen, die mit der gewünschten Konzentration von Testverbindungen, einschließlich geeigneter Kontrollen, gemischt werden.
| Menge | Komponente |
| 49 ml | DMEM/F-12 |
| 0,5 ml | N2-Ergänzung (100X) |
| 0,5 ml | MEM nicht essentielle Aminosäuren (100X) |
| 2 l | Heparin (2 g/ml) (Lager-Conc. ist 50 mg/ml) |
Tabelle 2. Erforderliche Komponenten für die Herstellung von 50 ml NIM
| Menge | Komponente |
| 1 ml | B-27 (50X) |
| 500 l | Antibiotika-Antimykotika (100X) |
| 5 l | Retinsäure (0,1 m) |
| 50 l | GDNF (10 g/ml) |
| 50 l | BDNF (10 g/ml) |
| 5 l | Ascorbinsäure (0,2 g/ml) (Stock Conc. ist 2 mg/ml) HINWEIS: Empfohlen, frisch zubereitet zu werden. |
| 48,5 ml | Nim |
Tabelle 3. Komponenten, die für die Herstellung von 50 ml Differenzierungsmedien erforderlich sind
5. Immunzytochemie (ICC)
HINWEIS: Die Zellen sind mit 4% Formaldehyd fixiert. Permeabilisierung und Blockierung wird dann durchgeführt, um die Penetration zu verbessern und unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. Die Zellen werden dann über Nacht mit primären Antikörpern inkubiert. Anschließend werden Die Zellen mit fluoreszierend markierten Sekundärantikörpern inkubiert. Schließlich werden nach der Verwendung von DAPI, um den Kern zu beflecken, Kammerschlitten montiert.
- Fixierung
- Saugen Sie die Medien in jedem Brunnen sanft an.
- Fügen Sie 500 l 4% Formaldehyd pro Bohrung von 4-Well-Kammer-Dias hinzu (250 l pro Bohrung von 8-Well-Kammer-Dias).
- 15 min bei RT inkubieren.
- 2x mit 500 l PBS vorsichtig waschen.
HINWEIS: Nach der Fixierung können Kulturfolien bei 4 °C für bis zu 3 Monate gespeichert werden, indem 1 ml PBS in jedem Brunnen belassen werden.
- Zellpermeabilisierung und Blockierung
- Fügen Sie die folgenden Komponenten in Tabelle 4 zu einem sterilen Einwegbehälter hinzu, um den Antikörperpuffer (Ab) zu bilden.
- Mischen Sie die folgenden Zutaten in Tabelle 5 mit dem Ab-Puffer im vorherigen Schritt, um die Zellpermeabilisierungs- und Blockierlösung herzustellen.
- Fügen Sie 500 l pro Bohrung von 4-Well-Kammer-Dias hinzu und brüten für 1 h bei RT.
HINWEIS: Ab-Puffer kann bei 4 °C gespeichert werden.
| Menge | Komponente |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3,6 g | L-Lysin (100 mM) |
| 8 g | Natriumazid (4%) |
| 200 ml | Destilliertes Wasser. HINWEIS: Lösen Sie zunächst die benötigten Komponenten in 150 ml Wasser auf, dann stellen Sie sie auf 200 ml ein. |
Tabelle 4. Komponenten für die Herstellung von 200 ml Antikörperpuffer erforderlich
| Menge | Komponente |
| 600 l | 20% Ziegenserum |
| 6 l | 0,2% Triton-X100 |
| 2394 l | Antikörperpuffer. HINWEIS: Lösen Sie zunächst die erforderlichen Komponenten in 2 ml Ab-Puffer auf und stellen Sie dann pH 7,4 ein. Fügen Sie dann mehr Ab-Puffer hinzu, um sich an das Endvolumen von 3 ml anzupassen und filtern Sie sie. |
Tabelle 5. Komponenten, die für die Herstellung von 3 ml Zellpermeabilisations- und Blockierlösung erforderlich sind
- Färbung
- 2x mit 500 l PBS waschen.
- Fügen Sie den verdünnten Primärantikörper Anti-A-Tubulin III (1:200) hinzu und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 4 °C (200 l pro Brunnen von 4-Well-Kammerrutschen). Verdünnen Sie den primären Antikörper in PBS.
- 2x mit PBS waschen.
- Fügen Sie den verdünnten, in PBS fluoreszierend markierten Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 (1:500) hinzu und brüten Sie für 2 h bei RT an einem lichtgeschützten Ort (250 l pro Bohrung von 4-Well-Kammerrutschen)
- 2x mit PBS waschen.
- Fügen Sie die verdünnte, in PBS, DAPI (300 nM Konzentration) und inkubieren für 5 min bei RT an einem Ort vor Licht geschützt (300 l pro Brunnen von 4-Well-Kammer-Dias).
- Waschen Sie 3x mit PBS.
- Montieren Sie die Kammerschlitten mit den folgenden Anweisungen.
- Nehmen Sie die Kammerrutsche auseinander, indem Sie die abreißenden Laschen brechen und die Dichtung und Basis entfernen.
- Fügen Sie einen Tropfen der Montagelösung (siehe Materialtabelle)pro Bohrung von 4-Well-Kammerschlitten hinzu. Verwenden Sie dann eine Abdeckungsfolie, um die gesamte Folie abzudecken.
- Platzieren Sie mit einer Pinzette und in einem Winkel eine Seite des Deckels gegen die Rutsche, während Sie Den Kontakt mit der äußeren Kante des Flüssigkeitstropfens herstellen.
- Geben Sie den Deckelrutsch vorsichtig auf die Montagelösung, wenn Sie ihn einnachlassen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Nehmen Sie eine Pipette-Spitze und drücken Sie sie auf den Deckel-Slip. Die Blasen bewegen sich zur Seite.
HINWEIS: Blasenbildung ist manchmal unvermeidlich. Wenn es auftritt, Bild um sie herum, solange es ein paar gibt. - Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Aushärtungszeit. Vermeiden Sie die Verwendung von nicht heilenden Montagelösungen aufgrund der Schwierigkeiten bei der Handhabung während der Bildgebung. Andernfalls ist ein geeignetes Deckschversiegelung an den Kanten erforderlich, um zu verhindern, dass der Deckelrutsch während der Bildgebung gleitet.
- Um den Deckelschlupf zu versiegeln, verwenden Sie Nagellack und machen Sie eine kleine Linie am Rand der Abdeckung Schlupf. Den Nagellack ca. 2 min trocknen lassen.
6. Bildaufnahme, Neuritenwachstum und Fluoreszenzintensitätsquantifizierung
HINWEIS: Verwenden Sie nach der Färbung ein konfokales Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv und einer Bildgröße von 1024 x 1024 Pixeln, um die Bilder der behandelten Zellen zu erfassen. Nehmen Sie mindestens Bilder aus zwei Feldern pro biologischer Replikation pro Bedingung auf. Verwenden Sie dann die Fidschi-Bildanalysesoftware (ImageJ 1.51u) zur Quantifizierung der Neuritenlänge. Kurz gesagt, messen Sie die Länge des längsten Neurites für jedes Neuron und nach der Mittelung der Werte pro Behandlung, verwenden Sie den t-Test des Studenten für unabhängige Gruppen, um die Mittelwerte zwischen experimentellen Gruppen und Kontrollgruppen zu vergleichen.
HINWEIS: Mehrere kommerzielle (Imaris, Volocity, Amira) und Open Source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) Bildverarbeitungsprogramme sind verfügbar. Unter diesen Programmen ist ImageJ zum Werkzeug der Wahl für die biologische Bildanalysegeworden 20,21. Das ImageJ-Portal auf https://imagej.net/Introduction ist eine nützliche Informationsquelle, die eine gründliche Beschreibung der grundlegenden und integrierten Funktionen von ImageJ bietet, einschließlich Bildverarbeitung, Kolokalisierung, Dekonvolution, Registrierung, Segmentierung, Tracking und Visualisierung.
- Messung des neuronalen Auswuchses mit der Fidschi-Bildanalysesoftware
- Wie in Abbildung 1dargestellt, öffnen Sie das Bild entweder, indem Sie es ziehen und auf Fidschi-Software ablegen oder indem Sie Datei | Öffnen.
- Analysieren auswählen | Werkzeuge | ROI-Manager, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf das5. Symbol in der Symbolleiste Gerade und wechseln Sie zur Freihandlinie. Optional doppelklicken Sie auf dasselbe Symbol, um die Linienbreite auf 10 zu ändern, und verfolgen Sie dann das längste Neurit, beginnend in der Nähe des Zellkörpers und bis zur Spitze des Neurites.
- Drücken Sie Strg + T & dann F, um die Messung zum ROI Manager hinzuzufügen und das gemessene Neuron hervorzuheben. Wählen Sie alle Zahlen im ROI aus, klicken Sie auf Messen, wählen Sie alle berechneten Längen aus und kopieren/einfügen sie in eine Kalkulationstabelle.
- Messung der Fluoreszenzintensität markierter Zellen mit der Fidschi-Bildanalysesoftware
- Wie in Abbildung 2dargestellt, klicken Sie nach dem Öffnen des Bildes auf das4. Symbol in der Symbolleiste Freihandauswahl. Zeichnen Sie die Form der Zelle.
- Analysieren auswählen | Messen festlegen und für die folgenden Werte auswählen: Fläche, Integrierte Dichte, Mittlerer Grauwert | Analysieren | Measure (ein Popup-Feld mit einem Stapel von Werten wird geöffnet).
- Wählen Sie einen Bereich neben der Zelle als Hintergrund aus (Größe ist nicht wichtig), und wählen Sie dann Analysieren | Maßnahme. Wählen Sie alle Messdaten aus und kopieren/einfügen Sie in eine Kalkulationstabelle.
HINWEIS: Integrierte Dichte (IntDen) ist das Element, das zur Bestimmung der fluoreszierenden Intensitäten verwendet wird. In dieser Studie wird die fluoreszierende Intensität des Zielmoleküls gemessen, um zunächst seine Verteilung in der Zelle zu analysieren und anschließend die Häufigkeit des Zielmoleküls unter verschiedenen Behandlungen zu quantifizieren. Folglich wird die Wirksamkeit der Behandlungen gemessen und mit der Kontrolle verglichen.
7. Neurotoxizitätsbewertung
ANMERKUNG: Die Zytotoxizität von Prüfverbindungen wird in 384-Well-Platten (siehe Materialtabelle) mit einem leuchtmförmigen Zelllebensfähigkeitstest (siehe Tabelle der Materialien) bewertet. Die hNPCs werden nach der gleichen Methode hergestellt, mit Ausnahme leichter Änderungen, die im Abschnitt "Differenzierung und Behandlung von hNPCs" beschrieben sind. Anschließend wird ein Lumineszenzsignal gemessen, das durch den Leuchtstoffzell-Lebensfähigkeitstest erzeugt wird, indem ein Mikroplattenleser verwendet wird. Das Leuchtsignal ist proportional zur zellulären ATP-Konzentration, die selbst direkt proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen ist, die in jedem Brunnen vorhanden sind.
- Beschichtung
- Fügen Sie 30 l Poly-L-Lysin (PLL) pro Bohrung mit 384-Well-Platte hinzu.
- 1 h bei RT inkubieren.
- 2x mit PBS waschen.
- Lassen Sie es bei RT trocknen (für ca. 30 min).
- Fügen Sie 30 l Laminin (50 g/ml) pro Bohrung mit 384-Well-Platte hinzu.
- 2 h bei 37 °C inkubieren.
- 2x mit PBS waschen.
HINWEIS: Beschichtete 384-Well-Platten können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
- Plattieren der Zellen
- Zählung und Platte 20.000 Einzelzell-Neurosphären pro Bohrgut von 384-Well-Platte in 25 L Differenzierungsmedien.
- 5 Tage bei 37 °C inkubieren.
- Behandeln Sie die Zellen nach 5 Tagen auf 24 h, indem Sie Verbindungen testen, die mit der 6-fachen endgewünschten Konzentration in 5 l Volumen (um das Endvolumen von 30 l pro Bohrkörper) zu erreichen.
- Zelllebensfähigkeitstest
- Fügen Sie 30 l Lumineszenzzell-Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz pro Bohrung von 384-Well-Platte hinzu.
HINWEIS: Fügen Sie ein Volumen von lumineszierenden Zelllebensfähigkeit assay Reagenz gleich dem Volumen in jedem Brunnen vorhanden. Tauen Sie das leuchtende Zell-Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz und equilibrate zu RT vor der Verwendung. - Auf einem Tellershaker für 2 Minuten schütteln (um zelllyse zu mischen und zu induzieren).
- Drehen Sie das Gemisch durch Zentrifugation bei 300-400 x g für 30 s nach unten.
- Inkubieren Sie die 384-Well-Platte für 10 min bei RT an einem Lichtschutzort (zur Stabilisierung des Leuchtsignals).
- Zeichnen Sie die Lumineszenz mit einem Mikroplattenleser auf.
ANMERKUNG: Verwenden Sie geeignete Kontrollen für den Rentabilitätstest einschließlich Velcade (bei einer Endkonzentration von 10 m) als positiv und HBSS, die DMSO enthalten (mit einer Endkonzentration von 0,1 % oder 0,2 %) als negative Kontrolle.
- Fügen Sie 30 l Lumineszenzzell-Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz pro Bohrung von 384-Well-Platte hinzu.
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Representative Results
Das im Manuskript vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich in zwei kürzlich veröffentlichten Papieren22,23verwendet. Abbildung 3 zeigt die Verwendung von hNPCs-abgeleiteten Neuronen bei der Untersuchung der Wirkung von HDAC-Inhibitoren als epigenetische Verbindungen auf die Ausdehnung von Neuriten als Marker für das Neuritenwachstum und die anschließende neurogene Fähigkeit kleiner Molekülverbindungen.
Darüber hinaus wird in Abbildung 4 die Neurotoxizität getesteter Verbindungen (HDAC-Hemmer) auch durch gleichzeitige Differenzierung der hNPCs in 384-Well-Platten bewertet, was das Potenzial des vorgestellten Zellmodells (hNPCs) für die Neurotoxizitätsbewertung und die Fähigkeit zeigt, die Neurotoxizität für eine höhere Anzahl von Verbindungen zu testen.
In einem weiteren Papier von Sartor et al. (Abbildung 5) wird die Messung der fluoreszenzenden Neuronenfluoreszenzintensität zur Quantifizierung der Fülle von H4K5ac als Histonmarkierung nach der Behandlung der von hNPCs mit epigenetischen Modifikatorverbindungen unterschiedenen Neuronen erfolgreich nachgewiesen23. Zusätzlich wurde das Protokoll, wie in Abbildung 6dargestellt, in einer unveröffentlichten Arbeit verwendet, um ein präsynaptisches Protein, Synaptophysin, zu visualisieren, um die mögliche synaptogene Wirkung kleiner Molekülverbindungen zu überprüfen.
Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Workflow zur Veranschaulichung eines Ansatzes zur Messung des neuronalen Auswuchses mit der Fidschi-Bildanalysesoftware. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schritt-für-Schritt-Workflow zur Veranschaulichung eines Ansatzes zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität neuronaler Zellen mit der Fidschi-Bildanalysesoftware. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Neuriten-Auswuchs-Assay mit epigenetischen Verbindungen mit kleinen Molekülen.
(A) Repräsentative Fluoreszenzbilder (20-fache Vergrößerung) zur Behandlung von hNPCs-abgeleiteten Neuronen mit hydroxamischen HDAC-Inhibitoren. Menschliche neuronale Vorläuferzellen werden für 5 Tage unterschieden; dann für 24 h mit 0,1% DMSO (als Kontrolle) und Trichostatin A, JNJ26481585, SB939 und PCI24781 (als Prüfverbindungen) behandelt. Anschließend wird die Immunfärbung mit neuronal-spezifischem Antikörper (grün) durchgeführt, um neuronale Prozesse zu visualisieren und Neuritlängen und DAPI (blau) zu quantifizieren, um Zellkerne zu visualisieren. (B) Statistische Analyse der Neuritenlänge in verschiedenen Gruppen. Wie dargestellt, können alle Testverbindungen Neuritenwachstum induzieren. Die quantitative Analyse der Neuritenlänge erfolgt mit der ImageJ-Software. Fehlerbalken stellen SEM dar; p < 0,001, **** p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Bagheri et al.22geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Neurotoxizitätsbewertung mit lumineszierendem Zelllebensfähigkeitstest.
hNPCs werden nach der gleichen Methode für den Neurititen-Auswuchs-Assay gesät und zu Neuronen in der 384-Well-Platte differenziert. Danach wird die Wirkung von Testverbindungen auf die Lebensfähigkeit von Zellen nach 24 h Exposition gemessen. Wie gezeigt, gibt es keine signifikante Toxizität bei Behandlungen. Einweg-ANOVA wird für die Datenanalyse verwendet und ein p-Wert < 0,05 wird als statistisch signifikant betrachtet. Diese Zahl wurde von Bagheri et al.22geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: RGFP966 erhöht H4K5ac in Neuronen, die von menschlichen neuronalen Vorläuferzellen unterschieden werden.
(A) Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von Tubulin, DAPI und H4K5ac nach Behandlung mit DMSO, RGFP966 oder RGFP966 + JQ1 in hNPCs-abgeleiteten Neuronen. (B) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von H4K5ac nach Behandlung mit DMSO, RGFP966 oder RGFP966 + JQ1. Fehlerbalken stellen SEM dar; p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Sartor et al.23geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung von Synaptophysin (rot), um synaptische Klemmen zu visualisieren, Tubulin (grün) zur Visualisierung neuronaler Prozesse und DAPI (blau), um Zellkerne nach der Behandlung mit DMSO (als Kontrolle) und SB939 (als Testverbindung) in hNPCs-abgeleiteten Neuronen zu visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll ist eines der wenigen veröffentlichten Papiere, die den Test auf Neuritenlänge bei der Behandlung mit Testverbindungen beschreiben. Darüber hinaus beschreiben wir, wie hNPCs für einen Neuriten-Outgrowth-Assay und eine Neurotoxizitätsbewertung verwendet werden. Durch die Verwendung dieses Neuriten-Outgrowth-Assays und der Neurotoxizitätsbewertung an hNPCs-abgeleiteten Neuronen wird das neurogene Potenzial einer Kategorie von epigenetischen Kleinmolekülverbindungen, HDAC-Hemmern, bei der Induktion von Neuritenwachstum demonstriert22. Darüber hinaus wird dieses Protokoll in einem anderen von Sartor et al. vorgestellten Papier verwendet, um die Fluoreszenzintensität von H4K5ac, einem Histonprotein, bei behandlung mit mehreren epigenetischen Modifikatorenverbindungen zu quantifizieren23.
Kognitive Funktion beruht auf der richtigen Verdrahtung und funktionellen Verbindungen innerhalb neuronaler Schaltkreise. Eine detaillierte und konsistente Quantifizierung verschiedener Aspekte der neuronalen Morphologie als phäkotypischer Screening-Ansatz ist unerlässlich, um zuverlässige Einblicke in die zugrunde liegenden Wege zu erhalten, die zu Hirnerkrankungen von neuroentwicklungsbedingten bis hin zu psychiatrischen Störungen führen. Phänotypisches Screening gilt als besonders effektiver Ansatz bei der Erforschung von kleinmolekularen Verbindungen als vermeintliche Wirkstoffkandidaten, um einen zellulären Phänotyp zu modulieren. Bei diesem Ansatz werden, anstatt nur ein einziges Ziel zu verhören, alle Komponenten und Wege der Zelle untersucht24.
Neuronale Morphologie einschließlich Form, Struktur und Konnektivität gelten als Schlüsselmerkmale der neuronalen Funktion. Genetische Störungen, die die Morphologie von Neuronen oder synaptischen Proteinlokalisierung und -niveau verändern, könnten insbesondere zur Analyse krankheitserregender Mutationen beitragen. Daher sind zuverlässige Methoden erforderlich, um die Auswirkungen von Störungen auf die neuronale Morphologie25zu bewerten.
Die hNPCs werden aus dem embryonalen Säugetierhirn isoliert, die anschließend in vitro in Gegenwart von Mitogenen kultiviert werden. Diese Zellen bestehen aus Neurosphären, die als schwimmende zelluläre Aggregate aus neuronalen Vorläuferzellen und radialen Gliazellen charakterisiert sind. Die hNPCs bieten ein wünschenswertes Modellsystem für die Funktion und Entwicklung des Nervensystems, indem sie ihr Differenzierungspotenzial bei der Herstellung verschiedener neuronaler Linien7,8,9beibehalten. Neuritenzahl, Intensität, Länge und Breite sowie synaptische Eigenschaften, einschließlich prä- und postsynaptischer Proteine, gehören zu Neuriten- und Synaptischen Veränderungen, die mit der vorgestellten Methode zuverlässig und effizient gemessen werden könnten.
Aufgrund einer Zunahme der Prävalenz von neurologischen Störungen wie Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung und Autismus, das Neurotoxizitätspotenzial von Umweltchemikalien auf Kinder bleibt ein öffentliches Anliegen15,26. Daher wird auch die Nutzbarkeit von hNPCs-abgeleiteten Neuronen für eine zuverlässige und effiziente Neurotoxizitätsbewertung untersucht. Wie in Abbildung 4dargestellt, konnten hNPCs für die Neurotoxizitätsbewertung in 384-Well-Platten angepasst und skaliert werden.
Die Neurotoxizitätsbewertung als Anwendung für das eingeführte Zellmodell ist möglich, indem entweder die Neurosphären in Neuronen differenziert werden, bevor sie sich in 384-Well-Platten plattieren, oder die Zellen differenzieren, während die Neurosphären in 384-Well-Platten als Einzelzellen plattiert werden. Bei letzterem Ansatz sind hochpräzise Pipettierfähigkeiten erforderlich, um die genaue Anzahl der in Einzelzellen aufgeschlüsselten Neurosphären zu plattieren und auch für die folgenden Behandlungsverfahren mit differenzierungsinduzierendem Medium. Unter Berücksichtigung der erforderlichen Pipettierfähigkeiten wird eine Differenzierung vor der Beschichtung empfohlen, um reproduzierbarere Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus könnte die Massenzellsortierung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) möglicherweise auch verwendet werden, um die erforderliche Anzahl von Zellen genau zu trennen, wodurch die Notwendigkeit hochpräziser Pipettierfähigkeiten umgangen wird.
Es wird empfohlen, den Neuriten-Auswuchs-Assay durch Neurotoxizitätsbewertung zu starten, um wiederholte Neuriten-Auswuchs-Assays mit verschiedenen Dosen der gleichen Verbindung zu vermeiden, um für ungiftige Konzentration zu erreichen. Daher führt die Kombination einer Neurotoxizitätsbewertung durch die Verwendung des leuchtstofffreien Zelllebensfähigkeitstests gegen eine Dosis-Wirkungs-Kurve von Testverbindungen dazu, die richtige Dosierung mit minimalem Aufwand zu finden. Der lumineszierende Zelllebensfähigkeitstest ist eine hochempfindliche Methode, um die Anzahl lebensfähiger Zellen in einer Zellkultur zu bestimmen. Die Methode arbeitet an der Quantifizierung des ATP in der Kultur als Indikator für den Zellstoffwechsel. Das Add-, Mix- und Measureformat des Tests bietet einen einfachen und schnellen Ansatz, um die Zelllebensfähigkeit und Zytotoxizität von Testverbindungen zu überprüfen.
Das vorgestellte Protokoll hat einige Einschränkungen wie folgt. Aufgrund der Verfügbarkeit und der inhärenten Variabilität ist der Einsatz physiologisch relevanter Primärzellenum 25begrenzt. hNPCs haben eine langsame Proliferationsrate, die ihre Auslastung einschränken könnte. Die manuelle großangelegte Analyse fluoreszierender Bilder von Neuronen ist zeitaufwändig und anfällig für Experimentierverzerrungen. hNPCs könnten als junge Nervenzellen betrachtet werden, die keine altersbedingten epigenetischen Veränderungen darstellen, die sich im Laufe des Lebens in Zellen ansammeln. Da neurodegenerative Erkrankungen bei älteren Menschen auftreten, kann es an ausreichender physiologischer Relevanz fehlen, um ein geeignetes Modell für spät auftretende Bedingungen zu sein.
Obwohl Tiermodelle und Zelllinien bei der Entschlüsselung molekularer Mechanismen, die Krankheiten zugrunde liegen, wertvoll waren, haben sie Beigaben bei der Umsetzung von Befunden in humane Therapeutikagezeigt 27,28,29,30. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) und menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) neben hNPCs gelten als bessere In-vitro-Zellmodelle, die die menschliche Physiologie rekapitulieren. Daher können hiPSCs- und hESCs- abgeleitete Neuronen auch potenziell als zwei alternative Zellquellen für den Neuriten-Auswuchs-Assay und die Neurotoxizitätsbewertung verwendet werden, wobei das hier vorgestellte Protokoll1,31verwendet wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein hohes translationales Potenzial und die physiologische Relevanz von hNPCs als primäres menschliches Zellmodell einen wertvollen Rückgriff auf neuroritenbezogene Arzneimittelentdeckungsscreenings und Neurotoxizitätsbewertungen bieten, die die oben genannten Einschränkungen überwiegen.
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Disclosures
Alle Autoren weisen auf keine potenziellen Interessenkonflikte hin.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch ein NIMAD-Forschungsstipendium (940714) finanziert, das mAF gewährt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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