Summary
Den fremlagte protokol beskriver en metode til en neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering af små molekyle forbindelser.
Abstract
Neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering er to store undersøgelser, der kan udføres ved hjælp af den præsenterede metode heri. Denne protokol giver pålidelig analyse af neuronal morfologi sammen med kvantitative målinger af modifikationer på neurite længde og synaptisk protein lokalisering og overflod ved behandling med små molekyle forbindelser. Ud over anvendelsen af den præsenterede metode i neurite udvækstundersøgelser kan der foretages en neurotoksicitetsvurdering for at vurdere, skelne og rangordne kommercielle kemiske forbindelser baseret på deres potentielle udviklingsmæssige neurotoksicitetseffekt.
Selv om cellelinjer er i dag udbredt i sammensatte screening assays i neurovidenskab, de ofte adskiller sig genetisk og fænotypisk fra deres væv oprindelse. Primære celler, på den anden side, opretholde vigtige markører og funktioner observeret in vivo. Derfor, på grund af oversættelsen potentiale og fysiologiske relevans, at disse celler kunne tilbyde neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering kan betydeligt drage fordel af at bruge humane neurale progenitor celler (hNPC' er) som den primære menneskelige celle model.
Den præsenterede metode heri kan bruges til at screene for evne til forbindelser til at fremkalde neurite udvækst og neurotoksicitet ved at drage fordel af den menneskelige neurale stamfader celle-afledte neuroner, en celle model tæt repræsenterer den menneskelige biologi.
Introduction
Neurite vækst er en proces, der er grundlæggende for dannelsen af det neuronale netværk og nerve regenerering1,2. Efter en skade, neurite udvækst spiller en central rolle i regenerering af nervesystemet. Neurite udvækst er også et vigtigt element i den ekstracellulære signalering i inducerende neuronal regenerative aktiviteter for at forbedre resultaterne for neurodegenerative lidelser og neuronal skade3,,4,5,6.
Ved at opretholde deres differentieringspotentiale i produktionen af forskellige neurale slægter, menneskelige neurale stamceller (hNPC'er) kunne give en model system for undersøgelser af centralnervesystemet (CNS) funktion og udvikling7,8,9. Høj translationel potentiale og fysiologisk relevans af hNPC'er som en primær human celle model giver en betydelig fordel i neurite udvækst-relaterede drug discovery screenings. Vedligeholdelse og skalering af primærcellemodellerne til analyser med høj kapacitet kan dog være tidskrævende og arbejdskrævende10,11,12,13.
Ud over anvendelsen af den præsenterede metode i neurite udvækstundersøgelser er neurotoksicitetsvurdering en anden anvendelse ved hjælp af hNPC-afledte neuroner. Der er tusindvis af kommercielle kemiske forbindelser, der enten ikke undersøges eller med dårligt forstået neurotoksicitet potentiale. Derfor, mere pålidelige og effektive screening eksperimenter til at vurdere, skelne, og rang forbindelser baseret på deres potentiale til at fremkalde udviklingsmæssige neurotoksicitet er i høj efterspørgsel14. Stigningen i prævalens og forekomst af neurologiske lidelser sammen med den overflod af uprøvede forbindelser i miljøet nødvendiggør udvikling af mere troværdige og effektive eksperimenter til at identificere farlige miljøforbindelser, der kan udgøre neurotoksicitet15.
Den præsenterede metode heri kan udnyttes til at screene for evne til forbindelser til at fremkalde neurite udvækst og neurotoksicitet ved at drage fordel af den menneskelige neurale stamfader celle-afledte neuroner, en celle model tæt repræsenterer den menneskelige biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Erklæring: Føtale prøver blev modtaget fra Fødselsdefekter Research Laboratory ved University of Washington i Seattle gennem et væv distributionsprogram støttet af National Institute of Health (NIH). Fødselsdefekter Research Laboratory opnået passende skriftligt informeret samtykke fra forældrene og indkøb af væv blev overvåget af Den Institutionelle Review Board ved University of Washington. Alt arbejdet blev udført med godkendelse af Human Subject Research Office ved University of Miami8.
1. Isolation og kultur af menneskelige neurale stamceller (hNPC' er)
- Placer hjernevævet i en 100 mm petriskål og fjern forsigtigt meninges ved hjælp af brystbanker.
- Hjernevævet overføres til et 50 ml konisk rør og vaskes to gange med 20 ml PBS ved forsigtigt at vende røret.
- Hjernevævet inkuberes i et nyt konisk rør på 50 ml ved nedsænkning af vævet i celle dissociationsopløsning (se materialetabel)og DNase I (10 U/ml) i 10 min. ved 37 °C.
- Der tilsættes 5 ml neuronal Table of Materialscellekulturmedium (se materialetabel) til det hjernevæv, der indeholder rør, og dissocier neurosfærerne mekanisk ved at triturere 20 til 30 gange gennem en 1000 μL pipetspids for at lave en encellede suspension.
- Celleruspensionen filtreres gennem en cellesyr på 70 μm for at fjerne celleklynger.
- Encellesuspensionen sås i en t-25-kolbe med 5-10 ml neuronal cellekulturmedium suppleret med komponenter, der er beskrevet i tabel 1.
- Heparinopløsningen steriliseres ved filtrering gennem et 0,2 μm filter. B-27 supplement uden Vitamin A er en serum-fri supplement til dyrkning af neurale stamceller og stamceller, uden at fremkalde differentiering.
BEMÆRK: Humane neurale progenitor celler (hNPC'er) er isoleret fra menneskelige føtale hjerne indsamlet fra aborteret foster. Efter 7-10 dage i kultur danner neurale stamceller (NSCs) fritsvævende neurosfærekolonikolonier, mens andre celletyper forbliver i suspension som enkelte celler eller bindes til bunden af kolben. De isolerede hNPC'er kan dyrkes som neurosfærer i suspension i fleremåneder 8,16,17.
- Heparinopløsningen steriliseres ved filtrering gennem et 0,2 μm filter. B-27 supplement uden Vitamin A er en serum-fri supplement til dyrkning af neurale stamceller og stamceller, uden at fremkalde differentiering.
| Beløb | Komponent |
| 100 μL | EGF (20 ng/ml) |
| 100 μL | FGF (10 ng/ml) |
| 2 ml | B-27, Minus vitamin A (50X) |
| 1 ml | L-alanyl-L-glutamin (100X) (se tabel over materialer) |
| 4 μL | Heparin (2 μg/ml) |
| 96,8 ml | Neuronal cellekulturmedium (se tabel over materialer) |
Tabel 1. Komponenter, der kræves til fremstilling af 100 ml kulturmedier
2. Passaging hNPC'erne
- Saml de medier, der indeholder de flydende kugler, store og små neurosfærer, og overføre dem til en 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: På grund af ukendte årsager varierer timingen for opdeling af neurosfærerne fra 7 dage op til 30 dage. Men generelt, neurosfærer skal passages, når de når en diameter større end 700-900 μm. Dette er, når midten af neurosfæren begynder at blive mørkere, hvilket betragtes som et tegn på en høj celledød18. - Spin neurosfærer ned ved centrifugering på 300-400 x g i 3 min.
- Supernatanten aspirerer forsigtigt, og kuglerne nedsænkes derefter i 500 μL optøet celleremociationsreagens (se materialetabel).
- Der foretages aliquots af cellereociationsreagens ved tilsætning af 500 μL pr. 1,5 ml mikrorør og opbevares ved -20 °C. For at undgå at miste enzymaktivitet optøs celleafledningsreagens ved at holde på RT eller varme i 5 min. i et 37 °C vand-/perlebad.
- Afhængigt af kuglernes tæthed og størrelse skal de neddykkede kugler inkuberes ved 37 °C i 5-15 min.
- Tilsæt 5-10 ml forvarmte kulturmedier til neurosfærer, der indeholder 50 ml konisk rør og centrifuge ved 300-400 x g i 5 min. til sediment neurosfærerne.
- Indsug supernatanten og pipette forsigtigt op og ned ved hjælp af en 1000 μL pipette i 2 ml kulturmedier, indtil alle neurosfærerne er i en enkelt cellesuspension.
BEMÆRK: Dissociationen bliver synlig for det blotte øje. Før dissociation, neurosfærer er i form af kugler. Efter nedsænkning i dissociationsreagens og ved pipettering op og ned, vil de blive enkelte celler.- Tæl cellerne og plade de enkelte celler, 2 til 3 millioner celler pr T-25 kolbe i 10 ml kultur medier.
- Fodre cellerne hver 3 dage ved at erstatte halvdelen af kulturmedierne.
- Afregne neurosfærer ved at læne kolben, så den er på sit nederste hjørne. Hold kolben i positionen i ca. 1-2 min, indtil neurosfæresedimentet. Derefter aspirere halvdelen af medierne forsigtigt ved at indsætte den serologiske pipetten i medierne over de afviklede neurosfærer. Dissocierede celler kan samles til at danne kugler efter 2 til 3 dage i kultur19.
3. Indefrysning af hNPC'erne
- Opklaring af cellefrysende medium ved at tilføje DMSO til kulturmediet til en endelig koncentration på 10 % (v/v) eller brug et kommercielt tilgængeligt kryopræserveringsmedium til følsomme celletyper (se materialetabel).
- Sortere store kugler ved at overføre medierne i en 50 ml konisk rør og lade kuglerne bosætte sig ved tyngdekraften. Fjern derefter og overfør de store neurosfærer til et nyt 50 ml konisk rør til passaging ved hjælp af en 200 eller 1000 μL pipetspids.
BEMÆRK: Neurosfærer med en diameter på over 900 μm betragtes som store, og dem med en diameter på mindre end 500 μm betragtes som små. - Drej de resterende neurosfærer ned ved centrifugering ved 300-400 x g i 3 min. Fjern forsigtigt supernatanten.
- Resuspend op til 100 kugler i 1 ml kryopræserveringsreagens og overfør det til en kryorør.
- Opbevares natten over ved -80 °C i en cellefrysningsbeholder (se materialetabel)og flyt det til flydende nitrogen næste dag til langtidsopbevaring.
BEMÆRK: Det er at foretrække at fryse små til mellemstore neurosfærer (under 900 μm i diameter) og undgå frysning af store neurosfærer (over 900 μm i diameter) eller enkelte celler. For at reducere celleskader under optøning af prøven skal cellerne være tæt ved at så de optøede neurosfærer i en lille T25-kolbe.
4. Differentiering og behandling af hNPC'er
BEMÆRK: For at fremkalde differentiering opdeles neurosfærer i enkelte celler, tælles og derefter seedes på coatede plader i 5 dage. Derefter behandles differentierede celler i 24 timer med testforbindelser før immunsårende og fluorescenskvantificering.
- Belægning
- Der tilsættes 200 μL poly-L-lysin (PLL) pr. brønd af 4-brønds glaskammerdias (140 μL pr. brønd af 8-brønds kammerdias).
- Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (RT).
- Vask 3x med PBS.
- Lad det tørre på RT (i ca. 30 min).
- Der tilsættes 150 μL laminin (50 μg/ml) pr. brønd af 4-brønds glaskammerdias (120 μL pr. brønd 8-brønds kammerdias).
- Inkuberes i 2 timer ved 37 °C.
- Vask 3x med PBS.
BEMÆRK: Belagte kammerdias kan opbevares ved 4 °C i 1 måned.
- Plating cellerne
- Tæl og plade 80.000 enkeltcelle neurosfærer (neurosfærer i en enkelt celle suspension) pr brønd af 4-brønds kammer dias (70.000 celler pr brønd af 8-brønd kammer dias).
- Der tilsættes 500 μL differentieringsmedier pr. brønd på 4-brønds kammerdias (250 μL-medier pr. brønd med 8-brønds kammerdias).
- For at gøre differentieringsmedierne først, tilsættes følgende komponenter i tabel 2 til en steril engangsbeholder for at gøre de neurale inducerende medier (NIM).
- Tilsæt følgende ingredienser i tabel 3 til 48,5 ml NIM i det foregående trin for at gøre differentieringsmediet.
- Inkuberes i 5 dage ved 37 °C.
- Efter 5 dage behandles cellerne i 24 timer ved at erstatte halvdelen af mediet i hver brønd med friske medier blandet med den ønskede koncentration af testforbindelser, herunder passende kontroller.
| Beløb | Komponent |
| 49 ml | DMEM/F-12 |
| 0,5 ml | N2 tillæg (100X) |
| 0,5 ml | MEM ikke-essentielle aminosyrer (100X) |
| 2 μL | Heparin (2 μg/ml) (Stock Conc. er 50 mg/ml) |
Tabel 2. Komponenter, der er nødvendige for fremstilling af 50 ml NIM
| Beløb | Komponent |
| 1 ml | B-27 (50X) |
| 500 μL | Antimykotisk (100x) |
| 5 μL | Retinsyre (0,1 μM) |
| 50 μL | GDNF (10 μg/ml) |
| 50 μL | BDNF (10 μg/ml) |
| 5 μL | Ascorbinsyre (0,2 μg/ml) (Stock Conc. er 2 mg/ml) BEMÆRK: Anbefales at blive friske. |
| 48,5 ml | Nim |
Tabel 3. Komponenter, der kræves til fremstilling af 50 ml differentieringsmedier
5. Immunocytokemi (ICC)
BEMÆRK: Cellerne er fastgjort med 4% formaldehyd. Permeabilisering og blokering udføres derefter for at forbedre penetration og forhindre uspecifikke binding af antistoffer. Cellerne inkuberes derefter med primære antistoffer natten over. Efterfølgende inkuberes cellerne med fluorescerende mærkede sekundære antistoffer. Endelig, efter at have brugt DAPI til at plette kernen, er kammerdias monteret.
- Fiksering
- Opsug forsigtigt mediet i hver brønd.
- Der tilsættes 500 μL formaldehyd pr. brønd af 4-brønds kammerdias (250 μL pr. brønd af 8-brønds kammerdias).
- Inkubere i 15 min på RT.
- Vask forsigtigt 2x med 500 μL PBS.
BEMÆRK: Efter fiksering kan der ved at efterlade 1 ml PBS i hver brønd opbevares 4 °C i op til 3 måneder.
- Cellepermeabilisering og blokering
- Tilsæt følgende komponenter i tabel 4 til en steril engangsbeholder for at danne antistofbufferen (Ab).
- I tabel 5 blandes følgende ingredienser med Ab-bufferen, der er fremstillet i det foregående trin, for at gøre cellepermeabiliserings- og blokeringsopløsningen.
- Der tilsættes 500 μL pr. brønd med 4-brønds kammerdias, og inkuber i 1 time ved RT.
BEMÆRK: Ab buffer kan opbevares ved 4 °C.
| Beløb | Komponent |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3,6 g | L-lysin (100 mM) |
| kr. | Natriumazid (4%) |
| 200 ml | Destilleret vand. BEMÆRK: De nødvendige komponenter opløses i første omgang i 150 ml vand, og juster derefter til 200 ml. |
Tabel 4. Komponenter, der er nødvendige for fremstilling af 200 ml antistofbuffer
| Beløb | Komponent |
| 600 μL | 20% Gedeserum |
| 6 μL | 0,2% Triton-X100 |
| 2394 μL | Antistofbuffer. BEMÆRK: De nødvendige komponenter opløses i første omgang i 2 ml Ab-buffer, og derefter justeres til pH 7,4. Derefter tilsættes mere Ab buffer til at justere til det endelige volumen på 3 ml og filter steriliseres. |
Tabel 5. Komponenter, der kræves til fremstilling af 3 ml cellepermeabiliserings- og blokeringsopløsning
- Farvning
- 2x med 500 μL PBS vaskes.
- Der tilsættes det fortyndede primære antistof, anti-β-tubulin III (1:200), og inkuber natten over ved 4 °C (200 μL pr. brønd af 4-brønds kammerdias). Det primære antistof fortyndes i PBS.
- Vask 2x med PBS.
- Der tilsættes fortyndet, i PBS, fluorescerende mærket sekundært antistof, Alexa Fluor 488 (1:500), og inkuber i 2 timer ved RT på et sted, der er beskyttet mod lys (250 μL pr. brønd af 4-brønds kammer) dias
- Vask 2x med PBS.
- Der tilsættes fortyndet DAPI (300 nM-koncentration) i PBS og inkuber i 5 min. ved RT på et sted, der er beskyttet mod lys (300 μL pr. brønd med 4-brønds kammerdias).
- Vask 3x med PBS.
- Monter kammerdiasene ved hjælp af følgende instruktioner.
- Tag kammerets glidebane ad ved at bryde udbryderfanerne og fjerne pakningen og basen.
- Der tilsættes en dråbe monteringsopløsning (se materialetabel)pr. brønd på 4-brønds kammerdias. Brug derefter et coverdias til at dække hele diaset.
- Ved hjælp af en pincet og i en vinkel skal du placere den ene side af dækslet mod glidetrækket, mens du kommer i kontakt med væskedråbens yderkant.
- Hæld forsigtigt dækslerne på monteringsopløsningen, når den sænkes på plads. Undgå oprettelsen af bobler. Tag en pipettespids og tryk den ned på dækslet. Boblerne vil flytte til siden.
BEMÆRK: Bobledannelse er uundgåelig til tider. Hvis det sker, billede omkring dem, så længe der er et par stykker. - Følg producentens anvisninger for hærdningstid. Undgå at bruge ikke-klikkende monteringsopløsninger på grund af håndteringsbesvær under billedbehandling. Ellers er det nødvendigt at bruge en passende overtrækstætningsmiddel på kanterne for at forhindre, at overtræksklippen glider under billeddannelse.
- For at forsegle coverslæben skal du bruge neglelak og lave en lille linje på kanten af dækslet slip. Lad neglelak tørre i ca 2 min.
6. Billederhvervelse, neurite udvækst og fluorescensintensitet kvantificering
BEMÆRK: Efter farvning skal du bruge et konforosset mikroskop med en 20x-målsætning og en billedstørrelse på 1024 x 1024 pixel for at hente billederne af de behandlede celler. Tag billede mindst fra to felter pr biologiske replikere pr betingelse. Brug derefter Fiji billedanalyse software (ImageJ 1.51u) for kvantificering af neurite længde. Kort, måle længden af den længste neurite for hver neuron og efter gennemsnit af værdierne pr behandling, skal du bruge elevernes t test for uafhængige grupper til at sammenligne midlerne mellem eksperimentelle grupper og kontrolgruppe.
BEMÆRK: Flere kommercielle (Imaris, Volocity, Amira) og open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) billedbehandling programmer er tilgængelige. Blandt disse programmer, imageJ er blevet det foretrukne værktøj til biologisk billedanalyse20,21. ImageJ-portalen på https://imagej.net/Introduction er en nyttig informationskilde, der giver en grundig beskrivelse af ImageJ's grundlæggende og indbyggede funktioner, herunder billedbehandling, colocalization, deconvolution, registrering, segmentering, sporing og visualisering.
- Måling neuronal udvækst med Fiji billedanalyse software
- Som vist i figur 1åbnes billedet enten ved at trække og slippe det på Fiji-software eller ved at vælge Fil | Åbn.
- Vælg Analysér | Værktøj | ROI manager, og højreklik derefter på 5th ikon i værktøjslinjen Straight og skifte til frihånd linje. Du kan også dobbeltklikke på det samme ikon for at ændre linjebredden til 10, og derefter spore den længste neurite, der begynder i nærheden af cellekroppen og strækker sig til spidsen af neurite.
- Tryk på Ctrl + T & derefter F for at føje målingen til ROI Manager og fremhæve den målte neuron. Marker alle tal i investeringsafkastet, klik på Målpunkt, vælg alle beregnede længder, og kopier/indsæt i et regneark.
- Måling af fluorescensintensiteten af mærkede celler med Fiji-billedanalysesoftware
- Som illustreret i figur 2, efter åbning af billedet, skal du klikke på 4th ikon i værktøjslinjen Frihånd valg. Tegn cellens form.
- Vælg Analysér | Angiv målinger, og vælg for følgende værdier: Område, Integreret tæthed , Middelgrå værdi | Analyser | Målpunkt (en pop op-boks med en stak værdier åbnes).
- Vælg et område ud for cellen som baggrund (størrelse er ikke vigtig), og vælg derefter Analysér | Mål. Markere alle målte data, og kopier/sæt ind i et regneark.
BEMÆRK: Integreret Tæthed (IntDen) er det element, der bruges til at bestemme fluorescerende intensiteter. I denne undersøgelse fluorescerende intensitet af målet molekyle måles til i første omgang at analysere dens fordeling i cellen og efterfølgende kvantificere overflod af målet molekyle under forskellige behandlinger. Derfor vil effektiviteten af behandlinger blive målt og sammenlignet med kontrol.
7. Vurdering af neurotoksicitet
BEMÆRK: Testforbindelsernes cytotoksicitet vurderes i 384-brøndplader Table of Materials(se materialetabel) ved hjælp af en selvlysende celles levedygtighedsanalyse (se materialetabel). HNPC'erne fremstilles efter samme metode, bortset fra mindre ændringer, der er beskrevet i afsnittet "Differentiering og behandling af hNPC'er". Efterfølgende måles et selvlysende signal, der genereres af selvlysende cellenætsbarhedsanalyse ved hjælp af en mikropladelæser. Det selvlysende signal er proportionalt med den cellulære ATP-koncentration, som i sig selv er direkte proportional med antallet af levedygtige celler til stede i hver brønd.
- Belægning
- Der tilsættes 30 μL poly-L-lysin (PLL) pr. brønd på 384-brøndspladen.
- Inkuber i 1 time på RT.
- Vask 2x med PBS.
- Lad det tørre på RT (i ca. 30 min).
- Der tilsættes 30 μL laminin (50 μg/ml) pr. brønd på 384 brøndplade.
- Inkuberes i 2 timer ved 37 °C.
- Vask 2x med PBS.
BEMÆRK: Coatede 384-brøndplader kan opbevares ved 4 °C i 1 måned.
- Plating cellerne
- Tæl og plade 20.000 encellede neurosfærer pr. brønd på 384-brøndsplade i 25 μL differentieringsmedier.
- Inkuberes i 5 dage ved 37 °C.
- Efter 5 dage behandles cellerne i 24 timer ved hjælp af testforbindelser, der er fremstillet ved 6x den endelige ønskede koncentration i 5 μL volumen (for at gøre det endelige volumen på 30 μL pr. brønd).
- Analyse af cellernes levedygtighed
- Der tilsættes 30 μL selvlysende cellers levedygtighedsanalysereagens pr. brønd på 384-brøndsplade.
BEMÆRK: Der tilsættes et volumen af selvlysende cellers levedygtighedsreagens svarende til det volumen, der er til stede i hver brønd. Optø det selvlysende cellers levedygtighedsreagens reagens og ligevægt til RT før brug. - Ryst på en pladeshaker i 2 minutter (for at blande og fremkalde cellelyse).
- Drej blandingen ned ved centrifugering ved 300-400 x g i 30 s.
- Inkuber 384-brøndpladen i 10 min. ved RT på et sted, der er beskyttet mod lys (for at stabilisere det selvlysende signal).
- Optag luminescens med en mikropladelæser.
BEMÆRK: Brug passende kontroller til levedygtighedsanalysen, herunder Velcade (ved en endelig koncentration på 10 μM) som positiv og HBSS indeholdende DMSO (med en slutkoncentration på 0,1 % eller 0,2 %) som negativ kontrol.
- Der tilsættes 30 μL selvlysende cellers levedygtighedsanalysereagens pr. brønd på 384-brøndsplade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol , der præsenteres i manuskriptet , er med succes blevet anvendt i to nyligt offentliggjortedokumenter 22,23. Figur 3 viser brugen af hNPC'er-afledte neuroner til at undersøge effekten af HDAC-hæmmere som epigenetiske forbindelser på forlængelsen af neurites som en markør for neurite udvækst og efterfølgende neurogen evne af små molekyleforbindelser.
Endvidere vurderes neurotoksiciteten af testede forbindelser (HDAC-hæmmere) i figur 4 også ved samtidig at differentiere hNPC'erne i 384-brøndsplader, der viser potentialet i den præsenterede cellemodel (hNPC'er) til neurotoksicitetsvurdering og evnen til at skalere op for at teste neurotoksicitet for et højere antal forbindelser.
I et andet papir af Sartor et al. (Figur 5), måling af neuronal celle fluorescens intensitet til at kvantificere den overflod af H4K5ac, som et histonemærke, efter behandling af neuroner differentieret fra hNPCs med epigenetiske modifikator forbindelser er med succes påvist23. Som illustreret i figur 6, i et ikke-offentliggjort værk, er protokollen desuden blevet brugt til at visualisere et præsynaptisk protein, synaptofysin, for at kontrollere den mulige synaptogene effekt af små molekyleforbindelser.
Figur 1: Trinvis arbejdsgang, der illustrerer en metode til måling af neuronal udvækst med Fiji-billedanalysesoftware. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Trinvis arbejdsgang, der illustrerer en metode til kvantificering af neuronale cellers fluorescensintensitet med Fiji-billedanalysesoftware. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Neurite udvækstanalyse med små molekyle epigenetiske forbindelser.
(A) Repræsentative fluorescerende billeder (20x forstørrelse) til behandling af hNPC'er-afledte neuroner med hydroxamic-baserede HDAC-hæmmere. Humane neurale progenitor celler er differentieret i 5 dage; derefter behandlet for 24 timer med 0,1% DMSO (som kontrol), og Trichostatin A, JNJ26481585, SB939 og PCI24781 (som testforbindelser). Derefter immunsintainer udføres med neuronal-specifikke β-tubulin III antistof (grøn) til at visualisere neuronale processer og kvantificere neurite længder og DAPI (blå) til at visualisere celle kerner. (B) Statistisk analyse af neuritlængde i forskellige grupper. Som afbildet, alle testforbindelser kan fremkalde neurite udvækst. Kvantitativ analyse af neurite længde sker ved hjælp af ImageJ software. Fejllinjer repræsenterer SEM. p < 0.001, **** p < 0.0001. Dette tal er blevet ændret fra Bagheri et al.22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Neurotoksicitetsvurdering ved hjælp af selvlysende celledygtighedsanalyse.
hNPC'er er seedet og differentieret til neuroner i 384-brøndpladen efter samme metode, der anvendes til neurite outgrowth-analyse. Derefter måles testforbindelsernes virkning på cellernes levedygtighed efter 24 timers eksponering. Som vist er der ingen signifikant toksicitet ved behandlinger. Envejs ANOVA bruges til dataanalyse, og en p-værdi < 0,05 betragtes som statistisk signifikant. Dette tal er blevet ændret fra Bagheri et al.22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: RGFP966 øger H4K5ac i neuroner differentieret fra menneskelige neurale stamceller.
(A) Repræsentativ immunfluorescens farvning af β tubulin, DAPI, og H4K5ac efter behandling med DMSO, RGFP966, eller RGFP966 + JQ1 i hNPC'er-afledte neuroner. (B) Kvantificering af fluorescensintensiteten på H4K5ac efter behandling med DMSO, RGFP966 eller RGFP966 + JQ1. Fejllinjer repræsenterer SEM. p < 0.0001. Dette tal er blevet ændret fra Sartor et al.23. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentativ immunfluorescensfarvning af Synaptophysin (rød) for at visualisere synaptiske terminaler, β tubulin (grøn) for at visualisere neuronale processer og DAPI (blå) til at visualisere cellekerner efter behandling med DMSO (som kontrol) og SB939 (som testforbindelse) i hNPC'er-afledte neuroner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er en af de få offentliggjorte papirer, der beskriver testen for neurite længde ved behandling med testforbindelser. Desuden beskriver vi, hvordan man bruger hNPC'er til en neurite outgrowth assay og neurotoxicity vurdering. Ved at udnytte denne neurite outgrowth assay og neurotoxicity vurdering på hNPCs-afledte neuroner, det neurogene potentiale af en kategori af epigenetiske små-molekyle forbindelser, HDAC hæmmere, i inducerende neurite udvækst er påvist22. Endvidere, i et andet papir fremlagt af Sartor et al., denne protokol bruges til at kvantificere fluorescensintensiteten af H4K5ac, en histon protein, ved behandling med flere epigenetiske modifikator forbindelser23.
Kognitiv funktion er afhængig af korrekt ledninger og funktionelle forbindelser inden for neuronal kredsløb. Detaljeret og konsekvent kvantificering af forskellige aspekter af neuronal morfologi som en fænotypisk screening tilgang er afgørende for at opnå pålidelig indsigt i de underliggende veje, der fører til hjernesygdomme lige fra neurodevelopmental til psykiatriske lidelser. Fænotypisk screening betragtes som en særlig effektiv tilgang til at udforske små-molekyle forbindelser som formodede stof kandidater til at modulere en cellulær fænotype. I denne tilgang undersøges alle cellekomponenter og veje i stedet for kun at afhøre et enkelt mål24.
Neuronal morfologi, herunder form, struktur, og tilslutningsmuligheder anses for at være centrale elementer i neuronal funktion. Genetiske forstyrrelser, der ændrer morfologien af neuroner eller synaptisk protein lokalisering og niveau kunne især bidrage til analysen af sygdomsskabende mutationer. Derfor er der behov for pålidelige metoder til at vurdere virkningen af forstyrrelser på neuronal morfologi25.
HNPC'erne er isoleret fra den embryonale pattedyrhjerne, som efterfølgende dyrkes in vitro i tilstedeværelse af mitogener. Disse celler består af neurosfærer, der er karakteriseret som flydende cellulære aggregater består af neurale stamceller og radiale gliaceller. HNPC'erne giver et ønskeligt modelsystem for nervesystemets funktion og udvikling ved at bevare deres differentieringspotentiale ved at producere forskellige neuraleslægter 7,8,9. Neurite antal, intensitet, længde og bredde sammen med synaptiske egenskaber, herunder præ- og post-synaptiske proteiner ændringer er blandt neurite og synaptiske ændringer, der kunne være pålideligt og effektivt måles ved hjælp af den præsenterede metode heri.
På grund af en stigning i forekomsten af neurologiske lidelser såsom opmærksomhed underskud hyperaktivitet lidelse og autisme, neurotoksicitet potentiale af miljøkemikalier på børn er fortsat en offentlig bekymring15,26. Derfor undersøges også anvendeligheden af hNPC'er-afledte neuroner for pålidelig og effektiv neurotoksicitetsvurdering. Som det fremgår af figur 4, kunne hNPC'er tilpasses og skaleres op til neurotoksicitetsvurdering i 384-brøndplader.
Neurotoksicitetsvurdering som ansøgning om den indførte cellemodel er mulig ved enten at differentiere neurosfærerne i neuroner, før de plating i 384-brøndplader eller differentiere cellerne, mens neurosfærerne er belagt i 384-brøndplader som enkelte celler. I sidstnævnte tilgang, høj præcision pipettering færdigheder er nødvendige for plating det nøjagtige antal neurosfærer, der er opdelt i enkelte celler og også for følgende behandlingsprocedurer med differentiering-inducerende medium. I betragtning af pipettering færdigheder, der kræves, differentiering før plating anbefales at opnå mere reproducerbare resultater. Desuden kan massecellesortering ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) også potentielt anvendes til nøjagtigt at adskille det krævede antal celler, der omgår behovet for højpræcisions pipetteringsfærdigheder.
Det tilrådes at starte neurite outgrowth-analysen ved neurotoksicitetsvurdering for at undgå gentagne neurite outgrowth-analyser med forskellige doser af samme forbindelse for at nå frem til ugiftig koncentration. Derfor, kombinere en neurotoksicitet vurdering ved at udnytte den selvlysende celle levedygtighed assay mod en dosis-respons kurve af testforbindelser vil resultere i at finde den rigtige dosis med minimal indsats. Den selvlysende celle levedygtighed assay er en meget følsom metode til at bestemme antallet af levedygtige celler i en cellekultur. Metoden virker på kvantificering af ATP til stede i kulturen som en indikator for cellulære stofskifte. Tilsætnings-, mix- og måleformatet for analysen giver en enkel og hurtig tilgang til at kontrollere, om testforbindelsernes cytotoksicitet er levedygtige.
Der er nogle begrænsninger for den præsenterede protokol som følger. På grund af tilgængelighed og iboende variabilitet er brugen af fysiologisk relevante primærceller begrænsettil 25. hNPC'er har en langsom spredningshastighed, hvilket kan begrænse dens udnyttelse. Manuel storstilet analyse af fluorescerende billeder af neuroner er tidskrævende og modtagelige for eksperimentator bias. hNPC'er kan betragtes som unge neurale celler, der ikke repræsenterer aldersrelaterede epigenetiske modifikationer akkumuleres i celler i hele en persons liv. Som neurodegenerative lidelser forekommer hos ældre personer, hNPC'er kan mangle tilstrækkelig fysiologisk relevans at være en passende model for sent debut betingelser.
Selv om dyremodeller og cellelinjer har været værdifulde til at tyde molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomme, har de vist begrænsninger i oversættelsen af fund til human behandling27,28,29,30. Menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC'er) og menneskelige embryonale stamceller (hESC'er) sammen med hNPC'er betragtes som bedre in vitro cellemodeller, der opsummerer menneskets fysiologi. Derfor kan hiPC'er- og hESC-afledte neuroner også potentielt anvendes som to alternative cellekilder til neurite outgrowth-assay og neurotoksicitetsvurdering ved hjælp af den protokol , der er fremlagtheri 1,31.
Afslutningsvis vil jeg sige, at høj translationel potentiel og fysiologisk relevans af hNPC'er som primær humancellemodel giver en værdifuld anvendelse i neurite outgrowth-relaterede lægemiddelopdagelsesscreeninger og neurotoksicitetsvurdering, der opvejer de tidligere nævnte begrænsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere angiver ingen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af NIMAD forskningstilskud (940714) tildelt MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
