Summary
הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה לneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח של תרכובות מולקולה קטנה.
Abstract
Neurite מוצלח הערכה ורעילות נוירולוגיה הם שני מחקרים עיקריים שניתן לבצע באמצעות השיטה המוצגת להלן. פרוטוקול זה מספק ניתוח אמין של מורפולוגיה עצבית יחד עם מדידות כמותיים של שינויים על אורך neurite ולוקליזציה חלבון סינפטית ושפע על הטיפול עם תרכובות מולקולה קטנה. בנוסף ליישום של השיטה המוצגת במחקרים neurite מוצלח, הערכה רעילות נוירו ניתן לבצע כדי להעריך, להבחין ולדרג תרכובות כימיות מסחריות מבוסס על ההשפעה הפוטנציאלית שלהם התפתחותית התפתחותיות.
למרות קווי התא הם כיום בשימוש נרחב ההקרנה מורכבים בחני מדעי המוח, הם לעתים קרובות שונים גנטית ופנופנטיות בדרך כלל ממקור הרקמה שלהם. תאים ראשוניים, מצד שני, לשמור על סמנים חשובים פונקציות נצפתה ב vivo. לכן, בשל פוטנציאל התרגום והרלוונטיות הפיזיולוגית שתאים אלה יכולים להציע שיטת neurite מוצלח והערכה של רעילות עצבית יכולה להועיל במידה ניכרת משימוש בתאים של מחולל קדמון אנושי (hnpcs) כמודל התא הראשי של האדם.
השיטה המוצגת במסמך זה יכול להיות מנוצל על המסך עבור היכולת של תרכובות כדי לגרום neurite מוצלח ו רעילות נוירורעלים על ידי ניצול של הנוירונים האדם הגוף האנושי הנגזר, מודל התא המייצג היטב את הביולוגיה האנושית.
Introduction
Neurite צמיחה היא תהליך בסיסי להיווצרות הרשת העצבית והתחדשות העצב1,2. בעקבות פציעה, neurite מוצלח ממלאת תפקיד מרכזי בהתחדשות של מערכת העצבים. Neurite מוצלח הוא גם מרכיב חשוב של איתות החילוץ בגרימת פעילויות רגנרטיבית נוירואליות כדי לשפר את התוצאות עבור הפרעות ניווניות ופציעה עצבית3,4,5,6.
על-ידי שמירה על פוטנציאל הבידול שלהם בהפקת לשונות עצבית שונים, תאי האדם העצביים האנושיים (hnpcs) יכולים לספק מערכת מודל למחקרים של פונקציית מערכת העצבים המרכזית (cn) ופיתוח7,8,9. פוטנציאל translational גבוהה ורלוונטיות פיזיולוגית של hNPCs כמודל הראשי של התא האנושי להציע יתרון ניכר neurite outgrowth הקשורות לגילוי סמים הקרנות. עם זאת, התחזוקה ושינוי קנה המידה של דגמי התאים הראשיים לקבלת תפוקה גבוהה יכול לגזול זמן רב ועבודה מוגברת של10,11,12,13.
בנוסף ליישום של השיטה המוצגת במחקרים neurite מוצלח, הערכה רעילות נוירו היא יישום אחר באמצעות נוירונים hnpc נגזר. יש אלפי תרכובות כימיות מסחריות שאינן נבדקות או בעלי פוטנציאל מובן מאליו של רעילות עצבית. לכן, ניסויים יותר אמין ואפקטיבי ההקרנה כדי להעריך, להבחין, ודירוג התרכובות בהתבסס על הפוטנציאל שלהם לעורר רעילות נוירוהתפתחותית היא ביקוש גבוה14. הגידול בשכיחות ושכיחות של הפרעות נוירולוגיות יחד עם שפע של תרכובות נבדק בסביבה מחייבת פיתוח של ניסויים אמין יותר ויעיל כדי לזהות תרכובות סביבתיות מסוכנים שעלולים להוות רעילות נוירורעילה15.
השיטה המוצגת במסמך זה יכול להיות מנוצל על המסך עבור היכולת של תרכובות כדי לגרום neurite מוצלח ו רעילות עצביים על ידי ניצול של הנוירונים האדם הגוף האנושי הנגזר, מודל התא המייצג היטב את הביולוגיה האנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת האתיקה: דגימות עוברי התקבלו מן המעבדה ליקויי לידה מחקר באוניברסיטת וושינגטון בסיאטל באמצעות תוכנית הפצת רקמות נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH). המעבדה למומים מולדים המחקר השיג הסכמה מושכלת בכתב מידע מן ההורים ואת הרכש של רקמות היה פיקוח על ידי המועצה לסקירה מוסדית של אוניברסיטת וושינגטון. כל העבודה בוצעה באישור משרד המחקר האנושי באוניברסיטת מיאמי8.
1. בידוד ותרבות של תאים אנושיים מעשה עצבי (hNPCs)
- מניחים את רקמת המוח בצלחת פטרי 100 מ"מ ומסירים בזהירות את מכלי הקרום באמצעות מלקחיים.
- העבר את רקמת המוח לשפופרת חרוטית 50 mL ושטוף אותה פעמיים עם 20 מ ל של PBS באמצעות היפוך עדין של הצינורית.
- דגירה רקמת המוח בצינור 50 mL חדש על ידי שוקע יזוג את הרקמה בפתרון הדיסוציאציה של התא (ראה טבלת חומרים) ו dnase I (10 U/mL) עבור 10 דקות ב 37 ° c.
- הוסף 5 מ ל של התרבות התא העצבי בינונית (ראה טבלה של חומרים) לרקמת המוח המכיל צינור מכנית השעיית הנוירוספירות על ידי triturating 20 כדי 30 פעמים דרך הקצה 1000 μl pipet כדי לבצע השעיה תא יחיד.
- לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 יקרומטר כדי להסיר אשכולות תא.
- זרע ההשעיה תא יחיד בבקבוקון T-25 פרקו סיפק עם 5-10 mL של התרבות התאית בינונית של הגוף בתוספת רכיבים המפורטים בטבלה 1.
- מעקר את פתרון ההפרין באמצעות סינון באמצעות פילטר 0.2 יקרומטר. תוספת B-27 ללא ויטמין A הוא תוסף ללא סרום לטיפוח ושלתי עצביים ותאי גזע, ללא גרימת בידול.
הערה: מבני אדם בתאי הגוף (hNPCs) מבודדים ממוח עוברי אדם שנאסף מעובר בוטלה. בעקבות 7 – 10 ימים בתרבות, תאי גזע עצביים (NSCs) טופס חינם צף מושבות נוירוספירה, בעוד סוגי תאים אחרים נשארים ההשעיה כמו תאים בודדים או לצרף לחלק התחתון של הבקבוקון. Hnpcs מבודדים יכול להיות תרבותי כמו נוירוספירות ההשעיה במשך כמה חודשים8,16,17.
- מעקר את פתרון ההפרין באמצעות סינון באמצעות פילטר 0.2 יקרומטר. תוספת B-27 ללא ויטמין A הוא תוסף ללא סרום לטיפוח ושלתי עצביים ותאי גזע, ללא גרימת בידול.
| כמות | רכיב |
| 100 מיקרומטר | EGF (20 ng/mL) |
| 100 מיקרומטר | FGF (10 ng/mL) |
| 2 מ ל | B-27, מינוס ויטמין A (50X) |
| 1 מ ל | L-alanyl-ל-גלוטמין (100X) (ראה טבלת חומרים) |
| 4 מיקרומטר | הפארין (2 μg/mL) |
| 96.8 מ ל | מדיום תרבות התאים העצבית (ראה טבלת חומרים) |
. שולחן 1 רכיבים הדרושים לעשיית 100 מ ל של מדיית תרבות
2. הפסאת ה-hNPCs
- לאסוף את המדיה המכילה את הספירות צף, נוירוספירות גדולות וקטנות, ולהעביר אותם לשפופרת חרוט 50 mL.
הערה: בשל סיבות לא ידועות, העיתוי לפיצול הנוירוספירות הוא משתנה מ -7 ימים עד 30 יום. עם זאת, בדרך כלל, נוירוספירות צריך להיות מיושן כאשר הם מגיעים קוטר גדול מ 700-900 μm. זה כאשר מרכז הנוירוספירה מתחיל להחשיך, אשר נחשב כסימן לשיעור גבוה של מוות תאים18. - לסובב את הנוירוספירות למטה על ידי צנטריפוגה ב 300-400 x g עבור 3 דקות.
- ולאחר מכן להטביע את הספירות ב-500 μL של הופשר מגיב לדיסוציאציה של תא (ראה טבלת חומרים).
- הפוך את השאביטים של מגיב הדיסוציאציה של התא על-ידי הוספת 500 μL לכל 1.5 mL והחנות ב-20 ° c. כדי למנוע אובדן של פעילות האנזים, הפשרת הדיסוציאציה של התא מגיב על ידי החזקת RT או חם עבור 5 דקות ב 37 ° צלזיוס מים/חרוז אמבטיה.
- בהתאם לצפיפות ולגודל של הספירות, מודפפת את הספירות השקועים ב-37 ° c עבור 5-15 דקות.
- הוסף 5-10 mL של מדיית התרבות טרום מחומם לנוירוספירות המכילות 50 mL שפופרת חרוט ו צנטריפוגה ב 300-400 x g עבור 5 דקות כדי משקע נוירוספירות.
- שימוש בצנרת הסופרנטית ובעדינות למעלה ולמטה, באמצעות מ1000 μL, ב -2 מ ל של מדיית תרבות עד שכל הנוירוספירות נמצאות בהשעיה של תא אחד.
הערה: הדיסוציאציה תהיה גלויה לעין בלתי. לפני הדיסוציאציה, הנוירוספירות הן בצורת כדורים. לאחר מיזוג משנה של מגיב הדיסוציאציה על ידי ליטוף למעלה ולמטה, הם יהפכו לתאים בודדים.- לספור את התאים ואת צלחת התאים בודדים, 2 כדי 3,000,000 תאים לבקבוקון T-25 ב 10 מ ל של מדיה תרבותית.
- האכילו את התאים כל 3 ימים על ידי החלפת חצי מדיית התרבות.
- להסדיר את הנוירוספירות על ידי להישען את הבקבוקון כך שהוא בפינה התחתונה שלו. להחזיק את הבקבוקון בעמדה כ 1-2 דקות עד המשקע נוירוספירות. לאחר מכן, מחלק חצי מהתקשורת בעדינות על-ידי החדרת הצנרת הסרוולוגית באמצעי התקשורת שמעל הנוירוספירות היוחסו. תאים המונתק יכולים לצבור כדי ליצור כדורים לאחר 2 עד 3 ימים בתרבות19.
3. הקפאת הhnpcs
- הכן את התא הקפאת המדיום על-ידי הוספת DMSO למדיית התרבות לריכוז סופי של 10% (v/v) או להשתמש באמצעי הקפאה מסחרית זמין עבור סוגי תאים רגישים (ראה טבלת חומרים).
- למיין את התחומים הגדולים על ידי העברת התקשורת לתוך שפופרת חרוט 50 mL ולתת הספירות להתיישב על ידי כוח הכבידה. לאחר מכן להסיר ולהעביר את הנוירוספירות גדול לתוך צינור 50 mL החדש של המעבר עבור passaging באמצעות 200 או 1000 μL pipet טיפ.
הערה: נוירוספירות עם קוטר גדול מ-900 יקרומטר נחשבים לגדולים ואלה עם קוטר קטן יותר מ-500 יקרומטר נחשבים לקטנים. - לסובב את הנוירוספירות שנותרו למטה על ידי צנטריפוגה ב 300-400 x g עבור 3 דקות. בזהירות להסיר את supernatant.
- השעיה מחדש עד 100 כדורים ב 1 מ ל של הקפאת ההזמנה מגיב ולהעביר אותו לצינור קריוגנית.
- אחסן לילה ב-80 ° c במיכל תא קפוא (ראה טבלת חומרים) והעבר אותו לחנקן נוזלי למחרת לאחסון לטווח ארוך.
הערה: עדיף להקפיא קטן כדי נוירוספירות בינוניות (נמוך מ 900 יקרומטר בקוטר) ולהימנע הקפאת כדורי נוירובגודל גדול (גדול מ 900 יקרומטר קוטר) או תאים בודדים. כדי להפחית את הנזק לתא במהלך הבעת המדגם, לשמור על התאים צפוף על ידי זריעת נוירוספירות מופשרים לתוך T25 בקבוקון קטן.
4. בידול וטיפול בהנחשבים
הערה: כדי לגרום לבידול, התחומים הנוירווניים מצטברים לתאים בודדים, נספרים ולאחר מכן הנזרע על צלחות מצופות במשך 5 ימים. לאחר מכן תאים הבדיל מטופלים עבור 24 שעות עם תרכובות הבדיקה לפני כתמים חיסוני וכימות הזריחה.
- ציפוי
- הוסף 200 μL של פולי-L-ליזין (PLL) לכל טוב של 4-באר שקופיות חדר הזכוכית (140 μL לכל טוב של 8-היטב שקופיות קאמרית).
- דגירה של 1 h בטמפרטורת החדר (RT).
- . שטוף את 3x עם הערוץ
- תנו לו להתייבש ב-RT (כ -30 דקות).
- הוסף 150 μL של למינציה (50 μg/mL) לכל טוב של 4-באר חדר זכוכית שקופיות (120 μL לכל טוב של 8-היטב שקופיות קאמרית).
- דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
- . שטוף את 3x עם הערוץ
הערה: ניתן לאחסן שקופיות קאמרית מצופות ב-4 ° צ' לחודש אחד.
- ציפוי התאים
- ספירה ולוחית 80,000 תא יחיד נוירוספירות (נוירוספירות בהשעיה של תא אחד) לכל טוב של 4-היטב שקופיות קאמרית (70,000 תאים לכל באר של 8-היטב שקופית קאמרית).
- הוסף 500 μL של בידול מדיה לכל טוב של 4-היטב שקופית קאמרית (250 μL מדיה לכל טוב של 8-היטב שקופיות קאמרית).
- כדי להפוך את מדיית הבידול לראשונה, הוסף את הרכיבים הבאים בטבלה 2 למיכל סטרילי, חד פעמי כדי להפוך את המדיה לגרימת מדיה (נים).
- הוסף את המרכיבים הבאים בטבלה 3 כדי 48.5 ML של נים עשה בשלב הקודם כדי להפוך את התקשורת בידול.
- דגירה של 5 ימים ב 37 ° c.
- לאחר 5 ימים, התייחס לתאים 24 שעות על-ידי החלפת חצי המדיה בכל באר עם מדיה טרייה המעורבת בריכוז הרצוי של תרכובות הבדיקה, כולל הפקדים המתאימים.
| כמות | רכיב |
| 49 מ ל | _ זיכרון/F-12 |
| 0.5 מ ל | N2 מוסף (100X) |
| 0.5 מ ל | חומצות אמינו בלתי חיוניות (100X) |
| 2 מיקרומטר | הפארין (2 μg/mL) (מניות Conc. is 50 mg/mL) |
שולחן 2. רכיבים הדרושים לעשיית 50 מ ל של נים
| כמות | רכיב |
| 1 מ ל | ב-27 (50X) |
| 500 מיקרומטר | אנטיביוטי-Antimycotic (100X) |
| 5 מיקרומטר | חומצה רטינואית (0.1 μM) |
| 50 מיקרומטר | GDNF (10 μg/mL) |
| 50 מיקרומטר | BDNF (10 μg/mL) |
| 5 מיקרומטר | חומצה אסקורבית (0.2 μg/mL) (מניות Conc. הוא 2 מ"ג/mL) הערה: מומלץ להיות טרי. |
| 48.5 מ ל | נים |
. שולחן 3 רכיבים הדרושים לעשיית 50 מ ל של בידול מדיה
5. אימונוציטוכימיה (ICC)
הערה: תאים מתוקנים עם 4% פורמלדהיד. החדירות והחסימה מתבצעים לאחר מכן כדי לשפר את החדירה ולמנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים. תאים מודבטים עם נוגדנים. ראשיים ללילה לאחר מכן, תאים מודבטים עם נוגדנים משניים המסומנים בעזרת פלואור. לבסוף, לאחר שימוש ב-DAPI כדי להכתים את הגרעין, שקופיות קאמרית נטענו.
- קיבעון
- מאחד בעדינות את התקשורת. בכל באר
- הוסף 500 μL של 4% פורמלדהיד לכל טוב של 4-היטב שקופיות קאמרית (250 μL לכל טוב של 8-היטב שקופיות קאמרית).
- דגירה עבור 15 דקות ב RT.
- שטוף בעדינות 2x עם 500 μL של PBS.
הערה: לאחר קיבעון, על ידי השארת 1 מ ל של PBS בכל טוב, שקופיות התרבות ניתן לאחסן ב 4 ° צ' עד 3 חודשים.
- חדירות התא וחסימתן
- הוסף את הרכיבים הבאים בטבלה 4 למכל סטרילי, חד פעמי כדי להפוך את הנוגדן (Ab) מאגר.
- ערבב את המרכיבים הבאים בטבלה 5 עם מאגר Ab שנעשו בשלב הקודם כדי להפוך את החדירות התא ואת הפתרון חסימה.
- הוסף 500 μL לכל טוב של 4-היטב שקופיות קאמרית ו-מודטה עבור 1 h ב RT.
הערה: ניתן לאחסן מאגר Ab ב-4 ° c.
| כמות | רכיב |
| 1.75 גרם | המשך (150 מ"מ) |
| 1.2 גרם | TrisBase (50 מ"מ) |
| 2 הוראות המשחק | היחידה לקשרי BSA |
| 3.6 גרם | L-ליזין (100 מ"מ) |
| מיכל שמונה | נתרן עזידה (4%) |
| 200 מ ל | . מים מזוקקים הערה: בתחילה פזר את הרכיבים הנדרשים ב-150 mL של מים, ולאחר מכן התאם ל 200 mL. |
. שולחן 4 רכיבים הדרושים לביצוע 200 mL של מאגר נוגדנים
| כמות | רכיב |
| 600 מיקרומטר | 20% סרום עז |
| 6 מיקרומטר | 0.2% טריטון-X100 |
| 2394 מיקרומטר | . מאגר נוגדנים הערה: בתחילה לפזר את הרכיבים הנדרשים 2 מ ל של מאגר Ab, ולאחר מכן להתאים ל-pH 7.4. לאחר מכן הוסף מאגר Ab יותר כדי לכוונן את הנפח הסופי של 3 מ"ל ו מסנן לעקר. |
. שולחן 5 רכיבים הנדרשים לביצוע 3 מ"ל של חדירות התא ופתרון חסימה
- צביעת
- שטוף 2x עם 500 μL של PBS.
- הוסף את הנוגדן העיקרי מדולל, anti-β-טובולין III (1:200), ו-דגירה לילה ב 4 ° צ' (200 μL לכל טוב של 4-היטב שקופיות קאמרית). לדלל את הנוגדן העיקרי ב-PBS.
- שטוף 2x עם PBS.
- להוסיף את מדולל, ב-PBS, התווית משנית המסומנים נוגדן, אלקסה Fluor 488 (1:500), ו דגירה עבור 2 h ב RT במקום מוגן מפני אור (250 μL לכל טוב של 4-היטב שקופיות קאמרית)
- שטוף 2x עם PBS.
- להוסיף את מדולל, ב-PBS, DAPI (300 nM ריכוז) ו דגירה עבור 5 דקות ב RT במקום מוגן מפני אור (300 μL לכל טוב של 4-היטב שקופיות קאמרית).
- . שטוף את 3x עם הערוץ
- הבהר את שקופיות החדר באמצעות ההנחיות הבאות.
- העבר את שקופית החדר על-ידי שבירת הכרטיסיות המתפרצת והסרת האטם והבסיס.
- הוסף טיפה אחת של הפתרון הגובר (ראה טבלת חומרים) לכל באר של 4 שקופיות קאמרית. לאחר מכן השתמש בשקופית כיסוי כדי לכסות את כל השקופית.
- באמצעות טוויצר ובזווית, הצב צד אחד של מכסה הכריכה כנגד השקופית תוך יצירת קשר עם הקצה החיצוני של טיפת הנוזל.
- עצה בקפידה את הכיסויים לפתרון ההרכבה בעת הנמכת המחשב למקומו. להימנע מיצירת בועות. קח טיפ של פיפטה. ותלחץ על המכסה . הבועות יזוזו לצד השני
הערה: היווצרות בועות הוא בלתי נמנע לעתים. אם זה קורה, התמונה סביבם כל עוד יש כמה. - בצע את הוראות היצרן לצורך ריפוי בזמן. הימנע משימוש בפתרונות הרכבה שאינם אשפרה בשל הקושי בטיפול במהלך הדימות. אחרת באמצעות איטום המתאים coverslip על הקצוות נדרש כדי למנוע את שמיכות הזזה במהלך הדמיה.
- כדי לאטום את העטיפה, להשתמש לק ציפורניים לעשות קו קטן על קצה שובר הכיסוי. תן את לק הציפורניים להתייבש בערך 2 דקות
6. רכישת תמונה, neurite מוצלח ואת עוצמת הקרינה הקוונפיקציה
הערה: בעקבות כתמים, להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם מטרה 20x ואת גודל התמונה של 1024 x 1024 פיקסלים כדי לרכוש את התמונות של התאים התייחסו. קח תמונה לפחות משני שדות לשכפול ביולוגי לכל תנאי. לאחר מכן השתמש בתוכנת ניתוח תמונה של פיג'י (ImageJ 1.51 u) לכימות האורך הneurite. בקצרה, למדוד את אורך הneurite הארוך ביותר עבור כל תא עצב ולאחר ממוצע הערכים לטיפול, להשתמש במבחן t של הסטודנט עבור קבוצות עצמאיות להשוות את האמצעים בין קבוצות ניסיוני וקבוצה בקרה.
הערה: מספר מסחרי (מאריס, Volocity, עמירה) וקוד פתוח (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, אייסי, KNIME) תוכניות עיבוד תמונה זמינים. בין התוכניות הללו, imagej הפך את כלי הבחירה לניתוח תמונה ביולוגית20,21. הפורטל ImageJ ב- https://imagej.net/Introduction הוא מקור שימושי למידע המספק תיאור מעמיק של הפונקציות הבסיסיות והמוכללות של imagej, כולל עיבוד תמונה, התאמה לשפות אחרות, פירוק, רישום, פילוח, מעקב והדמיה.
- מדידת הצמיחה העצבית עם תוכנת ניתוח התמונה של פיג'י
- כמו מומחש באיור 1, לפתוח את התמונה על ידי גרירה ושחרור על התוכנה פיג'י או על ידי בחירת קובץ | . פתח אתזה
- בחר באפשרות ' נתח ' | כלים | ROI managerולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית עלהסמל ה -5 בסרגל הכלים ישר ועבור לקו ביד חופשית. באופן אופציונלי, לחץ פעמיים על אותו סמל כדי לשנות את רוחב הקו ל -10, ולאחר מכן עקוב אחר הneurite הארוכה ביותר, החל מקרוב לגוף התא והארכת לקצה הneurite.
- הקש Ctrl + T & ולאחר מכן F כדי להוסיף את המדידה למנהל הROI ולהדגיש את תא העצב הנמדד. בחר את כל המספרים בהחזר, לחץ על מדידה, בחר את כל האורכים המחושבים והעתק/הדבק לתוך גיליון אלקטרוני.
- מדידת עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של תאים עם תוויות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה של פיג'י
- כפי שמודגם באיור 2, לאחר פתיחת התמונה, לחצו עלהסמל 4 בבחירות בסרגל הכלים ביד חופשית. צייר את צורת התא.
- בחר באפשרות ' נתח ' | קביעת מדידות ובחירה עבור הערכים הבאים: אזור, צפיפות משולבת, ממוצע ערך אפור | לנתח את | מדידה (תיבה מוקפצת עם ערימת ערכים נפתחת).
- בחר אזור ליד התא כרקע (גודל אינו חשוב) ולאחר מכן בחר באפשרות ' נתח ' | . מידה מדידה בחר את כל הנתונים שנמדדו והעתק/הדבק לתוך גיליון אלקטרוני.
הערה: דחיסות משולבת (IntDen) היא הפריט המשמש לקביעת עוצמות הפלורסנט. בעוצמת הפלורסנט למחקר זה של מולקולת היעד נמדד בתחילה לנתח את ההתפלגות שלה בתא, ולאחר מכן לכמת את השפע של מולקולת היעד תחת טיפולים שונים. כתוצאה מכך, האפקטיביות של הטיפולים יימדדו ויושוו בשליטה.
7. הערכת רעילות עצבית
הערה: לוחיות הרישוי של תרכובות הבדיקות מוערכות ב-384-לוחות הבאר (ראו טבלת חומרים) באמצעות שיטת הכדאיות התאית (ראה טבלת חומרים). HNPCs מוכנים בעקבות אותה שיטה, למעט שינויים קלים, המתוארים בסעיף "בידול וטיפול של hNPCs". לאחר מכן, אות זורח שנוצר על ידי הכדאיות האור הזורח היכולת נמדדת ניצול קורא מיקרופלייט. האות זורח הוא פרופורציונלי הריכוז ATP הסלולר אשר עצמו הוא פרופורציונלי באופן ישיר מספר תאים קיימא נוכח בכל טוב.
- ציפוי
- הוסף 30 μL של פולי-L-ליזין (PLL) לכל טוב של 384-ובכן צלחת.
- . מודטה בשביל 1 h ב-RT
- שטוף 2x עם PBS.
- תנו לו להתייבש ב-RT (כ -30 דקות).
- הוסף 30 μL של המילמינציה (50 μg/mL) לכל באר של 384-ובכן צלחת.
- דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
- שטוף 2x עם PBS.
הערה: מצופה 384-ובכן ניתן לאחסן צלחות ב -4 ° c במשך חודש אחד.
- ציפוי התאים
- הספירה ואת הלוח 20,000 תא יחיד נוירוספירות של מיטב הצלחת 384-באר ב 25 μL של בידול מדיה.
- דגירה של 5 ימים ב 37 ° c.
- לאחר 5 ימים, לטפל בתאים 24 שעות על ידי מבחן תרכובות שהוכנו על 6x את הריכוז הרצוי הסופי בנפח 5 μL (כדי להפוך את הנפח הסופי של 30 μL לכל טוב).
- שיטת הכדאיות של התא
- הוסף 30 μL של שיטת הכדאיות של התא זורח בהתאם לטוב של 384-ובכן צלחת.
הערה: הוסף נפח של הכדאיות בתאים הזורח הזהה שווה לאמצעי האחסון הקיים בכל באר. הפשרת היכולת האור הזורח הכדאיות מגיב ומשקל כדי RT לפני השימוש. - ללחוץ על שייקר צלחת 2 דקות (כדי לערבב לגרום לפירוק התא).
- לסובב את התערובת על ידי צנטריפוגה ב 300-400 x g עבור 30 s.
- מודקת את הצלחת 384-ובכן עבור 10 דקות ב RT במקום מוגן מפני אור (כדי לייצב את האות זורח).
- . מקליט עם קורא מיקרופלייט
הערה: השתמש בפקדים מתאימים עבור שיטת הכדאיות כולל ולקייד (בריכוז סופי של 10 μM) כחיובי ו-HBSS המכיל את DMSO (עם הריכוז הסופי של 0.1% או 0.2%) כשליטה שלילית.
- הוסף 30 μL של שיטת הכדאיות של התא זורח בהתאם לטוב של 384-ובכן צלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המוצג בכתב היד שימש בהצלחה בשני מאמרים שפורסמו לאחרונה22,23. איור 3 מדגים את השימוש של הנוירונים הנגזרים hnpcs בבדיקת ההשפעה של מעכבי hdac כתרכובות אפיגנטיות על הארכה של neurites כסמן עבור neurite מוצלח והיכולת הנוירוגניים העוקבים של תרכובות קטנות מולקולה.
יתר על כן, באיור 4 רעילות נוירוטימות של תרכובות נבדק (מעכבי hdac) מוערך גם על ידי במקביל מבדילים את hnpcs ב 384-היטב צלחות, מראה את הפוטנציאל של המודל התא הציג (hnpcs) עבור הערכת רעילות עצבית ואת היכולת לשנות את מבחן רעילות נוירול עבור מספר גבוה יותר של תרכובות.
במאמר אחר על ידי sartor ואח ' (איור 5), מדידה של עוצמת האור העצבי של תא העצב כדי לכמת את השפע של H4K5ac, כמו סימן היסטון, לאחר טיפול הנוירונים הבדיל מתוך hnpcs עם משנה אפיגנטי תרכובות מוצג בהצלחה23. בנוסף, כפי שמודגם באיור 6, בעבודה שלא פורסמה, הפרוטוקול שימש להמחיש חלבון טרום סינפטיות, synaptophysin, כדי לבדוק את ההשפעה האפשרית synaptogenic של תרכובות קטנות של מולקולה.
איור 1: זרימת עבודה צעד-אחר-צעד המדגימה גישה למדידת הצמיחה העצבית עם תוכנת ניתוח תמונה של פיג'י. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זרימת עבודה צעד-אחר-צעד הממחישות גישה לכמת תאים עצביים בעוצמה פלואורסצנטית עם תוכנת ניתוח תמונה של פיג'י. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שיטת Neurite מוצלח עם מולקולה קטנה מולקולות אפיגנטיות.
(א) מייצג תמונות פלורסנט (הגדלהב-20x) לטיפול בנוירונים הנגזרים באמצעות מעכבי hdac מבוססי הידרותלמי. התאים האנושיים מובחנים במשך 5 ימים; לאחר מכן מטופלים עבור 24 שעות עם 0.1% DMSO (שליטה), Trichostatin A, JNJ26481585, SB939, ו PCI24781 (כמו תרכובות בדיקה). לאחר מכן מבוצעת הכדורית באמצעות נוגדן β-טובולין III (ירוק) כדי להמחיש תהליכים עצביים ולכמת neurite אורכים ו DAPI (כחול) כדי להמחיש גרעיני תאים. (ב) אנליזה סטטיסטית של אורך neurite בקבוצות שונות. כפי שתוארה, כל תרכובות בדיקה יכול לגרום neurite outgrowth. ניתוח כמותי של אורך neurite נעשה באמצעות תוכנת ImageJ. קווי שגיאה מייצגים את SEM; p < 0.001, * * * * p < 0.0001. דמות זו שונתה מתוך בר ואח '22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הערכת רעילות עצבית באמצעות שיטת הכדאיות של תאים זורח.
hnpcs הם שנזרע הבדיל לנוירונים ב 384-באר צלחת על פי אותה שיטה בשימוש עבור שיטת neurite מוצלח. לאחר מכן את ההשפעה של תרכובות בדיקה על הכדאיות של תאים לאחר 24 h של חשיפה נמדד. כמוצג, אין רעילות משמעותית על טיפולים. ANOVA בכיוון אחד משמש לניתוח נתונים וערך p < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. דמות זו שונתה מתוך בר ואח '22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: RGFP966 מגדיל H4K5ac בנוירונים הבדיל מתאי האדם העצבי האנושי.
(א) מייצג כתמים של β טובולין, dapi, ו H4K5ac הטיפול הבא עם DMSO, RGFP966, או RGFP966 + JQ1 ב hnpcs-נגזר הנוירונים. (ב) קוונפיקציה של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של H4K5ac בעקבות טיפול עם DMSO, RGFP966, או RGFP966 + JQ1. קווי שגיאה מייצגים את SEM; p < 0.0001. דמות זו השתנתה מסרטור ואח '23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: כתמים immunofluorescence הנציג של Synaptophysin (אדום) כדי להמחיש מסופים סינפטית, β טובולין (ירוק) כדי להמחיש תהליכים עצביים, ו DAPI (כחול) כדי להמחיש גרעיני תאים בעקבות הטיפול עם DMSO (שליטה), ו SB939 (כמו בדיקת מתחם) ב hNPCs נגזר נוירונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הוא אחד העיתונים המעטים שפורסמו המתארת את הבדיקה לאורך neurite על הטיפול עם תרכובות הבדיקה. יתר על כן, אנו מתארים כיצד להשתמש hnpcs עבור שיטת neurite מוצלח והערכה רעילות נוירו. על ידי ניצול זה הneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח על הנוירונים הנגזרים מסוג hnpcs, הפוטנציאל הנוירוגני של קטגוריה של תרכובות קטנות מולקולה קטנה, מעכבי hdac, בגרימת neurite מוצלח הוא הפגינו22. יתר על כן, במאמר אחר שהוצגו על ידי sartor ואח ', פרוטוקול זה משמש כדי לכמת את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של H4K5ac, חלבון היסטון, על הטיפול עם מספר תרכובות משנה אפיגנטיות23.
תפקוד קוגניטיבי מסתמך על חיווט תקין וקשרים פונקציונליים בתוך מעגלים עצביים. כימות מפורטת ועקבית של היבטים שונים של מורפולוגיה עצבית כגישה הקרנה פנוטימית חיונית כדי להשיג תובנה אמינה במסלולים הבסיסיים המובילים להפרעות במוח החל התפתחותי נוירולית להפרעות פסיכיאטריות. הקרנת פנוטיפ נחשבת לגישה אפקטיבית במיוחד בחקירת תרכובות מולקולות קטנות כמועמדים לשימוש בסמים לווסת את הפנוטיפים הסלולריים. בגישה זו, במקום לחקור רק מטרה אחת, כל הרכיבים והמסלולים של התא נבדקים24.
מורפולוגיה עצבית כולל צורה, מבנה וקישוריות נחשבים לתכונות מרכזיות של תפקוד עצבי. רטבאליות גנטי המשנים את המבנה של הנוירונים או לוקליזציה של חלבון סינפטית ורמת יכול בעיקר לתרום ניתוח של מוטציות גרימת מחלות. לכן, שיטות אמינות נדרשות להעריך את ההשפעה של הperturbagens על מורפולוגיה עצבית25.
HNPCs, מבודדים מן המוח מהיונקים העובריים, אשר לאחר מכן הם מתורבתים בתוך מבחנה בנוכחות של mitogens. תאים אלה מורכבים מתחומים נוירואליים המאופיינת באגרגטים סלולריים צפים המורכבת מתאים מחולל קדמון ותאי גליה רדיאליים. Hnpcs לספק מערכת מודל רצוי עבור פונקציה מערכת העצבים ופיתוח על ידי שמירה על פוטנציאל הבידול שלהם בהפקת שונים ליניאריות עצביים7,8,9. Neurite מספר, עוצמה, אורך, ורוחב יחד עם מאפיינים סינפטיות כולל טרום לאחר הסינפטית שינויים חלבונים הם בין Neurite ושינויים סינפטית שיכול להיות אמין וביעילות נמדד באמצעות השיטה המוצגת להלן.
בשל העלייה בשכיחות ההפרעות הנוירולוגיות כגון הפרעת קשב וריכוז ואוטיזם, הפוטנציאל הנוירורעילות של כימיקלים סביבתיים על ילדים נשאר חשש לציבור15,26. לכן, השימושיות של הנוירונים הנגזרים הנגזרות עבור הערכה אמינה ויעילה רעילות המוח נבדקת גם. כפי שמתואר באיור 4, hnpcs ניתן להתאים ולשנות את הערכה להערכת רעילות ב 384-היטב צלחות.
רעילות המוח כיישום עבור המודל התא הציג ניתן על ידי הבחנה בין נוירוספירות לנוירונים לפני ציפוי ב 384-טוב צלחות או להבדיל את התאים בעוד נוירוספירות מצופים ב 384-היטב צלחות כמו תאים בודדים. בגישה האחרונה, מיומנויות ליטוף בדיוק גבוה נדרשות לציפוי המספר המדויק של כדורים נוירופלסטיים שאינם מצטברים לתאים בודדים וגם עבור הליכי הטיפול הבאים עם מדיום ממריץ בידול. בהתחשב בכישורי הליטוף הנדרשים, בידול לפני הציפוי מומלץ להשיג תוצאות שונות יותר. יתר על כן, מיון התא בצובר על-ידי מיון התא המופעל באמצעות פלואורסצנטית (FACS) יכול גם לשמש כדי להפריד במדויק את המספר הנדרש של תאים להקיף את הצורך באיכות גבוהה ליטוף מיומנויות.
מומלץ להתחיל את הneurite מוצלח הערכה על ידי הערכת רעילות נוירולהימנע חוזרות neurite מוצלח בחני עם מינונים שונים של אותו תרכובת להגיע לריכוז לא רעיל. לכן, שילוב של הערכת רעילות עצבית על ידי ניצול הכדאיות של תאים זורח כנגד מינון-תגובה עקומה של תרכובות הבדיקה יגרום למצוא את המינון הנכון עם מאמץ מינימלי. שיטת הכדאיות של התא הזורח היא שיטה רגישה מאוד כדי לקבוע את מספר התאים הקיימא בתרבות התא. השיטה פועלת על כימות ה-ATP המצויים בתרבות כאינדיקטור לחילוף החומרים התאי. להוסיף, לערבב, ולמדוד את הפורמט של המנה מספק גישה פשוטה ומהירה כדי לבדוק את הכדאיות התאית ו ציטורעילות של תרכובות בדיקה.
ישנן מספר מגבלות לפרוטוקול המוצג כדלקמן. בשל זמינות והשונות הטבועה, השימוש בתאים ראשוניים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית מוגבל ל-25. hNPCs יש קצב התפשטות איטי, אשר יכול להגביל את הניצול שלה. ידני ניתוח גדול בקנה מידה של תמונות פלורסנט של הנוירונים הוא זמן רב ופגיע להטיות בהטיית. hNPCs יכול להיחשב כתאים עצביים צעירים, לא המייצגים שינויים הקשורים גיל אפיגנטי הצטברות בתאים ברחבי החיים של אדם. כמו הפרעות ניווניות מתרחשים באנשים מבוגרים, hNPCs עשויים להיעדר רלוונטיות פיזיולוגית נאותה להיות מודל המתאים לתנאי התפרצות מאוחרת.
אף על פי דגמי בעלי חיים וקווי תאים היו יקרי ערך בפענוח מנגנונים מולקולריים המשמשים כבסיס מחלות, הם הראו מגבלות בתרגום ממצאים לאדם therapeutics27,28,29,30. האדם המושרה בתאי גזע (hiPSCs) ותאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לצד hNPCs נחשבים טוב יותר במודלים תא מבחנה, לכידה של הפיזיולוגיה האנושית. לכן hiPSCs ו-hESCs-הנוירונים הנגזרים יכולים גם לשמש כשני מקורות תא חלופיים לצורך neurite מוצלח והערכת רעילות, ניצול הפרוטוקול המוצג להלן1,31.
לסיכום, פוטנציאל translational גבוהה והרלוונטיות הפיזיולוגית של hNPCs כמודל הראשי של התא האנושי מספק מפלט יקר בneurite outgrowth הקשורות לגילוי סמים הקרנות והערכת רעילות המוח outgrowth את המגבלות שהוזכרו קודם לכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מציינים שאין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק מחקר NIMAD (940714) הוענק MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
