Summary
Sunulan protokol, küçük molekül bileşiklerinin nörat dışı büyüme testini ve nörotoksisite değerlendirmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.
Abstract
Neurite outgrowth tsay ve nörotoksisite değerlendirmesi burada sunulan yöntem kullanılarak yapılabilir iki önemli çalışmalardır. Bu protokol, nöronal morfolojinin, küçük molekül bileşikleri ile tedavi üzerine nötrit uzunluğu ve sinaptik protein lokalizasyonu ve bolluğu üzerine yapılan değişikliklerin nicel ölçümleri ile birlikte güvenilir bir analiz sağlar. Neurite outgrowth çalışmalarında sunulan yöntemin uygulanmasına ek olarak, potansiyel gelişimsel nörotoksisite etkisine göre ticari kimyasal bileşikleri değerlendirmek, ayırt etmek ve sıralamak için nörotoksisite değerlendirmesi yapılabilir.
Hücre hatları günümüzde yaygın olarak nörolojik bileşik tarama tahlillerinde kullanılan olsa da, genellikle genetik ve fenotipik doku kökenlerinden farklıdır. Birincil hücreler ise in vivo gözlenen önemli belirteçleri ve işlevleri korurlar. Bu nedenle, çeviri potansiyeli ve fizyolojik alaka nedeniyle bu hücrelerin neurite outgrowth çıkış ve nörotoksisite değerlendirmesi sunabilir önemli ölçüde birincil insan hücre modeli olarak insan nöral progenitor hücreleri (hNPCs) kullanarak yararlanabilir.
Burada sunulan yöntem, bileşiklerin insan nöral progenitor hücre kaynaklı nöronlardan yararlanarak nötrat büyümesini ve nörotoksisiteyi tetikleme yeteneğini taramak için kullanılabilir."
Introduction
Neurite büyüme nöronal ağ ve sinir rejenerasyon oluşumu için temel bir süreçtir1,2. Bir yaralanma sonrasında, neurite outgrowth sinir sisteminin yenilenmesinde önemli bir rol oynar. Neurite outgrowth da nörodejeneratif,bozukluklar ve nöronal yaralanma3,4,5,6sonuçlarını artırmak için nöronal rejeneratif faaliyetleri indükleyen ekstrasellüler sinyal önemli bir unsurdur .
Çeşitli nöral soy üreten kendi farklılaşma potansiyelini koruyarak, insan nöral progenitor hücreleri (hNPCs) merkezi sinir sistemi çalışmaları için bir model sistemi sağlayabilir (CNS) fonksiyonu ve gelişimi7,8,9. HNP'lerin birincil insan hücresi modeli olarak yüksek çeviri potansiyeli ve fizyolojik önemi, neurite büyümeye bağlı ilaç keşif taramalarında önemli bir avantaj sağlamaktadır. Ancak, bakım ve yüksek iş gücü tahlilleri için birincil hücre modelleri ölçekleme zaman alıcı ve emek yoğunolabilir 10,11,12,13.
Neurite outgrowth çalışmalarında sunulan yöntemin uygulanmasına ek olarak, nörotoksisite değerlendirmesi hNPC kaynaklı nöronlar kullanılarak başka bir uygulamadır. Ya incelenmemiş ya da kötü anlaşılmış nörotoksisite potansiyeline sahip binlerce ticari kimyasal bileşik vardır. Bu nedenle, daha güvenilir ve etkili tarama deneyleri değerlendirmek için, ayırt etmek ve gelişimsel nörotoksisite ortaya potansiyeline dayalı bileşiklersıralamak için yüksek talep14. Ortamda denenmemiş bileşiklerin bolluğu ile birlikte nörolojik hastalıkların yaygınlık ve insidansı artış nörotoksisite 15 oluşturabilecek tehlikeli çevresel bileşikleri belirlemek için daha güvenilir ve verimli deneylergeliştirilmesini gerektirir15.
Burada sunulan yöntem, bileşiklerin insan nöral progenitor hücre kaynaklı nöronlardan yararlanarak nötrat büyümesini ve nörotoksisiteyi tetikleme yeteneğini taramak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Açıklama: Fetal örnekler, Seattle'daki Washington Üniversitesi Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı'ndan Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından desteklenen bir doku dağıtım programı ile alındı. Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı velilerden uygun yazılı bilgilendirilmiş onam aldı ve doku ların temini Washington Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından izlendi. Tüm çalışma MiamiÜniversitesi'ndeİnsan Konu Araştırma Ofisi tarafından onaylanması ile yapıldı 8 .
1. İnsan nöral progenitor hücrelerinin (hNPCs) izolasyonu ve kültürü
- Beyin dokusunu 100 mm'lik petri kabına yerleştirin ve forceps kullanarak menenjleri dikkatlice çıkarın.
- Beyin dokusunu 50 mL konik bir tüpe aktarın ve tüpü hafifçe ters çevirerek 20 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- Hücre ayrıştırma çözeltisindeki dokuyu batırarak beyin dokusunu 50 mL konik tüpe yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve DNase I (10 U/mL) 10 dakika boyunca 37 °C'de.
- Tüp içeren beyin dokusuna 5 mL nöronal hücre kültürü ortamı (bkz. Malzeme Tablosu)ekleyin ve tek hücreli süspansiyon yapmak için 1000 μL pipet ucu ile 20 ila 30 kez üçleme yaparak nörosferleri mekanik olarak ayrıştırın.
- Hücre kümelerini kaldırmak için hücre süspansiyonuna 70 μm'lik bir süzgeçten süzün.
- Tablo 1'deayrıntılı bileşenlerle desteklenen 5-10 mL nöronal hücre kültürü ortamı ile sağlanan bir havalandırmalı T-25 şişesinde tek hücreli süspansiyon tohum.
- Heparin çözeltisini 0,2 μm filtre ile filtreleyerek sterilize edin. A vitamini olmadan B-27 takviyesi nöral atalar ve kök hücrelerin ekimi için serumsuz bir ektir, farklılaşma indüklemeden.
NOT: İnsan nöral progenitor hücreleri (hNPCs) iptal fetus toplanan insan fetal beyin izole edilir. Kültürde 7-10 gün geçirdikten sonra, nöral kök hücreler (NSC' ler) serbest yüzen nörosfer kolonileri oluştururken, diğer hücre tipleri tek hücre olarak süspansiyonda kalır veya şişenin altına bağlanır. İzole hNPCs birkaç ay için süspansiyon nörosferler olarak kültürlü olabilir8,16,17.
- Heparin çözeltisini 0,2 μm filtre ile filtreleyerek sterilize edin. A vitamini olmadan B-27 takviyesi nöral atalar ve kök hücrelerin ekimi için serumsuz bir ektir, farklılaşma indüklemeden.
| Tutar | Bileşen |
| 100 μL | EGF (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, Eksi A vitamini (50X) |
| 1 mL | L-alanyl-L-glutamin (100X) (bkz. malzeme tablosu) |
| 4 μL | Heparin (2 g/mL) |
| 96,8 mL | Nöronal hücre kültürü ortamı (bkz. malzeme tablosu) |
Tablo 1. 100 mL kültür ortamı yapmak için gerekli bileşenler
2. HNPC'lerin geçişi
- Yüzen küreler, büyük ve küçük nörosferler içeren ortamları toplayın ve bunları 50 mL konik tüpe aktarın.
NOT: Bilinmeyen nedenlerden dolayı, nörosferlerin bölünmesinin zamanlaması 7 günden 30 güne kadar değişkendir. Ancak, genellikle, nörosferler 700-900 μm daha büyük bir çapa ulaştığında geçit edilmesi gerekir. Bu nörosferin merkezi kararmaya başlar, hangi hücre ölümü yüksek bir oranı bir işareti olarak kabul edilir18. - 3 dk için 300-400 x g santrifüj ile aşağı nörosferler spin.
- Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve sonra küreleri 500 μL'lik çözülmüş hücre ayrışma reaktifinde batırın (bkz. Malzemeler Tablosu).
- 1,5 mL mikrotüpler başına 500 μL ekleyerek hücre bölünmesi reaktifinin aliquots olun ve -20 °C'de saklayın. Enzim aktivitesini kaybetmemek için, 37 °C'lik su/boncuk banyosunda RT'de veya sıcakta 5 dakika bekleterek hücre bölünmesi reaktifini eritin.
- Kürelerin yoğunluğuna ve büyüklüğüne bağlı olarak, 37 °C'de batık küreleri 5-15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 5 dk nörosferleri tortulamak için 50 mL konik tüp ve 300-400 x g'de santrifüj içeren nörosferlere 5-10 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
- 1000 μL'lik bir pipet kullanarak, tüm nörosferler tek hücreli süspansiyona gelene kadar 2 mL kültür medyasında süpernatant ve hafifçe pipetaspire edin.
NOT: Dissociation çıplak gözle görünür hale gelecektir. Dissociation önce, nörosferler küreler şeklindedir. Dissociation reaktifine daldırıladıktan ve yukarı ve aşağı borular birleştirdikten sonra tek hücre haline gelecektir.- Hücreleri sayın ve tek hücreleri plakalayın, Kültür medyasının 10 mL'inde T-25 şişesi başına 2 ila 3 milyon hücre.
- Kültür ortamının yarısını değiştirerek hücreleri 3 günde bir besleyin.
- Alt köşesinde olacak şekilde şişeyi yaslayarak nörosferleri yerleştirin. Nörosferler tortu kadar yaklaşık 1-2 dakika pozisyonda şişe tutun. Daha sonra yerleşmiş nörosferlerin üzerinde ortama serolojik pipet takarak ortamın yarısını nazikçe aspire edin. Ayrıştırılmış hücreler kültür192-3 gün sonra küreler oluşturmak için biraraya gelebilir.
3. HNP'lerin dondurulması
- DMSO'yu kültür ortamına %10 'lık (v/v) nihai konsantrasyona ekleyerek hücre dondurma ortamını hazırlayın veya hassas hücre tipleri için ticari olarak kullanılabilen kriyopreservation ortamı kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Ortamı 50 mL konik bir tüpe aktararak ve kürelerin yer çekimine göre yerleşmesine izin vererek büyük küreleri sıralayın. Daha sonra büyük nörosferleri 200 veya 1000 μL'lik pipet ucu kullanarak geçmek için 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın ve çıkarın.
NOT: Çapı 900 μm'den büyük olan nöroküreler büyük, çapı 500 μm'den küçük olanlar ise küçük olarak kabul edilir. - Kalan nörosferleri 3 dk. için 300-400 x g santrifüj ile aşağı doğru çevirin.
- 1 mL kriyopreservation reaktifinde 100 küreye kadar yeniden askıya alın ve bir kriyotube aktarın.
- Bir hücre dondurma kabında -80 °C'de geceleme (Bkz. Malzeme Tablosu)ve uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı nitrojene taşıyın.
NOT: Küçük ve orta büyüklükteki nörosferlerin dondurulması (çapı 900 μm'den düşük) ve büyük boyutlu nörosferlerin (çapı 900 μm'den büyük) veya tek hücrelerin dondurulmasını önlemek tercih edilir. Örneğin erimesırasında hücre hasarını azaltmak için, çözülmüş nörosferleri küçük bir T25 şişesine tohumlayarak hücreleri yoğun tutun.
4. HNP'lerin farklılaşması ve tedavisi
NOT: Farklılaşmayı sağlamak için nöroküreler tek hücrelere ayrıştırılır, sayılmaktadır ve 5 gün boyunca kaplanmış plakalar üzerinde tohumlanır. Daha sonra farklılaşmış hücreler immünboyama ve floresan nicelleştirme den önce test bileşikleri ile 24 saat tedavi edilir.
- Kaplama
- 4 kuyulu cam oda kaydıraklar (8 kuyulu oda slaytlar kuyubaşına 140 μL) başına 200 μL poli-L-l-lizin (PLL) ekleyin.
- Oda sıcaklığında 1 saat (RT) için kuluçka.
- PBS ile 3x yıkayın.
- RT (yaklaşık 30 dakika) kuruolsun.
- 4 kuyulu cam hazne slaytları kuyubaşına 150 μL laminin (50 μg/mL) ekleyin (8 kuyulu hazneli slaytların kuyusu başına 120 μL).
- 37 °C'de 2 saat kuluçka.
- PBS ile 3x yıkayın.
NOT: Kaplamalı hazne slaytları 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
- Hücreleri kaplama
- Sayısı ve plaka 80.000 tek hücreli nörosferler (tek bir hücre süspansiyon nörosferler) 4-iyi oda slaytlar kuyu başına (8-iyi oda slayt kuyu başına 70.000 hücre).
- 4 kuyulu oda slaytı kuyubaşına 500 μL ayırım ortamı ekleyin (8 kuyulu oda slaytları kuyubaşına 250 μL ortam).
- Farklılaşma ortamını ilk yapmak için, nöral indükleme ortamı (NIM) yapmak için tablo 2'deki aşağıdaki bileşenleri steril, tek kullanımlık bir kapsayıcıya ekleyin.
- Farklılaşma ortamı nı yapmak için bir önceki adımda yapılan NIM'in Tablo 3 ila 48,5 mL'sine aşağıdaki malzemeleri ekleyin.
- 37 °C'de 5 gün kuluçkaya yatırın.
- 5 gün sonra, her kuyudaki ortamın yarısını, uygun kontroller de dahil olmak üzere test bileşiklerinin istenilen konsantrasyonuyla karıştırılmış taze ortamla değiştirerek hücreleri 24 saat boyunca tedavi edin.
| Tutar | Bileşen |
| 49 mL | DMEM/F-12 |
| 0,5 mL | N2 takviyesi (100X) |
| 0,5 mL | MEM esansiyel olmayan amino asitler (100X) |
| 2 μL | Heparin (2 μg/mL) (Stok Conc. 50 mg/mL'dir) |
Tablo 2. NIM 50 mL yapmak için gerekli bileşenler
| Tutar | Bileşen |
| 1 mL | B-27 (50X) |
| 500 μL | Antibiyotik-Antimikotik (100X) |
| 5 μL | Retinoik asit (0.1 μM) |
| 50 μL | GDNF (10 g/mL) |
| 50 μL | BDNF (10 g/mL) |
| 5 μL | Askorbik asit (0.2 μg/mL) (Stok Conc. 2 mg/mL'dir) NOT: Taze yapılması önerilir. |
| 48,5 mL | Nim |
Tablo 3. 50 mL farklılaştırma ortamı yapmak için gerekli bileşenler
5. İmmünositokimya (ICC)
NOT: Hücreler %4 formaldehit ile sabitlenir. Permeabilizasyon ve engelleme daha sonra penetrasyonu artırmak ve antikorların nonspesifik bağlanmasını önlemek için yapılır. Hücreler daha sonra bir gecede primer antikorlar ile kuluçkaya yatırılır. Daha sonra hücreler floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırılır. Son olarak, çekirdeği lekelemek için DAPI kullandıktan sonra, oda slaytlar monte edilir.
- Fiksasyon
- Yavaşça her kuyuda medya aspire.
- 4 kuyulu oda slaytları kuyubaşına 500 μL %4 formaldehit ekleyin (8 kuyulu hazne slaytların kuyusu başına 250 μL).
- RT'de 15 dakika kuluçka.
- 2x'i 500 μL PBS ile hafifçe yıkayın.
NOT: Fiksasyondan sonra her kuyuda 1 mL PBS bırakılarak kültür slaytları 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.
- Hücre permeabilizasyonu ve bloke etme
- Antikor (Ab) tamponu yapmak için tablo 4'teki aşağıdaki bileşenleri steril, tek kullanımlık bir kaba ekleyin.
- Hücre permeabilizasyon ve engelleme çözeltisi yapmak için bir önceki adımda yapılan Ab tamponu ile Tablo 5'te aşağıdaki maddeleri karıştırın.
- 4 kuyulu oda slaytları kuyu başına 500 μL ekleyin ve RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Ab tamponu 4 °C'de saklanabilir.
| Tutar | Bileşen |
| 1.75 g | NaCl (150 mM) |
| 1.2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3.6 g | L-lizin (100 mM) |
| 8 g | Sodyum Azit (%4) |
| 200 mL | Distile su. NOT: Başlangıçta gerekli bileşenleri 150 mL suda çözün, ardından 200 mL'ye ayarlayın. |
Tablo 4. 200 mL Antikor tamponu yapmak için gerekli bileşenler
| Tutar | Bileşen |
| 600 μL | %20 Keçi serumu |
| 6 μL | %0.2 Triton-X100 |
| 2394 μL | Antikor tamponu. NOT: Başlangıçta gerekli bileşenleri 2 mL Ab arabelleği içinde çözün ve sonra pH 7.4'e ayarlayın. Daha sonra 3 mL'nin son hacmine ayarlamak için daha fazla Ab arabelleği ekleyin ve sterilize edin. |
Tablo 5. 3 mL hücre permeabilizasyonu ve engelleme çözeltisi yapmak için gerekli bileşenler
- Boy -ama
- 500 μL PBS ile 2 x yıkayın.
- Seyreltilmiş primer antikor, anti-β-tubulin III (1:200) ve 4 °C (4-iyi oda slaytlar kuyu başına 200 μL) gecede kuluçka ekleyin. PBS'deki primer antikorseyreltin.
- PBS ile 2x yıkayın.
- Seyreltilmiş, PBS, floresan ikincil antikor, Alexa Fluor 488 (1:500) etiketli ve ışıktan korunan bir yerde RT 2 saat için kuluçka (4-iyi oda slaytlar kuyu başına 250 μL) ekleyin
- PBS ile 2x yıkayın.
- Seyreltilmiş, PBS, DAPI (300 nM konsantrasyonu) ve ışıktan korunan bir yerde RT 5 dakika kuluçka (4-iyi oda slaytlar kuyu başına 300 μL).
- PBS ile 3x yıkayın.
- Aşağıdaki yönergeleri kullanarak oda slaytlarını monte edin.
- Ayrılık sekmelerini kırarak ve conta ve tabanı çıkararak oda slaytını ayırın.
- 4 kuyulu oda slaytlarının kuyusu başına montaj çözeltisi (Bkz. Malzeme Tablosu)bir damla ekleyin. Ardından tüm slaydı kapsayacak şekilde bir kapak slaytı kullanın.
- Bir cıvık ve bir açıyla, sıvı damlanın dış kenarı ile temas ederken kapağın bir tarafını kaydırağa doğru yerleştirin.
- Yerine indirirken kapak lıyı montaj çözeltisinin üzerine dikkatlice getirin. kabarcıklar oluşturulmasını kaçının. Bir pipet ucu alın ve kapak kayma aşağı basın. Kabarcıklar yana doğru hareket edecek.
NOT: Kabarcık oluşumu zaman zaman kaçınılmazdır. Oluşursa, birkaç olduğu sürece çevrelerindeki görüntü. - Kür süresi için üreticinin yönergelerini izleyin. Görüntüleme sırasında kullanım zorluğu nedeniyle tedavi edilmeyen montaj çözümlerini kullanmaktan kaçının. Aksi takdirde, görüntüleme sırasında kapak kaymasının kaymasını önlemek için kenarlarda uygun bir kapak lı sızdırmazlık kullanılması gerekir.
- Kapak kapağını kapatmak için, oje kullanın ve kapak fişinin kenarında küçük bir çizgi yapın. Yaklaşık 2 dakika boyunca kuru oje izin verin.
6. Görüntü edinimi, neurite büyüme ve floresan yoğunluğu nicelleştirme
NOT: Boyamadan sonra, tedavi edilen hücrelerin görüntülerini elde etmek için 20x nesnel ve 1024 x 1024 piksel görüntü boyutuna sahip bir konfokal mikroskop kullanın. Her koşul da biyolojik çoğaltma başına en az iki alandan görüntü alın. Sonra neurit uzunluğu niteleme için Fiji görüntü analizi yazılımı (ImageJ 1.51u) kullanın. Kısaca, her nöron için en uzun neurit uzunluğunu ölçmek ve tedavi başına değerleri ortalama sonra, deneysel gruplar ve kontrol grubu arasındaki araçları karşılaştırmak için bağımsız gruplar için öğrencinin t testi kullanın.
NOT: Çeşitli ticari (Imaris, Volocity, Amira) ve açık kaynak (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Buzlu, KNIME) görüntü işleme programları mevcuttur. Bu programlar arasında, ImageJ biyolojik görüntü analizi için tercih edilen araç haline gelmiştir20,21. https://imagej.net/Introduction'daki ImageJ portalı, ImageJ'in temel ve görüntü işleme, kolokalizasyon, dekonvolution, kayıt, segmentasyon, izleme ve görselleştirme gibi yerleşik işlevlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sağlayan yararlı bir bilgi kaynağıdır.
- Fiji görüntü analiz yazılımı ile nöronal büyümenin ölçülmesi
- Şekil 1'degösterildiği gibi, görüntüyü sürükleyip Fiji yazılımına bırakarak veya Dosya' yı seçerek açın | Aç.
- Analiz'i Seçin | Araçlar | RoI yöneticisi, ve sonra sağ araç çubuğudüz 5 simgesine tıklayın ve serbest çizgiyegeçin. İsteğe bağlı olarak, satır genişliğini 10'a değiştirmek için aynı simgeye çift tıklayın ve ardından hücre gövdesinin yakınından başlayıp neuritin ucuna kadar uzanan en uzun neurite'yi takip edin.
- Ölçümü Yatırım Getirisi Yöneticisi'ne eklemek ve ölçülen nöronu vurgulamak için Ctrl + T & F tuşuna basın. YG'dekitüm sayıları seçin, Ölçü'yetıklayın, hesaplanan tüm uzunlukları seçin ve elektronik tabloya kopyalayın/yapıştırın.
- Fiji görüntü analiz yazılımı ile etiketli hücrelerin floresan yoğunluğunun ölçülmesi
- Şekil 2'degösterildiği gibi, resmi açtıktan sonra, araç çubuğu Freehand seçimlerinde4simgesine tıklayın. Hücrenin şeklini çizin.
- Analiz'i Seçin | Ölçümleri ayarlayın ve aşağıdaki değerleri seçin: Alan, Tümleşik yoğunluk, Ortalama gri değer | Analiz Et | Ölçü (bir değer yığını nın açOlduğu açılır kutu).
- Arka plan olarak hücrenin yanında bir bölge seçin (boyut önemli değildir) ve ardından Çözümle | Ölçün. Ölçülen tüm verileri seçin ve bir elektronik tabloya kopyalayın/yapıştırın.
NOT: Entegre Yoğunluk (IntDen), floresan yoğunluklarını belirlemek için kullanılan öğedir. Bu çalışmada hedef molekülün floresan yoğunluğu başlangıçta hücredeki dağılımını analiz etmek ve daha sonra çeşitli tedaviler altında hedef molekülün bolluğunu ölçmek için ölçülür. Sonuç olarak, tedavilerin etkinliği ölçülecek ve kontrol ile karşılaştırılacaktır.
7. Nörotoksisite değerlendirmesi
NOT: Test bileşiklerinin sitotoksisitesi 384 kuyulu plakalarda değerlendirilir (Bkz. Malzemeler Tablosu) Parlak hücre canlılığı testi kullanılarak (bkz. Malzemeler Tablosu). HNPC'ler aynı yöntemle hazırlanır, hafif değişiklikler dışında, "HNPC'lerin Farklılaşması ve Tedavisi" bölümünde açıklanmıştır. Daha sonra, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ışıldayan hücre canlılık tsay tarafından oluşturulan bir Parlak sinyal ölçülür. Parlak sinyal hücresel ATP konsantrasyonu ile orantılıdır ve kendisi her kuyuda bulunan canlı hücre sayısıyla doğru orantılıdır.
- Kaplama
- 384 kuyulu plaka nın kuyubaşına 30 μL poli-L-lizin (PLL) ekleyin.
- RT'de 1 saat kuluçka.
- PBS ile 2x yıkayın.
- RT (yaklaşık 30 dakika) kuruolsun.
- 384 kuyulu plakanın kuyubaşına 30 μL laminin (50 μg/mL) ekleyin.
- 37 °C'de 2 saat kuluçka.
- PBS ile 2x yıkayın.
NOT: Kaplanmış 384 kuyulu plakalar 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
- Hücreleri kaplama
- Farklılaşma ortamının 25 μL'sinde 384 kuyulu plakanın kuyubaşına 20.000 tek hücreli nöroküre sayısı ve plakası.
- 37 °C'de 5 gün kuluçkaya yatırın.
- 5 gün sonra, hücreleri 5 μL hacimde istenilen son konsantrasyonu 6 kat test bileşikleri ile 24 saat tedavi edin (kuyu başına 30°L'lik son hacmi yapmak için).
- Hücre canlılığı tsası
- 384 kuyulu plakanın kuyubaşına 30 μL'lik parlak hücre canlılığı isame reaktifi ekleyin.
NOT: Her kuyuda bulunan hacime eşit bir hacim liminesans hücre canlılık isabilme reaktifi ekleyin. Parlak hücre canlılığı isaveti reaktifini eritin ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin. - 2 dakika boyunca bir tabak shaker çalkalayın (karıştırmak ve hücre lisis indüklemek için).
- Karışımı 30 s için 300-400 x g'de santrifüj ile aşağı doğru çevirin.
- 384 kuyulu plakayı ışıktan korunan bir yerde RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın (Parlak sinyali stabilize etmek için).
- Bir mikroplaka okuyucu ile parlaklık kaydedin.
NOT: Velcade (10 μM'lik son konsantrasyonda) pozitif ve HBSS içeren DMSO (nihai konsantrasyon %0,1 veya %0,2) dahil olmak üzere canlılık tahlilleri için uygun kontrolleri kullanın negatif kontrol olarak.
- 384 kuyulu plakanın kuyubaşına 30 μL'lik parlak hücre canlılığı isame reaktifi ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El yazmasısunulan protokol başarıyla iki yeni yayınlanan kağıtları22,23kullanılmıştır . Şekil 3, HDAC inhibitörlerinin epigenetik bileşikler olarak nötrit lerin uzantısı üzerindeki etkisini incelerken hNPC'lerden türetilmiş nöronların kullanımını göstermektedir.
Ayrıca, Şekil 4'te test edilen bileşiklerin nörotoksisitesi (HDAC inhibitörleri) aynı anda 384-iyi plakalarda hNPC'lerin farklılaşarak, nörotoksisite değerlendirmesi için sunulan hücre modelinin (hNPCs) potansiyelini ve daha yüksek sayıda bileşik için nörotoksisiteyi test etme yeteneğini göstererek değerlendirilir.
Sartor ve ark. tarafından başka bir kağıt (Şekil 5), h4K5ac bolluğunu ölçmek için nöronal hücre floresan yoğunluğuölçümü, bir histon işareti olarak, epigenetik değiştirici bileşikler ile hNPCs farklılaşan nöronlar tedavi edildikten sonra başarıyla gösterilmiştir23. Ayrıca, Şekil 6'dagösterildiği gibi, yayınlanmamış bir çalışmada protokol, küçük molekül bileşiklerinin olası sinaptojenik etkisini kontrol etmek için bir presinaptik proteinolan sinaptofirini görselleştirmek için kullanılmıştır.
Şekil 1: Fiji görüntü analizi yazılımı ile nöronal büyümeyi ölçmek için bir yaklaşımı gösteren adım adım iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fiji görüntü analiz yazılımı ile nöronal hücre floresan yoğunluğunu ölçmek için bir yaklaşım gösteren adım adım iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Küçük molekül epigenetik bileşikleri ile neurite outgrowth tsay.
(A) Hidroksamik esaslı HDAC inhibitörleri ile hNPCs kaynaklı nöronların tedavisi için temsili floresan görüntüler (20x büyütme). İnsan nöral progenitor hücreleri 5 gün boyunca ayırt edilir; daha sonra 24 saat için tedavi 0.1% DMSO (kontrol olarak), ve Trichostatin A, JNJ26481585, SB939, ve PCI24781 (test bileşikleri olarak). Daha sonra nöronal prosesleri görselleştirmek ve hücre çekirdeklerini görselleştirmek için nötrit uzunluklarını ve DAPI'yi (mavi) ölçmek için nöronal spesifik β-tubulin III antikor (yeşil) ile immünboyama yapılır. (B) Çeşitli gruplardaki nötrit uzunluğunun istatistiksel analizi. Tasvir edildiği gibi, tüm test bileşikleri neurite büyüme neden olabilir. Neurit uzunluğunun nicel analizi ImageJ yazılımı kullanılarak yapılır. Hata çubukları SEM'i temsil; p < 0.001, **** p < 0.0001. Bu rakam Bagheri ve ark.22'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Parlak hücre canlılığı tözünü kullanarak nörotoksisite değerlendirmesi.
hNPC'ler, neurite outgrowth tsay için kullanılan yönteme göre 384 kuyulu plakadaki nöronlara tohumlanır ve ayırt edilir. Bundan sonra test bileşiklerinin 24 saat maruz kaldıktan sonra hücrelerin canlılığı üzerindeki etkisi ölçülür. Gösterildiği gibi, tedaviler üzerinde önemli bir toksisite yoktur. Tek yönlü ANOVA veri analizi için kullanılır ve p değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilir. Bu rakam Bagheri ve ark.22'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: RGFP966 insan nöral progenitor hücrelerinden ayırt nöronlarda H4K5ac artırır.
(A)HNPCs kaynaklı nöronlarda DMSO, RGFP966 veya RGFP966 + JQ1 ile tedavi sonrasında β tubulin, DAPI ve H4K5ac'ın temsili immünororesans boyama. (B) DMSO, RGFP966 veya RGFP966 + JQ1 ile tedavi sonrasında H4K5ac floresan yoğunluğunun ölçülmesi. Hata çubukları SEM'i temsil; p < 0.0001. Bu rakam Sartor ve ark.23'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Synaptophysin (kırmızı) synaptophysin (kırmızı) temsili immünororesans boyama sinaptik terminalleri görselleştirmek için, β tubulin (yeşil) nöronal süreçleri görselleştirmek için, ve DAPI (mavi) DMSO ile tedavi sonrasında hücre çekirdeklerini görselleştirmek için (kontrol olarak), ve SB939 (test bileşik olarak) hNPCs kaynaklı nöronlarda. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, test bileşikleri ile tedavi üzerine neurite uzunluğu için test açıklayan birkaç yayınlanan makalelerden biridir. Ayrıca, bir neurite outgrowth tsay ve nörotoksisite değerlendirmesi için hNPCs nasıl kullanılacağını açıklar. HNCs kaynaklı nöronlar bu neurite outgrowth ve nörotoksisite değerlendirmesi kullanarak, epigenetik küçük molekül bileşikleri bir kategorinörojenik potansiyeli, HDAC inhibitörleri, neurite outgrowth indükleyen22gösterilmiştir . Ayrıca, Sartor ve ark. tarafından sunulan başka bir makalede, bu protokol H4K5ac floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılır, bir histon protein, birkaç epigenetik değiştirici bileşikler ile tedavi üzerine23.
Bilişsel fonksiyon nöronal devreler içinde uygun kablolama ve fonksiyonel bağlantılar dayanır. Nöronal morfolojinin çeşitli yönlerinin bir fenotipik tarama yaklaşımı olarak ayrıntılı ve tutarlı bir şekilde ölçülmesi, nörogelişimsel den psikiyatrik bozukluklara kadar beyin bozukluklarına yol açan altta yatan yollarda güvenilir bir içgörü elde etmek için gereklidir. Fenotipik tarama, hücresel fenotip modüle etmek için putatif ilaç adayları olarak küçük moleküllü bileşiklerin araştırılmasında özellikle etkili bir yaklaşım olarak kabul edilir. Bu yaklaşımda, sadece tek bir hedefi sorgulamak yerine, hücrenin tüm bileşenleri ve yolları24olarak incelenir.
Şekil, yapı ve bağlanabilirlik gibi nöronal morfoloji nöronal fonksiyonun temel özellikleri olarak kabul edilir. Nöronların morfolojisini veya sinaptik protein lokalizasyonunu ve seviyesini değiştiren genetik pertürbasyonlar özellikle hastalığa neden olan mutasyonların analizine katkıda bulunabilmektedir. Bu nedenle perturbagenlerin nöronal morfoloji üzerindeki etkisini değerlendirmek için güvenilir yöntemler ekidir25.
HNPCs, embriyonik memeli beyin izole edilir, daha sonra mitojenlerin varlığında in vitro kültürlü olan. Bu hücreler nöral progenitor hücreleri ve radyal glial hücrelerden oluşan yüzen hücresel agregalar olarak karakterize nörosferler oluşur. HNPCs çeşitli nöralsoyları7 ,8,,9üretiminde kendi farklılaşma potansiyelini koruyarak sinir sistemi fonksiyonu ve gelişimi için arzu edilen bir model sistemi sağlar. Pre-ve post-sinaptik protein modifikasyonları da dahil olmak üzere sinaptik özellikleri ile birlikte nötrit sayısı, yoğunluk, uzunluk ve genişlik, burada sunulan yöntem kullanılarak güvenilir ve verimli bir şekilde ölçülebilen nötrit ve sinaptik değişiklikler arasındadır.
Dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu ve otizm gibi nörolojik hastalıkların yaygınlığı bir artış nedeniyle, çocuklar üzerinde çevresel kimyasalların nörotoksisite potansiyeli bir kamu endişe kalır15,26. Bu nedenle, güvenilir ve verimli nörotoksisite değerlendirmesi için hNPCs kaynaklı nöronların kullanılabilirliği de incelenir. Şekil 4'tegösterildiği gibi, hNPC'ler 384 kuyulu plakalarda nörotoksisite değerlendirmesi için uyarlanabilir ve ölçeklendirilebilir.
Tanıtılan hücre modeli için bir uygulama olarak nörotoksisite değerlendirmesi ya 384-iyi plakalar kaplama önce nörosferler nöronlar ayırt veya nörosferler 384-iyi plakalar tek hücreler olarak kaplanmış ise hücreleri ayırt edilebilir. İkinci yaklaşımda, tek hücrelere ayrıştırılabilen nörosferlerin tam sayısını kaplamak için yüksek hassasiyetli pipetleme becerileri ve ayrıca farklılaşma yada ortama sahip aşağıdaki tedavi prosedürleri için gereklidir. Gerekli pipetleme becerileri göz önüne alındığında, kaplama önce farklılaşma daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tavsiye edilir. Ayrıca, floresan aktif hücre sıralama (FACS) tarafından toplu hücre sıralama da potansiyel olarak doğru yüksek hassas pipetleme becerileri için ihtiyaç atlatmak için gerekli hücre sayısını ayırmak için kullanılabilir.
Bu nontoxic konsantrasyonulaşmak için aynı bileşiğin çeşitli dozlarda tekrarlanan nötrit outgrowth tahlilleri önlemek için nörotoksisite değerlendirmesi ile nötrit outgrowth tahlil başlatmak için tavsiye edilir. Bu nedenle, test bileşiklerinin bir doz-yanıt eğrisi karşı Parlak hücre canlılık testi kullanarak bir nörotoksisite değerlendirmesi birleştirerek minimum çaba ile doğru dozbulma neden olacaktır. Parlak hücre canlılığı analizi, hücre kültüründeki canlı hücrelerin sayısını belirlemek için son derece hassas bir yöntemdir. Yöntem, hücremetabolizmasının bir göstergesi olarak kültürde mevcut OLAN ATP'nin nicelliği üzerinde çalışır. Test testinin ekleme, karıştırma ve ölçü biçimi, test bileşiklerinin hücre canlılığını ve sitotoksisitesini kontrol etmek için basit ve hızlı bir yaklaşım sağlar.
Sunulan protokolde aşağıdaki gibi bazı sınırlamalar vardır. Kullanılabilirlik ve doğal değişkenlik nedeniyle, fizyolojik olarak ilgili birincil hücrelerin kullanımı sınırlıdır25. hNPC'ler yavaş bir çoğalma oranına sahiptir, bu da kullanımını sınırlandırabilir. Nöronların floresan görüntülerinin manuel büyük ölçekli analizi zaman alıcı dır ve deneyci önyargısına karşı hassastır. hNPC'ler genç nöral hücreler olarak düşünülebilir, bir kişinin yaşamı boyunca hücrelerde biriken yaşa bağlı epigenetik modifikasyonları temsil etmez. Nörodejeneratif bozukluklar yaşlı bireylerde ortaya çıkar gibi, hNPCs geç başlangıçlı durumlar için uygun bir model olmak için yeterli fizyolojik alaka eksikliği olabilir.
Hayvan modelleri ve hücre hatları hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaları niçin deşifre etmede değerli olsa da, bulguların insan terapötiklerine çevrilmesinde sınırlamalar göstermiştir27,28,29,30. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) ve insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) hNPCs yanında daha iyi in vitro hücre modelleri olarak kabul edilir, insan fizyolojisi özetleme. Bu nedenle hiPSCs- ve HESCs- türetilmiş nöronlar da potansiyel olarak neurite outgrowth test ve nörotoksisite değerlendirmesi için iki alternatif hücre kaynağı olarak kullanılabilir, protokol burada sunulan kullanarak1,31.
Sonuç olarak, hNPC'lerin birincil insan hücresi modeli olarak yüksek çeviri potansiyeli ve fizyolojik önemi, daha önce bahsedilen sınırlamalardan daha ağır sonuçlanan nisit büyümeile ilişkili ilaç keşif taramaları ve nörotoksisite değerlendirmesinde değerli bir başvuru alanı sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışması olduğunu belirtmez.
Acknowledgments
Bu araştırma MAF'ye verilen NIMAD araştırma hibesi (940714) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
