Summary
Il protocollo presentato descrive un metodo per un saggio di escrescenza neurite e la valutazione della neurotossicità di piccoli composti molecolari.
Abstract
Neurite analisi di escrescenza e la valutazione della neurotossicità sono due studi principali che possono essere eseguiti utilizzando il metodo presentato qui. Questo protocollo fornisce un'analisi affidabile della morfologia neuronale insieme alle misurazioni quantitative delle modifiche sulla lunghezza dei neuriti e sulla localizzazione delle proteine sinaptiche e sull'abbondanza al trattamento con piccoli composti molecolari. Oltre all'applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità può essere eseguita per valutare, distinguere e classificare i composti chimici commerciali in base al loro potenziale effetto di neurotossicità dello sviluppo.
Anche se le linee cellulari sono oggi ampiamente utilizzate nei saggi di screening composto nelle neuroscienze, spesso differiscono geneticamente e fenotipicamente dalla loro origine tissutale. Le cellule primarie, d'altra parte, mantengono importanti marcatori e funzioni osservate in vivo. Pertanto, a causa del potenziale di traduzione e rilevanza fisiologica che queste cellule potrebbero offrire analisi di crescita neurite e la valutazione della neurotossicità possono notevolmente beneficiare dell'utilizzo di cellule progenitrici neurali umane (hNPC) come modello cellulare umano primario.
Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre la crescita di neurite e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana."
Introduction
La crescita di Neurite è un processo fondamentale per la formazione della rete neuronale e la rigenerazione del nervo1,2. A seguito di un infortunio, la crescita dei neuriti svolge un ruolo chiave nella rigenerazione del sistema nervoso. L'escrescenza di Neurite è anche un elemento importante della segnalazione extracellulare nell'indurre attività rigenerative neuronali per migliorare i risultati per disturbi neurodegenerativi e lesioni neuronali3,4,5,6.
Mantenendo il loro potenziale di differenziazione nella produzione di vari lignaggi neurali, le cellule progenitrici neurali umane (hNMC) potrebbero fornire un sistema modello per gli studi sulla funzione del sistema nervoso centrale (CNS) e sullo sviluppo7,8,9. L'elevato potenziale traslazionale e la rilevanza fisiologica degli hNMC come modello primario di cellule umane offrono un notevole vantaggio negli screening di scoperti di farmaci legati alla crescita neurite. Tuttavia, la manutenzione e il ridimensionamento dei modelli cellulari primari per i test ad alto consumo potrebbero richiedere molto tempo e molta mano doperante10,11,12,13.
Oltre all'applicazione del metodo presentato negli studi sulla neurite outgrowth, la valutazione della neurotossicità è un'altra applicazione che utilizza i neuroni derivati dall'hNPC. Ci sono migliaia di composti chimici commerciali che non vengono esaminati o con un potenziale di neurotossicità poco compreso. Pertanto, esperimenti di screening più affidabili ed efficaci per valutare, distinguere e classificare i composti in base al loro potenziale di provocare neurotossicità dello sviluppo è molto richiesto14. L'aumento della prevalenza e dell'incidenza di disturbi neurologici insieme all'abbondanza di composti non testati nell'ambiente richiede lo sviluppo di esperimenti più affidabili ed efficienti per identificare composti ambientali pericolosi che possono rappresentare la neurotossicità15.
Il metodo presentato qui può essere utilizzato per lo screening per la capacità dei composti di indurre neurite ecrescita e neurotossicità sfruttando i neuroni derivati dalla cellula progenitore neurale umano, un modello cellulare che rappresenta da vicino la biologia umana.
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Protocol
Dichiarazione etica: Gli esemplari fetali sono stati ricevuti dal Birth Defects Research Laboratory dell'Università di Washington a Seattle attraverso un programma di distribuzione dei tessuti sostenuto dal National Institute of Health (NIH). Il Birth Defects Research Laboratory ha ottenuto un adeguato consenso informato scritto dai genitori e l'approvvigionamento dei tessuti è stato monitorato dall'Institutional Review Board dell'Università di Washington. Tutto il lavoro è stato svolto con l'approvazione dell'Ufficio di Ricerca Sulla Materia Umana dell'Università di Miami8.
1. Isolamento e coltura di cellule progenitrici neurali umane (hNPC)
- Mettere il tessuto cerebrale in una parabola Petri da 100 mm e rimuovere con attenzione le meningi con la pinze.
- Trasferire il tessuto cerebrale in un tubo conico da 50 mL e lavarlo due volte con 20 mL di PBS invertendo delicatamente il tubo.
- Incubare il tessuto cerebrale in un nuovo tubo conico da 50 mL immergendo il tessuto nella soluzione di dissociazione cellulare (cfr. tabella dei materiali)e DNase I (10 U/mL) per 10 min a 37 .
- Aggiungere 5 mL di mezzo di coltura cellulare neuronale (vedi Tabella dei materiali)al tessuto cerebrale contenente tubo e dissociare meccanicamente le neurosfere triturando da 20 a 30 volte attraverso una punta di pipet da 1000 per effettuare una sospensione a singola cellula.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare di 70 m per rimuovere i cluster di cellule.
- Semina la sospensione a cella singola in un flacone T-25 ventilato dotato di 5-10 mL di coltura cellulare neuronale medio integrato con componenti descritti nella tabella 1.
- Sterilizzare la soluzione di eparina filtrando attraverso un filtro di 0,2 m. Il supplemento B-27 senza vitamina A è un integratore senza siero per la coltivazione di progenitori neurali e cellule staminali, senza indurre differenziazione.
NOTA: le cellule progenitrici neurali umane (hNMC) sono isolate dal cervello fetale umano raccolto dal feto abortito. Dopo 7-10 giorni di coltura, le cellule staminali neurali (NSC) formano colonie di neurosfera fluttuanti, mentre altri tipi di cellule rimangono in sospensione come singole cellule o si attaccano al fondo del pallone. Gli hNMC isolati possono essere coltivati come neurosfere in sospensione per diversi mesi8,16,17.
- Sterilizzare la soluzione di eparina filtrando attraverso un filtro di 0,2 m. Il supplemento B-27 senza vitamina A è un integratore senza siero per la coltivazione di progenitori neurali e cellule staminali, senza indurre differenziazione.
| Quantità | Componente |
| 100 ll | EGF (20 ng/mL) |
| 100 ll | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, Meno vitamina A (50X) |
| 1 mL | L-alanyl-L-glutamine (100X) (vedi tabella dei materiali) |
| 4 ll | Eparina (2 g/mL) |
| 96,8 mL | Mezzo di coltura cellulare neuronale (vedi tabella dei materiali) |
Tabella 1. Componenti necessari per la produzione di 100 mL di supporti di coltura
2. Passare gli hNPC
- Raccogliere i supporti contenenti le sfere galleggianti, neurosfere grandi e piccole, e trasferirli in un tubo conico da 50 mL.
NOTA: A causa di motivi sconosciuti, i tempi per la divisione delle neurosfere sono variabili da 7 a 30 giorni. Tuttavia, in generale, le neurosfere devono essere passaggiate quando raggiungono un diametro maggiore di 700-900 m. Questo è quando il centro della neurosfera inizia a scurirsi, che è considerato come un segno di un alto tasso di morte cellulare18. - Ruotare le neurosfere verso il basso per centrifugazione a 300-400 x g per 3 min.
- Aspirare con attenzione il superatatore e poi immergere le sfere in 500 -L di reagente di dissociazione delle cellule scongelate (vedi Tabella dei materiali).
- Rendere le aliquote del reagente di dissociazione cellulare aggiungendo 500 l per 1,5 mL di microtubi e conservare a -20 gradi centigradi. Per evitare di perdere l'attività enzimatica, scongelare il reagente di dissociazione cellulare tenendo a RT o caldo per 5 min in un bagno di acqua / perline 37 C.
- A seconda della densità e delle dimensioni delle sfere, incubare le sfere sommerse a 37 gradi centigradi per 5-15 min.
- Aggiungere 5-10 mL di mezzi di coltura preriscaldati alle neurosfere contenenti 50 mL di tubi conici e centrifugare a 300-400 x g per 5 min per sedimentare le neurosfere.
- Aspirare il superatante e delicatamente pipetta su e giù, utilizzando una pipetta 1000 L, in 2 mL di mezzi di coltura fino a quando tutte le neurosfere sono in una sospensione a cella singola.
NOTA: La dissociazione diventerà visibile ad occhio nudo. Prima della dissociazione, le neurosfere sono sotto forma di sfere. Dopo l'immersione nella dissociazione reagente e pipettando su e giù, diventeranno singole cellule.- Contare le cellule e piastrare le singole cellule, da 2 a 3 milioni di cellule per T-25 fiaschetta in 10 mL di mezzi di coltura.
- Alimenta le cellule ogni 3 giorni sostituendo metà dei mezzi di coltura.
- Risolvi le neurosfere appoggiando il pallone in modo che sia sul suo angolo inferiore. Tenere il pallone in posizione per circa 1-2 min fino a quando le neurosfere sedimentano. Poi aspirare metà dei media delicatamente inserendo la pipetta sierologica nei media sopra le neurosfere stabilite. Le cellule dissociate possono aggregarsi per formare sfere dopo 2 o 3 giorni in coltura19.
3. Congelamento degli hNPC
- Preparare il mezzo di congelamento delle cellule aggiungendo DMSO ai supporti di coltura a una concentrazione finale del 10% (v/v) o utilizzare il mezzo di crioconservazione disponibile in commercio per i tipi di cellule sensibili (vedere Tabella dei materiali).
- Ordinare grandi sfere trasferendo i media in un tubo conico 50 mL e lasciando che le sfere si stabilizzano per gravità. Quindi rimuovere e trasferire le grandi neurosfere in un nuovo tubo conico da 50 mL per passare utilizzando una punta di pipet da 200 o 1000 l.
NOTA: Le neurosfere con un diametro superiore a 900 m sono considerate grandi e quelle con un diametro inferiore a 500 m sono considerate piccole. - Ruotare le neurosfere rimanenti verso il basso per centrifugazione a 300-400 x g per 3 min. Rimuovere con attenzione il supernatante.
- Risospendere fino a 100 sfere in 1 mL di reagente crioconservazione e trasferirlo in un criotubo.
- Conservare durante la notte a -80 gradi centigradi in un contenitore di congelamento delle cellule (vedere Tabella dei materiali)e spostarlo in azoto liquido il giorno successivo per lo stoccaggio a lungo termine.
NOTA: È preferibile congelare le neurosfere di piccole e medie dimensioni (di un diametro inferiore a 900 m) ed evitare di congelare le neurosfere di grandi dimensioni (più di 900 m di diametro) o singole cellule. Al fine di ridurre i danni alle cellule durante lo scongelamento del campione, mantenere le cellule dense seminando le neurosfere scongelate in una piccola fiaschetta T25.
4. Differenziazione e trattamento degli hNPC
NOTA: Per indurre la differenziazione, le neurosfere vengono disaggregate in singole cellule, conteggiate e poi semiate su piastre rivestite per 5 giorni. Quindi le cellule differenziate vengono trattate per 24 h con composti di prova prima dell'immunostaining e della quantificazione della fluorescenza.
- Rivestimento
- Aggiungere 200 l di poli-L-lisina (PLL) per pozzo di 4 bicchieri da camera (140 -L per vetrini a 8 camere).
- Incubare per 1 h a temperatura ambiente (RT).
- Lavare 3x con PBS.
- Lasciare asciugare a RT (per circa 30 min).
- Aggiungete 150 l di laminina (50 g/mL) per pozzetti di 4 pozzetti in vetro (120 l per pozzetti da camera a 8 pozzetti).
- Incubare per 2 h a 37 .
- Lavare 3x con PBS.
NOTA: I vetrini a camera rivestita possono essere conservati a 4 gradi centigradi per 1 mese.
- Placcatura delle cellule
- Contare e placcare 80.000 neurosfere a cellule singole (neurosfere in una sospensione a cella singola) per pozzo di vetrini a 4 camere (70.000 cellule per pozzo di scivolo camera 8-well).
- Aggiungere 500 l di supporti di differenziazione per pozzo di 4 camere (250 -L media per pozzo di 8-well diapositive camera).
- Per rendere prima il supporto di differenziazione, aggiungere i seguenti componenti nella Tabella 2 a un contenitore sterile e usa e getta per rendere il supporto di induzione neurale (NIM).
- Aggiungere i seguenti ingredienti nella tabella 3 a 48,5 mL di NIM realizzati nel passaggio precedente per realizzare i supporti di differenziazione.
- Incubare per 5 giorni a 37 gradi centigradi.
- Dopo 5 giorni, trattare le cellule per 24 h sostituendo metà dei supporti in ogni pozzo con supporti freschi mescolati con la concentrazione desiderata di composti di prova, compresi i controlli appropriati.
| Quantità | Componente |
| 49 mL | DMEM/F-12 |
| 0,5 mL | Supplemento N2 (100X) |
| 0,5 mL | MEM aminoacidi non essenziali (100X) |
| 2 ll | Eparin (2 g/mL) (Stock Conc. è 50 mg/mL) |
Tabella 2. Componenti necessari per fare 50 mL di NIM
| Quantità | Componente |
| 1 mL | B-27 (50X) |
| 500 lL | Antibiotico-antimicotico (100X) |
| 5 ll | Acido retinoico (0,1 m) |
| 50 ll | GDNF (10 g/mL) |
| 50 ll | BDNF (10 g/mL) |
| 5 ll | L'acido ascorbico (0,2 g/mL) (Stock Conc. è 2 mg/mL) NOTA: Consigliato per essere fatto fresco. |
| 48,5 mL | Nim |
Tabella 3. Componenti necessari per la creazione di 50 mL di supporti di differenziazione
5. Immunocitochimica (ICC)
NOTA: Le cellule sono fissate con il 4% di formaldeide. La permeabilizzazione e il blocco vengono quindi eseguiti per migliorare la penetrazione e prevenire il legame non specifico degli anticorpi. Le cellule vengono poi incubate con anticorpi primari durante la notte. Successivamente, le cellule vengono incubate con anticorpi secondari etichettati fluorescentmente. Infine, dopo aver usato DAPI per macchiare il nucleo, vengono montati scivoli da camera.
- Fissazione
- Aspirare delicatamente i supporti in ogni pozzo.
- Aggiungere 500 l di 4% di formaldeide per vetrini a 4 pozzetti (250 -L per pozzetti a camera 8-well).
- Incubare per 15 min a RT.
- Lavare delicatamente 2x con 500 gradi l di PBS.
NOTA: Dopo la fissazione, lasciando 1 mL di PBS in ogni pozzo, i vetrini di coltura possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
- Permeabilizzazione e blocco delle cellule
- Aggiungere i seguenti componenti nella tabella 4 a un contenitore sterile e usa e getta per creare il buffer anticorpo (Ab).
- Mescolare i seguenti ingredienti nella tabella 5 con il buffer Ab realizzato nel passaggio precedente per rendere la soluzione di blocco e permeabilizzazione cellulare.
- Aggiungere 500 l per pozzetti di 4 camere da camera e incubare per 1 h a RT.
NOTA: Il buffer Ab può essere memorizzato a 4 gradi centigradi.
| Quantità | Componente |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3,6 g | L-lisina (100 mM) |
| 8 g | Azide di sodio (4%) |
| 200 mL | Acqua distillata. NOTA: Sciogliere inizialmente i componenti necessari in 150 mL di acqua, quindi regolare a 200 mL. |
Tabella 4. Componenti necessari per la produzione di 200 mL di buffer anticorpo
| Quantità | Componente |
| 600 ll | 20% Siero di capra |
| 6 ll | 0,2% Triton-X100 |
| 2394 L L | Buffer anticorpo. NOTA: inizialmente sciogliere i componenti necessari in 2 mL di ab buffer, quindi regolare al pH 7.4. Quindi aggiungere più Ab buffer per regolare al volume finale di 3 mL e filtro sterilizzare. |
Tabella 5. Componenti necessari per la realizzazione di 3 mL di permeabilizzazione cellulare e soluzione di blocco
- Colorazione
- Lavare 2x con 500 gradi l di PBS.
- Aggiungete l'anticorpo primario diluito, l'anti-tubulina III (1:200) e incubate peruna durante la notte a 4 gradi centigradi (200 gradi l per pozzetti a 4 camere). Diluire l'anticorpo primario in PBS.
- Lavare 2x con PBS.
- Aggiungere il diluito, in PBS, anticorpo secondario con etichetta fluorescente, Alexa Fluor 488 (1:500), e incubare per 2 h a RT in un luogo protetto dalla luce (250 l per vetrini a 4 camere)
- Lavare 2x con PBS.
- Aggiungere il diluito, in PBS, DAPI (concentrazione 300 nM) e incubare per 5 min a RT in un luogo protetto dalla luce (300 -L per pozzo di 4-bene diapositive camera).
- Lavare 3x con PBS.
- Montare le diapositive della camera seguendo le istruzioni riportate di seguito.
- Smontare lo scivolo della camera rompendo le linguette di rottura e rimuovendo la guarnizione e la base.
- Aggiungere una goccia della soluzione di montaggio (vedere Tabella dei materiali) per pozzo di 4 camere vetrini. Quindi utilizzare una diapositiva di copertura per coprire l'intera diapositiva.
- Utilizzando una pinzetta e ad un angolo, posizionare un lato del coperchio scivolare contro il vetrino mentre si entra in contatto con il bordo esterno della goccia di liquido.
- Puntare con attenzione il coperchio sulla soluzione di montaggio quando lo si abbassa in posizione. Evitare la creazione di bolle. Prendi una punta di pipetta e premila sul coperchio del coperchio. Le bolle si sposteranno di lato.
NOTA: La formazione di bolle è inevitabile a volte. Se si verifica, l'immagine intorno a loro fino a quando ci sono alcuni. - Seguire le indicazioni del produttore per il tempo di stagionatura. Evitare di utilizzare soluzioni di montaggio non curing a causa della difficoltà di manipolazione durante l'imaging. In caso contrario, è necessario utilizzare un sigillante coverslip appropriato sui bordi per evitare che il coperchio scivoli durante l'imaging.
- Per sigillare la coverslip, utilizzare lo smalto e fare una piccola linea sul bordo della cover slip. Lasciare asciugare lo smalto per circa 2 min.
6. Acquisizione di immagini, escrescenza neurite e quantificazione dell'intensità della fluorescenza
NOTA: Dopo la colorazione, utilizzare un microscopio confocale con un obiettivo 20x e una dimensione dell'immagine di 1024 x 1024 pixel per acquisire le immagini delle cellule trattate. Prendere immagine almeno da due campi per replica biologica per condizione. Quindi utilizzare il software di analisi delle immagini Fiji (ImageJ 1.51u) per la quantificazione della lunghezza neurite. In breve, misurare la lunghezza della neurite più lunga per ogni neurone e dopo aver in media i valori per trattamento, utilizzare il test di sstudente per i gruppi indipendenti per confrontare i mezzi tra gruppi sperimentali e gruppo di controllo.
NOTA: sono disponibili diversi programmi di elaborazione delle immagini commerciali (Imaris, Volocity, Amira) e open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME). Tra questi programmi, ImageJ è diventato lo strumento di scelta per l'analisi biologica delle immagini20,,21. Il portale ImageJ presso https://imagej.net/Introduction è un'utile fonte di informazioni che fornisce una descrizione approfondita delle funzioni di base e predefinite di ImageJ, tra cui l'elaborazione delle immagini, la colocalizzazione, la deconvoluzione, la registrazione, la segmentazione, il monitoraggio e la visualizzazione.
- Misurazione della crescita neuronale con il software di analisi delle immagini Fiji
- Come illustrato nella Figura 1, aprire l'immagine trascinandola e rilasciandola sul software Fiji o selezionando File Aperto.
- Selezionare Analizza . Proprietà Tools (Strumenti) Gestione ROI, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'icona 5nella barra degli strumenti Straight e passare alla linea a mano libera. Facoltativamente, fare doppio clic sulla stessa icona per modificare lo spessore della linea in 10, quindi tracciare il neurite più lungo, iniziando vicino al corpo della cella e estendendosi fino alla punta del neurite.
- Premere Ctrl e T e quindi F per aggiungere la misura a Gestione ROI ed evidenziare il neurone misurato. Selezionare tutti i numeri nel ROI, fare clic su Misura, selezionare tutte le lunghezze calcolate e copiare/incollare in un foglio di calcolo.
- Misurazione dell'intensità di fluorescenza delle cellule etichettate con il software di analisi delle immagini Fiji
- Come illustrato nella Figura 2, dopo aver aperto l'immagine, fare clic sull'icona 4th nella barra degli strumenti Selezioni a mano libera. Disegnare la forma della cella.
- Selezionare Analizza . Impostare Misure e selezionare per i seguenti valori: Area, Densità integrata, Valore grigio medio . Proprietà Analyze . Misura (si apre una finestra pop-up con una pila di valori).
- Selezionare un'area accanto alla cella come sfondo (la dimensione non è importante) e quindi selezionare Analizza . Misurare. Selezionare tutti i dati misurati e copiare/incollare in un foglio di calcolo.
NOTA: Densità integrata (IntDen) è l'elemento utilizzato per determinare le intensità fluorescenti. In questo studio viene misurata l'intensità fluorescente della molecola bersaglio per analizzare inizialmente la sua distribuzione nella cellula e successivamente quantificare l'abbondanza della molecola bersaglio in vari trattamenti. Di conseguenza, l'efficacia dei trattamenti sarà misurata e confrontata con il controllo.
7. Valutazione della neurotossicità
NOTA: la citotossicità dei composti di prova viene valutata in piastre a 384 pozze (vedere Tabella dei materiali)utilizzando un saggio di fattibilità delle cellule luminescenti (vedere Tabella dei materiali). Gli hNMC sono preparati seguendo lo stesso metodo, ad eccezione di lievi modifiche, descritte nella sezione "Differenziazione e trattamento degli hNMC". Successivamente, viene misurato un segnale luminescente generato dal saggio di fattibilità delle cellule luminescenti utilizzando un lettore di microplacia. Il segnale luminescente è proporzionale alla concentrazione cellulare di ATP che a sua volta è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali presenti in ogni pozzo.
- Rivestimento
- Aggiungete 30 l di poli-L-lisina (PLL) per pozzo di 384 pozzetti.
- Incubare per 1 h a RT.
- Lavare 2x con PBS.
- Lasciare asciugare a RT (per circa 30 min).
- Aggiungere 30 l di laminina (50 g/mL) per pozzo di 384 pozzetti.
- Incubare per 2 h a 37 .
- Lavare 2x con PBS.
NOTA: Le piastre rivestite di 384 pozze possono essere conservate a 4 gradi centigradi per 1 mese.
- Placcatura delle cellule
- Contare e placcare 20.000 neurosfere a cella singola per pozzo di 384 pozzetti in 25 - L di supporti di differenziazione.
- Incubare per 5 giorni a 37 gradi centigradi.
- Dopo 5 giorni, trattare le cellule per 24 h con composti di prova preparati a 6 volte la concentrazione desiderata finale in volume di 5 gradi (per rendere il volume finale di 30 gradi per pozzo).
- Saggio di fattibilità cellulare
- Aggiungete 30 -L di raddicere per saldatura di 384 pozzetti.
NOTA: Aggiungere un volume di reagente di saggio di fattibilità cellulare luminescente uguale al volume presente in ogni pozzo. Scongelare la vitalità cellulare luminescente saggio reagente ed equilibrate a RT prima dell'uso. - Agitare su uno shaker piastra per 2 minuti (per mescolare e indurre lisi cellulare).
- Ruotare la miscela verso il basso per centrifugazione a 300-400 x g per 30 s.
- Incubare la piastra da 384 pozzetto per 10 min in un luogo protetto dalla luce (per stabilizzare il segnale luminescente).
- Registrare la luminescenza con un lettore di microplacino.
NOTA: Utilizzare i controlli appropriati per il saggio di fattibilità, tra cui Velcade (a una concentrazione finale di 10 m) come positivo e HBSS contenente DMSO (con concentrazione finale dello 0,1% o 0,2%) come controllo negativo.
- Aggiungete 30 -L di raddicere per saldatura di 384 pozzetti.
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Representative Results
Il protocollo presentato nel manoscritto è stato utilizzato con successo in due articoli pubblicati di recente22,23. La figura 3 mostra l'uso di neuroni derivati da hNPC nell'esaminare l'effetto degli inibitori HDAC come composti epigenetici sull'estensione dei neuriti come marcatore per la escrescenza dei neuriti e la successiva capacità neurogenica dei composti molecolari di piccole dimensioni.
Inoltre, nella Figura 4 la neurotossicità dei composti testati (inibitori HDAC) viene valutata anche differenziando contemporaneamente gli hNPC in piastre a 384 pozze, mostrando il potenziale del modello cellulare presentato (hNPC) per la valutazione della neurotossicità e la capacità di scalare fino a testare la neurotossicità per un numero maggiore di composti.
In un altro documento di Sartor et al. (Figura 5), la misurazione dell'intensità della fluorescenza delle cellule neuronali per quantificare l'abbondanza di H4K5ac, come un marchio di istone, dopo aver trattato i neuroni differenziati dagli hNPC con composti epigenetici è dimostrata con successo23. Inoltre, come illustrato nella Figura 6, in un lavoro inedito, il protocollo è stato utilizzato per visualizzare una proteina presinaptica, la sinaptofiina, per verificare il possibile effetto sinaptogenico dei piccoli composti molecolari.
Figura 1: Flusso di lavoro passo-passo che illustra un approccio per misurare la crescita neuronale con il software di analisi delle immagini Fiji. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro passo-passo che illustra un approccio per quantificare l'intensità di fluorescenza delle cellule neuronali con il software di analisi delle immagini Fiji. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Neurite escrescenza di svalutazione con piccoli composti epigenetici molecolari.
(A) Immagini fluorescenti rappresentative (ingrandimento 20x) per il trattamento di neuroni derivati da hNPC con inibitori HDAC basati sull'idrossimia. Le cellule progenitrici neurali umane sono differenziate per 5 giorni; quindi trattata per 24 h con 0,1% DMSO (come controllo) e Trichostatin A, JNJ26481585, SB939 e PCI24781 (come composti di prova). Quindi l'immunostaining viene eseguita con anticorpi neuronali-tubulina III (verde) per visualizzare i processi neuronali e quantificare le lunghezze dei neuriti e DAPI (blu) per visualizzare i nuclei cellulari. (B) Analisi statistica della lunghezza dei neuriti in vari gruppi. Come raffigurato, tutti i composti di prova possono indurre escrescenza neurite. L'analisi quantitativa della lunghezza dei neuriti viene effettuata utilizzando il software ImageJ. Le barre di errore rappresentano SEM; p < 0,001, szp < 0.0001. Questa cifra è stata modificata da Bagheri et al.22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione della neurotossicità utilizzando il saggio di vitalità cellulare luminescente.
gli hNMC sono semi e differenziati ai neuroni nella piastra 384-well secondo lo stesso metodo utilizzato per il saggio di escrescenza neurite. Successivamente viene misurato l'effetto dei composti di prova sulla vitalità delle cellule dopo 24 h di esposizione. Come mostrato, non c'è tossicità significativa sui trattamenti. Unidirezionale ANOVA viene utilizzato per l'analisi dei dati e un valore p < 0,05 è considerato statisticamente significativo. Questa cifra è stata modificata da Bagheri et al.22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: RGFP966 aumenta H4K5ac nei neuroni differenziati dalle cellule progenitrici neurali umane.
(A) Rappresentativa dell'immunofluorescenza di tubulina, DAPI e H4K5ac in seguito al trattamento con DMSO, RGFP966 o RGFP966 - JQ1 nei neuroni derivati da hNPC. (B) Quantificazione dell'intensità di fluorescenza di H4K5ac a seguito di trattamento con DMSO, RGFP966 o RGFP966 - JQ1. Le barre di errore rappresentano SEM; p < 0.0001. Questa cifra è stata modificata da Sartor et al.23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Rappresentativa dell'immunofluorescenza di Synaptophysin (rosso) per visualizzare i terminali sinaptici, la tubulina (verde) per visualizzare i processi neuronali e DAPI (blu) per visualizzare i nuclei cellulari dopo il trattamento con DMSO (come controllo) e SB939 (come composto di prova) nei neuroni derivati dagli hNPC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo è uno dei pochi articoli pubblicati che descrivono il test per la lunghezza della neurite al trattamento con composti di prova. Inoltre, descriviamo come utilizzare gli hNPC per un saggio di escrescenza di neurite e una valutazione della neurotossicità. Utilizzando questa valutazione di analisi e neurotossicità della neurite e della neurotossicità sui neuroni derivati dagli hNFC, il potenziale neurogenico di una categoria di composti epigenetici di piccole molecole, inibitori HDAC, nell'indurre la crescita del neurite è dimostrato22. Inoltre, in un altro articolo presentato da Sartor et al., questo protocollo viene utilizzato per quantificare l'intensità di fluorescenza di H4K5ac, una proteina istone, al trattamento con diversi composti modificatori epigenetici23.
La funzione cognitiva si basa su un corretto cablaggio e connessioni funzionali all'interno dei circuiti neuronali. La quantificazione dettagliata e coerente di vari aspetti della morfologia neuronale come approccio di screening fenotipico è essenziale per ottenere una comprensione affidabile delle vie sottostanti che portano a disturbi cerebrali che vanno dal neurosviluppo ai disturbi psichiatrici. Lo screening fenotico è considerato un approccio particolarmente efficace nell'esplorazione di composti di piccole molecole come candidati di farmaci putativi per modulare un fenotipo cellulare. In questo approccio, invece di interrogare un solo obiettivo, tutti i componenti e i percorsi della cella vengono esaminati24.
La morfologia neuronale, compresa la forma, la struttura e la connettività, sono considerate caratteristiche chiave della funzione neuronale. Le perturbazioni genetiche che alterano la morfologia dei neuroni o la localizzazione e il livello delle proteine sinaptiche potrebbero contribuire in particolare all'analisi delle mutazioni che causano malattie. Pertanto, sono necessari metodi affidabili per valutare l'impatto dei perturbagens sulla morfologia neuronale25.
Gli hNMC, sono isolati dal cervello dei mammiferi embrionali, che vengono successivamente coltivati in vitro in presenza di mitogeni. Queste cellule sono costituite da neurosfere che sono caratterizzate come aggregati cellulari galleggianti costituiti da cellule progenitrici neurali e cellule gliali radiali. Gli hNMC forniscono un sistema modello desiderabile per la funzione e lo sviluppo del sistema nervoso mantenendo il loro potenziale di differenziazione nella produzione di varie linee neurali7,8,9. Il numero di neurite, l'intensità, la lunghezza e la larghezza insieme alle caratteristiche sinaptiche, tra cui le modifiche alle proteine pre e post-sinaptiche, sono tra i cambiamenti neuritici e sinaptici che potrebbero essere misurati in modo affidabile ed efficiente utilizzando il metodo presentato nel presente documento.
A causa di un aumento della prevalenza di disturbi neurologici come disordine di iperattività di deficit di attenzione e autismo, il potenziale di neurotossicità delle sostanze chimiche ambientali sui bambini rimane una preoccupazione pubblica15,26. Pertanto, viene esaminata anche l'usabilità dei neuroni derivati dagli hNPC per una valutazione della neurotossicità affidabile ed efficiente. Come dimostrato nella Figura 4, gli hNPC potrebbero essere adattati e scalati per la valutazione della neurotossicità in piastre a 384 pozze.
La valutazione della neurotossicità come applicazione per il modello cellulare introdotto è fattibile differenziando le neurosfere nei neuroni prima di placcarsi in piastre a 384 pozze o differenziando le cellule mentre le neurosfere sono placcate in piastre 384-well come singole cellule. In quest'ultimo approccio, sono necessarie abilità di pipettaggio ad alta precisione per classificare il numero esatto di neurosfere che vengono disaggregate in singole cellule e anche per le seguenti procedure di trattamento con mezzi che inducono differenziazione. Considerando le capacità di pipettatura richieste, la differenziazione prima della placcatura è raccomandata per ottenere risultati più riproducibili. Inoltre, lo smistamento di cellule sfuse per fluorescenza ha attivato lo smistamento delle cellule (FACS) potrebbe anche essere potenzialmente utilizzato per separare con precisione il numero richiesto di cellule che eludono la necessità di abilità di tubazione ad alta precisione.
Si consiglia di iniziare il saggio di escrescenza di neurite dalla valutazione della neurotossicità per evitare ripetuti saggi di escrescenza di neurite con varie dosi dello stesso composto per raggiungere la concentrazione non tossica. Pertanto, combinando una valutazione della neurotossicità utilizzando il saggio di fattibilità cellulare luminescente contro una curva dose-risposta di composti di prova si tradurrà nella ricerca del dosaggio giusto con il minimo sforzo. Il saggio di vitalità cellulare luminescente è un metodo altamente sensibile per determinare il numero di cellule vitali in una coltura cellulare. Il metodo funziona sulla quantificazione dell'ATP presente nella coltura come indicatore del metabolismo cellulare. Il formato di aggiunta, combinazione e misurazione del saggio fornisce un approccio semplice e rapido per verificare la vitalità cellulare e la citotossicità dei composti di prova.
Ci sono alcune limitazioni al protocollo presentato come segue. A causa della disponibilità e della variabilità intrinseca, l'uso di cellule primarie fisiologicamente rilevanti è limitato25. Gli HNMC hanno un tasso di proliferazione lento, che potrebbe limitarne l'utilizzo. L'analisi manuale su larga scala delle immagini fluorescenti dei neuroni richiede molto tempo e è suscettibile di distorsione allo sperimentatore. Gli hNMC potrebbero essere considerati come cellule neurali giovani, non rappresentando modifiche epigenetiche legate all'età che si accumulano nelle cellule per tutta la vita di una persona. Poiché i disturbi neurodegenerativi si verificano negli individui più anziani, gli hNPC possono non avere un'adeguata rilevanza fisiologica per essere un modello appropriato per le condizioni di esordio tardivo.
Anche se i modelli animali e le linee cellulari sono stati preziosi per decifrare i meccanismi molecolari alla base delle malattie, hanno mostrato limitazioni nella traduzione dei risultati in terapie umane27,28,29,30.30 Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e le cellule staminali embrionali umane (hESC) insieme agli HNPC sono considerate migliori nei modelli cellulari in vitro, ricapitolando la fisiologia umana. Pertanto hiPSCs- e hESCs- neuroni derivati possono anche potenzialmente essere utilizzati come due fonti cellulari alternative per analisi di escrescenza neurite e valutazione della neurotossicità, utilizzando il protocollo presentatoqui1,31.
In conclusione, l'elevato potenziale traslazionale e la rilevanza fisiologica degli hNPC come modello di cellule umane primarie forniscono un prezioso ricorso agli screening di scoperta di farmaci legati alla crescita e alla valutazione della neurotossicità che superano i limiti menzionati in precedenza.
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Disclosures
Tutti gli autori non indicano potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dalla borsa di ricerca NIMAD (940714) assegnata al MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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