Summary
제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.
Abstract
Neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가는 본원에 제시된 방법을 사용하여 수행될 수 있는 2개의 주요 연구이다. 이 프로토콜은 뉴라이트 길이 및 시냅스 단백질 국소화에 대한 수정의 정량적 측정과 함께 뉴런 형태학의 신뢰할 수있는 분석을 제공하고 작은 분자 화합물로 치료시 풍부합니다. 중성염 외성장 연구에서 제시된 방법의 적용 외에도, 신경 독성 평가는 잠재적인 발달 신경 독성 효과에 기초하여 상업적 화학 화합물을 평가, 구별 및 순위를 매기기 위해 수행될 수 있다.
세포주신경과학의 화합물 스크리닝 에세이에서 요즘 널리 사용되고 있지만, 종종 조직 기원과 는 유전적으로 다르습니다. 반면에 1차 세포는 생체 내에서 관찰되는 중요한 마커와 기능을 유지한다. 따라서, 이러한 세포가 중성자 성장 분석및 신경 독성 평가를 제공할 수 있는 번역 잠재력 및 생리적 관련성으로 인해 인간 신경 전구 세포(hNpC)를 1차 인간 세포 모델로 사용하여 상당히 유익할 수 있다.
본 명세서에서 제시된 방법은 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용하여 중성기 의 성장과 신경 독성을 유도하는 화합물의 능력을 선별하는 데 활용될 수 있다, 인간 생물학을 밀접하게 대표하는 세포 모델."
Introduction
중성성장은 뉴런 네트워크 형성과 신경재생1,,2의형성에 근본적인 과정이다. 부상 후, neurite 아웃 성장 신경계의 재생에 중요 한 역할을 한다. Neurite 아웃성장은 또한 신경 퇴행성 질환 및 신경 손상에 대한 결과를 향상시키기 위해 신경 재생 활동을 유도하는 세포 외 신호의 중요한 요소입니다3,,4,,5,,6.
다양한 신경 계보를 생성하는 데 있어 분화 잠재력을 유지함으로써, 인간 신경 전구 세포(hNpC)는 중추 신경계(CNS) 기능 및 개발7,,8,,9의연구를 위한 모델 시스템을 제공할 수 있다. 1 차인간 세포 모델로 hNPC의 높은 번역 잠재력 및 생리적 관련성은 neurite 아웃성장 관련 약물 발견 선별에서 상당한 이점을 제공합니다. 그러나, 고처리량 에 대한 1차 세포 모델의 유지 보수 및 스케일링은 시간이 많이 소요되고 노동 집약적인10,,11,,12,,13일수 있다.
중성기 외성장 연구에서 제시된 방법의 적용 외에도, 신경 독성 평가는 hNPC 유래 뉴런을 이용한 또 다른 응용이다. 검사되지 않거나 제대로 이해되지 않는 신경 독성 잠재력을 가진 수천 개의 상업적인 화학 화합물이 있습니다. 따라서, 보다 안정적이고 효과적인 스크리닝 실험은 개발 신경 독성을 유도하는 그들의 잠재력에 기초하여 화합물을 평가, 구별 및 순위를 매기는 데 큰 수요가14이다. 환경에서 테스트되지 않은 화합물의 풍부와 함께 신경 장애의 보급 및 발생률이 증가함에 따라 신경 독성을 유발할 수 있는 위험한 환경 화합물을 식별하기 위해 보다 신뢰할 수 있고 효율적인 실험이필요합니다(15)
본 명세서에서 제시된 방법은 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용하여 중성기 의 성장과 신경 독성을 유도하는 화합물의 능력을 선별하는 데 활용될 수 있으며, 이는 인간 생물학을 밀접하게 대표하는 세포 모델이다.
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Protocol
윤리 성명서: 태아 표본은 국립 보건원(NIH)이 지원하는 조직 분배 프로그램을 통해 시애틀에 있는 워싱턴 대학의 출생 결함 연구소로부터 수신되었습니다. 출생 결함 연구소는 부모로부터 적절한 서면 통보 동의를 얻고 조직의 조달은 워싱턴 대학의 기관 검토 위원회에 의해 모니터링되었다. 모든 작업은 마이애미 대학의 인간 과목 연구 사무소의 승인으로 수행되었다8.
1. 인간 신경 전구 세포의 격리 및 배양 (hNPC)
- 뇌 조직을 100mm 페트리 접시에 놓고 포셉을 사용하여 수막을 조심스럽게 제거합니다.
- 뇌 조직을 50mL 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 부드럽게 반전시켜 PBS 20mL로 두 번 씻습니다.
- 37°C에서 10분 동안 세포 해리 용액(재료표참조) 및 DNase I(10 U/mL)에서 조직을 침수하여 새로운 50mL 원추형 튜브에서 뇌 조직을 배양한다.
- 5mL의 신경 세포 배양 배지(재료표참조)를 튜브를 함유하는 뇌 조직에 추가하고 1000 μL 파이프 팁을 통해 20~30회 세리하게 하여 신경구를 기계적으로 해리시켜 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
- 세포 현탁액을 70 μm 세포 여과기를 통해 필터링하여 세포 클러스터를 제거합니다.
- 1표에상세한 성분으로 보충된 5-10mL의 뉴런 세포 배양 배지와 함께 제공되는 통풍T-25 플라스크에서 단일 세포 현탁액을 종자한다.
- 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 헤파린 용액을 살균합니다. 비타민 A가 없는 B-27 보충제는 분화를 유도하지 않고 신경 전구와 줄기 세포를 재배하기 위한 혈청 이함유 보충제입니다.
참고: 인간 신경 전구 세포 (hNPC)는 중단된 태아에게서 집합된 인간 적인 태아 두뇌에서 격리됩니다. 배양시 7-10일 후, 신경줄기세포(NSC)는 자유부동 신경권 식민지를 형성하지만, 다른 세포 유형은 단일 세포로 현탁액에 남아 있거나 플라스크의 바닥에 부착한다. 격리된 hNPC는 몇 달 동안 현탁액에서8신경구로 배양될 수 있다8,16,,17.
- 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 헤파린 용액을 살균합니다. 비타민 A가 없는 B-27 보충제는 분화를 유도하지 않고 신경 전구와 줄기 세포를 재배하기 위한 혈청 이함유 보충제입니다.
| 금액 | 구성 요소 |
| 100 μL | EGF (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, 마이너스 비타민 A (50X) |
| 1 mL | L-alanyl-L-글루타민 (100X) (재료 표 참조) |
| 4 μL | 헤파린 (2 μg/mL) |
| 96.8 mL | 신경 세포 배양 배지 (재료의 표 참조) |
표 1. 문화 매체 100mL 제작에 필요한 구성 요소
2. hNPC를 전달
- 부동 구체, 크고 작은 신경구가 들어 있는 미디어를 수집하고 50mL 원문 튜브로 옮긴다.
참고: 알 수 없는 이유로 인해 신경구를 분할하는 시기는 7일에서 30일까지 다양합니다. 그러나 일반적으로 신경구는 700-900 μm보다 큰 직경에 도달하면 통과해야합니다. 이것은 신경구의 중심이 어두워지기 시작할 때, 세포 사멸의 높은 비율의 표시로 간주됩니다18. - 신경구를 3분 동안 300-400 x g에서 원심분리로 아래로 회전시하십시오.
- 조심스럽게 슈퍼나탄을 흡인한 다음 해동 된 세포 해리 시약의 500 μL에 구체를 잠급니다 (재료 표참조).
- 1.5mL 마이크로튜브당 500 μL을 추가하고 -20°C에 저장하여 세포 해리 시약의 알리쿼시를 만듭니다. 효소 활성을 잃지 않도록 하기 위해, 37°C 물/비드 목욕에서 RT를 유지하거나 5분 동안 따뜻하게 하여 세포 해리 시약을 해동하십시오.
- 구체의 밀도와 크기에 따라 침수된 구를 37°C에서 5-15분 동안 배양한다.
- 신경구를 퇴적시키기 위해 5 분 동안 300-400 x g에서 50 mL 원심관및 원심분리기를 포함하는 신경구에 5-10 mL의 사전 온난 한 배양 배지를 추가합니다.
- 모든 신경구가 단일 세포 현탁액에 들어질 때까지 문화 매체의 2mL에서 1000 μL 파이펫을 사용하여 상류체와 부드럽게 피펫을 위아래로 흡인합니다.
참고 : 해리는 육안으로 볼 수 있게 됩니다. 해리하기 전에 신경구는 구체의 형태입니다. 해리 시약에 잠기고 위아래로 파이프를 통해 침수 한 후, 그들은 단일 세포가 될 것입니다.- 세포와 플레이트 단일 세포를 계산하고, 배양 배지의 10mL에서 T-25 플라스크 당 2~300만 개의 세포가 플라스크한다.
- 배양 미디어의 절반을 대체하여 3일마다 세포를 공급합니다.
- 플라스크를 기울여 신경구를 정착시켜 아래 모서리에 있습니다. 신경구 퇴적물때까지 약 1-2 분 동안 플라스크를 제자리에 고정하십시오. 그런 다음 정착 된 신경 구체 위의 미디어에 혈청 경피를 삽입하여 미디어를 부드럽게 반으로 흡인합니다. 해리된 세포는배양(19)에서2~3일 후에 구체를 형성하도록 집계할 수 있다.
3. hNPC 동결
- 배양 매체에 DMSO를 10%(v/v)의 최종 농도로 첨가하여 세포 동결 배지를 준비하거나 민감한 세포 유형에 대해 시판되는 냉동 보존 배지를 사용합니다(재료표참조).
- 미디어를 50mL 원문 튜브로 옮기고 구체가 중력에 의해 정착하도록 하여 큰 구체를 정렬합니다. 그런 다음 큰 신경구를 제거하고 200 또는 1000 μL 파이프 팁을 사용하여 패딩을위한 새로운 50 mL 원추형 튜브로 전송합니다.
참고: 직경이 900 μm보다 큰 신경구는 큰 것으로 간주되며 직경이 500 μm보다 작은 신경구는 작은 것으로 간주됩니다. - 나머지 신경구를 300-400 x g에서 3분 동안 원심분리로 아래로 돌리면 주체를 조심스럽게 제거합니다.
- 냉동 보존 시약의 1 mL에서 최대 100 구를 다시 중단하고 냉동 튜브로 전송합니다.
- 세포 동결 용기에 -80 °C에서 하룻밤 을 저장하고 (재료의 표참조) 장기 저장을 위해 다음 날 액체 질소로 이동합니다.
참고: 중소형 신경구(직경 900μm 미만)를 동결하고 큰 크기의 신경구(직경 900μm 이상) 또는 단일 세포를 동결하지 않는 것이 바람직하다. 시료를 해동하는 동안 세포 손상을 줄이기 위해 해동된 신경구를 작은 T25 플라스크로 파종하여 세포를 조밀하게 유지하십시오.
4. hNPC의 차별화 및 치료
참고: 분화를 유도하기 위해 신경구는 단일 세포로 분해되어 계산된 다음 5일 동안 코팅된 플레이트에 시드됩니다. 그런 다음 분화 된 세포는 면역 염색 및 형광 정량화 전에 테스트 화합물로 24 시간 동안 치료됩니다.
- 코팅
- 4웰 유리 챔버 슬라이드(8웰 챔버 슬라이드의 웰당 140 μL)의 웰 당 폴리 L-리신(PLL)의 200μL을 추가합니다.
- 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
- PBS로 3배 세척합니다.
- RT에서 건조시키세요(약 30분).
- 4웰 유리 챔버 슬라이드(8웰 챔버 슬라이드의 웰당 120 μL)의 우물당 150 μL(50 μg/mL)을 추가합니다.
- 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- PBS로 3배 세척합니다.
참고: 코팅된 챔버 슬라이드는 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
- 세포 도금
- 4웰 챔버 슬라이드(8웰 챔버 슬라이드의 웰당 70,000세포)의 우물당 80,000개의 단일 세포 신경구(단일 세포 현탁액의 신경구)를 카운트 및 플레이트.
- 4웰 챔버 슬라이드(8웰 챔버 슬라이드의 웰당 250 μL 미디어)의 웰당 500 μL의 분화 매체를 추가합니다.
- 분화 매체를 먼저 만들려면, 다음 성분을 멸균, 일회용 용기에 추가하여 신경 유도 매체(NIM)를 만듭니다.
- 다음 성분을 이전 단계에서 만든 NIM의 표 3 ~48.5 mL에 추가하여 차별화 미디어를 만듭니다.
- 37 °C에서 5 일 동안 배양하십시오.
- 5 일 후, 적절한 제어를 포함하여 테스트 화합물의 원하는 농도와 혼합 된 신선한 매체와 각각의 우물에서 절반 미디어를 대체하여 24 시간 동안 세포를 치료한다.
| 금액 | 구성 요소 |
| 49 mL | DMEM/F-12 |
| 0.5mL | N2 보충 (100 X) |
| 0.5mL | MEM 비필수 아미노산 (100X) |
| 2 μL | 헤파린 (2 μg/mL) (스톡 콘은 50 mg/mL) |
표 2. NIM 50mL 제작에 필요한 구성 요소
| 금액 | 구성 요소 |
| 1 mL | B-27 (50X) |
| 500 μL | 항생제 항진제 (100X) |
| 5 μL | 망리노산 (0.1 μM) |
| 50 μL | GDNF (10 μg/mL) |
| 50 μL | BDNF (10 μg/mL) |
| 5 μL | 아스코르브산(0.2 μg/mL) (스톡 콘은 2 mg/mL) 참고: 신선하게 만들 수 있도록 권장합니다. |
| 48.5mL | 님 |
표 3. 차별화 미디어 50mL 제작에 필요한 부품
5. 면역 세포 화학 (ICC)
참고 : 세포는 4 % 포름알데히드로 고정됩니다. 침투및 차단은 침투를 개선하고 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 수행됩니다. 세포는 그 때 일차 항체로 하룻밤 배양됩니다. 그 후, 세포는 형광으로 표지된 이차 항체로 배양됩니다. 마지막으로, DAPI를 사용하여 핵을 더럽힌 후 챔버 슬라이드가 장착됩니다.
- 고정
- 각 우물에서 미디어를 부드럽게 흡인합니다.
- 4웰 챔버 슬라이드(8웰 챔버 슬라이드의 웰당 250 μL)의 웰당 4% 포름알데히드500 μL을 추가합니다.
- RT에서 15분 동안 배양하십시오.
- PBS 500 μL로 2배 부드럽게 씻으십시오.
참고: 고정 후, 각 웰에 PBS1mL을 방치하면 배양 슬라이드를 최대 3개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
- 세포 투과 성 및 차단
- 다음 성분을 표 4에 추가하여 멸균, 일회용 용기에 추가하여 항체(Ab) 버퍼를 만듭니다.
- 다음 성분을 표 5에 혼합하여 이전 단계에서 만든 Ab 버퍼와 혼합하여 세포 투과화 및 차단 용액을 만듭니다.
- 4웰 챔버 슬라이드의 웰당 500 μL을 추가하고 RT에서 1 h에 대한 인큐베이션을 제공합니다.
참고: Ab 버퍼는 4°C에서 저장할 수 있습니다.
| 금액 | 구성 요소 |
| 1.75 g | 나Cl (150mM) |
| 1.2 g | 트리스베이스 (50mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3.6 g | L-리신 (100 mM) |
| 8 g | 아지데 나트륨 (4%) |
| 200 mL | 증류수. 참고: 처음에는 필요한 부품을 150mL의 물에 녹인 다음 200mL로 조정합니다. |
표 4. 항체 버퍼 200mL 만들기에 필요한 부품
| 금액 | 구성 요소 |
| 600 μL | 20% 염소 세럼 |
| 6 μL | 0.2% 트리톤 X100 |
| 2394 μL | 항체 버퍼. 참고: 처음에는 필요한 구성 요소를 Ab 버퍼 2mL로 용인한 다음 pH 7.4로 조정합니다. 그런 다음 Ab 버퍼를 더 추가하여 3mL의 최종 부피에 적응하고 필터 살균을 필터링합니다. |
표 5. 세포 투과 및 차단 용액 3mL 제작에 필요한 부품
- 얼룩
- PBS 500 μL로 2배 세척합니다.
- 희석된 1차 항체, 안티-β-tubulin III(1:200)를 추가하고, 4°C(4웰 챔버 슬라이드의 웰당 200 μL)에서 하룻밤 동안 배양한다. PBS에서 1 차적인 항체를 희석시하십시오.
- PBS로 2배 세척합니다.
- 희석된 액수, PBS, 형광으로 표지된 이차 항체, 알렉사 플루어 488(1:500) 및 빛으로부터 보호되는 장소에서 RT에서 2시간 동안 배양(4웰 챔버 슬라이드당 250 μL)을 추가합니다.
- PBS로 2배 세척합니다.
- PBS, DAPI(300 nM 농도)에서 희석된 것을 추가하고 빛으로부터 보호되는 장소에서 RT에서 5분 동안 배양합니다(4웰 챔버 슬라이드의 웰당 300 μL).
- PBS로 3배 세척합니다.
- 다음 지침을 사용하여 챔버 슬라이드를 마운트합니다.
- 탈주 탭을 부수고 개스킷과 베이스를 제거하여 챔버 슬라이드를 분해하십시오.
- 4웰 챔버 슬라이드의 웰당 장착 용액 1방울(재료 표참조)을 추가합니다. 그런 다음 커버 슬라이드를 사용하여 전체 슬라이드를 덮습니다.
- 트위저를 사용하여 비스듬히 커버의 한쪽을 슬라이드에 대고 액체 방울의 바깥쪽 가장자리와 접촉합니다.
- 커버슬립을 제자리에 낮출 때 마운팅 용액에 조심스럽게 팁을 주세요. 거품의 생성을 피하십시오. 파이펫 팁을 가지고 커버 슬립에 아래로 누릅니다. 거품이 측면으로 이동합니다.
참고 : 거품 형성은 때때로 피할 수 없습니다. 이 경우, 몇 가지가있는 한 그들 주변의 이미지. - 제조 업체의 지시에 따라 시간을 경화하십시오. 이미징 중 처리가 어렵기 때문에 비경화 장착 솔루션을 사용하지 마십시오. 그렇지 않으면 가장자리에 적절한 커버 슬립 실란트를 사용하여 이미징 중에 커버 슬립이 미끄러지는 것을 방지해야합니다.
- 커버슬립을 밀봉하려면 매니큐어를 사용하고 표지 슬립 가장자리에 작은 선을 만듭니다. 매니큐어를 약 2 분 동안 건조시키십시오.
6. 이미지 수집, 중성염 아웃성장과 형광 강도 정량화
참고: 염색 후 20배 목표와 1024 x 1024 픽셀의 이미지 크기로 공초점 현미경을 사용하여 처리된 세포의 이미지를 습득합니다. 조건당 생물학적 복제당 적어도 두 가지 필드에서 이미지를 가져 가라. 그런 다음 피지 이미지 분석 소프트웨어(ImageJ 1.51u)를 사용하여 중성기 길이의 정량화를 한다. 간단히, 각 뉴런에 대한 가장 긴 중성염의 길이를 측정하고 치료 당 값을 평균 한 후, 실험 그룹과 대조군 사이의 수단을 비교하기 위해 독립적 인 그룹에 대한 학생의 t 테스트를 사용합니다.
참고: 여러 상용(이마리스, 볼로시티, 아미라) 및 오픈 소스(이마제J, 셀프로파일러, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) 이미지 처리 프로그램을 사용할 수 있습니다. 이러한 프로그램 중 ImageJ는 생물학적 이미지 분석20,,21을선택하는 도구가 되었습니다. https://imagej.net/Introduction ImageJ 포털은 이미지 처리, 지역화, deconvolution, 등록, 세분화, 추적 및 시각화를 포함한 ImageJ의 기본 및 기본 기능에 대한 철저한 설명을 제공하는 유용한 정보 소스입니다.
- 피지 이미지 분석 소프트웨어로 뉴런 아웃성장을 측정
- 그림 1에도시된 바와 같이, 피지 소프트웨어에 드래그하고 떨어뜨리거나 파일을 선택하여 이미지를 엽니다 | 열립니다.
- 분석 선택 | 도구 | ROI 관리자는도구 모음 직선의 5번째 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 프리핸드 라인으로 전환합니다. 선택적으로 동일한 아이콘을 두 번 클릭하여 선 너비를 10으로 변경한 다음 셀 바디 근처에서 시작하여 중성염 의 끝으로 확장된 가장 긴 중성자를 추적합니다.
- Ctrl + T & F를 눌러 ROI 관리자에 측정값을 추가하고 측정된 뉴런을 강조 표시합니다. ROI의모든 숫자를 선택하고 측정을클릭하고 계산된 모든 길이를 선택하고 스프레드시트에 복사/붙여넣습니다.
- 피지 이미지 분석 소프트웨어로 표지된 세포의 형광 강도 측정
- 그림 2에나와 있듯이 이미지를 연 후 도구 모음 프리핸드 선택에서4번째 아이콘을 클릭합니다. 셀의 모양을 그립니다.
- 분석 선택 | 측정을 설정하고 다음 값에 대해 선택: 영역, 통합 밀도, 평균 회색 값 | 분석 | 측정값(값이 쌓인 팝업 상자가 열립니다).
- 셀 옆 지역을 배경(크기가 중요하지 않음)으로 선택한 다음 분석 | 측정합니다. 측정된 모든 데이터를 선택하고 스프레드시트에 복사/붙여넣기합니다.
참고: 통합 밀도(IntDen)는 형광 강도를 결정하는 데 사용되는 항목입니다. 이 연구에서표적 분자의 형광 강도는 세포 내의 분포를 처음에 분석하고 이후 다양한 치료 하에서 표적 분자의 풍부를 정량화하기 위해 측정된다. 따라서 치료의 효과를 측정하고 대조군과 비교합니다.
7. 신경 독성 평가
참고: 시험 화합물의 세포 독성은 발광 세포 생존가능성 분석(재료 표참조)을 사용하여 384웰 플레이트(재료 표참조)에서 평가됩니다. hNPC는 "hNPc의 분화 및 처리" 섹션에 기재된 약간의 수정을 제외하고 동일한 방법에 따라 준비됩니다. 이어서, 발광 세포 생존성 분석에 의해 생성된 발광 신호는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정된다. 발광 신호는 세포 ATP 농도에 비례하여 각 우물에 존재하는 실행 가능한 세포의 수에 직접적으로 비례합니다.
- 코팅
- 384웰 플레이트의 웰 당 폴리 L-리신(PLL)의 30μL을 추가합니다.
- RT에서 1시간 동안 인큐베이션을 합니다.
- PBS로 2배 세척합니다.
- RT에서 건조시키세요(약 30분).
- 384웰 플레이트의 웰 당 30 μL(50 μg/mL)을 추가합니다.
- 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- PBS로 2배 세척합니다.
참고: 코팅된 384웰 플레이트는 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있다.
- 세포 도금
- 카운트 및 플레이트 20,000 단세포 신경구는 분화 매체의 25 μL에서 384 웰 플레이트의 우물 당.
- 37 °C에서 5 일 동안 배양하십시오.
- 5 일 후, 5 μL 부피에서 최종 원하는 농도6x로 제조 된 테스트 화합물에 의해 24 시간 동안 세포를 치료하십시오 (우물 당 30 μL의 최종 부피를 만들기 위해).
- 셀 생존가능성 분석
- 384웰 플레이트의 웰당 발광 세포 생존성 분석 시약 30μL를 추가합니다.
참고: 각 웰에 존재하는 부피와 동일한 발광 세포 생존성 분석 시약의 부피를 추가합니다. 발광 세포 생존성 분석 시약을 해동하고 사용하기 전에 RT에 평형. - 플레이트 셰이커를 2분간 흔들어 주세요(셀 리시스를 혼합하고 유도합니다).
- 30 s에 대 한 300-400 x g에서 원심 분리에 의해 혼합물을 아래로 회전.
- 384웰 플레이트를 빛으로부터 보호하는 장소에서 RT에서 10분 동안 배양합니다(발광 신호를 안정화하기 위해).
- 마이크로 플레이트 판독기와 함께 발광을 기록합니다.
참고: 벨케이드(최종 농도 10μM)를 포함한 생존 가능성에 적합한 컨트롤을 비수기 및 DMSO가 함유한 HBSS(최종 농도0.1% 또는 0.2%)로 사용하십시오. 부정적인 제어로.
- 384웰 플레이트의 웰당 발광 세포 생존성 분석 시약 30μL를 추가합니다.
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Representative Results
원고에 제시 된 프로토콜은 성공적으로 두 개의 최근에 출판 된논문22에서사용되었습니다 22,,23. 도 3은 중성염 아웃성장과 소분자 화합물의 후속 신경유발능력에 대한 마커로서 중성염의 연장에 대한 후성유전학적 화합물로서 HDAC 억제제의 효과를 검사하는 hNpC 유래 뉴런의 사용을 입증한다.
더욱이, 도 4에서 시험된 화합물(HDAC 억제제)의 신경독성은 또한 384웰 플레이트에서 hNpC를 동시에 분화하여 평가되며, 제시된 세포 모델(hNpC)의 잠재력을 나타내고, 더 많은 수의 화합물에 대한 신경 독성을 테스트하기 위해 확장할 수 있는 능력을 보여준다.
Sartor 외.(도5)에의한 또 다른 논문에서 H4K5ac의 풍부함을 정량화하기 위한 뉴런 세포 형광 강도의 측정은 히스톤 마크로서, 후성유전학 적 색조 화합물로 hNPc로부터 분화된 뉴런을 치료한 후23개의성공적으로 입증된다. 또한, 도 6에도시된 바와 같이, 미공개 작업에서, 프로토콜은 소분자 화합물의 가능한 시냅토제 효과를 확인하기 위해 사전 시냅스 단백질, 시냅토피신을 시각화하는 데 사용되어 왔다.
그림 1: 피지 이미지 분석 소프트웨어로 뉴런 아웃성장을 측정하는 방법을 설명하는 단계별 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 피지 이미지 분석 소프트웨어로 뉴런 세포 형광 강도를 정량화하기 위한 접근법을 보여주는 단계별 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 작은 분자 후성 유전학 화합물을 가진 Neurite 아웃성장 분석.
(A)하이드록사믹 계 HDAC 억제제로 hNPC 유래 뉴런의 치료를 위한 대표적인 형광 이미지(20배율). 인간 신경 전구 세포는 5 일 동안 분화된다; 그 후 0.1% DMSO(대조군), 트리호스타틴 A, JNJ26481585, SB939 및 PCI24781(시험 화합물)으로 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음 면역염색은 뉴런 특이적 β-tubulin III 항체(green)로 수행되어 신경 과정을 시각화하고 중성자 길이및 DAPI(blue)를 정량화하여 세포 핵을 시각화한다. (B)다양한 그룹에서 중성염 길이의 통계 적 분석. 묘사 된 바와 같이, 모든 테스트 화합물은 neurite 아웃 성장을 유도 할 수 있습니다. neurite 길이의 정량적 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. p < 0.001, **** p < 0.0001. 이 그림은 Bagheri 외22에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 발광 세포 생존성 분석기를 이용한 신경 독성 평가.
hNPC는 중성염 아웃성장 분석법에 사용되는 동일한 방법에 따라 384웰 플레이트에서 뉴런으로 시드되고 분화된다. 그 후 24시간 노출 후 세포의 생존가능성에 대한 테스트 화합물의 효과가 측정된다. 표시된 바와 같이, 치료에 상당한 독성이 없습니다. 일방적인 ANOVA는 데이터 분석에 사용되며 p 값 & 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. 이 그림은 Bagheri 외22에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: RGFP966은 인간 신경 전구 세포와 분화된 뉴런에서 H4K5ac를 증가시킨다.
(A)hNPC 유래 뉴런에서 DMSO, RGFP966 또는 RGFP966 + JQ1을 치료한 후 β 튜불린, DAPI 및 H4K5ac의 대표적인 면역불광 염색. (B)DMSO, RGFP966 또는 RGFP966 + JQ1을 통해 치료한 후 H4K5ac의 형광 강도의 정량화. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. p < 0.0001. 이 그림은 사르토르 등에서 수정되었습니다. 23. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 시냅스 말단을 시각화하기 위해 시냅스닌(red)의 대표적인 면역형 염색, 신경 과정을 시각화하는 β tubulin(녹색), DAPI(blue) 및 DASO(대조군) 및 HNPc유래 뉴런에서 SB939(테스트 화합물로)를 사용하여 세포 핵을 시각화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 시험 화합물을 가진 처리시 neurite 길이에 대한 시험을 설명하는 몇몇 간행된 논문 의 한개입니다. 또한, 우리는 중성자 아웃 성장 분석 및 신경 독성 평가에 hNPC를 사용하는 방법을 설명합니다. hNPC 유래 뉴런에 대한 이러한 중성기 내성장 분석 및 신경 독성 평가를 활용하여 후생유전학 소분자 화합물, HDAC 억제제의 범주의 신경성 잠재력을 유동적으로 유도하여22개의신경질적 성장을 유도하는 것으로 입증된다. 더욱이, Sartor 등.al.에 의해 제시된 또 다른 논문에서, 이 프로토콜은 여러 후생유전학 수정자화합물(23)으로처리되는 시히스톤 단백질인 H4K5ac의 형광 강도를 정량화하는 데 사용된다.
인지 기능은 신경 회로 내에서 적절한 배선 및 기능적 연결에 의존합니다. 현상 전형 검열 접근으로 신경 형태학의 각종 양상의 상세하고 일관된 정량화는 신경 발달에서 정신 장애에 구역 수색하는 두뇌 무질서로 이끌어 내는 근본적인 통로에 있는 믿을 수 있는 통찰력을 달성하기 위하여 필수적입니다. Phenotypic 스크리닝은 세포 표현형을 조절하기 위해 putative 약물 후보로 소분자 화합물을 탐구하는 데 특히 효과적인 접근법으로 간주됩니다. 이 접근법에서는 단일 표적만 심문하는 대신 셀의 모든 구성 요소 및 경로를24검사합니다.
모양, 구조 및 연결을 포함한 신경 형태는 신경 기능의 주요 특징으로 간주됩니다. 뉴런 또는 시냅스 단백질 국소화 및 수준의 형태를 변화시키는 유전적 혼란은 질병을 유발하는 돌연변이의 분석에 특히 기여할 수 있었다. 따라서, 신뢰할 수 있는 방법은 신경 형태에 대한 농어바겐의 영향을 평가하는 데요구된다(25).
hNPC는, 미토겐의 존재에 있는 시험관에서 그 후에 배양되는 배아 포유류 두뇌에서 격리됩니다. 이 세포는 신경 전구 세포와 방사형 신경교세포로 구성된 부동 세포 응집체로 특징 지어지는 신경구로 이루어져 있습니다. hNPC는 다양한 신경 계보,7,8,89를생산하는 데 있는 분화 잠재력을 유지함으로써 신경계 기능 및 개발을 위한 바람직한 모델 시스템을 제공한다. 중성수 수, 강도, 길이 및 폭과 시냅스 전 및 시냅스 단백질 수정을 포함하는 시냅스 특성은 본원에서 제시된 방법을 사용하여 안정적으로 효율적으로 측정할 수 있는 중성염 및 시냅스 변화 중 이다.
주의력 결핍 과잉 행동 장애 및 자폐증과 같은 신경 장애의 보급의 증가로 인해 어린이환경 화학 물질의 신경 독성 잠재력은15,,26의대중의 관심사로 남아 있다. 따라서, 안정적이고 효율적인 신경 독성 평가를 위한 hNPc 유래 뉴런의 유용성도 검토된다. 그림 4에서입증된 바와 같이, hNPC는 384웰 플레이트에서 신경 독성 평가를 위해 적응하고 확장될 수 있었습니다.
도입된 세포 모형을 위한 응용으로 신경 독성 평가는 신경구를 384웰 플레이트에서 도금하기 전에 신경구를 뉴런으로 분화하거나 신경구가 단일 세포로 384웰 플레이트로 도금되는 동안 세포를 분화시킴으로써 가능하다. 후자의 접근법에서, 고정밀 파이펫팅 기술은 단일 세포로 분해되는 정확한 신경구 수를 도금하고 또한 분화 유도 매체를 가진 다음 처리 절차를 위해 요구됩니다. 필요한 파이펫팅 기술을 고려할 때 도금 전에 차별화하여 더 재현 가능한 결과를 얻는 것이 좋습니다. 더욱이, 형광 활성화 셀 정렬(FACS)에 의한 벌크 셀 정렬은 고정밀 파이펫팅 기술의 필요성을 우회하는 필요한 수의 세포를 정확하게 분리하는 데 잠재적으로 사용될 수 있다.
그것은 비 독성 농도에 도달 하는 동일한 화합물의 다양 한 복용량으로 반복 된 neurite 아웃 성장 분석 약을 피하기 위해 신경 독성 평가에 의해 neurite 아웃 성장 분석 시작 하는 것이 좋습니다. 따라서, 시험 화합물의 투여반응 곡선에 대한 발광 세포 생존성 분석체를 이용하여 신경독성 평가를 결합하면 최소한의 노력으로 올바른 투여량을 찾는 결과를 낳을 것이다. 발광 세포 생존성 분석법은 세포 배양에서 실행 가능한 세포의 수를 결정하는 매우 민감한 방법입니다. 이 방법은 세포 대사의 지표로서 문화에 존재하는 ATP의 양에 작용합니다. 분석의 추가, 혼합 및 측정 형식은 검사 화합물의 세포 생존력과 세포 독성을 확인하는 간단하고 신속한 접근 방식을 제공합니다.
다음과 같이 제시된 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 가용성 및 내재된 가변성으로 인해 생리적으로 관련된251차 세포의 사용은 25개제한적이다. hNPC는 확산 속도가 느리기 때문에 사용률을 제한할 수 있습니다. 뉴런의 형광 이미지의 수동 대규모 분석은 시간이 많이 걸리고 실험자 편향에 취약합니다. hNPC는 사람의 일생 내내 세포에 축적된 나이 관련 후성 유전학 수정을 나타내지 않는 젊은 신경 세포로 간주될 수 있었습니다. 신경 퇴행성 질환은 오래된 개별에서 생기기 때문에, hNPc는 늦은 개시 조건에 적합한 모형이 되기 위하여 적당한 생리적인 관련성이 부족할 수 있습니다.
동물 모델과 세포주 기본 질환분자 메커니즘 해독에 귀중하더라도, 그(것)들은 인간치료27,28,,,29,,30로사실 인정을 번역에 있는 한계를 보여주었습니다. hNPC와 함께 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 및 인간 배아 줄기 세포 (hESC)는 인체 외 세포 모델, 인간 생리학을 재구성하는 더 나은 것으로 간주됩니다. 따라서 hiPSCs-및 hESCs-유래 뉴런은 또한 잠재적으로 중성자 내성장 분석및 신경 독성 평가를 위한 2개의 대체 세포 근원으로서 사용될 수 있고, 본원에 제시된프로토콜을활용하여1,31.
결론적으로, 1 차인간 세포 모형으로 hNPc의 높은 번역 잠재력 및 생리적 관련성은 이전에 언급한 한계를 능가하는 neurite 아웃성장 관련 약 발견 검열 및 신경 독성 평가에 있는 귀중한 의지를 제공합니다.
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Disclosures
모든 저자는 잠재적인 이해 상충이 없음을 나타냅니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIMAD 연구 보조금에 의해 투자되었다 (940714) MAF에 수여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
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