Summary
Det presenterade protokollet beskriver en metod för en neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning av små molekylföreningar.
Abstract
Neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning är två stora studier som kan utföras med den presenterade metoden häri. Detta protokoll ger tillförlitlig analys av neuronal morfologi tillsammans med kvantitativa mätningar av modifieringar på neurit längd och synaptisk protein lokalisering och överflöd vid behandling med små molekylföreningar. Förutom tillämpningen av den presenterade metoden i neurite utväxt studier, neurotoxicitet bedömning kan utföras för att bedöma, särskilja och rangordna kommersiella kemiska föreningar baserat på deras potentiella utvecklingsmässiga neurotoxicitet effekt.
Även om cellinjer numera används i stor utsträckning i sammansatta screening analyser i neurovetenskap, de skiljer sig ofta genetiskt och fenotypiskt från deras vävnad ursprung. Primära celler, å andra sidan, upprätthålla viktiga markörer och funktioner som observerats in vivo. Därför, på grund av översättningen potential och fysiologiska relevans att dessa celler kan erbjuda neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning kan avsevärt dra nytta av att använda mänskliga neurala stamceller (hNPCs) som den primära mänskliga cellen modell.
Den presenterade metoden häri kan användas för att skärmen för förmågan hos föreningar att inducera neurite utväxt och neurotoxicitet genom att dra nytta av den mänskliga neurala föregångaren cell-härledda nervceller, en cellmodell som nära representerar mänsklig biologi."
Introduction
Neurit tillväxt är en process grundläggande för bildandet av neuronala nätverk och nerv regenerering1,2. Efter en skada, neurite utväxt spelar en nyckelroll i förnyelse av nervsystemet. Neurite utväxt är också en viktig del av den extracellulära signalering i inducera neuronala regenerativ verksamhet för att förbättra resultaten för neurodegenerativa sjukdomar och neuronal skada3,,4,5,6.
Genom att bibehålla deras differentieringspotential när det gäller att producera olika neurala härstamningar kan mänskliga neurala stamceller (hNPCs) tillhandahålla ett modellsystem för studier av centrala nervsystemet (CNS) funktion och utveckling7,8,9. Hög translationell potential och fysiologiska relevans hNPCs som en primär mänsklig cell modell erbjuder en betydande fördel i neurite utväxt-relaterade missbruk upptäckt screenings. Underhåll och skalning av de primära cellmodellerna för analyser med högt genomströmning kan dock vara tidskrävande och arbetsintensivt10,11,12,13.
Förutom tillämpningen av den presenterade metoden i neurite utväxt studier, neurotoxicitet bedömning är ett annat program med hNPC-härledda nervceller. Det finns tusentals kommersiella kemiska föreningar som antingen inte undersöks eller med dåligt förstådd neurotoxicitet potential. Därför är mer tillförlitliga och effektiva screening experiment för att bedöma, skilja och rangordna föreningar baserat på deras potential att framkalla utvecklingsneurotoxicitet i hög efterfrågan14. Ökningen av prevalens och incidens av neurologiska sjukdomar tillsammans med överflödet av oprövade föreningar i miljön kräver utveckling av mer pålitliga och effektiva experiment för att identifiera farliga miljöföreningar som kan utgöra neurotoxicitet15.
Den presenterade metoden häri kan användas för att skärmen för förmågan hos föreningar att inducera neurite utväxt och neurotoxicitet genom att dra nytta av den mänskliga neurala föregångaren cell-härledda nervceller, en cellmodell som nära representerar mänsklig biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikuttalande: Fosterprover mottogs från Birth Defects Research Laboratory vid University of Washington i Seattle genom ett vävnadsdistributionsprogram som stöds av National Institute of Health (NIH). The Birth Defects Research Laboratory fått lämpligt skriftligt informerat samtycke från föräldrarna och tillvaratagandet av vävnader övervakades av Institutional Review Board vid University of Washington. Allt arbete utfördes med godkännande av Human Subject Research Office vid University of Miami8.
1. Isolering och odling av mänskliga neurala stamceller (hNPCs)
- Placera hjärnvävnaden i en 100 mm petriskål och ta försiktigt bort hjärnhinnorna med pincett.
- Överför hjärnvävnaden till ett koniskt rör på 50 ml och tvätta den två gånger med 20 ml PBS genom att försiktigt vända röret.
- Inkubera hjärnvävnaden i ett nytt koniskt rör på 50 ml genom att doppa vävnaden i celldissociationslösningen (se Tabell över material) och DNase I (10 U/mL) i 10 min vid 37 °C.
- Tillsätt 5 ml neuronal cellodlingsmedium (se Tabell över material) till hjärnvävnaden som innehåller röret och ta bort neuosfärerna mekaniskt genom att triturera 20 till 30 gånger genom en 1000 μL pipetspets för att göra en single-cell suspension.
- Filtrera cellfjädringen genom en 70 μm cellsil för att ta bort cellkluster.
- Såfäls single-cell suspension i en ventilerad T-25 kolv försedd med 5-10 ml neuronal cell odling medium kompletteras med komponenter som beskrivs i tabell 1.
- Sterilisera heparinlösningen genom filtrering genom ett 0,2 μm filter. B-27 tillskott utan Vitamin A är ett serumfritt tillägg för odling av neurala förfäder och stamceller, utan att inducera differentiering.
OBS: Mänskliga neurala stamcellsceller (hNPCs) är isolerade från mänskliga fetala hjärnan samlas in från aborterade foster. Efter 7–10 dagar i kultur bildar neurala stamceller (NSCs) fritt flytande neurosfärkolonier, medan andra celltyper förblir i suspension som enskilda celler eller fäster vid kolvens botten. De isolerade hNPCs kan odlas som neurosfärer i suspension i flera månader8,16,17.
- Sterilisera heparinlösningen genom filtrering genom ett 0,2 μm filter. B-27 tillskott utan Vitamin A är ett serumfritt tillägg för odling av neurala förfäder och stamceller, utan att inducera differentiering.
| Belopp | Komponent |
| 100 μl | Fonden (20 ng/mL) |
| 100 μl | FGF (10 ng/mL) |
| 2 ml | B-27, Minus vitamin A (50X) |
| 1 ml | L-alanyl-L-glutamin (100X) (se tabell över material) |
| 4 μl | Heparin (2 μg/ml) |
| 96,8 mL | Neuronal cellodlingsmedium (se tabell över material) |
Tabell 1. Komponenter som krävs för att göra 100 ml kulturmedia
2. Passaging hNPCs
- Samla media som innehåller flytande sfärer, stora och små neurospheres, och överföra dem till en 50 ml koniska rör.
OBS: På grund av okända skäl varierar tidpunkten för uppdelning av neurosfärerna från 7 dagar upp till 30 dagar. Men i allmänhet, neurosfärer måste passeras när de når en diameter större än 700-900 μm. Det är när centrum av neurosfären börjar mörkna, vilket anses vara ett tecken på en hög grad av celldöd18. - Snurra ner neurosfärerna genom centrifugering vid 300-400 x g i 3 min.
- Sug försiktigt upp supernatanten och dränka sedan sfärerna i 500 μL av upptinad celldissociationsreagens (se Tabell över material).
- Gör alikvoter av celldissociationsreagens genom att tillsätta 500 μL per 1,5 ml mikrorör och förvara vid -20 °C. För att undvika att förlora enzymaktivitet, tina upp celldissociationsreagensen genom att hålla vid RT eller värma i 5 min i ett 37 °C vatten/pärlbad.
- Beroende på sfärernas densitet och storlek inkuberar du de nedsänkta sfärerna vid 37 °C i 5-15 minuter.
- Tillsätt 5-10 ml förvärmt kulturmedia till de neurosfärer som innehåller 50 ml koniskt rör och centrifug vid 300-400 x g i 5 minuter till sedimentneurosfärerna.
- Sug upp supernatanten och pipetten försiktigt upp och ner, med en 1000 μL pipett, i 2 ml odlingsmedia tills alla neurosfärer är i en enda cellfjädring.
DISsociationen blir synlig för blotta ögat. Före dissociation, är neurosfärerna i form av sfärer. Efter att ha sjunkit ned i dissociation reagens och genom pipettering upp och ner, kommer de att bli enstaka celler.- Räkna cellerna och plattan de enskilda cellerna, 2 till 3 miljoner celler per T-25 kolv i 10 ml odlingsmedia.
- Mata cellerna var tredje dag genom att ersätta hälften av kulturmedierna.
- Sätt upp neurosfärer genom att luta kolven så att den är på sitt nedre hörn. Håll kolven i läge i ca 1-2 min tills neurosfärerna sediment. Sug sedan hälften av mediet försiktigt genom att sätta in den serologiska pipetten i media ovanför de fasta neurosfärerna. Separerade celler kan aggregera för att bilda sfärer efter 2 till 3 dagar i kultur19.
3. Frysning av hNCC
- Förbered cellfrysningsmediet genom att lägga till DMSO i odlingsmediet till en slutlig koncentration på 10 % (v/v) eller använda kommersiellt tillgängligt kryobevarandemedium för känsliga celltyper (se Tabell över material).
- Sortera ut stora sfärer genom att överföra media till en 50 ml konisk rör och låta sfärerna bosätta sig genom gravitationen. Ta sedan bort och överföra de stora neurospheres till en ny 50 ml koniska rör för passaging med en 200 eller 1000 μL pipet spets.
OBS: Neurosfärer med en diameter större än 900 μm anses vara stora och de med en diameter som är mindre än 500 μm anses vara små. - Snurra de återstående neurosfärerna nedåt genom centrifugering vid 300-400 x g i 3 min. Ta försiktigt bort supernatanten.
- Resuspend upp till 100 sfärer i 1 ml kryobevarande reagens och överföra den till en cryotube.
- Förvara över natten vid -80 °C i en cellfrysningsbehållare (se Materialförteckning)och flytta den till flytande kväve nästa dag för långtidsförvaring.
OBS: Det är att föredra att frysa små till medelstora neurosfärer (lägre än 900 μm i diameter) och undvika att frysa stora stora neurosfärer (större än 900 μm i diameter) eller enstaka celler. För att minska cellskador under upptining av provet, håll cellerna täta genom att så de upptinade neurosfärerna till en liten T25-kolv.
4. Differentiering och behandling av hNPCs
OBS: För att framkalla differentiering, är neurospheres delas upp i enstaka celler, räknas och sedan sås på belagda plattor i 5 dagar. Därefter behandlas differentierade celler för 24 timmar med testföreningar före immunfärgning och fluorescenskvantifiering.
- Beläggning
- Tillsätt 200 μl poly-L-lysin (PLL) per brunn av 4-brunnsglaskammare diabilder (140 μL per brunn av 8-brunns kammarrutschbanor).
- Inkubera i 1 h vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta 3x med PBS.
- Låt den torka på RT (i ca 30 min).
- Tillsätt 150 μl laminin (50 μg/ml) per brunn av 4-brunns glaskammare diabilder (120 μL per brunn av 8-brunns kammarrutschbanor).
- Inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
- Tvätta 3x med PBS.
OBS: Belagda kammarglas kan förvaras vid 4 °C i 1 månad.
- Plätering av cellerna
- Räkna och platta 80.000 encelliga neurospheres (neurospheres i en enda cell suspension) per brunn av 4-brunn kammare diabilder (70.000 celler per brunn av 8-brunn kammare slide).
- Tillsätt 500 μl differentieringsmedia per brunn med 4-brunnskammarglid (250 μL media per brunn med 8-brunnskammarglas).
- För att göra differentieringsmediet först, lägg till följande komponenter i tabell 2 i en steril engångsbehållare för att göra det neurala inducerande mediet (NIM).
- Tillsätt följande ingredienser i tabell 3 till 48,5 ml NIM som gjorts i föregående steg för att göra differentieringsmediet.
- Inkubera i 5 dagar vid 37 °C.
- Efter 5 dagar, behandla cellerna i 24 timmar genom att ersätta hälften av mediet i varje brunn med färska medier blandas med önskad koncentration av testföreningar, inklusive lämpliga kontroller.
| Belopp | Komponent |
| 49 ml | DMEM/F-12 |
| 0,5 mL | N2 tillägg (100X) |
| 0,5 mL | MEM icke-essentiella aminosyror (100X) |
| 2 μl | Heparin (2 μg/ml) (Lager Conc. är 50 mg/ml) |
Tabell 2. Komponenter som krävs för att göra 50 ml NIM
| Belopp | Komponent |
| 1 ml | B-27 (50X) |
| 500 μl | Antibiotika-antimykolsyra (100X) |
| 5 μl | Retinoinsyra (0,1 μM) |
| 50 μl | GDNF (10 μg/ml) |
| 50 μl | BDNF (10 μg/ml) |
| 5 μl | Askorbinsyra (0,2 μg/ml) (Lager Conc. är 2 mg/ml) OBS: Rekommenderas att göras färska. |
| 48,5 ml | Nim |
Tabell 3. Komponenter som krävs för att göra 50 ml differentieringsmedia
5. Immuncytokemi (ICC)
OBS: Cellerna är fixerade med 4% formaldehyd. Permeabilisering och blockering utförs sedan för att förbättra penetrationen och förhindra icke-specifik bindning av antikroppar. Cellerna inkuberas sedan med primära antikroppar över natten. Därefter inkuberas celler med fluorescerande märkta sekundära antikroppar. Slutligen, efter att ha använt DAPI för att färga kärnan, kammaren diabilder monteras.
- Fixering
- Sug försiktigt upp media i varje brunn.
- Tillsätt 500 μl 4% formaldehyd per brunn av 4-brunns kammarglas (250 μL per brunn av 8-brunns kammarrutschbanor).
- Inkubera i 15 min på RT.
- Tvätta försiktigt 2x med 500 μl PBS.
OBS: Efter fixering, genom att lämna 1 ml PBS i varje brunn, kan kulturrutschbanor lagras vid 4 °C i upp till 3 månader.
- Cell permeabilisering och blockering
- Tillsätt följande komponenter i tabell 4 i en steril engångsbehållare för att tillverka antikroppsbufferten (Ab).
- Blanda följande ingredienser i tabell 5 med Ab-bufferten som gjordes i föregående steg för att göra cellen permeabilisering och blockeringslösning.
- Tillsätt 500 μL per brunn med 4-brunnskammarrutschbanor och inkubera i 1 h vid RT.
OBS: Ab buffert kan lagras vid 4 °C.
| Belopp | Komponent |
| 1,75 g | NaCl (150 mM) |
| 1,2 g | TrisBase (50 mM) |
| 2 g | BSA 1% |
| 3,6 g | L-lysin (100 mM) |
| 8 g | Natriumazid (4%) |
| 200 ml | Destillerat vatten. OBS: Lös initialt upp de nödvändiga komponenterna i 150 ml vatten och justera sedan till 200 ml. |
Tabell 4. Komponenter som krävs för att göra 200 ml antikroppsbuffert
| Belopp | Komponent |
| 600 μl | 20% Getserum |
| 6 μl | 0,2% Triton-X100 |
| 2394 μL | Antikroppsbuffert. OBS: Lös initialt upp de nödvändiga komponenterna i 2 ml Ab-buffert och justera sedan till pH 7.4. Tillsätt sedan mer Ab buffert för att anpassa sig till den slutliga volymen på 3 ml och filtrera sterilisera. |
Tabell 5. Komponenter som krävs för att göra 3 ml cell permeabilisering och blockering lösning
- Färgning
- Tvätta 2x med 500 μl PBS.
- Tillsätt den utspädda primära antikroppen, anti-β-tubulin III (1:200) och inkubera över natten vid 4 °C (200 μl per brunn av 4-brunnskammarrutschbanor). Späd den primära antikroppen i PBS.
- Tvätta 2x med PBS.
- Tillsätt utspädd, i PBS, fluorescerande märkt sekundär antikropp, Alexa Fluor 488 (1:500) och inkubera för 2 h vid RT på en plats skyddad från ljus (250 μL per brunn av 4-brunnskammarglas)
- Tvätta 2x med PBS.
- Tillsätt den utspädda i PBS, DAPI (300 nM-koncentration) och inkubera i 5 min vid RT på en plats som är skyddad från ljus (300 μl per brunn med 4-brunnskammarrutschbanor).
- Tvätta 3x med PBS.
- Montera kammarens diabilder med hjälp av följande instruktioner.
- Ta isär kammaren bilden genom att bryta ut breakaway flikar och ta bort packningen och basen.
- Lägg till en droppe monteringslösning (se Materialbord) per brunn med 4-brunnskammarglas. Använd sedan en täckbild för att täcka hela bilden.
- Placera en sida av täcket mot glidningen med hjälp av en pincett och i en vinkel och placera ena sidan av locket mot glidningen samtidigt som du kommer i kontakt med vätskedroppens ytterkant.
- Tippa försiktigt täcket på monteringslösningen när du sänker det på plats. Undvika skapandet av bubblor. Ta en pipettspets och tryck ner den på täckslipen. Bubblorna kommer att flytta åt sidan.
OBS: Bubbla bildning är oundvikligt ibland. Om det inträffar, bild runt dem så länge det finns några. - Följ tillverkarens anvisningar för härdningstid. Undvik att använda engångsmonteringslösningar på grund av svårigheten att hantera under bildbehandling. I annat fall krävs användning av ett lämpligt täcklås på kanterna för att förhindra att täcken glider under avbildningen.
- För att täta täcket, använd nagellack och gör en liten linje på kanten av täcket slip. Låt nagellacket torka i ca 2 min.
6. Bild förvärv, neurite utväxt och fluorescens intensitet kvantifiering
OBS: Efter färgning, använd ett konfokalmikroskop med ett 20x-mål och en bildstorlek på 1024 x 1024 pixlar för att hämta bilderna av de behandlade cellerna. Ta avbildning minst från två fält per biologisk replikat per villkor. Använd sedan Fiji bildanalys programvara (ImageJ 1.51u) för kvantifiering av neurite längd. Kortfattat, mäta längden på den längsta neurite för varje neuron och efter genomsnitt värdena per behandling, använda studentens t-test för oberoende grupper att jämföra medel mellan experimentella grupper och kontrollgrupp.
OBS: Flera kommersiella (Imaris, Volocity, Amira) och öppen källkod (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) bildbehandlingsprogram finns tillgängliga. Bland dessa program har ImageJ blivit det verktyg för biologisk bildanalys20,21. ImageJ-portalen på https://imagej.net/Introduction är en användbar informationskälla som ger en grundlig beskrivning av ImageJ:s grundläggande och inbyggda funktioner, inklusive bildbehandling, colocalization, deconvolution, registrering, segmentering, spårning och visualisering.
- Mäta neuronal utväxt med Fiji bildanalys programvara
- Som visas i figur 1, öppna bilden antingen genom att dra och släppa den på Fiji programvara eller genom att välja Arkiv | Öppna.
- Välj Analysera | Verktyg | ROI manager, och sedan högerklicka på5: e ikonen i verktygsfältet Rak och växla till frihand linje. Alternativt dubbelklicka på samma ikon för att ändra linjebredden till 10, och sedan spåra den längsta neuriten, med början nära cellkroppen och sträcker sig till neuritens spets.
- Tryck på Ctrl + T & sedan F för att lägga till mätningen i ROI Manager och markera den uppmätta neuronen. Markera alla nummer i roi,klicka på Mät,markera alla beräknade längder och kopiera/klistra in i ett kalkylblad.
- Mätning av fluorescensintensitet hos märkta celler med Fiji bildanalysprogram
- Som illustreras i figur 2, efter att ha öppnat bilden, klicka på den 4:e ikonen i verktygsfältet Freehand val. Rita cellens form.
- Välj Analysera | Ange mått och välj för följande värden: Area, Integrerad densitet, Medelgråvärde | Analysera | Mått (en popup-ruta med en bunt värden öppnas).
- Markera ett område bredvid cellen som bakgrund (storleken är inte viktig) och välj sedan Analysera | Mät. Markera alla uppmätta data och kopiera/klistra in dem i ett kalkylblad.
OBS: Integrerad densitet (IntDen) är den artikel som används för att bestämma fluorescerande intensiteter. I denna studie fluorescerande intensitet av målmolekylen mäts för att initialt analysera dess fördelning i cellen och därefter kvantifiera förekomsten av målet molekylen under olika behandlingar. Följaktligen kommer effektiviteten av behandlingar att mätas och jämföras med kontroll.
7. Bedömning av neurotoxicitet
OBS: Cytotoxicitet hos testföreningar utvärderas i 384-brunnsplattor (se Materialförteckning)med hjälp av en självlysande cellens livskraftsanalys (se Tabell över material). HNPC förbereds enligt samma metod, utom små ändringar, som beskrivs i avsnittet "Differentiering och behandling av hNPCs". Därefter mäts en självlysande signal som genereras av självlysande cellens livskraftsanalys med hjälp av en mikroplåtsläsare. Den självlysande signalen är proportionell mot den cellulära ATP-koncentrationen som i sig är direkt proportionell mot antalet livskraftiga celler som finns i varje brunn.
- Beläggning
- Tillsätt 30 μl poly-L-lysin (PLL) per brunn på 384-brunnsplatta.
- Inkubera i 1 h på RT.
- Tvätta 2x med PBS.
- Låt den torka på RT (i ca 30 min).
- Tillsätt 30 μl laminin (50 μg/ml) per brunn av 384-brunnsplatta.
- Inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
- Tvätta 2x med PBS.
OBS: Belagda 384-brunnsplattor kan förvaras vid 4 °C i 1 månad.
- Plätering av cellerna
- Räkna och platta 20.000 encelliga neurosfärer per brunn av 384-brunnsplatta i 25 μL differentieringsmedia.
- Inkubera i 5 dagar vid 37 °C.
- Efter 5 dagar, behandla cellerna i 24 timmar med testföreningar beredda vid 6x den slutliga önskade koncentrationen i 5 μL volym (för att göra den slutliga volymen på 30 μL per brunn).
- Cellens lönsamhetsanalys
- Tillsätt 30 μL självlysande cellens livsduglighetsflödesreagens per brunn av 384-brunnsplatta.
OBS: Tillsätt en volym av självlysande cellens livsduglighetsanalysreagens som är lika med den volym som finns i varje brunn. Tina upp den självlysande cellens livsduglighetsanalysreagens och jämvikt till RT före användning. - Skaka på en tallrik shaker i 2 minuter (för att blanda och inducera celllys).
- Snurra blandningen nedåt genom centrifugering vid 300-400 x g för 30 s.
- Inkubera 384-brunnsplattan i 10 min vid RT på en plats som är skyddad från ljus (för att stabilisera den självlysande signalen).
- Spela in luminescence med en mikroplåtsläsare.
OBS: Använd lämpliga kontroller för lönsamhetsanalysen, inklusive Velcade (vid en slutlig koncentration på 10 μM) som positiv och HBSS som innehåller DMSO (med slutlig koncentration på 0,1 % eller 0,2 %) som negativ kontroll.
- Tillsätt 30 μL självlysande cellens livsduglighetsflödesreagens per brunn av 384-brunnsplatta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som presenteras i manuskriptet har framgångsrikt använts i två nyligen publicerade dokument22,23. Figur 3 visar användningen av hNPCs-härledda nervceller för att undersöka effekten av HDAC-hämmare som epigenetiska föreningar på förlängningen av neuriter som en markör för neurite utväxt och efterföljande neurogen förmåga små molekylföreningar.
I figur 4 bedöms dessutom neurotoxiciteten hos testade föreningar (HDAC-hämmare) genom att hNPCs samtidigt differentieras i 384-brunnsplattor, vilket visar potentialen hos den presenterade cellmodellen (hNPCs) för neurotoxicitetsbedömning och förmågan att skala upp för att testa neurotoxicitet för ett högre antal föreningar.
I ett annat dokument av Sartor et al. (Figur 5), mätning av neuronal cell fluorescens intensitet för att kvantifiera förekomsten av H4K5ac, som ett histon märke, efter behandling av nervceller differentieras från hNPCs med epigenetiska modifiering föreningar framgångsrikt visat23. Dessutom, som illustreras i figur 6, i ett opublicerat arbete, har protokollet använts för att visualisera ett presynaptisk protein, synaptophysin, för att kontrollera den möjliga synaptogenic effekten av små molekylföreningar.
Figur 1: Steg-för-steg-arbetsflöde som illustrerar en metod för att mäta neuronal utväxt med Fiji bildanalys programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Steg-för-steg-arbetsflöde som illustrerar en metod för att kvantifiera neuronala celler fluorescensintensitet med Fiji bildanalys programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Neurituppväxtanalys med små molekylegenetiska föreningar.
(A)Representativa fluorescerande bilder (20x förstoring) för behandling av hNPCs-härledda nervceller med hydroxemiska HDAC-hämmare. Mänskliga neurala stamceller differentieras i 5 dagar; sedan behandlas för 24 h med 0,1% DMSO (som kontroll), och Trichostatin A, JNJ26481585, SB939 och PCI24781 (som testföreningar). Därefter utförs immunostaining med neuronal-specifika β-tubulin III antikroppar (grön) att visualisera neuronala processer och kvantifiera neurite längder och DAPI (blå) för att visualisera cellkärnor. b)Statistisk analys av neuritlängd i olika grupper. Som avbildas, alla testföreningar kan framkalla neurite utväxt. Kvantitativ analys av neurite längd görs med ImageJ programvara. Felstaplar representerar SEM; p < 0.001, **** p < 0.0001. Denna siffra har ändrats från Bagheri et al.22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bedömning av neurotoxicitet med hjälp av analys av självlysande celler.
hNPCs är sådd och differentierade till nervceller i 384-brunnsplattan enligt samma metod som används för neurite utväxtanalys. Därefter mäts effekten av testföreningar på cellernas livskraft efter 24 timmars exponering. Som visas, det finns ingen signifikant toxicitet vid behandlingar. Enkelriktad ANOVA används för dataanalys och ett p-värde < 0,05 anses vara statistiskt signifikant. Denna siffra har ändrats från Bagheri et al.22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: RGFP966 ökar H4K5ac i nervceller som skiljer sig från mänskliga neurala stamceller.
(A)Representativ immunofluorescensfärgning av β tubulin, DAPI och H4K5ac efter behandling med DMSO, RGFP966 eller RGFP966 + JQ1 i hNPCs-härledda nervceller. B)Kvantifiering av fluorescensintensiteten hos H4K5ac efter behandling med DMSO, RGFP966 eller RGFP966 + JQ1. Felstaplar representerar SEM; p < 0,0001. Denna siffra har ändrats från Sartor et al.23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativ immunofluorescensfärgning av Synaptophysin (röd) för att visualisera synaptiska terminaler, β tubulin (grön) för att visualisera neuronala processer och DAPI (blå) för att visualisera cellkärnor efter behandling med DMSO (som kontroll) och SB939 (som testförening) i hNPCs-härledda nervceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är en av de få publicerade artiklar som beskriver testet för neurite längd vid behandling med testföreningar. Dessutom beskriver vi hur man använder hNPCs för en neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning. Genom att använda denna neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning på hNPCs-härledda nervceller, den neurogena potentialen hos en kategori av epigenetiska små molekylföreningar, HDAC-hämmare, för att inducera neurit utväxt visas22. Dessutom, i ett annat dokument som presenteras av Sartor et al., detta protokoll används för att kvantifiera fluorescens intensitet H4K5ac, en histon protein, vid behandling med flera epigenetiska modifierare föreningar23.
Kognitiv funktion bygger på korrekt ledningar och funktionella anslutningar inom neuronala kretsar. Detaljerad och konsekvent kvantifiering av olika aspekter av neuronal morfologi som en fenotypisk screening strategi är viktigt att uppnå tillförlitlig insikt i de underliggande vägar som leder till hjärnsjukdomar som sträcker sig från neurodevelopmental till psykiska störningar. Fenotypisk screening anses vara ett särskilt effektivt tillvägagångssätt för att utforska små molekylföreningar som förmodade läkemedelskandidater att modulera en cellulär fenotyp. I detta tillvägagångssätt, i stället för att förhöra endast ett enda mål, undersöks alla komponenter och vägar i cellen24.
Neuronal morfologi inklusive form, struktur, och anslutning anses vara viktiga funktioner i neuronal funktion. Genetiska störningar som förändrar morfologi av nervceller eller synaptisk protein lokalisering och nivå kan särskilt bidra till analys av sjukdomsframkallande mutationer. Därför krävs tillförlitliga metoder för att bedöma effekterna av perturbagens på neuronal morfologi25.
HNPCs, är isolerade från embryonala däggdjur hjärnan, som därefter odlas in vitro i närvaro av mitogens. Dessa celler består av neurosfärer som kännetecknas som flytande cellulära aggregat bestående av neurala stamceller och radiella gliaceller. HNPCs ger ett önskvärt modellsystem för nervsystemet funktion och utveckling genom att upprätthålla deras differentiering potential att producera olika neurala härstamningar7,8,9. Neuritnummer, intensitet, längd och bredd tillsammans med synaptiska egenskaper, inklusive modifieringar av pre- och postsynaptiska proteiner, är bland neurit- och synaptiska förändringar som på ett tillförlitligt och effektivt sätt kan mätas med hjälp av den presenterade metoden häri.
På grund av en ökning av förekomsten av neurologiska sjukdomar såsom attention deficit hyperactivity disorder och autism, neurotoxicitet potential miljökemikalier på barn är fortfarande en allmän oro15,26. Därför undersöks också användbarheten av hNPCs-härledda nervceller för tillförlitlig och effektiv neurotoxicitetsbedömning. Som framgår av figur 4skulle hNPCs kunna anpassas och skalas upp för neurotoxicitetsbedömning i 384-brunnsplattor.
Neurotoxicitet bedömning som en ansökan om den introducerade cellen modellen är möjligt genom att antingen differentiera neurospheres i nervceller innan plätering i 384-väl plattor eller differentiera cellerna medan neurospheres är pläterade i 384-brunnsplattor som enstaka celler. I det senare tillvägagångssättet krävs hög precision pipettering färdigheter för plätering det exakta antalet neurospheres som är uppdelade i enstaka celler och även för följande behandlingsförfaranden med differentiering-inducerande medium. Med tanke på de pipettering färdigheter som krävs, differentiering före plätering rekommenderas för att uppnå mer reproducerbara resultat. Bulkcellsortering efter fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) skulle dessutom kunna användas för att exakt separera det antal celler som krävs och kringgå behovet av rörledningsfärdigheter med hög precision.
Det rekommenderas att starta neurite utväxt analysen av neurotoxicitet bedömning för att undvika upprepade neurite utväxt analyser med olika doser av samma förening för att nå för giftfri koncentration. Därför, kombinera en neurotoxicitet bedömning genom att använda självlysande cellens livskraft analys mot en dos-respons kurva av testföreningar kommer att resultera i att hitta rätt dos med minimal ansträngning. Den självlysande cellens lönsamhetsanalys är en mycket känslig metod för att bestämma antalet livskraftiga celler i en cellkultur. Metoden fungerar på kvantation av ATP närvarande i kulturen som en indikator på cellulär metabolism. Tillägget, mix, och mått format av analysen ger en enkel och snabb strategi för att kontrollera cellens livskraft och cytotoxicitet av testföreningar.
Det finns vissa begränsningar i det presenterade protokollet enligt följande. På grund av tillgänglighet och inneboende variationer är användningen av fysiologiskt relevanta primära celler begränsad25. hNPCs har en långsam spridningshastighet, vilket kan begränsa dess utnyttjande. Manuell storskalig analys av fluorescerande bilder av nervceller är tidskrävande och mottagliga för experimenter bias. hNPCs kan betraktas som unga neurala celler, inte representerar åldersrelaterade epigenetiska modifieringar ackumuleras i celler under en persons liv. Eftersom neurodegenerativa störningar förekommer hos äldre individer, hNPCs kan sakna tillräcklig fysiologisk relevans vara en lämplig modell för sent sjukdomsfall.
Även om djurmodeller och cellinjer har varit värdefulla för att dechiffrera molekylära mekanismer bakom sjukdomar, har de visat begränsningar i att översätta fynd till human therapeutics27,28,29,30. Humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) och mänskliga embryonala stamceller (hESCs) tillsammans med hNPCs anses vara bättre in vitro-cellmodeller, recapitulating mänskliga fysiologi. Därför hiPSCs- och hESCs-härledda nervceller kan också potentiellt användas som två alternativa cellkällor för neurite utväxt analys och neurotoxicitet bedömning, med hjälp av protokollet presenteras häri1,31.
Sammanfattningsvis ger hög translationell potential och fysiologiska relevans hNPCs som primära mänskliga cell modell en värdefull användning i neurite utväxt-relaterade läkemedel upptäckt screenings och neurotoxicitet bedömning uppväger de begränsningar som nämnts tidigare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare anger inga potentiella intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av NIMAD forskningsanslag (940714) som tilldelats MAF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 - minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1°C/minute cell freezing in a -80°C freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
References
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
- Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
- Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
- Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
- Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
- Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
- Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
- Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
- Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
- An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
- Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
- Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
- Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
- Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
- Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
- Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
- Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).
