Summary
Vi rapporterer en protokoll for å produsere en hybrid lipidmembran ved vann - / luftgrensesnittet ved å doping lipid bilayer med kobber (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftthalocyanine (CuPc) molekyler. Den resulterende hybrid lipid membran har en lipid / CuPc / lipid sandwich struktur. Denne protokollen kan også brukes på dannelsen av andre funksjonelle nanomaterialer.
Abstract
På grunn av deres unike egenskaper, inkludert en ultratyn tykkelse (3-4 nm), ultrahøy resistivitet, flyt og selvmonteringsevne, kan lipid bilayers lett funksjonaliseres og har blitt brukt i ulike applikasjoner som biosensorer og bio-enheter. I denne studien introduserte vi et planær organisk molekyl: kobber (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalaocyanin (CuPc) til dope lipid membraner. CuPc/lipid hybridmembran dannes ved vann-/luftgrensesnittet ved selvmontering. I denne membranen er de hydrofobe CuPc-molekylene plassert mellom de hydrofobe halene til lipidmolekyler, og danner en lipid / CuPc / lipid sandwichstruktur. Interessant, en luftstabil hybrid lipid bilayer kan lett dannes ved å overføre hybrid membranen til en Si substrat. Vi rapporterer en enkel metode for å innlemme nanomaterialer i et lipid bilayer system, som representerer en ny metodikk for fabrikasjon av biosensorer og biodevices.
Introduction
Som essensielle rammer av cellemembraner, er det indre av celler skilt fra utsiden av et lipid bilayer system. Dette systemet består av amfifile fosfolipider, som består av hydrofile fosfor ester "hoder" og hydrofobe fettsyrer "haler". På grunn av bemerkelsesverdig flyt og selvmonteringsevne lipid bilayers i vandig miljø1,2, kan kunstige lipid bilayers dannes ved hjelp av enklemetoder 3,4. Ulike typer membranproteiner, som iionkanaler, membranreseptorer og enzymer, har blitt innlemmet i den kunstige lipid bilayer for å etterligne og studere funksjonene til cellemembraner5,6. Mer nylig har lipid bilayers blitt dopet med nanomaterialer (f.eks metall nanopartikler, grafen og karbon nanorør) for å danne funksjonelle hybridmembraner7,8,9,10,11,12,13. En mye brukt metode for å danne slike hybridmembraner innebærer dannelsen av dopet lipid vesikler, som inneholder hydrofobe materialer som modifiserte Au-nanopartikler7 eller karbon nanorør11, og de resulterende vesikler blir deretter smeltet sammen til planar støttet lipid bilayers. Denne tilnærmingen er imidlertid kompleks og tidkrevende, noe som begrenser den potensielle bruken av slike hybridmembraner.
I dette arbeidet ble lipidmembraner dopet med organiske molekyler for å produsere hybrid lipidmembraner som dannes ved vann / luftgrensesnitt ved selvmontering. Denne protokollen innebærer tre trinn: utarbeidelse av den blandede løsningen, dannelse av en hybrid membran ved vann / luftgrensesnitt, og overføring av membranen til et Si-substrat. Sammenlignet med andre tidligere rapporterte metoder, er metoden som er beskrevet her enklere og krever ikke sofistikert instrumentering. Ved hjelp av denne metoden kan luftstabile hybridlipidmembraner med et større område dannes på kortere tid. Nanomaterialet som brukes i denne studien er et halvledende organisk molekyl, kobber (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalaocyanin (CuPc), som er mye brukt i en rekke applikasjoner, inkludert solceller, fotodetektorer, gasssensorer og katalyse14,15. CuPc, et lite organisk molekyl med en planarstruktur, har en høy affinitet for "haler" av fosfolipidduo til sine hydrofobe egenskaper. Andre grupper har rapportert at CuPc molekyler kan selv montere på single-krystall overflater med dannelsen av høyt bestilte strukturer16,17. Derfor er det svært mulig at CuPc-molekylene kan innlemmes i lipid bilayers gjennom selvmontering.
Vi gir en detaljert beskrivelse av prosedyrene som brukes til å danne membraner og gi noen forslag til å implementere denne prosedyren jevnt. I tillegg presenterer vi noen presentative resultater av hybrid lipidmembranene, og diskuterer potensielle anvendelser av denne metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av en hybrid løsning
- Vask fire 4 ml engangsglassglass og skruehettter (med PTFE-belagte tetninger) i et ultralydbad i 10 min i destillert vann (renset med et filtreringssystem), etterfulgt av henholdsvis etanol og kloroform. Tørk hetteglassene og hettene i en strøm av nitrogengass.
- I en anaerob hanskeboks, lag en CuPc lagerløsning (10 mg / ml) i et vasket hetteglass med glass ved å oppløse pulverisert CuPc i kloroform.
- Filtrer CuPc-løsningen gjennom en 0,2 μm polytetrafluoretylen (PTFE) membran.
- Oppbevar den filtrerte oppløsningen i et vasket hetteglass fylt med nitrogen, og forsegle hetteglasset med parafilm.
- Ta den kjøpte kloroformoppløsningen på 1,2 diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfolklin (DPhPC) (25 mg/ml) ut av -80 °C-kjøleskapet og la det varmes opp til romtemperatur.
- Rør DPhPC-oppløsningen ved hjelp av en vortex mikser ved 2300 o/min i 10 s.
- Skyll en glassmikrosprøyte med kloroform i 5 ganger.
- Overfør 200 μL av DPhPC kloroformoppløsningen til et forhåndsvasket hetteglass med den vasket sprøyten. Fordampe oppløsningsvæsken i hetteglasset med en mild strøm av nitrogen.
- Skyll en glassmikrosprøyte 5 ganger med kloroform.
- Tilsett 202,6 μL kloroform til hetteglasset med DPhPC ved hjelp av den rengjorte sprøyten.
- Tilsett 47,4 μL filtrert 10 mg/ml CuPc-oppløsning i DPhPC-løsningen. Molar forholdet mellom DPhPC og CuPc bør være 10:1.
- Skyll glassmikrosprøyten 5 ganger med kloroform.
- Tilsett 250 μL heksan i oppløsningen ved hjelp av sprøyten. Den endelige konsentrasjonen av oppløsningen skal være 10 mg/ml.
- Bland den tilberedte oppløsningen ved hjelp av en vortex mikser ved 2300 o/min i 10 s.
- Filtrer CuPc-løsningen gjennom en 0,2 μm polytetrafluoretylen (PTFE) membran.
- Forsegle hetteglasset med glass med parafilm. Sett den i en gripeforseglet pose fylt med nitrogen og legg grepet forseglet pose i en fryser ved -20 °C.
MERK: Etter trinn 1.13 ble DPhPC og CuPc oppløst i et blandet løsningsmiddel, som besto av kloroform og heksan (volumforhold på 1:1). I tillegg er molarforholdet mellom DPhPC og CuPc ikke begrenset til 10:1. Med en konstant konsentrasjon av lipider (10 mg/ml) kan forskjellige molarforhold brukes. Ifølge tidligere eksperimentelle resultater, et område fra 10:1 til 3:1 er foretrukket for å danne en høy kvalitet hybrid lipid membran.
2. Dannelsen av en hybrid membran ved vann-/luftgrensesnittet
- Klipp Si underlag (3 cm x 3 cm) fra en Si wafer.
- Rengjør 3 cm x 3 cm Si-substrater i et ultralydbad i 10 min i renset vann, etterfulgt av etanol og deretter kloroform. Behandle Si-underlaget med et O2 plasma i 5 min for å fjerne adsorberte organiske materialer fra overflaten og for å forbedre hydrofilisiteten.
- Vask et Teflon-beger med en innvendig diameter på 7,5 cm med rennende renset vann i 3 min.
- Sett det rengjorte Si-substratet i det vasket PTFE-begeret. Substratet er vippet i en vinkel på 30° til horisontal.
- Hell en tilstrekkelig mengde renset vann i Teflon-begeret til hele Si-substratet er nedsenket.
- Ta forberedt hybrid løsning ut av fryseren og la den varme til romtemperatur.
- Rør hybridløsningen ved hjelp av en vortex mikser ved 2300 o/min for 15 s.
- Skyll en mikrosprøyte i glass (50 μL) 5 ganger med kloroform.
- Slipp 3-5 μL av hybridoppløsningen på vannoverflaten ved hjelp av sprøyten for å danne en flytende hybrid lipidmembran.
MERK: Når oppløsningen slippes ned, er det viktig å holde dråpen nær (mindre enn 1 cm) vannoverflaten. Det bør også bemerkes at en enkeltlags hybridmembran ikke er synlig for det blotte øye, men flerlags hybridmembranen ser ut som tynn, blåfarget film. For å overføre flerlags hybridmembran til Si-underlaget, er det viktig å slippe den blandede løsningen så nært som mulig til Si-substratet.
3. Overføre membranen til et Si-substrat
- Etter fordampning av organisk løsemiddel (det vil ta mindre enn 2 sekunder), senk vannstanden med en hastighet på 3 mm / min ved å pumpe ut vannet gjennom et gummirør som drives av en peristaltisk pumpe, for å overføre den flytende hybridmembranen til Si-underlaget.
- Etter at overføringsprosessen er fullført (ca. 5 min), plasser Si-underlaget på en renromsvisker, og la alt gjenværende vann fordampe.
MERK: Senking av vannstanden med en så lav hastighet tjener til å minimere vannturbulensen og for å beskytte membranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den as-formede membranen har en jevn lyseblå farge på grunn av tilstedeværelsen av CuPc molekyler. Området av den fargede membranen er normalt flere kvadratcentimeter. I figur 1A og figur 1Bviser vi et mikroskopisk bilde og et atomkraftmikroskop (AFM) bilde (inkludert en høydeprofil) av hybrid lipidmembranen på et Si-substrat. I AFM-bildet er membranen øverst til venstre tykk, med en tykkelse på 79,4 nm og at nederst til høyre er tynn, med en tykkelse på 4,9 nm. Den tynne membranen viser en overflate grovhet av Ra = 0,4 nm, som er nær den rengjorte Si substrat. I tillegg, basert på flere målinger, viser membrantykkelser en diskret fordeling med 5-nm trinn18. Siden den rapporterte tykkelsen på en DPhPC lipid bilayer membran er ca 4 nm19, kan det konkluderes med at 5 nm tynn membran er en CuPc dopet lipid bilayer membran og at de tykke membranene består av stabler av dopet lipid bilayers.
Energidispergeringsanalyse (EDX) ble brukt til å undersøke sammensetningen av hybridmembranen på Si-substratet. Som beregnet ut fra dataene som vises i figur 2,er atomforholdene til representative elementer som Cu, P, N og C, 0,33%, 0,97%, 4,06% og 68,56%. Tatt i tanke på at et molarforhold på 3 til1 (DPhPC til CuPc) ble brukt til å forberede hybridmembranen, bør det teoretiske molarforholdet mellom Cu:P:N:C være 1:3:11:192, som er nær det målte elementforholdet i hybridmembranen, noe som indikerer at forholdet mellom lipidene og CuPc-molekylene opprettholdes etter filmdannelsen og overføringsprosessene.
Figur 1: As-formet hybrid membran dopet med CuPc. (A)Et konfokal mikroskopibilde av hybridmembranen. (B) AFM-bilde av hybridmembranen. Membranen vist i (B) inkluderer en hybrid flerlagsmembran med en tykkelse på 79,4 nm og en sammenhengende monolayer hybrid membran med en tykkelse på 4,9 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: EDX mønster av hybridmembranen på et Si-substrat. Tilsvarende elementer til funksjonene vises i figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I forløperløsningen av hybridmembranen brukes et blandet organisk løsningsmiddel (kloroform og heksan) i stedet for ren kloroform til å oppløse lipider og CuPc. Hvis ren kloroform brukes, vil tettheten av forløperløsningen være høyere enn vann. Derfor er det svært sannsynlig at løsningen vil synke til bunnen av vannet i stedet for å spre seg på vannoverflaten. Legge hexane, en lav tetthet løsemiddel, til forløperen løsning, sikrer at løsningen vil flyte på vannoverflaten og danne en jevn hybrid membran etter fordampning av løsemiddelet. Det bør også bemerkes at umiddelbart etter at løsningen kommer i kontakt med vannoverflaten, ble det alltid observert en liten overflatebølge, muligens på grunn av spredning av membranen og det organiske løsningsmidlet, noe som ville endre overflatespenningen av vann. Siden hybridmembranen er ultratyn og skjør, vil en liten forstyrrelse skade membranens intakthet med synlige sprekker som dannes. Derfor, for å forhindre ytterligere skade, er det svært viktig å minimere luftstrømmen rundt membranen og for å unngå vibrasjoner av vann etter dannelsen av hybridmembraner. Hvis det er mulig, bør Teflon-begeret plasseres på et vibrasjonsisolasjonsbord.
Den veletablerte Langmuir-Blodgett (LB) metoden er mye brukt til å danne lipid monolayers på vann / luft grensesnitt der hydrofile hoder av lipider er orientert mot vannet mens hydrofobe haler er orientert mot luften. Forskjellig fra LB-metoden, ved doping med CuPc-molekyler, tillot vår metode hybridmembraner med en bilayerstruktur som skal dannes ved vann / luftgrensesnittet i ett trinn. I hybridmembranen antas det at de hydrofobe CuPc-molekylene ligger mellom de hydrofobe "halene" av lipidmolekyler, og danner en spennende lipid / CuPc / lipid sandwichstruktur. Vi bekreftet denne antagelsen ved å gjennomføre fluorescens resonans energioverføring (FRET) målinger18.
I tillegg gjentok vi filmdannelsesprosessen ved hjelp av flere forskjellige molarforhold mellom DPhPC til CuPc etter samme protokoll som er beskrevet ovenfor. Vanligvis resulterte et lavt CuPc-forhold (f.eks. molarforhold på 20:1) i en hybridmembran med lysere farge og et mindre område enn et forberedt ved hjelp av et høyt CuPc-forhold (f.eks. 3:1 og 10:1). Det ser ut til at CuPc-molekylene bistår i bilayerformasjonen og også fungerer som et klebemiddel, noe som resulterer i dannelse av membraner med store områder. I tillegg, i fravær av lipidmolekyler, har CuPc-molekyler en tendens til å aggregere på både vannoverflaten20, og på det faste substratet etter løsningsmiddelfordampningen21. Men i tilfelle av en hybrid membran indikerte XRD-resultatene at CuPc-molekylene ikke samlet seg for å danne små krystaller i hybridmembranen18. Dette tyder på at aggregeringen av CuPc molekyler ble forhindret av samspillet mellom hydrofobe "haler" av lipider med CuPc. Men når flere CuPc molekyler ble brukt til å forberede en lipidløsning (for eksempel et molarforhold på 1:1), viser hybridmembranene ikke bare en mørkere blå farge, men CuPc-molekyler er også synlig aggregert i membranene. Tatt i tanke på at størrelsen på CuPc-molekylet (1,7 nm) er litt større enn diameteren på hodegruppen til lipidmolekylet (ca. 1 nm), har et molarforhold høyere enn 3:1 en tendens til å resultere i filmer som inneholder aggregerte CuPc-molekyler. Molarforholdet på 10:1 som ble brukt i de representative eksperimentene er en avveining mellom membranområdet og uønsket aggregering.
Etter den beskrevne protokollen ble hybride lipidmembraner med en sandwichstruktur dannet ved vann-/luftgrensesnittet. Ved doping med CuPc molekyler, hybrid lipid membran ville ha noen av funksjonene i halvledende molekyler, inkludert optoelektroniske og fotocatalytiske egenskaper, som ville betydelig utvide anvendelsene av lipid bilayer strukturer. Det bør også bemerkes at dopingmaterialet ikke er begrenset til CuPc molekyler. Vi har også dannet lignende hybridmembraner med lipid / Pc / lipid sandwich strukturer ved hjelp av 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyan (H2PC) og sink 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalaocyanin (ZnPC) som dopingmaterialer. Andre grupper har vist at overflatemodifiserte Au-nanopartikler, grafennanopark og fyldigerener kan stabilisere seg inne i lipid bilayer7,9,12. Derfor er det mulig å dope en lipid bilayer med andre hydrofobe molekyler og nanomaterialer, noe som ytterligere vil utvide anvendelsesområdet av hybrid lipidmembraner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av CREST-programmet til Japan Science and Technology Agency (JPMJCR14F3) og Grant in-Aids fra Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 og 18K14120). Dette arbeidet ble delvis utført ved Laboratory for Nanoelectronics og Spintronics, Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Wako Chemicals | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Glass vials with screw cap | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Chemicals | 084-03421 | |
| Membrane filters | Merck Millipore Ltd. | R8CA42836 | |
| Micro-syringe | Hamilton | 80530 | |
| Peristaltic pump | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | 11914199 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
References
- Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
- Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
- Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
- Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
- Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
- Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
- Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
- Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
- Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
- Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102 (2014).
- Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
- Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
- Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
- Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
- Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
- Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
- Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
- Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
- Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).
