Summary
Relatamos um protocolo para a produção de uma membrana lipídica híbrida na interface água/ar dopando a bicamada lipídica com moléculas de cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). A membrana lipídica híbrida resultante tem uma estrutura de sanduíche lipídida/CuPc/lipídio. Este protocolo também pode ser aplicado à formação de outros nanomateriais funcionais.
Abstract
Devido às suas propriedades únicas, incluindo uma espessura ultrathin (3-4 nm), resistividade ultra-alta, fluidez e capacidade de auto-montagem, bicamadas lipídicas podem ser facilmente funcionais e têm sido usadas em várias aplicações, como bio-sensores e bio-dispositivos. Neste estudo, introduzimos uma molécula orgânica planar: cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) para dopar membranas lipídicas. A membrana híbrida CuPc/lipídica se forma na interface água/ar por auto-montagem. Nesta membrana, as moléculas de CuPc hidrofóbicas estão localizadas entre as caudas hidrofóbicas de moléculas lipídicas, formando uma estrutura de sanduíche lipídico/CuPc/lipídio. Curiosamente, um bicamador lipídado híbrido estável no ar pode ser prontamente formado transferindo a membrana híbrida para um substrato Si. Relatamos um método simples para incorporar nanomateriais em um sistema de bicamadas lipídicas, o que representa uma nova metodologia para a fabricação de biosensores e biodispositivos.
Introduction
Como estruturas essenciais das membranas celulares, o interior das células são separados do exterior por um sistema lipídetivo bicamada. Este sistema consiste em fosfolipídios anfífilicos, que são compostos por ésterso fosfórico hidrofílico "cabeças" e ácidos graxos hidrofóbicos "caudas". Devido à notável fluidez e capacidade de auto-montagem de bicamadas lipídicas em ambiente aquoso1,2, bicamadas lipídicas artificiais podem ser formadas usando métodos simples3,4. Vários tipos de proteínas de membrana, como canais de íons, receptores de membrana e enzimas, foram incorporadas na bicamada lipídica artificial para imitar e estudar as funções das membranas celulares5,6. Mais recentemente, bicamadas lipídicas foram dopadas com nanomateriais (por exemplo, nanopartículas metálicas, grafeno e nanotubos de carbono) para formar membranas híbridas funcionais7,8,9,10,11,12,13. Um método amplamente utilizado para a formação dessas membranas híbridas envolve a formação de vesículas lipídicas dopadas, que contêm materiais hidrofóbicos, como nanotuculas Au-nanopartículasmodificadas 7 ou nanotubos de carbono11,e as vesículas resultantes são então fundidas em bicamadas lipídicas apoiadas por planares. No entanto, essa abordagem é complexa e demorada, o que limita o uso potencial dessas membranas híbridas.
Neste trabalho, as membranas lipídicas foram dopadas com moléculas orgânicas para produzir membranas lipídicas híbridas que se formaram na interface água/ar por auto-montagem. Este protocolo envolve três etapas: preparação da solução mista, formação de uma membrana híbrida na interface água/ar e transferência da membrana para um substrato Si. Comparado com outros métodos relatados anteriormente, o método descrito aqui é mais simples e não requer instrumentação sofisticada. Usando este método, membranas lipídicas híbridas estáveis no ar com uma área maior podem ser formadas em um tempo menor. O nanomaterial utilizado neste estudo é uma molécula orgânica semicondutora, cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (CuPc), que é amplamente utilizado em uma série de aplicações, incluindo células solares, fotodetetores, sensores de gás e catálise14,15. CuPc, uma pequena molécula orgânica com uma estrutura planar, tem uma alta afinidade com as "caudas" da dupla de fosfolipídios com suas características hidrofóbicas. Outros grupos relataram que as moléculas de CuPc podem se auto-montar em superfícies de cristal único com a formação de estruturas altamente ordenadas16,17. Portanto, é altamente possível que as moléculas de CuPc possam ser incorporadas aos bicamadas lipídicos através da auto-montagem.
Fornecemos uma descrição detalhada dos procedimentos utilizados para formar membranas e fornecemos algumas sugestões para implementar suavemente este procedimento. Além disso, apresentamos alguns resultados apresentá-inativos das membranas lipídicas híbridas e discutimos possíveis aplicações desse método.
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Protocol
1. Preparação de uma solução híbrida
- Lave quatro frascos de vidro descartáveis de 4 mL e tampas de parafuso (com selos revestidos de PTFE) em um banho ultrassônico por 10 min em água destilada (purificada com um sistema de filtragem), seguida por etanol e clorofórmio, respectivamente. Seque os frascos de vidro e as tampas em um fluxo de gás nitrogênio.
- Em um porta-luvas anaeróbica, prepare uma solução de estoque cupc (10 mg/mL) em um frasco de vidro lavado dissolvendo CuPc em pó em clorofórmio.
- Filtre a solução CuPc através de uma membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 μm (PTFE).
- Armazene a solução filtrada em um frasco de vidro lavado cheio de nitrogênio e sele o frasco com parafilme.
- Pegue a solução de clorofórmio de 1,2 mg/mL adquirida e deixe aquecer até a temperatura ambiente.
- Mexa a solução DPhPC usando uma batedeira de vórtice a 2300 rpm por 10 s.
- Enxágüe uma micro-seringa de vidro com clorofórmio por 5 vezes.
- Transfira 200 μL da solução de clorofóide DPhPC em um frasco de vidro pré-lavado usando a seringa lavada. Evaporar o solvente no frasco com um fluxo suave de nitrogênio.
- Enxágüe uma micro-seringa de vidro 5 vezes com clorofórmio.
- Adicione 202,6 μL de clorofórmio ao frasco de vidro com DPhPC usando a seringa limpa.
- Adicione 47,4 μL de solução de CuPc filtrada de 10 mg/mL na solução DPhPC. A relação molar de DPhPC para CuPc deve ser de 10:1.
- Enxágüe a micro-seringa de vidro 5 vezes com clorofórmio.
- Adicione 250 μL de hexano à solução usando a seringa. A concentração final da solução deve ser de 10 mg/mL.
- Misture a solução preparada usando um misturador de vórtice a 2300 rpm por 10 s.
- Filtre a solução CuPc através de uma membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 μm (PTFE).
- Sele o frasco de vidro com parafilm. Coloque-o em um saco selado recheado com nitrogênio e coloque o saco selado em um congelador a -20 °C.
NOTA: Após a etapa 1.13, o DPhPC e o CuPc foram dissolvidos em solvente misto, composto por clorofórmio e hexano (razão de volume de 1:1). Além disso, a razão molar de DPhPC para CuPc não se limita a 10:1. Com uma concentração constante de lipídios (10 mg/mL), diferentes razões molares podem ser usadas. De acordo com resultados experimentais anteriores, uma faixa de 10:1 a 3:1 é preferível para formar uma membrana lipídica híbrida de alta qualidade.
2. Formação de uma membrana híbrida na interface água/ar
- Corte substratos Si (3 cm x 3 cm) de um wafer Si.
- Limpe os substratos si de 3 cm x 3 cm em um banho ultrassônico por 10 minutos em água purificada, seguido de etanol e depois clorofórmio. Trate o substrato Si com um plasma O2 por 5 minutos para remover materiais orgânicos adsorvidos da superfície e melhorar a hidrofilicidade.
- Lave um béquer de Teflon com diâmetro interno de 7,5 cm com água purificada fluindo por 3 min.
- Coloque o substrato Si limpo no béquer PTFE lavado. O substrato é inclinado em um ângulo de 30° para a horizontal.
- Despeje uma quantidade suficiente de água purificada no béquer Teflon até que todo o substrato Si esteja submerso.
- Pegue a solução híbrida preparada do congelador e deixe aquecer até a temperatura ambiente.
- Mexa a solução híbrida usando um misturador de vórtice a 2300 rpm por 15 s.
- Enxágüe uma micro-seringa de vidro (50 μL) 5 vezes com clorofórmio.
- Solte 3-5 μL da solução híbrida na superfície da água usando a seringa para formar uma membrana lipídica híbrida flutuante.
NOTA: Quando a solução é descartada, é importante segurar a gota perto (menos de 1 cm) da superfície da água. Deve-se notar também que uma membrana híbrida de camada única não é visível a olho nu, mas a membrana híbrida de várias camadas aparece como uma película fina e de cor azul. Para transferir a membrana híbrida de várias camadas para o substrato Si, é importante deixar a solução mista o mais próxima possível do substrato Si.
3. Transferir a membrana para um substrato Si
- Após a evaporação do solvente orgânico (levará menos de 2 segundos), baixe o nível de água a uma taxa de 3 mm/min bombeando a água através de um tubo de borracha que é conduzido por uma bomba peristáltica, para transferir a membrana híbrida flutuante para o substrato Si.
- Após o processo de transferência ser concluído (cerca de 5 minutos), coloque o substrato Si em um limpador de sala de limpeza e permita que toda a água residual evapore.
NOTA: Baixar o nível da água a uma taxa tão baixa serve para minimizar a turbulência da água e proteger a membrana.
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Representative Results
A membrana como formada tem uma cor azul claro uniforme devido à presença de moléculas de CuPc. A área da membrana colorida é normalmente vários centímetros quadrados. Na Figura 1A e Figura 1B,mostramos uma imagem microscópica e uma imagem de microscópio de força atômica (AFM) (incluindo um perfil de altura) da membrana lipídica híbrida em um substrato Si. Na imagem AFM, a membrana no canto superior esquerdo é grossa, com espessura de 79,4 nm e que no canto inferior direito é fina, com espessura de 4,9 nm. A membrana fina mostra uma rugosidade superficial de Ra = 0,4 nm, que é próxima à do substrato Si limpo. Além disso, com base em múltiplas medidas, as espessuras da membrana mostram uma distribuição discreta com incrementos de 5 nm18. Uma vez que a espessura relatada de uma membrana bicamada lipídica DPhPC é de cerca de 4 nm19, pode-se concluir que a membrana fina de 5 nm é uma membrana de bicamada lipídica dopada cupc e que as membranas grossas são compostas de pilhas de bicamadas lipídicas dopadas.
A análise de raios-X dispersivos de energia (EDX) foi utilizada para investigar melhor a composição da membrana híbrida no substrato Si. Conforme calculado pelos dados apresentados na Figura 2,as proporções atômicas de elementos representativos como, P, N e C, são de 0,33%, 0,97%, 4,06% e 68,56%. Considerando que uma razão molar de 3 para 1 (DPhPC para CuPc) foi utilizada na preparação da membrana híbrida, a razão molar teórica de Cu:P:N:C deve ser de 1:3:11:192, que está próxima da razão de elementos medidos na membrana híbrida, indicando que a razão entre os lipídios e as moléculas de CuPc é mantida após os processos de formação e transferência de filme.
Figura 1: Membrana híbrida formada dopada com CuPc. (A) Uma imagem de microscopia confocal da membrana híbrida. (B) Imagem AFM da membrana híbrida. A membrana mostrada em (B) inclui uma membrana multicamadas híbrida com uma espessura de 79,4 nm e uma membrana híbrida monocameira contígua com uma espessura de 4,9 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Padrão EDX da membrana híbrida em um substrato Si. Os elementos correspondentes às características são mostrados na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Na solução precursora da membrana híbrida, um solvente orgânico misto (clorofórmio e hexano) em vez de clorofórmio puro é usado para dissolver lipídios e CuPc. Se o clorofórmio puro for usado, a densidade da solução precursora seria maior que a água. Portanto, é altamente provável que a solução afundaria no fundo da água em vez de se espalhar na superfície da água. Adicionar hexano, um solvente de baixa densidade, à solução precursora, garante que a solução flutuará sobre a superfície da água e formará uma membrana híbrida uniforme após a evaporação do solvente. Deve-se notar também que imediatamente após a solução entrar em contato com a superfície da água, sempre foi observada uma leve onda superficial, possivelmente devido à disseminação da membrana e do solvente orgânico, o que alteraria a tensão superficial da água. Uma vez que a membrana híbrida é ultrafina e frágil, uma pequena perturbação danificaria a intactidade da membrana com rachaduras visíveis sendo formadas. Portanto, para evitar maiores danos, é muito importante minimizar o fluxo de ar ao redor da membrana e evitar vibrações de água após a formação de membranas híbridas. Se possível, o béquer Teflon deve ser colocado em uma mesa de isolamento de vibração.
O método langmuir-blodgett (LB) bem estabelecido é amplamente utilizado para formar monocamadas lipídicas na interface água/ar onde cabeças hidrofílicas dos lipídios são orientadas para a água enquanto as caudas hidrofóbicas são orientadas para o ar. Diferente do método LB, dopando com moléculas de CuPc, nosso método permitiu que membranas híbridas com uma estrutura bicamada fossem formadas na interface água/ar em um passo. Na membrana híbrida, supõe-se que as moléculas de CuPc hidrofóbicas estão localizadas entre as "caudas" hidrofóbicas de moléculas lipídicas, formando uma intrigante estrutura de sanduíche lipídico/CuPc/lipídio. Confirmamos essa suposição realizando medições de transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET)18.
Além disso, repetimos o processo de formação de filmes usando várias proporções molar diferentes de DPhPC para CuPc seguindo o mesmo protocolo descrito acima. Geralmente, uma baixa relação de CuPc (por exemplo, razão molar de 20:1) resultou em uma membrana híbrida com uma cor mais clara e uma área menor do que uma preparada usando uma alta razão de CuPc (por exemplo, 3:1 e 10:1). Parece que as moléculas de CuPc auxiliam na formação de bicamadas e também atuam como um adesivo, resultando na formação de membranas com grandes áreas. Além disso, na ausência de moléculas lipídicas, as moléculas de CuPc tendem a se agregar tanto na superfície da água20, quanto no substrato sólido após a evaporação do solvente21. No entanto, no caso de uma membrana híbrida, os resultados do XRD indicaram que as moléculas de CuPc não se agregaram para formar pequenos cristais na membrana híbrida18. Isso sugere que a agregação de moléculas de CuPc foi evitada pela interação de "caudas" hidrofóbicas de lipídios com CuPc. No entanto, quando mais moléculas de CuPc foram usadas para preparar uma solução lipídica (como uma razão molar de 1:1), as membranas híbridas não só mostram uma cor azul mais escura, mas também moléculas de CuPc também são visivelmente agregadas nas membranas. Considerando que o tamanho da molécula de CuPc (1,7 nm) é ligeiramente maior do que o diâmetro do grupo principal da molécula lipídica (cerca de 1 nm), uma razão molar superior a 3:1 tende a resultar em filmes que contêm moléculas de CuPc agregadas. A razão molar de 10:1 que foi usada nos experimentos representativos é uma troca entre a área de membrana e a agregação indesejável.
Seguindo o protocolo descrito, membranas lipídicas híbridas com estrutura de sanduíche foram formadas na interface água/ar. Ao dopar com moléculas de CuPc, a membrana lipídica híbrida possuiria algumas das funcionalidades de moléculas semicondutoras, incluindo propriedades optoeletrônicas e fotocatalíticas, o que expandiria significativamente as aplicações de estruturas lipídicas de bicamadas. Deve-se notar também que o material de doping não se limita às moléculas de CuPc. Também formamos membranas híbridas similares com estruturas de sanduíches lipídicos/pc/lipídios usando 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (H2PC) e zinco 2,9,16,23-tetra-tert-butil-29H,31H-phthalocyanine (ZnPC) como materiais de doping. Outros grupos demonstraram que as nanopartículas de Au-nanopartículas, nanofolhas de grafeno e fullerenes modificados pela superfície poderiam estabilizar-se dentro da bicamada lipídica7,9,12. Portanto, é possível drogar uma bicamadas lipídicas com outras moléculas hidrofóbicas e nanomateriais, o que expandiria ainda mais a gama de aplicações de membranas lipídicas híbridas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo programa CREST da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão (JPMJCR14F3) e pela Grant in-Aids da Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 e 18K14120). Este trabalho foi realizado parcialmente no Laboratório de Nanoeletrônica e Spintronics, Instituto de Pesquisa de Comunicação Elétrica da Universidade de Tohoku.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Wako Chemicals | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Glass vials with screw cap | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Chemicals | 084-03421 | |
| Membrane filters | Merck Millipore Ltd. | R8CA42836 | |
| Micro-syringe | Hamilton | 80530 | |
| Peristaltic pump | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | 11914199 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
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