Summary
Biz bakır ile lipid bilayer doping tarafından su / hava arayüzü bir hibrid lipid membran üretmek için bir protokol rapor (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthayanilocne (CuPc) molekülleri. Ortaya çıkan hibrid lipid membran lipid/CuPc/lipid sandviç yapısına sahiptir. Bu protokol diğer fonksiyonel nanomalzemelerin oluşumuna da uygulanabilir.
Abstract
Ultraince kalınlık (3-4 nm), ultra yüksek direnç, akışkanlık ve kendi kendine montaj yeteneği gibi benzersiz özellikleri nedeniyle, lipid iki katmanları kolayca işlevsel hale getirilebilir ve biyo-sensörler ve biyo-cihazlar gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmıştır. Bu çalışmada, bir düzlemsel organik molekül tanıttı: bakır (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H, 31H-phthalocyanine (CuPc) dope lipid membranlar için. CuPc/lipid hibrid membran, su/hava arabiriminde kendi kendine montaj yoluyla oluşur. Bu membranda, hidrofobik CuPc molekülleri lipid moleküllerinin hidrofobik kuyrukları arasında yer alır, bir lipid / CuPc / lipid sandviç yapısı oluşturan. İlginçtir, bir hava kararlı hibrid lipid çift katmanlı kolayca bir Si substrat üzerine hibrid membran transfer imal edilebilir. Biyosensörler ve biyocihazların üretimi için yeni bir metodolojiyi temsil eden, nanomateryalleri lipid çift katmanlı bir sisteme dahil etmek için basit bir yöntem sunacağız.
Introduction
Hücre zarlarının temel çerçeveleri olarak, hücrelerin iç bir lipid çift katmanlı sistemi ile dış ayrılır. Bu sistem fofilik fosfolipidler oluşur, hangi hidrofilik fosforik ester oluşur "kafaları" ve hidrofobik yağ asitleri "kuyrukları". Sulu ortamda lipid iki katlarının olağanüstü akışkanlığı ve kendi kendine montaj yeteneği nedeniyle1,2, yapay lipid bilayers basit yöntemlerkullanılarak oluşturulabilir3,4. Iyon kanalları, membran reseptörleri ve enzimler gibi çeşitli membran proteinlerinin, hücre zarlarının işlevlerini taklit etmek ve incelemek için yapay lipid bilayer içine dahil edilmiştir5,6. Daha yakın zamanlarda, lipid iki katmanlı nanomalzemeler ile doped edilmiştir (örneğin, metal nano tanecikleri, grafen, ve karbon nanotüpler) fonksiyonel hibrid membranlar oluşturmak için7,8,9,10,11,12,13. Bu tür hibrid membranlar oluşturmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, modifiye Au-nanotanecikleri7 veya karbon nanotüpler11gibi hidrofobik malzemeler içeren doped lipid veziküloluşumunu içerir , ve ortaya çıkan veziküller daha sonra düzlemsel destekli lipid bilayers içine eritilir. Ancak, bu yaklaşım karmaşık ve zaman alıcı, bu tür hibrid membranların potansiyel kullanımları sınırlar.
Bu çalışmada, lipid membranlar kendi kendine montaj ile su / hava arabiriminde oluşan hibrid lipid membranlar üretmek için organik moleküller ile doped edildi. Bu protokol üç adım dan oluşur: karışık çözeltinin hazırlanması, su/hava arabiriminde hibrit membran oluşumu ve membranın Si substratına aktarılması. Daha önce bildirilen diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada açıklanan yöntem daha basittir ve gelişmiş enstrümantasyon gerektirmez. Bu yöntem kullanılarak daha geniş bir alana sahip hava stabil hibrid lipid membranlar daha kısa sürede oluşturulabilir. Bu çalışmada kullanılan nanomalzeme bir yarı iletken organik molekül, bakır (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H, 31H-phthalocyanine (CuPc), yaygın olarak güneş pilleri, fotodedektörler, gaz sensörleri ve kataliz14,15dahil olmak üzere bir dizi uygulamada kullanılır . Düzlemsel yapıya sahip küçük bir organik molekül olan CuPc, fosfolipid ikilisinin hidrofobik özelliklerine "kuyrukları" için yüksek bir afiniteye sahiptir. Diğer gruplar CuPc moleküllerinin tek kristal yüzeylerde yüksek sıralı yapıların oluşumu ile kendi kendine biraraya getirebildiği bildirilmiştir16,17. Bu nedenle, CuPc moleküllerinin kendi kendine montaj yoluyla lipid iki katiçine dahil edilebilir son derece mümkündür.
Membranoluşturmak için kullanılan prosedürlerin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar ve bu prosedürün sorunsuz bir şekilde uygulanması için bazı öneriler sayılmaktayız. Buna ek olarak, hibrid lipid membranların bazı sunum sonuçları sunmak ve bu yöntemin potansiyel uygulamaları tartışmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hibrit bir çözeltinin hazırlanması
- Yıkama dört 4 mL tek kullanımlık cam şişeleri ve vida kapakları (PTFE kaplı mühürler ile) distile suda 10 dakika ultrasonik banyo (bir filtrasyon sistemi ile arıtılmış), sırasıyla etanol ve kloroform izledi. Azot gazı akışında cam şişeleri ve kapakları kurulayın.
- Bir anaerobik eldiven kutusunda, kloroform toz CuPc eriterek yıkanmış cam şişe bir CuPc stok çözeltisi (10 mg / mL) hazırlamak.
- CuPc çözeltisini 0,2 μm politetrafloroetilen (PTFE) membrandan filtreleyin.
- Filtrelenmiş çözeltiyi azot dolu yıkanmış bir cam şişede saklayın ve şişeyi parafilmle kapatın.
- Satın alınan 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPhPC) kloroform çözeltisini (25 mg/mL) -80 °C buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına kadar ısıtın.
- 10 s için 2300 rpm bir girdap karıştırıcı kullanarak DPhPC çözeltisi karıştırın.
- 5 kez kloroform ile bir cam mikro şırınga durulayın.
- DPhPC kloroform çözeltisinin 200 μL'sini yıkanmış şırınga kullanarak önceden yıkanmış cam şişeye aktarın. Şişedeki çözücüyü nazik bir nitrojen akışıyla buharlaştırın.
- Bir cam mikro şırıngayı 5 kez kloroformla durulayın.
- Temizlenmiş şırınga kullanarak DPhPC ile cam şişeye 202,6 μL kloroform ekleyin.
- DPhPC çözeltisine 47,4 μL filtrelenmiş 10 mg/mL CuPc çözeltisi ekleyin. DPhPC'nin CuPc'ye molar oranı 10:1 olmalıdır.
- Cam mikro şırıngayı 5 kez kloroformile durulayın.
- Şırıngayı kullanarak çözeltiye 250°L heksane ekleyin. Çözeltinin son konsantrasyonu 10 mg/mL olmalıdır.
- Hazırlanan çözeltiyi 10 s için 2300 rpm'de bir girdap mikseri kullanarak karıştırın.
- CuPc çözeltisini 0,2 μm politetrafloroetilen (PTFE) membrandan filtreleyin.
- Cam şişeyi parafilmle kapatın. Azot dolu bir kavrama mühürlü torbaya koyun ve kavrama mühürlü torbayı -20 °C'de bir dondurucuya yerleştirin.
NOT: DPhPC ve CuPc 1.13.adımdan sonra kloroform ve heksandan (hacim oranı 1:1) oluşan karışık bir çözücü de çözüldü. Buna ek olarak, DPhPC'nin CuPc'ye molar oranı 10:1 ile sınırlı değildir. Sabit lipid konsantrasyonu (10 mg/mL) ile farklı molar oranlar kullanılabilir. Önceki deneysel sonuçlara göre, yüksek kaliteli hibrid lipid membran ı oluşturmak için 10:1 ile 3:1 arasında bir aralık tercih edilmektedir.
2. Su/hava arabiriminde hibrit membran oluşumu
- Si gofretinden Si yüzeyleri (3 cm x 3 cm) kesin.
- Temiz 3 cm x 3 cm Si arıtılmış suda 10 dakika ultrasonik banyoda yüzeyler, etanol ve ardından kloroform izledi. Yüzeyden adsorbe organik maddeleri kaldırmak ve hidrofililiği artırmak için Si substratını 5 dakika boyunca O2 plazmaile tedavi edin.
- Bir Teflon kabını 7,5 cm'lik iç çapı ile 3 dakika boyunca akan arıtılmış su ile yıkayın.
- Yıkanmış PTFE kabına temizlenmiş Si substratını koyun. Substrat 30° açıyla yataya doğru yatırılır.
- Tüm Si substrat batırılmış kadar Teflon kabı içine arıtılmış su yeterli miktarda dökün.
- Hazırlanan hibrid çözeltiyi dondurucudan alın ve oda sıcaklığına kadar ısıtın.
- 15 s için 2300 rpm bir girdap karıştırıcı kullanarak hibrid çözeltisi karıştırın.
- Bir cam mikro şırıngayı (50°L) 5 kez kloroformla durulayın.
- Yüzen bir hibrid lipid membran oluşturmak için şırınga kullanarak su yüzeyine hibrid çözeltinin 3-5 μL bırakın.
NOT: Çözelti bırakıldığında, damlacık su yüzeyine (1 cm'den az) yakın tutmak önemlidir. Ayrıca tek katmanlı hibrid membran çıplak gözle görülemez unutulmamalıdır, ama çok katmanlı hibrid membran ince olarak görünür, mavi renkli film. Çok katmanlı hibrid membranı Si substratına aktarmak için karışık çözeltiyi Si substratına mümkün olduğunca yakın bırakmak önemlidir.
3. Membranın bir Si substratına aktarılması
- Organik çözücübuharlaşma sonra (daha az alacak 2 saniye), 3 mm /dk bir hızda bir peristaltik pompa ile tahrik bir kauçuk tüp ile su pompalayarak su seviyesini düşürmek, Si substrat üzerine yüzen hibrid membran aktarmak için.
- Aktarım işlemi tamamlandıktan sonra (yaklaşık 5 dk), Si substratını temiz oda sileceklerine yerleştirin ve kalan suyun buharlaşmasına izin verin.
NOT: Su seviyesinin bu kadar düşük bir oranda düşürülmesi, suyun türbülansını en aza indirmeye ve membranı korumaya hizmet eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Olarak oluşan membran CuPc moleküllerinin varlığı nedeniyle düzgün bir açık mavi renge sahiptir. Renkli membran alanı normalde birkaç santimetre kare. Şekil 1A ve Şekil 1B'de,bir Si substratı üzerinde hibrit lipid membranının mikroskobik görüntü ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüsü (yükseklik profili dahil) gösteririz. AFM görüntüde, sol üstteki membran kalın, kalınlığı 79.4 nm ve sağ alt kısım ince, kalınlığı 4.9 nm.'dir. İnce membran, temizlenen Si substratına yakın olan Ra = 0.4 nm'nin yüzey pürüzlüğünü gösterir. Buna ek olarak, birden fazla ölçüme dayanarak, membran kalınlıkları 5-nm artışlı ayrı bir dağılım gösterir18. Bir DPhPC lipid çift katmanlı membran bildirilen kalınlığı yaklaşık 4 nm19olduğundan, 5 nm ince membran bir CuPc doped lipid çift katmanlı membran olduğu ve kalın membranlar doped lipid iki katmanlı yığınları oluşur sonucuna varılabilir.
Si substratı üzerindeki hibrid membranın bileşimini daha fazla araştırmak için enerji dağılımlı X-ışını (EDX) analizi kullanıldı. Şekil 2'degösterilen verilerden hesaplandığı üzere Cu, P, N ve C gibi temsili elementlerin atomik oranları %0.33, %0.97, %4.06 ve %68.56'dır. Hibrit membranın hazırlanmasında 3-1 molar oranının (DPhPC'den CuPc'ye) kullanıldığı düşünülürse, film oluşumu ve transfer işlemlerinden sonra lipidler ve CUPc molekülleri arasındaki oranın korunduğuna işaret eden, membranda ölçülen element oranına yakın olan Cu:P:N:C teorik molar oranı 1:3:11:192 olmalıdır.
Şekil 1: CuPc ile doped olarak oluşan hibrid membran. (A) Melez membranın konfokal mikroskopi görüntüsü. (B) Hibrid membranAFM görüntüsü. (B)'degösterilen membran, 79.4 nm kalınlığında hibrit çok katmanlı membran ve 4.9 nm kalınlığında bitişik bir monokatmanlı hibrid membran içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir Si substrat üzerinde hibrid membran EDX deseni. Özelliklere karşılık gelen öğeler şekilde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Melez membranın öncü çözeltisinde, saf kloroform yerine karışık organik çözücü (kloroform ve hekzan) lipidleri ve CuPc'yi eritmek için kullanılır. Saf kloroform kullanılırsa, öncül çözeltinin yoğunluğu sudan daha yüksek olacaktır. Bu nedenle, çözeltinin su yüzeyine yayılmak yerine suyun dibine batması çok olasıdır. Öncül çözeltiye düşük yoğunluklu bir çözücü olan heksanın eklenmesi, çözeltinin su yüzeyinde süzülmesini ve çözücünün buharlaşmasından sonra tek tip bir hibrid membran oluşturmasını sağlar. Ayrıca, çözelti su yüzeyi ile temas ettikten hemen sonra, hafif bir yüzey dalgası her zaman gözlenen, muhtemelen membran ve organik çözücü yayılması nedeniyle, hangi su yüzey gerilimini değiştirecek unutulmamalıdır. Hibrid membran ultra ince ve kırılgan olduğundan, küçük bir rahatsızlık görünür çatlaklar oluşan membran bozulmazarar verecek. Bu nedenle, daha fazla zarar görmesini önlemek için, membran çevresindeki hava akışını en aza indirmek ve hibrid membranoluşumundan sonra su titreşimleri önlemek için çok önemlidir. Mümkünse, Teflon kabı titreşim izolasyon masasına yerleştirilmelidir.
Köklü Langmuir−Blodgett (LB) yöntemi yaygın olarak lipid lerin hidrofilik kafaları suya yönelik iken hidrofobik kuyrukları havaya yönelik su / hava arabiriminde lipid monolayers oluşturmak için kullanılır. LB yönteminden farklı olarak, CuPc molekülleri ile doping yaparak, yöntemimiz bir adımda su/hava arabiriminde iki katmanlı bir yapıya sahip hibrit membranlara izin verilmiştir. Melez membranda, hidrofobik CuPc moleküllerinin lipid moleküllerinin hidrofobik "kuyrukları" arasında yer aldığı ve ilginç bir lipid/CuPc/lipid sandviç yapısı oluşturduğu varsayılır. Biz floresan rezonans enerji transferi (FRET) ölçümleri18yaparak bu varsayımı doğruladı.
Buna ek olarak, yukarıda açıklanan aynı protokolü izleyerek DPhPC'nin birkaç farklı molar oranını kullanarak Film Oluşum Sürecini CuPc'ye tekrarladık. Genel olarak, düşük CuPc oranı (örneğin, molar oranı 20:1) daha açık renkli ve yüksek CuPc oranı kullanılarak hazırlanan bir hibrid membran sonuçlandı (örneğin 3:1 ve 10:1). Bu CuPc molekülleri iki katmanlı oluşumuna yardımcı ve aynı zamanda bir yapıştırıcı olarak hareket görünür, geniş alanlara sahip membranların oluşumu ile sonuçlanan. Buna ek olarak, lipid moleküllerinin yokluğunda, CuPc molekülleri hem su yüzeyinde toplam eğilimindedir20, ve çözücü buharlaşma sonra katı substrat21. Ancak, bir hibrid membran durumunda, XRD sonuçları CuPc moleküllerinin hibrid membran küçük kristaller oluşturmak için toplam olmadığını belirtti18. Bu cupc moleküllerinin toplama CuPc ile lipidlerin hidrofobik "kuyrukları" etkileşimi ile önlenmiş olduğunu göstermektedir. Ancak, daha fazla CuPc molekülleri bir lipid çözeltisi hazırlamak için kullanıldığında (1:1 molar oranı gibi), hibrid membranlar sadece koyu mavi renk göstermek le kalmıyor, aynı zamanda CuPc molekülleri de gözle görülür bir şekilde membranlarda toplanır. CuPc molekülünün (1,7 nm) büyüklüğünün lipid molekülünün baş grubunun çapından biraz daha büyük olduğu düşünülürse (yaklaşık 1 nm), 3:1'den daha yüksek bir azı azı oranı, birleştirilmiş CuPc molekülü içeren filmlere neden olma eğilimindedir. Temsili deneylerde kullanılan 10:1 molar oranı membran alanı ile istenmeyen toplama arasındaki bir dengedir.
Açıklanan protokolün ardından su/hava arabiriminde sandviç yapılı hibrit lipid membranlar oluşturuldu. CuPc molekülleri ile doping olarak, hibrid lipid membran önemli ölçüde lipid iki katmanlı yapıların uygulamalarını genişletmek istiyorsunuz optoelektronik ve fotokatalitik özellikleri de dahil olmak üzere, yarı iletken moleküllerin bazı işlevleri sahip olacaktır. Ayrıca doping malzemesi CuPc molekülleri ile sınırlı değildir unutulmamalıdır. Ayrıca 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H, 31H-phthalocyanine (H2PC) ve çinko 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthayanine (ZnPC) doping malzemeleri olarak kullanarak lipid/Pc/lipid sandviç yapıları ile benzer hibrid membranlar oluşturduk. Diğer gruplar yüzey modifiye Au-nanotanecikleri, grafen nanosheets ve fullerenes lipid bilayeriçindestabilize olabileceğini göstermiştir7 ,9,12. Bu nedenle, diğer hidrofobik moleküller ve nanomalzemeler ile bir lipid bilayer dope mümkündür, hangi daha hibrid lipid membranların uygulama yelpazesini genişletmek olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı(JPMJCR14F3) crest programı ve Japonya Bilimin Teşvik Derneği'nden (19H00846 ve 18K14120) Hibe in-Aids programı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Tohoku Üniversitesi Elektrik İletişimi Araştırma Enstitüsü Nanoelektronik ve Spintronics Laboratuvarı'nda gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Wako Chemicals | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Glass vials with screw cap | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Chemicals | 084-03421 | |
| Membrane filters | Merck Millipore Ltd. | R8CA42836 | |
| Micro-syringe | Hamilton | 80530 | |
| Peristaltic pump | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | 11914199 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
References
- Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
- Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
- Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
- Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
- Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
- Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
- Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
- Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
- Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
- Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102 (2014).
- Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
- Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
- Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
- Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
- Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
- Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
- Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
- Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
- Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).
