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Genetics

मात्रात्मक गुणसूत्र संरचना कैप्चर (4C) द्वारा भ्रूण निकायों में एन्हांस्ड-प्रमोटर संपर्कों की पहचान

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/60960
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Universitat Pompeu Fabra, 3Vall d'Hebron Institute of Oncology

Summary

हम भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न भ्रूणीय निकायों में उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के बाद मात्रात्मक गुणसूत्र संरचना कैप्चर के आवेदन की रिपोर्ट करते हैं। यह तकनीक भ्रूणस्टेम कोशिका भेदभाव के दौरान किसी दिए गए जीन के ख्यात संवर्न्दरों और प्रमोटर क्षेत्रों के बीच संपर्कों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है।

Abstract

स्तनधारी विकास के दौरान, कोशिका फैट्स नियामक नेटवर्क की स्थापना के माध्यम से निर्धारित किए जाते हैं जो जीन अभिव्यक्ति की विशिष्टता, समय और स्थानिक पैटर्न को परिभाषित करते हैं। प्लुरीपोटस्टेम सेल से प्राप्त भ्रूणीय निकाय (ईबी) मुख्य तीन रोगाणु परतों के भेदभाव का अध्ययन करने और सेल भाग्य विनिर्देश के दौरान नियामक सर्किट को परिभाषित करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल रहे हैं। हालांकि यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि ऊतक विशिष्ट बढ़ाने प्रमोटरों के साथ बातचीत करके इन नेटवर्कों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, उन्हें अपने प्रासंगिक लक्ष्य जीन को निर्दिष्ट अभी भी चुनौतीपूर्ण बना हुआ है । इसे संभव बनाने के लिए, विकास के दौरान बढ़ाने वाले प्रमोटर संपर्कों और उनकी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। यहां, हमने ईबी विभेदन मॉडल में कॉग्नेट प्रमोटरों के साथ बढ़ाने वालों और उनके संपर्कों को परिभाषित करने के लिए 4C विधि को अनुकूलित किया। विधि अक्सर प्रतिबंध एंजाइमों, ध्वनि, और एक नेस्टेड-लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर प्रोटोकॉल वाणिज्यिक डीएनए पुस्तकालय तैयार करने किट के साथ संगत का उपयोग करता है । बाद में, 4C पुस्तकालयों को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के अधीन किया जाता है और बायोइंफॉर्मेटिक रूप से विश्लेषण किया जाता है, जिससे उन सभी दृश्यों का पता लगाने और मात्रा निर्धारित की जाती है जिनके पास चुने हुए प्रमोटर के साथ संपर्क होते हैं। परिणामस्वरूप अनुक्रमण डेटा का उपयोग भेदभाव के दौरान बढ़ाने वाले प्रमोटर संपर्कों की गतिशीलता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है। ईबी भेदभाव मॉडल के लिए वर्णित तकनीक को लागू करना आसान है।

Introduction

चूहों में, ३.५ दिन पुराने भ्रूण के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) में भ्रूणीय pluripotent स्टेम कोशिकाएं होती हैं । आईसीएम आगे दिन 4.5 पर एपिब्लास्ट में विकसित होता है, जिससे एक्टोडर्म, मेसोडरम और एंडोडर्म कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं, जो भ्रूण में मुख्य तीन रोगाणु परतें होती हैं। यद्यपि आईसीएम में प्लूरिटेंट कोशिकाएं केवल वीवो में क्षणिक रूप से मौजूद हैं, लेकिन उन्हें माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (एमसीएससी)1,2,2,3की स्थापना द्वारा संस्कृति में पकड़ा जा सकता है। एमसीईसी एक अविभेदित स्थिति में रहते हैं और अनिश्चित काल तक पैदा होते हैं, फिर भी आंतरिक और बाह्य उत्तेजनाओं पर वे भी pluripotenc राज्य से बाहर निकलने और तीन विकासात्मक रोगाणु परतों2,,4की कोशिकाओं को पैदा करने में सक्षम हैं । दिलचस्प बात यह है कि जब छोटी बूंदों में निलंबन में सुसंस्कृत, एमसीईसी तीन आयामी समुचेगित (यानी, ईबीएस) बनाते हैं जो सभी तीन रोगाणु परतों5में अंतर करते हैं। ईबी गठन परख प्रारंभिक वंश विशिष्टता प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

वंश विशिष्टता के दौरान, प्रत्येक रोगाणु परत की कोशिकाएं एक विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम4प्राप्त करती हैं। जीन की सटीक स्थानिक अभिव्यक्ति को विविध सीआईएस-नियामक तत्वों द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसमें कोर प्रमोटर, एन्हांसर, साइलेंसर और इंसुलेटर6,,7,,8,,9शामिल हैं। बढ़ाने, नियामक डीएनए खंड आम तौर पर कुछ सौ आधार जोड़े फैले, ऊतक विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति8समंवय । स्थानीय क्रोमेटिन संरचना8,10को विनियमित करने वाले प्रतिलेखन कारकों और कोकारकों को बाध्यकारी बनाकर एन्हांसर्स सक्रिय या खामोश कर दिए जाते हैं । आमतौर पर ख्यात बढ़ाने वालों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकें जीनोम-वाइड क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन हैं जिसके बाद अनुक्रमण (सीआईपी-सीक्यू) और अनुक्रमण (ATAC-seq) तकनीकों का उपयोग करके ट्रांसपोसे-सुलभ क्रोमेटिन के लिए परख। इस प्रकार, सक्रिय एन्हांसर्स विशिष्ट सक्रिय हिस्टोन के निशान और स्थानीय डीएनए पहुंच11,,12,13,,14में वृद्धि से विशेषता है।, इसके अलावा, विकासात्मक बढ़ाने वालों को उनके कॉग्नेट प्रमोटर8,9के साथ शारीरिक बातचीत की आवश्यकता होती है। दरअसल, यह दिखाया गया है कि बढ़ाने वाले वेरिएंट और विलोपन जो बढ़ाने वाले प्रमोटर संपर्कों को बाधित करते हैं, विकासात्मक विकृतियोंको 15का कारण बन सकते हैं। इसलिए, उपन्यास तकनीकों की आवश्यकता है जो विकासात्मक जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले कार्यात्मक एन्हांसर्स की पहचान के लिए अतिरिक्त जानकारी प्रदान करती हैं।

गुणसूत्र संरचना कैप्चर (3 सी) तकनीक16के विकास के बाद से, गुणसूत्र संपर्कों की मैपिंग का नियामक तत्वों के बीच भौतिक दूरी का आकलन करने के लिए गहन ताकीद किया गया है। महत्वपूर्ण बात, 3 सी तकनीकों के उच्च थ्रूपुट वेरिएंट हाल ही में विकसित किए गए हैं, जो गुणन, पाचन, लिगेशन और क्रोमेटिन टुकड़ों17के बीच संपर्कों की वसूली के लिए विभिन्न रणनीतियां प्रदान करते हैं। उनमें से, सीटू हाय-सी में एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है जो 3 सी लिगेशन उत्पादों जीनोम-वाइड18के अनुक्रमण की अनुमति देता है। हालांकि, बढ़ाने-प्रमोटर संपर्कों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त संकल्प तक पहुंचने के लिए आवश्यक उच्च अनुक्रमण लागत विशिष्ट लोकी के अध्ययन के लिए इस तकनीक को अव्यावहारिक बनाती है। इसलिए, उच्च,संकल्प19, 20,,21,22पर लक्षित लोकी का विश्लेषण करने के लिए वैकल्पिक तरीके विकसित किए गए थे ।20 इन तरीकों में से एक, अर्थात् 4C, जिसे सभी रणनीति बनाम एक के रूप में जाना जाता है, उन सभी दृश्यों का पता लगाने की अनुमति देता है जो दृष्टिकोण के रूप में चुनी गई साइट से संपर्क करते हैं। हालांकि, मानक 4C तकनीक का नुकसान प्रतिकूल पीसीआर आवश्यक है, जो अलग आकार के टुकड़ों को बढ़ाता है, छोटे उत्पादों के पक्ष में और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के बाद पूर्वाग्रह मात्रा। हाल ही में, यूमी-4सी, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं (यूमी) का उपयोग करके 4C तकनीक का एक नया संस्करण मात्रात्मक और लक्षित गुणसूत्र संपर्क प्रोफाइलिंग के लिए विकसित किया गया है जो इस समस्याको 23को दरकिनार करता है । यह दृष्टिकोण लगातार कटर, सोनिकेशन और एक नेस्टेड-लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, जिससे अपेक्षाकृत समान लंबाई वितरण के साथ डीएनए टुकड़ों का प्रवर्धन शामिल है। यह एकरूपता छोटे दृश्यों के लिए पीसीआर वरीयताओं की प्रवर्धन प्रक्रिया में पूर्वाग्रहों को कम करती है और स्थानिक रूप से जुड़े अणुओं/टुकड़ों की कुशल वसूली और सटीक गिनती की अनुमति देती है ।

यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो ईबी विभेदन के दौरान प्रमोटरों और वंश शिक्षाप्रद प्रतिलेखन कारकों के बढ़ाने के बीच क्रोमेटिन संपर्कों की पहचान करने और निर्धारित करने के लिए यूमी-4सी तकनीक को अनुकूलित करता है।

Protocol

1. माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से भ्रूण शरीर पीढ़ी

  1. एमईएससी सीरम-मुक्त संस्कृति माध्यम तैयार करें: डीएमईएम/एफ12 और न्यूरोबेसल मीडियम 1:1 के अनुपात में मिलाया गया । संस्कृति माध्यम MEM गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (1x), सोडियम पायरुवेट (1 mM), एल ग्लूटामाइन (2 mM), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०० U/mL), बीटा-मर्काप्टो के साथ पूरक है इथेनॉल (50 माइक्रोन), एन 2 और बी 27 सप्लीमेंट (1x), PD0325901 (1 μM), CHIR99021 (3 μM), और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF) (1,000 U/mL) ।
  2. ईबी विभेदन माध्यम तैयार करें: डीएमईएम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (1x), सोडियम पायरुवेट (1 mM), एल-ग्लूटामाइन (2 mM), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू/एमएल), बीटा-मर्कैप्टोथेनॉल (50 माइक्रोएम) के साथ पूरक है।
  3. 10 सेमी प्लास्टिक व्यंजनों पर संस्कृति एमसीईसी को एमएससी संस्कृति सीरम-मुक्त माध्यम में 0.1% (w/v) जिलेटिन के साथ प्रीकोटेड किया गया है।
  4. जब एमसीईसी 60% कन्फ्लंच तक पहुंचते हैं, तो संस्कृति माध्यम को हटा दें और बंध्याकरण पीबीएस के 2 मिलील के साथ धीरे-धीरे 1x धोएं।
  5. पीबीएस को पूरी तरह से हटा दें और सेल टुकड़ी माध्यम के 2 mL जोड़ें। 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर डिश इनक्यूबेट करें।
  6. ईबी विभेदन माध्यम के 8 मिलीग्राम को पकवान में जोड़कर प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करें।
  7. एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 15-20 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा एमईएससी उपनिवेशों को अलग करना।
  8. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को केंद्रित करें और ध्यान से सुपरनेटेंट को हटा दें।
  9. कोशिकाओं की गणना करें (उदाहरण के लिए, हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करना)।
  10. ईबी विभेदन माध्यम के साथ सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और एकाग्रता को 2 x 104 कोशिकाओं/mL में समायोजित करें।
  11. एक 15 सेमी संस्कृति पकवान के ढक्कन उलटा और ढक्कन पर पुनः निलंबित कोशिकाओं (~ 400 कोशिकाओं/बूंद) की 20 μL बूंदों को जमा करने के लिए एक 200 μL मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
  12. नीचे कक्ष पर ध्यान से ढक्कन उलटा और 3 दिनों के लिए 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फांसी बूंदों के साथ पकवान इनक्यूबेट।
  13. पीबीएस के 10 मीटर के साथ धीरे से ढक्कन धोने और एक 50 मीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए ईबी युक्त निलंबन हस्तांतरण द्वारा ईबी ले लीजिए।
  14. 30 मिन के लिए आरटी पर ट्यूब रखें, ताकि ईबीएस गुरुत्वाकर्षण से नीचे तक डूब जाए। अतिशयोक्ति को सावधानी से हटा दें।
  15. ईबीएस को 10 मीटर ताजा ईबी भेदभाव माध्यम के साथ धीरे से फिर से निलंबित करें और 10 सेमी जीवाणु पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  16. 3-6 दिन बाद उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करईईईई गठन की जांच करें। उत्पन्न ईबीएस गोल और आकार में सजातीय होना चाहिए।
  17. 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें। ईबीएस तीन रोगाणु परतों में अंतर करना जारी रखेगा और विश्लेषण के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है।

2. ईबी का विच्छेदन

  1. ईबीएस को दो से तीन 10 सेमी व्यंजन ों से 50 मिलीएल प्लास्टिक ट्यूब में इकट्ठा करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर 300 x ग्राम पर ईबी को अपकेंद्रित करें, फिर ध्यान से सुपरनेटेंट को हटा दें।
  2. पीबीएस के 10 एमएल के साथ ईबी को फिर से निलंबित करें। 3 मिन के लिए आरटी पर 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र ईबीएस और सुपरनेटेंट को हटा दें।
  3. ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.25%) का 2 एमएल जोड़ें गोली के लिए और 15 min के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट. एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए हर 3 मिन ऊपर और नीचे पिपेट।
  4. ट्राइप्सिन रिएक्शन को रोकने के लिए ईबी विभेदन माध्यम के 8 मिलीग्राम जोड़ें। माइक्रोस्कोप के तहत ईबी विसोशन की जांच करें और कोशिकाओं की गणना करें।

3. निर्धारण

  1. 1 x 106 कोशिकाओं/mL पर ताजा ईबी संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें । 50 मीटर ट्यूब के लिए, मध्यम के 45 मीटर में अधिकतम 4.5 x 107 कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. एक 37% स्टॉक (6 महीने से पुराना नहीं) से पैराफॉर्मलडिहाइड को 1% अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
    सावधानी: पैराफॉर्मलडिहाइड को संभालते समय उचित स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों का पालन करें क्योंकि यह एक खतरनाक रसायन है।
  3. रोटेशन के तहत आरटी में 10 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  4. 0.125 मीटर की अंतिम एकाग्रता में ग्लाइसिन जोड़कर फॉर्मलडिहाइड को बुझाएं।
  5. रोटेशन के तहत आरटी में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  6. निश्चित कोशिकाओं को बर्फ में स्थानांतरित करें और अभी से 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखें।
  7. एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली।
  8. सुपरनेट को त्यागें और ठंडे पीबीएस (5 x 106 कोशिकाओं के लिए 1 mL) में गोली को फिर से निलंबित करें, फिर 1.5 मिलील सुरक्षित-लॉक ट्यूबों पर स्थानांतरित करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली, अलौकिक त्यागें, और तरल नाइट्रोजन में छर्रों को स्नैप-फ्रीज करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।

4. सेल लिसिस और प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट

  1. ताजा तैयार बर्फ-ठंडा लाइसिस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच = 8.0, 10 एमएम एनएसीएल, 0.2% इगेपाल सीए630, और 1x प्रोट अवरोधक) प्रति 2-5 x 106 कोशिकाओं के 0.25 मिलील में सेल पैलेट को धीरे से फिर से निलंबित करें। लिसिस बफर के 5 mL तैयार करने के लिए, तालिका 1देखें ।
  2. बर्फ पर 15 मिन के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। अधिनायक को त्यागें और गोली रखें, जिसमें नाभिक होता है।
  4. पैलेट ्ड न्यूक्लियी को 500 माइक्रोन कोल्ड लिसिस बफर से धोएं।
  5. 1x बफर 2 में 0.5% एसडीएस के 50 माइक्रोन के साथ 1.5 मिलीट्यूब में गोली को धीरे से फिर से निलंबित करें, फिर 10 मीटर के लिए 62 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक में ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  6. हीटिंग ब्लॉक से ट्यूबों को हटा दें और एसडीएस को बुझाने के लिए 10% ट्राइटन एक्स-100 के 25 माइक्रोन युक्त पाचन बफर के 170 माइक्रोन जोड़ें। अत्यधिक फोमिंग से बचते हुए, पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  7. 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  8. पाचन बफर के 25 μL जोड़ें, उलटा द्वारा मिश्रण है, और एक अपाच्य नियंत्रण के रूप में 8 μL ले लो । -20 डिग्री सेल्सियस पर अपाच्य नियंत्रण नमूना रखें। शेष नाभिक में 100 यू एमबीओआई प्रतिबंध एंजाइम (25 यू/माइक्रोन स्टॉक का 4 माइक्रोन) जोड़ें और रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए क्रोमेटिन को पचा लें। एमबोई के 100 यू का एक और एलिकोट जोड़ें और अतिरिक्त 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रोटेशन के तहत एमबोआई का एक और 100 यू जोड़ें और इनक्यूबेट लें।
  10. अगले दिन, MboI के एक और १०० यू जोड़ें और रोटेशन के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  11. एक पचा नियंत्रण नमूने के रूप में 8 μL ले लो। डी-क्रॉसलिंक पचा नियंत्रण नमूने और टीई बफर के 80 माइक्रोन (10 एमएम ट्रिस पीएच = 8, 1 mM EDTA) और 10 माइक्रोन प्रोटीन के 10 माइक्रोन (10 मिलीग्राम/mL) जोड़कर चरण 4.8 से अपाच्य नियंत्रण नमूने। 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  12. पाचन दक्षता की जांच करने के लिए 0.6% जेल पर 20 माइक्रोन एल को चलाएं। सफल पाचन 3.0-0.5 केबी रेंज में ज्यादातर टुकड़े दिखाते हैं।

5. निकटता लिगेशन और क्रॉसलिंक रिवर्सल

  1. MboI को निष्क्रिय करने के लिए 20 मिन के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 65 डिग्री सेल्सियस पर MboI पचाने वाले नमूनों को इनक्यूबेट करें, फिर आरटी को ठंडा करें।
  2. आरटी पर 1,000 x ग्राम पर 5 मिन के लिए ट्यूबों को अपकेंद्रित करना, सुपरनेटेंट को हटा दें, और ताजा लिगास बफर के 200 माइक्रोन में गोली को भंग करें।
  3. प्रत्येक नमूने में लिगेशन मास्टर मिक्स के 1,000 माइक्रोन जोड़ें। लिगेशन मास्टर मिक्स के 1,000 माइक्रोन तैयार करने के लिए, तालिका 2देखें।
  4. धीमी गति से रोटेशन (9 आरपीएम) के साथ रातोंरात आरटी पर उलटा और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स ।
  5. आरएनए और प्रोटीन अवशेषों को प्रोटीनके 100 माइक्रोन (10 मिलीग्राम/mL) और RNase ए (10 मिलीग्राम/mL) के 10 μL जोड़कर खत्म करें । 45-60 मिन के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट सैंपल।
  6. अतिरिक्त 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूने इनक्यूबेटिंग जारी रखें।

6. डीएनए बाल काटना और आकार चयन

  1. टी के लिए शांत ट्यूबों ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
  3. नमूना को 2 मिलील ट्यूबों में तीन 400 माइक्रोन एलिकोट में विभाजित करें और प्रत्येक ट्यूब में 100% इथेनॉल के 2 माइक्रोन (3 एम, पीएच = 5.2), और 2.5x वॉल्यूम (1 एमएल) 100% इथेनॉल के 2 माइक्रोन (20 मिलीग्राम) जोड़ें। 45-60 मिन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इनवर्टिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिलाएं।
  4. 25 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। 25 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें और ध्यान से पाइपिंग करके सुपरनेटेंट को हटा दें।
  5. 70% इथेनॉल के 800 माइक्रोन में फिर से निलंबित करके डीएनए छर्रों को धोएं। 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  6. अधिनेता को हटा दें और 70% इथेनॉल के 800 माइक्रोन के साथ एक बार फिर धोने का प्रदर्शन करें।
  7. 1x ट्रिस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच = 8) के 130 माइक्रोन में गोली को भंग करें और डीएनए को पूरी तरह से भंग करने के लिए 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि आवश्यक हो, तो किसी भी उपजी को फिर से निलंबित करने के लिए पाइपिंग का उपयोग करें।
  8. डीएनए उपज को मापें; 1 x 106 कोशिकाओं के लिए क्रोमेटिन के 2.5-5 μg की उम्मीद की जा सकती है। 0.6% अगारोज जेल पर 3 सी उत्पाद के ± 200 एनजी चलाकर लिगेशन की जांच करें। सफल लिगेशन ज्यादातर डीएनए के टुकड़े और 3 केबी दिखाते हैं । नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. 1x ट्रिस बफर वॉल्यूम (1 μg प्रति ट्यूब) के 100 माइक्रोन में 10 एनजी/μL के लिए ध्वनि के लिए उपयुक्त 0.65 mL ट्यूब में एक नमूना पतला करें। पुस्तकालय तैयार करने के लिए उपयोग की जाने वाली मानक राशि 3 μg है, इसलिए यदि आवश्यक हो तो तीन अलग-अलग ट्यूबों में सोनिकेशन करें।
  10. सोनिकेटर पर निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके 150-700 बीपी (औसत = 400-500 बीपी) के आकार के लिए डीएनए कतरनी: चक्र: 20 में से 6-8 पर -60 एस बंद। यह Illumina अनुक्रमकों का उपयोग कर उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार करने के लिए उपयुक्त डीएनए बनाना चाहिए ।
  11. कतरनी डीएनए को एक सामान्य नई सुरक्षित-लॉक ट्यूब पर स्थानांतरित करें। एक ही नमूने से कई ध्वनि पूल।
  12. आरटी पर डीएनए शुद्धिकरण मोतियों की एक बोतल गर्म करें। अब से, कम बाध्यकारी सुझावों का उपयोग करें।
  13. डीएनए ट्यूब में मोतियों की 1.8x मात्रा जोड़ें और धीरे से फिर से निलंबित करें।
  14. 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  15. एक चुंबकीय रैक के साथ मोती ले लीजिए। चुंबकीय रैक में ट्यूबों को रखते हुए ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 1 mL के साथ मोतियों 2x धोएं।
    नोट: अवशिष्ट बूंदों सहित सभी इथेनॉल निकालें।
  16. हवा सूखी मोती संक्षेप में (2-3 मिन) आरटी में ।
    नोट: 5 मिन से अधिक समय तक मोतियों को सूखा न करें। इससे डीएनए यील्ड में कमी आएगी।
  17. डीएनए को एल्यूट करने के लिए 1x ट्रिस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच = 8) के 90 माइक्रोन के साथ मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  18. डीएनए यील्ड को मापें और 1.5% जेल पर 5 माइक्रोन एलिकोट का विश्लेषण करें। प्रीसोनिकेशन यील्ड की तुलना में बहुत कम नुकसान होना चाहिए।

7. अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी

  1. लाइब्रेरी तैयार करने वाली किट से मास्टर मिक्स के 15 माइक्रोन जोड़ें। कतरनी डीएनए के सिरों की मरम्मत के लिए, 10x अंत मरम्मत प्रतिक्रिया बफर के 10 μL और अंत मरम्मत एंजाइम मिश्रण के 5 μL गठबंधन ।
  2. 30 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  3. डीएनए शुद्धिकरण मोतियों की 1.1 x मात्रा जोड़ें और धीरे से फिर से निलंबित करें।
  4. 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  5. एक चुंबकीय रैक के साथ मोती ले लीजिए। चुंबकीय रैक में ट्यूब ों को रखते हुए ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 1 mL के साथ दो बार मोतियों को धोएं। इथेनॉल निकालें।
  6. आरटी में 2-3 मिन के लिए मोतियों को हवा से सुखाएं। 1x ट्रिस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच = 8) के 42 माइक्रोन के साथ मोतियों को डीएनए को एल्यूट करने के लिए रिसस्पेंड करें।
  7. प्रत्येक नमूने में डीए-टेलिंग मास्टर मिक्स के 8 माइक्रोन जोड़ें। डीए-टेलिंग मास्टर मिक्स तैयार करने के लिए, 10x डीए-टेलिंग रिएक्शन बफर के 5 माइक्रोन और क्लेनो खंड एक्सो माइनस के 3 माइक्रोन को मिलाएं।
  8. 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  9. डीएनए को डिफोस्फोरेट करने के लिए 2 μL बछड़ा आंतों क्षारीय फॉस्फेटेज़ (सीआईपी) जोड़ें।
  10. 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर, फिर 60 मिन 50 डिग्री सेल्सियस पर।
  11. डीएनए शुद्धिकरण मोतियों की 1.1x मात्रा जोड़ें और धीरे से फिर से निलंबित करें।
  12. 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  13. एक चुंबकीय रैक के साथ मोती ले लीजिए। चुंबकीय रैक में ट्यूबों को रखते हुए ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 1 mL के साथ मोतियों 2x धोएं।
  14. हवा सूखी मोती संक्षेप में (2-3 मिन) आरटी में । डीएनए को एल्यूट करने के लिए 1x ट्रिस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच = 8) के ३५ माइक्रोन के साथ मोतियों को फिर से निलंबित करें ।
  15. एडाप्टर लिगेशन रिएक्शन करें। तालिका 3में उल्लिखित कम एडाप्टर/लिगास सांद्रता का उपयोग करें ।
  16. 15 मिन के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  17. यूरासिल डीएनए ग्लाइकोसिलेस और डीएनए ग्लाइकोसिलेस लाइसे एंनोटुस्लीज VII (जैसे, उपयोगकर्ता) एंजाइम के मिश्रण का 3 μL जोड़ें, पाइपिंग द्वारा मिश्रण करें, और 15 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  18. पानी के साथ वॉल्यूम को 100 माइक्रोन तक बढ़ाएं, 5 मिन को 96 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, फिर बर्फ पर सैंपल रखें।
  19. डीएनए शुद्धिकरण मोतियों की 1.1x मात्रा जोड़ें और धीरे से फिर से निलंबित करें।
  20. 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  21. एक चुंबकीय रैक के साथ मोती ले लीजिए। चुंबकीय रैक में ट्यूबों को रखते हुए ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 1 mL के साथ मोतियों 2x धोएं।
  22. आरटी में 2-3 मिन के लिए मोतियों को हवा से सुखाएं। 1x ट्रिस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच = 8) के 50 माइक्रोन के साथ मोतियों को डीएनए को एल्यूट करने के लिए रिसस्पेंड करें।

8. 4C क्रोमेटिन इंटरैक्शन लाइब्रेरी प्रवर्धन और शुद्धि

  1. पहली पीसीआर को पूरा करने के लिए पुस्तकालय के 10 माइक्रोन का उपयोग करके 4सी लाइब्रेरी को बढ़ाना। पीसीआर सेटअप और कार्यक्रम तालिका 4में पाया जा सकता है ।
  2. नेस्टेड पीसीआर को अंजाम दें। नेस्टेड पीसीआर सेटअप और प्रोग्राम तालिका 5में पाया जा सकता है ।
  3. प्रत्येक पुस्तकालय के लिए पूल पीसीआर उत्पाद और 1.1 x डीएनए शुद्धिकरण मोतियों के साथ शुद्ध करें।
  4. डीएनए यील्ड को मापें और 1.5% जेल पर 5 माइक्रोन एलिकोट का विश्लेषण करें।
  5. पुस्तकालय एकाग्रता समायोजित और पुस्तकालय अनुक्रम। यदि अनुक्रमित, पुस्तकालयों अनुक्रमण से पहले पूल किया जा सकता है ।

Representative Results

फांसी की बूंदों में ईएससी भेदभाव को शामिल करने के छह दिन बाद, हमने ईबी की एक समरूप आबादी प्राप्त की जिसका उपयोग आगे विश्लेषण(चित्रा 1)के लिए किया गया था। हमने ईबीएस24में वंश विशिष्ट जीन के प्रमोटरों पर विशिष्ट क्रोमेटिन बातचीत की मात्रा निर्धारित करने के लिए यूमी-4सी विधि23 को अनुकूलित किया। विभिन्न चरणों में प्रतिनिधि गुणवत्ता नियंत्रण जैल के साथ प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 2एमें दिखाया गया है। पहली गुणवत्ता नियंत्रण MboI प्रतिबंध एंजाइम पाचन की दक्षता निर्धारित करने के लिए किया गया था। कुशल पाचन से कम 3 kbp(चित्रा 2बी)के एक टुकड़ा आकार दिखाया । नोट की, एमईएससी और ईबी क्रोमेटिन पाचन मुश्किल था और कभी-कभी अवशिष्ट अपाच्य क्रोमेटिन कायम था। दूसरी गुणवत्ता नियंत्रण लिगेशन के बाद किया गया था ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि अधिकांश टुकड़े अब 3 केबीपी(चित्रा 2बी)थे । फिर, जैल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा सोनिकेशन के बाद प्राप्त क्रोमेटिन टुकड़ों का विश्लेषण किया गया। 400-500 बीपी के टुकड़े आकार की उम्मीद थी(चित्रा 2बी)।

डिफोस्फोरिलाइजेशन और सिंगल-एंड एडाप्टर लिगेशन के बाद, ब्याज के लक्ष्यों को बढ़ाने के लिए पीसीआर के दो राउंड किए गए । प्रत्येक लोकस के लिए दो प्राइमर का एक सेट डिजाइन करने के लिए एक नेस्टेड दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। इससे विशिष्टता में सुधार करने में मदद मिली । प्रत्येक लक्ष्य को पीसीआर स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए दो अलग-अलग प्राइमर जोड़े के साथ अलग से परिलक्षित किया गया था (यानी, पीएयू 5एफ1 लोकस के लिए प्राइमर जोड़े ए और बी और टी लोकस के लिए प्राइमर जोड़े सी और डी) और परिणामस्वरूप 400 बीपी(चित्रा 2सी)के आसपास डीएनए धब्बा हो गया। वैकल्पिक रूप से, मल्टीप्लेक्स पीसीआर को एक साथ लक्ष्य ए और सी(चित्रा 2डी)लक्ष्यबढ़ाने के लिए किया गया था और इसके परिणामस्वरूप शुद्धि के बाद एक समान टुकड़ा आकार(चित्रा 2डी)हुआ। 4C लाइब्रेरी तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर (Pou5f1 और टीके लोकी) टेबल 6में पाए जा सकते हैं।

डेटा विश्लेषण के लिए, कच्चे अनुक्रमण पढ़ता है पहले refence mm10 माउस जीनोम के खिलाफ गठबंधन किया गया, सभी डुप्लिकेट थे, और कम गुणवत्ता (< 20) पढ़ता हटा दिया गया । प्रत्येक चारा के लिए, प्रत्येक प्रतिबंध टुकड़े पर जानकारी पढ़ने के टुकड़ों की संख्या की गणना करके प्राप्त की गई थी, और एक कच्चा संपर्क प्रोफ़ाइल प्राप्त किया गया था। इसके बाद, ब्याज के क्षेत्र को चारा के लिए 2 केबीपी और 250 केबीपी दूरी के साथ सभी प्रतिबंध टुकड़ों के रूप में परिभाषित किया गया था। प्रत्येक प्रतिबंध टुकड़े के आकार को निकटवर्ती प्रतिबंध के टुकड़ों को क्रमिक रूप से एकत्र करके बढ़ाया गया था ताकि ब्याज के क्षेत्र में कच्चे संपर्कों की कुल संख्या का 5% की सीमा तक पहुंच न न हो जाए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रतिकृतिएकीकृत थे, और शर्तों की तुलना की गई थी, हमने प्रतिबंध टुकड़ा स्तर पर ढलानों और यादृच्छिक अवरोध दोनों शामिल थे। प्रति स्थिति औसत प्रोफ़ाइल और उनके बीच गुना परिवर्तन की साजिश रची गई थी जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है । ईबी भेदभाव के दौरान, लचीलाता जीन Pou5f1 के बढ़ाने और प्रमोटर के बीच संपर्कों में कमी आई, जबकि मेसेंदोडर वंश शिक्षाप्रद प्रतिलेखन कारक टी के बढ़ाने-प्रमोटर संपर्कों में वृद्धि हुई(चित्रा 3),इन विकासात्मक बढ़ाने वालों के बारे में कार्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

Figure 1
चित्र 1: MESC और व्युत्पन्न भ्रूण निकायों के प्रतिनिधि छवियां । दिन 0 mESC सीरम मुक्त स्थितियों में सुसंस्कृत (बाएं) और समरूप दिन 6 EBs (दाएं) एक उल्टे माइक्रोस्कोप द्वारा मनाया । स्केल बार = 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 4C कार्यप्रवाह और प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों की प्रतिनिधि छवियां। (A)मात्रात्मक 4C की योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। रुपये = प्रतिबंध साइट; अमेरिका = अपस्ट्रीम; डीएस = डाउनस्ट्रीम; यूपी = यूनिवर्सल प्राइमर; D = आरएस और डीएस के बीच की दूरी आदर्श रूप से 5-15 बीपी होनी चाहिए।(B)एमबोई-डाइजेटेड क्रोमेटिन (I), इन-न्यूक्लिकी लिगाटेड क्रोमेटिन (II), और सोनिकेटेड क्रोमेटिन (III) के उदाहरण। बाईं ओर की संख्या डीएनए सीढ़ी द्वारा निर्धारित डीएनए आकार प्रत्येक नमूने के लिए चलाने का संकेत मिलता है । (ग)दो लोकी पर पीसीआर प्रवर्धन के उदाहरण: Pou5f1 (प्राइमर ए और बी) और टी (प्राइमर सी और डी) । (D) Pou5f1 और टी loci में मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रवर्धन के उदाहरण प्राइमर ए और सी ES = भ्रूणस्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर; ईबी = भ्रूणशरीर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 4C प्रोफाइल के उदाहरण। Pou5f1 और टी जीन प्रमोटरों पर स्थित बाइट्स के लिए मात्रात्मक 4C प्रोफाइल mESCs और दिन 6 EBS में परख े । शीर्ष पैनल दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों से उत्पन्न औसत संपर्कों के भूखंडों को दिखाता है; नीचे पैनल दिन 6 EBs बनाम mESCs (दो प्रतिकृति के औसत) के औसत संपर्क गुना परिवर्तन से पता चलता है । हल्के नीले बक्से भेदभाव के दौरान गतिशील परिवर्तन के साथ बढ़ाने वालों के स्थान को इंगित करते हैं। चित्रा Tian एट अल24से अनुकूलित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

5mL के लिए
1M Tris-HCl, पीएच8.0 50 माइक्रोन
5M NaCl 10 माइक्रोन
10% इगेपाल CA630 100 माइक्रोन
50x रोशे पूर्ण प्रोटीज़ अवरोधक 100 माइक्रोन
मिलीक्यू पानी 4.74 करोड़

तालिका 1: लिसिस बफर।

1000μL के लिए
मिलीक्यू पानी 869 μL
10X एनईबी T4 डीएनए लिगासे बफर 120 माइक्रोन
20mg/mL गोजातीय सीरम एल्बुमिन 6 माइक्रोन
२००० U/μL T4 डीएनए लिगास 5 माइक्रोन

तालिका 2: लिगेशन मास्टर मिक्स तैयारी।

15 μL के लिए
5X त्वरित लिगेशन रिएक्शन बफर 10 माइक्रोन
NEBNext एडाप्टर 3 माइक्रोन
त्वरित T4 डीएनए लिगाज़ 2 माइक्रोन

तालिका 3: एडाप्टर लिगेशन रिएक्शन।

पीसीआर सेटअप
एडाप्टर लिगाटेड लाइब्रेरी-ऑन-डेड 10 माइक्रोन
पीसीआर ग्रेड पानी 20.25 माइक्रोन
10 माइक्रोएम लक्ष्य विशिष्ट प्राइमर 3.75 माइक्रोन
10 माइक्रोन एम एनईबी इंडेक्स प्राइमर 3.75 माइक्रोन
हर्कुलाज़ II 5X बफर 10 माइक्रोन
10 मिमी डीएनटीपी 1.25 माइक्रोन
हर्कुलाज़ द्वितीय बहुलक 1 μL
कुल मात्रा 50 माइक्रोन
पीसीआर कार्यक्रम
चरण 1: 98 डिग्री सेल्सियस - 2 मिन
चरण 2: 98 डिग्री सेल्सियस - 20s
चरण 3: 65 डिग्री सेल्सियस - 30
चरण 4: 72 डिग्री सेल्सियस - 45s
चरण 5: 15-18 चक्रों की कुल बनाने के लिए 2 कदम पर जाएं
चरण 6: 72 डिग्री सेल्सियस - 3 मिन
चरण 7: 4 डिग्री सेल्सियस - पकड़ो

तालिका 4: 4सी क्रोमेटिन इंटरैक्शन लाइब्रेरी प्रवर्धन, पहली पीसीआर।

नेस्टेड पीसीआर सेटअप
पहली पीसीआर से डीएनए टुकड़ा 10 माइक्रोन
पीसीआर ग्रेड पानी 20.25 माइक्रोन
10 μM विशिष्ट प्राइमर +P5 Illumina प्राइमर 3.75 माइक्रोन
10 μM P7 Illumina प्राइमर 3.75 माइक्रोन
हर्कुलाज़ II 5X बफर 10 माइक्रोन
10 मिमी डीएनटीपी 1.25 माइक्रोन
हर्कुलाज़ द्वितीय बहुलक 1 μL
कुल मात्रा 50 माइक्रोन
नेस्टेड पीसीआर कार्यक्रम
चरण 1: 98 डिग्री सेल्सियस - 2 मिन
चरण 2: 98 डिग्री सेल्सियस - 20s
चरण 3: 65 डिग्री सेल्सियस - 30
चरण 4: 72 डिग्री सेल्सियस - 45s
चरण 5: 15-18 चक्रों की कुल बनाने के लिए 2 कदम पर जाएं
चरण 6: 72 डिग्री सेल्सियस - 3 मिन
चरण 7: 4 डिग्री सेल्सियस - पकड़ो

तालिका 5: 4सी क्रोमेटिन इंटरैक्शन लाइब्रेरी प्रवर्धन, नेस्टेड पीसीआर।

नाम अनुक्रम (5'-3')
डीएस-अक्टूबर 4-ए AATGATACGGCGACCACGAGATCTACCTCTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTTCGCAagataACTCAGCAGCAGCAG
यूएस-अक्टूबर 4-ए TCTCTTGCAaaGATAACTACACCAGGCC
डीएस-अक्टूबर 4-बी AATGATACGGCGACCACGAGATCTACCTCTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTGTGATGTCAGCAGCTGGCCGCGCT
यूएस-अक्टूबर 4-बी ACCAGGTGGGGGTGTGTCAGCAGCT
डीएस-टी-सी AATGATACGGCGACCACGAGATCTACCTCTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCCCCTGGGTCCTGCACATTCGCCAAAGC
यूएस-टी-सी GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA
डीएस-टी-डी AATGATACGGCGACCACGAGATCTACCTCTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTCTTGGAGAGGTCAAGAGCCCGGGAG
यूएस-टी-डी GCTGAGGCTTTGGAGGCAGAGCC
यूपी-4सी CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
एडीपी-आई1 CAAGCAGAAGCGGCATACAGATCGTGTGTGTGTGAGA
CGTGTGCTCTTCCGATCC
एडीपी-आई2 CAAGCAGaAGCGGCATACAGATACTACATATCGGTGTGACTGTTCAGA
CGTGTGCTCTTCCGATCC
एडीपी-आई3 CAAGCAGAAGCGGCATACGAGATGCCTAAgtgactgTTCAGA
CGTGTGCTCTTCCGATCC
एडीपी-आई4 CAAGCAGAAGCGGCATACGAGTTGGTCAGTgACTGGGGTTGAA
CGTGTGCTCTTCCGATCC

तालिका 6: प्राइमर्स 4C लाइब्रेरी तैयार करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।

Discussion

हैंगिंग ड्रॉप कल्चर विधि को अतिरिक्त विकास कारकों या साइटोकिनों की आवश्यकता नहीं होती है और एमसीईसी5की पूर्व निर्धारित संख्या से ईबी की सजातीय आबादी को पुन: उत्पन्न करता है । यहां हम ईबी विभेदन मॉडल में वंश विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों के बढ़ाने-प्रमोटर संपर्क की मात्रा निर्धारित करने के लिए UMI-4C दृष्टिकोण से अनुकूलित मात्रात्मक 4C के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । हमने क्रोमेटिन क्षेत्रों की पहचान की जो ईबी भेदभाव के दौरान गतिशील अंदाज में Pou5f1 और टी जीन के प्रमोटरों से संपर्क करते हैं। Pou5f1 ईबी भेदभाव के दौरान डाउनरेकेटेड था और Pou5f1 प्रमोटर और उसके डिस्टल एन्हांसियर के बीच संपर्क आवृत्ति में कमी आई। इसके विपरीत, ईबी भेदभाव के दौरान टी को अपरेच किया गया था और हमने तीन एन्हांसर्स की पहचान की जिसके लिए उनके प्रमोटर के साथ संपर्क आवृत्तियों में कमी आई है(चित्रा 3)। पहचान की पुष्टि करने के लिए, सक्रिय हिस्टोन मार्क एच3के27एसी की क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन (सीआईपी) परख24किया जा सकता है, क्योंकि इस हिस्टोन मार्क को बढ़ाने वाले सक्रियण से जुड़ा हुआ दिखाया गया है और संयोजिका अपने निष्क्रियता11के दौरान इस निशान को खो देते हैं।

विशिष्ट जीनोमिक साइटों25के क्रोमेटिन संपर्क प्रोफ़ाइल का सर्वेक्षण करने के लिए एक मानक 4सी तकनीक का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है । हालांकि, पीसीआर खंड आकार की विषमता और पीसीआर डुप्लिकेट को अलग करने की असंभवता के कारण26,,27,,28 को व्यापक सामान्यीकरण के बाद भी इस दृष्टिकोण की मात्रात्मक व्याख्या करना मुश्किल है। हमारी मात्रात्मक 4सी विधि काफी हद तक यूएमआई-4सी तकनीक के समान है जो क्लासिक 4सी दृष्टिकोण23की सीमा को बाईपास करने के लिए सोनिकेशन और एक नेस्टेड-लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर चरण का उपयोग करके एकल अणुओं के परिमाणीकरण की अनुमति देती है। हालांकि, यूमी-4सी के विपरीत जो अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं का उपयोग करता है, हमारा मात्रात्मक 4C प्रोटोकॉल सोनिकेशन चरण द्वारा उत्पादित विशिष्ट डीएनए ब्रेक के आधार पर एकल अणुओं के परिमाणीकरण की अनुमति देता है। यह हमारे प्रोटोकॉल वाणिज्यिक डीएनए पुस्तकालय तैयारकरने किट के साथ संगत बनाता है, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं के साथ प्राइमर की जरूरत का निराकरण ।

हमारे प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। शास्त्रीय 4C विधि28में, हमारे प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कारक 3 सी अणुओं की तैयारी के दौरान पाचन और लिगेशन की दक्षता हैं। कम पाचन/लिगेशन क्षमता नाटकीय रूप से ब्याज के एक टुकड़े के साथ बातचीत की जटिलता को कम कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक कम संकल्प । जैसा कि पहले23वर्णित है, प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम पुस्तकालय प्रवर्धन के लिए प्राइमर का डिजाइन है। दूसरी पीसीआर रिएक्शन प्राइमर को पूछताछ प्रतिबंध स्थल से 5-15 एनटी स्थित होना चाहिए। एक 75 nt अनुक्रमण पढ़ने में, यह मानचित्रण के लिए कब्जा लंबाई के कम से कम 40 nt छोड़ दिया के लिए अनुमति देता है। पहली पीसीआर प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर को दूसरे प्राइमर के ऊपर डिजाइन किया जाना चाहिए जिसमें कोई ओवरलैप नहीं होना चाहिए और दोनों को कुशल डीएनए प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त विशिष्ट होना चाहिए। मल्टीप्लेक्सिंग के लिए, प्राइमर को स्वतंत्र रूप से डिजाइन किया जाना चाहिए, जिसका लक्ष्य पिघलने वाले तापमान (टीएम)60-65 डिग्री सेल्सियस के लिए है। इसके अलावा, अन्य 3 C तकनीकों के लिए, मात्रात्मक 4C विधि का संकल्प प्रोटोकॉल25में उपयोग किए जाने वाले प्रतिबंध एंजाइम द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल 4 बीपी रिकग्निशन साइट, एमबीओआई के साथ एक प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करता है। इस एंजाइम के साथ अधिकतम संकल्प लगभग 500 बीपी है, लेकिन यह अत्यधिक लोकस निर्भर है और शायद ही कभी हासिल किया जाता है। एक और सीमा यह है कि एक ही प्रतिबंध के टुकड़े में स्थित तत्वों के बीच होने वाली बातचीत का पता नहीं लगाया जा सकता है। इसके अलावा, एक प्रतिबंध स्थल की दूरी पर होने वाली बातचीत को अपाच्य पृष्ठभूमि से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। लिगेशन से पहले एक फिल-इन चरण का उपयोग इन बातचीत का पता लगाने की अनुमति दे सकता है।

मात्रात्मक 4C आदर्श रूप से लक्षित लोकी के क्रोमेटिन संपर्कों से पूछताछ करने के लिए अनुकूल है। हालांकि, विशिष्ट पीसीआर प्रवर्धन कदम एक साथ जांच की जा सकती है कि loci की संख्या को सीमित करता है। लक्षित लोकी की संख्या बढ़ाने का एक तरीका कई लक्ष्यों को बढ़ाना करने के लिए पीसीआर कदमों को मल्टीप्लेक्स करना है, लेकिन इसके लिए कार्यान्वयन से पहले प्रत्येक प्राइमर जोड़ी का उपयोग और परीक्षण करने वाले प्राइमर की अनुकूलता की आवश्यकता होती है। यदि प्रमोटरों पर क्रोमेटिन वास्तुकला के वैश्विक परिवर्तन वांछित हैं, तो जीनोम-व्यापी दृष्टिकोण जैसे हाय-सी, पीसी हाय-सी, या हिचआईपी29,,30,,31अधिक उपयुक्त होंगे।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम एफ ले डिली, आर Stadhouders और उनकी सलाह और चर्चा के लिए ग्राफ प्रयोगशाला के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । जीएस को मैरी Sklodowska-क्यूरी फैलोशिप (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), एक जुआन डे ला Cierva पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (MINECO, FJCI-2014-22946) द्वारा टीटी द्वारा समर्थित किया गया था । इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा 7फ्रेमवर्क प्रोग्राम FP7 (ईआरसी सिनर्जी ग्रांट 4डी-जीनोम, अनुदान समझौते 609989 को टीजी), स्पेन के अर्थव्यवस्था, उद्योग और प्रतिस्पर्धा मंत्रालय (एमईआईसी) को ईएमबीएल साझेदारी, सेंट्रो डी एक्सेलेंसिया सेवेरो ओचोआ 2013-2017 और सीईआरसीए प्रोग्राम जनरलिट डी कैटाल्यून्या के तहत समर्थन दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% EmbryoMax gelatin EMD Millipore ES-006-B Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA 25200072
AMPure XP Beckman Coulter 10136224 4C/DNA purification
B27 supplement Gibco 17504044 Cell culture
Beta-mercaptoethanol Gibco 31350010 Cell culture
Bioruptor Pico Diagencode B01060010 4C/sonication
BSA NEB B9000S 4C
CHIR99021 Selleck Chemicals S1263 Cell culture
CIP NEB M0212 4C
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001 4C
DMEM/F12 medium Gibco 11320033 Cell culture
dNTP NEB N0447S 4C
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1107 Cell culture
Formaldehyde solution (37%) Sigma 252549-25ML 4C
Glycin Sigma GE17-1323-01 4C
Glycogen ThermoFischer R0551 4C
Herculase II Fusion DNA polymerase Agilent 600675 4C
IGEPAL CA-630 Sigma I3021-50ML 4C
Knockout DMEM 10829018
L-glutamine Gibco 25030081 Cell culture
MboI NEB R0147M 4C
MEM non-essential amino acids Gibco 11140050 Cell culture
N2 supplement Gibco A1370701 Cell culture
NEBNext DNA Library prep NEB E6040 4C
NEBuffer 2.1 NEB B7202S 4C/digestion
Neurobasal medium Gibco 21103049 Cell culture
PD0325901 Selleck Chemicals S1036 Cell culture
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Proteinase K NEB P8107S 4C
Qubit 4 Fluorometer ThermoFischer Q33238 4C
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFischer Q32851 4C
RNase A ThermoFischer EN0531 4C
Sodium pyruvate solution Gibco 11360070 Cell culture
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 Cell culture
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S 4C
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB M0202M 4C

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जेनेटिक्स इश्यू 158 डेवलपमेंट ट्रांसक्रिप्शन रेगुलेशन भ्रूण शरीर वंश विनिर्देश एन्हांसर प्रमोटर गुणसूत्र संरचना कैप्चर 4C
मात्रात्मक गुणसूत्र संरचना कैप्चर (4C) द्वारा भ्रूण निकायों में एन्हांस्ड-प्रमोटर संपर्कों की पहचान
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Tian, T. V., Vidal, E., Graf, T.,… More

Tian, T. V., Vidal, E., Graf, T., Stik, G. Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C). J. Vis. Exp. (158), e60960, doi:10.3791/60960 (2020).

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