Summary
우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.
Abstract
포유류 발달 도중, 세포 운명은 유전자 발현의 특이성, 타이밍 및 공간 패턴을 정의하는 규정하는 네트워크의 설치를 통해 결정됩니다. 다능성 줄기 세포에서 유래된 배아체(EBs)는 주요 3개의 생식층의 분화를 연구하고 세포 운명 규격 동안 조절 회로를 정의하는 인기 있는 모델이었다. 조직 특이적 강화제가 프로모터와 상호 작용하여 이러한 네트워크에서 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있지만, 관련 표적 유전자에 할당하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이를 가능 하 게 하려면, 양적 접근 증강-프로모터 접촉 및 개발 하는 동안 그들의 역학을 공부 하는 데 필요한. 여기서, EB 분화 모델에서 인핸서 및 이들의 접촉을 코그네이트 프로모터와 정의하는 4C 방법을 적용하였다. 이 방법은 상용 DNA 라이브러리 준비 키트와 호환되는 자주 절단 제한 효소, 초음파 처리 및 중첩 결찰 매개 PCR 프로토콜을 사용합니다. 이어서, 4C 라이브러리는 고처리량 시퀀싱을 실시하고 생체 정보학적으로 분석되어 선택한 프로모터와 접촉하는 모든 서열을 감지하고 정량화할 수 있습니다. 생성된 시퀀싱 데이터는 또한 분화 동안 증강-프로모터 접촉의 역학에 대한 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. EB 분화 모델에 대해 설명된 기술은 구현하기 쉽습니다.
Introduction
마우스에서, 3.5 일 된 배아의 내부 세포 질량 (ICM)은 배아 다능성 줄기 세포를 포함합니다. ICM은 4.5일째에 에피블라스트로 발전하여 배아의 주요 3개 생식층인 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포를 생성한다. ICM내의 다능성 세포는 생체 내에서 만일시적으로 존재하지만, 마우스 배아 줄기세포(mESCs)의 확립에 의해 배양내에서 포획될 수 있다1,,2,,3. 상기 mESCs는 미분화 상태로 남아 무기한 증식하지만, 본질및 외인성 자극에 따라 그들은 또한 3개의 발달세균층의 다능상태 및 생성 세포를 빠져나갈 수 있다2,,4. 흥미롭게도, 작은 물방울에서 현탁액에서 배양될 때, mESCs는 3개의 세균 층모두로분화하는 3차원 응집체(즉, EB)를 형성한다 5. EB 형성 분석은 초기 계보 사양 프로세스를 연구하는 중요한 도구입니다.
계보 명세서 동안, 각 생식층의 세포는 특정 유전자 발현 프로그램4를획득한다. 유전자의 정확한 시공간적 발현은 코어 프로모터, 인핸서, 소음기 및 절연체6,,7,,8,,9를포함하는 다양한 시스 조절 요소에 의해 조절된다. 인핸서, 조절 DNA 세그먼트는 전형적으로 수백 개의 염기 쌍을 아우르며, 조직 특이적 유전자발현을 조정한다 8. 인핸서는 국소 염색질 구조를 조절하는 전사 인자 및 보조 인자의 결합에 의해 활성화되거나 침묵된다8,,10. 일반적으로 사용되는 기술은 게놈 전체 염색체 면역 침전 시퀀싱 (ChIP-seq) 및 시퀀싱 (ATAC-seq) 기술을 사용하여 트랜스 포사제 접근 크로마틴에 대한 분석법뒤에 있습니다. 따라서, 활성 강화제는 특이적 활성 히스톤 마크 및 증가된 국소 DNA 접근성11,,12,,13,,14를특징으로 한다. 또한, 발달 강화제는 그들의 동체프로모터와물리적 인 상호 작용을 필요로하는 것으로 추정된다8,9. 실제로, 인핸서-프로모터 접촉을 방해하는 인핸서 변이체 및 삭제가 발달기형(15)으로이어질 수 있음을 보여주었다. 따라서, 발달 유전자 발현을 조절하는 기능성 강화제의 식별을 위한 추가 정보를 제공하는 새로운 기술에 대한 필요성이 있다.
염색체 형태 포획(3C)기술(16)의발달 이후, 염색체 접촉체의 매핑은 조절 요소 들 사이의 물리적 거리를 평가하기 위해 집중적으로 사용되어 왔다. 중요한 것은, 3C 기술의 높은 처리량 변이체는 최근에 개발되어 크로마틴 단편17사이의 접촉의 고정, 소화, 결찰 및 회복을 위한 상이한 전략을 제공한다. 그 중에서도, 시투Hi-C는 3C 결찰 제품의 시퀀싱을 허용하는 인기 기술이 되어 게놈 폭18이다. 그러나, 인핸서-프로모터 접촉의 분석에 적합한 분해능에 도달하는 데 필요한 높은 시퀀싱 비용은 특정 로시의 연구에 비실용적이다. 따라서, 고해상도19,,20,,21,,22에서표적 궤위를 분석하기 위한 대체 방법이 개발되었다. 이러한 방법 중 하나인 4C는 모든 전략대 하나로 알려져 있으므로 관측점으로 선택된 사이트에 접촉하는 모든 시퀀스를 검색할 수 있습니다. 그러나 표준 4C 기술의 단점은 다른 크기의 조각을 증폭하는 역 PCR이 요구되어 작은 제품을 선호하고 고처리량 시퀀싱 후 정량화를 편향시키는 것입니다. 최근, UMI-4C는, 고유 분자 식별자(UMI)를 이용한 4C 기술의 새로운 변이체가 이러한 문제를 우회하는 정량적 및 표적 염색체 접촉 프로파일링을 위해 개발되었다23. 이 접근법은 빈번한 커터, 초음파 처리 및 중첩-결찰 매개 PCR 프로토콜을 사용하여 비교적 균일한 길이 분포를 가진 DNA 단편의 증폭을 포함합니다. 이 균질성은 짧은 시퀀스를 위한 PCR 환경 설정의 증폭 과정에서 편향을 감소시키고 공간적으로 연결된 분자/단편을 효율적으로 복구하고 정확하게 계산할 수 있게 합니다.
여기에서 우리는 EB 분화 도중 계보 유익한 전사 인자의 프로모터 와 강화제 사이 염색질 접촉을 확인하고 정량화하기 위하여 UMI-4C 기술을 적응하는 프로토콜을 기술합니다.
Protocol
1. 마우스 배아 줄기 세포에서 배아 체 생성
- mESC 무혈청 배양 배지를 준비하십시오: DMEM/F12 및 신경기저 배지를 1:1의 비율로 혼합하였다. 배양 배지는 MEM 비필수 아미노산 용액 (1x), 피루바트 나트륨 (1 mM), L-글루타민 (2 mM), 페니실린 스트렙토 마이신 (100 U / mL), 베타 메르 카포에탄올 (50 μM), N2 및 B27 보충제 (1x), PD0325901 (1 μM), CHIR99021 (3 μM), 및 백혈병 억제 인자 (LIF) (1,000 U / mL).
- EB 분화 배지 준비: DMEM은 10% 태아 소 혈청(FBS), MEM 비필수 아미노산(1배), 피루바트 나트륨(1mM), L-글루타민(2mM), 페니실린-스트렙토마이신(100 U/mL), 베타 메르카토에탄(50 μm)으로 보충되었습니다.
- mESC 배양 혈청이 없는 배지에 0.1%(w/v) 젤라틴으로 미리 코팅된 10cm 플라스틱 접시에 배양 미CS.
- mESC가 60% 결합에 도달하면 배양 배지를 제거하고 살균 된 PBS 2 mL로 1 x 부드럽게 씻어 냅니다.
- PBS를 완전히 제거하고 2 mL의 세포 분리 매체를 추가합니다. 배양 접시를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 접시에 EB 분화 배지 8 mL를 첨가하여 반응을 비활성화시고 반응합니다.
- 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 15-20 회 위아래로 파이펫팅하여 mESC 콜로니를 해리.
- 실온 (RT)에서 300 x g의 세포를 5 분 동안 원심 분리하고 조심스럽게 상류를 제거하십시오.
- 셀 카운트 (예를 들어, 혈세포계를 사용하여).
- EB 분화 배지로 세포 펠릿을 다시 중단하고 농도를 2 x 104 세포/mL로 조정합니다.
- 15cm 배양 접시의 뚜껑을 반전시키고 200 μL 멀티 채널 파이펫을 사용하여 뚜껑에 20 μL 의 재중단 된 세포 (~ 400 셀 / 드롭)를 증착시하십시오.
- 뚜껑을 바닥 챔버에 조심스럽게 반전시키고 37 °C에서 5 % CO2 및 95 % 습도로 3 일 동안 매달려있는 방울로 접시를 배양하십시오.
- 10 mL의 PBS로 뚜껑을 부드럽게 세척하여 EB를 수집하고 EB 함유 현탁액을 50 mL 플라스틱 튜브로 옮김을 옮김을 옮김.
- 튜브를 RT에 30분 동안 놓아 중력에 의해 BB가 바닥으로 가라앉도록 합니다. 조심스럽게 장식품을 제거하십시오.
- 10 mL의 신선한 EB 분화 매체로 EB를 부드럽게 다시 일시 중단하고 10cm 세균학 페트리 접시로 옮김.
- 반전된 현미경을 사용하여 3-6일 후에 EB 형성을 확인하십시오. 생성된 EB는 둥글고 균일해야 합니다.
- 5%CO2 및 95% 습도로 37°C에서 배양합니다. EB는 3개의 세균 층으로 계속 분화하고 분석을 위한 각종 시간 점에서 집합될 수 있습니다.
2. EB의 해리
- 50mL 플라스틱 튜브에 2 ~ 3 개의 10cm 접시에서 EB를 수집합니다. 5 분 동안 RT에서 300 x g의 EB를 원심 분리한 다음 조심스럽게 상급체를 제거하십시오.
- PBS의 10 mL로 EB를 다시 일시 중단합니다. 3분 동안 RT에서 300 x g의 원심분리기 EB를 제거하고 상급체를 제거합니다.
- 트립신-EDTA 2mL 추가 (0.25%) 펠릿을 37°C에서 15분 동안 튜브를 배양시켰다.
- 트립신 반응을 멈추기 위해 EB 분화 배지의 8 mL를 첨가한다. 현미경의 밑에 EB 해리를 검사하고 세포를 계산하십시오.
3. 고정
- 1 x 106 세포 /mL에서 신선한 EB 배양 배지에서 세포를 다시 중단하십시오. 50 mL 튜브의 경우 배지 45mL에서 최대 4.5 x 107 셀을 사용하십시오.
- 파라포름알데히드를 37%(6개월 이상 이전 제외)에서 최종 농도1%로 추가합니다.
주의: 파라포름알데히드는 유해 화학물질이기 때문에 적절한 건강 및 안전 규정을 준수하십시오. - 회전 하에 RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 0.125 M의 최종 농도에 글리신을 첨가하여 포름알데히드를 담금질한다.
- 회전 중인 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 고정 된 세포를 얼음으로 옮기고 지금부터 4 °C에서 차가운 상태로 유지하십시오.
- 냉장 원심분리기에서 5분 동안 300 x g의 세포를 펠렛합니다.
- 상급체를 버리고 차가운 PBS (5 x 106 셀에 대한 1 mL)에서 펠릿을 다시 일시 중단 한 다음 1.5 mL 안전 잠금 튜브로 옮김하십시오.
- 4 °C에서 5 분 동안 300 x g의 세포를 펠렛하고 상류액을 버리고 펠릿을 액체 질소로 스냅 동결시. -80 °C에서 보관하거나 아래 의정서를 진행하십시오.
4. 세포 라 해 및 제한 효소 다이제스트
- 2-5 x 106 세포 당 0.25 mL의 갓 준비된 얼음 차가운 용해 완충액 (10 mM Tris-HCl pH = 8.0, 10 mMM NaCl, 0.2% Igepal CA630 및 1x 프로테아제 억제제)에서 세포 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다. 5 mL의 라시스 버퍼를 준비하려면 표 1을참조하십시오.
- 얼음에 15 분 동안 세포를 배양.
- 4 °C에서 5 분 동안 1,000 x g의 원심 분리기. 상급체를 버리고 핵을 포함하는 펠릿을 유지하십시오.
- 500 μL의 차가운 라이시 버퍼로 펠릿 핵을 세척합니다.
- 1x 완충2에서 0.5% SDS의 50 μL로 1.5 mL 튜브에 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단한 다음 62°C에서 10분 동안 가열 블록에 튜브를 인큐베이션합니다.
- 가열 블록에서 튜브를 제거하고 SDS를 담금질하기 위해 10 % 트리톤 X-100의 25 μL을 포함하는 170 μL의 소화 버퍼를 추가합니다. 과도한 거품을 피하면서 파이펫팅을 통해 잘 섞어주세요.
- 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 25 μL의 소화 버퍼를 넣고 뒤집어 섞은 다음 소화되지 않은 대조군으로 8 μL을 복용하십시오. 소화되지 않은 대조군 샘플을 -20°C에서 유지합니다. 남은 핵에 100 U MboI 제한 효소(25 U/μL 스톡의 4 μL)를 넣고 37°C에서 2시간 동안 크로마틴을 소성합니다. MboI 의 100 U의 또 다른 알리쿼트를 추가하고 추가로 2 시간 동안 배양하십시오.
- MboI의 또 다른 100 U를 추가하고 37 °C에서 밤새 회전하에 배양합니다.
- 다음날, MboI의 또 다른 100 U를 추가하고 회전하에서 37°C에서 3시간 동안 배양한다.
- 8 μL을 소화된 대조군 샘플로 복용하십시오. 디 크로스링크 소화 대조군 샘플 및 4.8단계에서 소화되지 않은 대조군 샘플을 TE 완충액 80 μL(10 mM Tris pH = 8, 1 mM EDTA) 및 10 μL의 단백질분해제 K(10 mg/mL)를 첨가하였다. 1 시간 동안 65 °C에서 배양하십시오.
- 소화 효율을 확인하기 위해 0.6% 젤에 20 μL aliquots를 실행합니다. 성공적인 소화는 3.0-0.5 kb 범위에서 주로 조각을 보여줍니다.
5. 근접 결찰 및 크로스 링크 반전
- MboI를 65°C에서 65°C에서 인큐베이션하여 20분 동안 가열 블록에서 MboI를 비활성화한 다음 RT로 냉각시.
- RT에서 1,000 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고 상류를 제거하고 펠릿을 신선한 리가제 완충액 200 μL에 용해시다.
- 각 샘플에 결찰 마스터 믹스 1,000 μL을 추가합니다. 결찰 마스터 믹스의 1,000 μL을 준비하려면 표 2를참조하십시오.
- 느린 회전 (9 rpm)으로 RT에서 하룻밤 동안 반전하고 배양하여 혼합하십시오.
- 단백질나제 K 100 μL(10 mg/mL)과 RNase A(10 mg/mL)의 10 μL을 추가하여 RNA 및 단백질 잔류물을 제거합니다. 45-60 분 동안 55 °C에서 샘플을 배양하십시오.
- 추가 4 시간 동안 65 °C에서 샘플을 계속 배양하십시오.
6. DNA 전단 및 크기 선택
- RT에 냉각 튜브.
- 4 °C에서 1,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 샘플을 2 mL 튜브에 3개의 400 μL aliquots로 분할하고 각 튜브에 2 μL의 글리코겐(20 mg/m), 40 μL의 아세테이트 나트륨(3M, pH = 5.2), 및 각 튜브에 100% 에탄올의 2.5배 부피(1 mL)를 추가합니다. 45-60 분 동안 -80 °C에서 반전하고 배양하여 혼합하십시오.
- 4 °C에서 16,000 x g에서 25 분 동안 원심 분리기. 회전 후 얼음에 튜브를 유지하고 조심스럽게 파이펫팅에 의해 상류를 제거합니다.
- 70% 에탄올의 800 μL에서 재중단하여 DNA 펠릿을 세척한다. 16,000 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상급체를 제거하고 70 % 에탄올800 μL로 한 번 더 세척하십시오.
- 펠렛을 1x Tris 완충액(10 mM Tris-HCl, pH=8)의 130 μL에 용해시키고 DNA를 완전히 용해시키기 위해 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 필요한 경우 파이펫팅을 사용하여 침전기를 다시 일시 중단하십시오.
- DNA 수율을 측정; 2.5-5 μg의 염색질은 1 x 106 세포에 대해 예상될 수 있습니다. 0.6% 아가로즈 겔상에 3C 생성물의 ±200 ng를 실행하여 결찰을 확인하였다. 성공적인 결찰은 주로 DNA 단편 > 3 kb를 보여줍니다. 샘플을 -20°C에 보관합니다.
- 1x Tris 버퍼 부피 (튜브 당 1 μg)의 100 μL에서 10 ng /μL로 초음파 처리에 적합한 0.65 mL 튜브로 샘플을 희석하십시오. 라이브러리 준비에 사용되는 표준 양은 3 μg이므로 필요한 경우 3 개의 별도 튜브에서 초음파 처리를 수행합니다.
- DNA를 초음파 처리기에서 다음 매개 변수를 사용하여 150-700 bp (평균 = 400-500 bp)의 크기로 전단하십시오: 사이클: -60s에 20초의 6-8s. 이것은 일루미나 시퀀서를 사용하여 고처리량 시퀀싱 라이브러리 준비에 적합한 DNA를 만들어야 합니다.
- 전형 된 DNA를 정상적인 새로운 안전 잠금 튜브로 옮김. 동일한 샘플에서 여러 초음파 처리풀.
- RT에서 DNA 정제 구슬 한 병을 데우습니다. 이제부터는 낮은 바인딩 팁을 사용하십시오.
- DNA 튜브에 1.8 배의 구슬을 추가하고 부드럽게 다시 일시 중단하십시오.
- RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 마그네틱 랙으로 구슬을 수집합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 유지하면서 갓 제조한 80% 에탄올 1mL로 비드 2x를 세척합니다.
참고: 잔류 방울을 포함한 모든 에탄올을 제거합니다. - RT에서 구슬을 잠시(2-3분) 공기 건조시.
참고: 구슬을 5분 이상 건조시키지 마십시오. 이것은 DNA 수율을 감소시킬 것입니다. - DNA를 용해시키기 위해 1x Tris 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH =8)의 90 μL로 구슬을 다시 일시 중단합니다.
- DNA 수율을 측정하고 1.5% 겔에서 5 μL aliquot를 분석하였다. 사전 소속 수율에 비해 손실이 거의 없어야합니다.
7. 시퀀싱을 위한 도서관 준비
- 라이브러리 준비 키트에서 마스터 믹스 15 μL을 추가합니다. 전단 DNA의 끝을 복구하려면 10 x 말 수리 반응 버퍼 10 μL과 5 μL의 끝 수리 효소 혼합을 결합합니다.
- RT에서 30분 동안 배양합니다.
- DNA 정제 구슬의 1.1 배 볼륨을 추가하고 부드럽게 다시 일시 중단.
- RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 마그네틱 랙으로 구슬을 수집합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 유지하면서 갓 준비한 80% 에탄올 1mL로 구슬을 두 번 씻습니다. 에탄올을 제거합니다.
- RT에서 2-3 분 동안 구슬을 공기 건조. DNA를 용출하기 위해 1x Tris 버퍼 (10 mM Tris-HCl, pH = 8)의 42 μL로 구슬을 다시 중단시다.
- 각 샘플에 8 μL의 dA-tailing 마스터 믹스를 추가합니다. dA-테일링 마스터 믹스를 준비하려면, 10x dA-테일링 반응 완충액 5 μL과 3 μL의 클레나우 단편 엑소마이너스를 결합한다.
- 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- DNA를 탈인하기 위해 2 μL 송아지 알칼리성 인산염(CIP)을 첨가합니다.
- 37°C에서 30분 동안 배양한 다음 50°C에서 60분 동안 배양합니다.
- DNA 정제 구슬의 1.1 배 볼륨을 추가하고 부드럽게 다시 일시 중단.
- RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 마그네틱 랙으로 구슬을 수집합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 유지하면서 갓 제조한 80% 에탄올 1mL로 비드 2x를 세척합니다.
- RT. 1x Tris 완충제(10 mM Tris-HCl, pH =8)의 35 μL로 구슬을 RT에서 간략하게(2-3분) 공기 건조하여 DNA를 용출한다.
- 어댑터 결찰 반응을 수행합니다. 표 3에언급된 대로 감소된 어댑터/리가제 농도를 사용하십시오.
- 20 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 우라실 DNA 글리코실라제와 DNA 글리코실라제 리아제 엔도누클레스 VII(예: USER) 효소의 혼합물 3 μL을 첨가하고, 파이펫팅으로 혼합하고, 37°C에서 15분 동안 배양한다.
- 부피를 물로 100 μL로 늘리고 96 °C에서 5 분 끓인 다음 샘플을 얼음에 보관하십시오.
- DNA 정제 구슬의 1.1 배 볼륨을 추가하고 부드럽게 다시 일시 중단.
- RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 마그네틱 랙으로 구슬을 수집합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 유지하면서 갓 제조한 80% 에탄올 1mL로 비드 2x를 세척합니다.
- RT에서 2-3 분 동안 구슬을 공기 건조. DNA를 용출하기 위해 1x Tris 버퍼 (10 mM Tris-HCl, pH = 8)의 50 μL로 구슬을 다시 중단시다.
8. 4C 크로마틴 상호 작용 라이브러리 증폭 및 정제
- 10 μL의 라이브러리를 사용하여 4C 라이브러리를 증폭하여 첫 번째 PCR을 수행합니다. PCR 설정 및 프로그램은 표 4에서찾을 수 있습니다.
- 중첩된 PCR을 수행합니다. 중첩된 PCR 설정 및 프로그램은 표 5에서찾을 수 있습니다.
- 각 라이브러리에 대한 PCR 제품을 풀화하고 1.1배 DNA 정제 구슬로 정제합니다.
- DNA 수율을 측정하고 1.5% 겔에서 5 μL aliquot를 분석하였다.
- 라이브러리 농도를 조정하고 라이브러리의 순서를 조정합니다. 인덱싱된 경우 시퀀싱 전에 라이브러리를 풀링할 수 있습니다.
Representative Results
매달린 방울에서 ESC 분화의 유도 후 6 일, 우리는 추가 분석에 사용 된 EBs의 균질 한 집단을 얻었다(그림 1). 우리는 UMI-4C 방법23을 적응하여 EBs24에서계보 특정 유전자의 프로모터에서 특정 염색질 상호 작용을 정량화했습니다. 다양한 단계에서 대표적인 품질 관리 겔을 가진 프로토콜의 개략적 개요는 도 2A에나타내고 있다. 제1 품질 관리는 MboI 제한 효소 소화의 효율을 결정하기 위해 수행되었다. 효율적인 소화는 3 kbp 미만의 단편 크기를 나타내보였다(도2B). 참고로, mESC 및 EB 염색질 소화는 어려웠고 때로는 소화되지 않은 염색질이 지속되었습니다. 제2 품질 관리는 결찰 후 대부분의 단편이 현재 > 3 kbp(도2B)였는지확인하기 위해 수행되었다. 이어서, 초음파 처리 후 얻어진 크로마틴 단편을 겔 전기 동공에 의해 분석하였다. 400-500 bp의 프래그먼트 크기가 예상되었다(그림2B).
탈인 및 단일 엔드 어댑터 결찰 후, 관심 대상을 증폭시키기 위해 두 라운드의 PCR을 수행했습니다. 중첩 된 접근 방식은 각 궤적에 대한 두 개의 프라이머 세트를 설계하는 데 사용되었습니다. 이것은 특이성을 향상시키는 것을 도왔습니다. 각 표적은 PCR 조건을 최적화하기 위해 2개의 상이한 프라이머 쌍으로 별도로 증폭되었고(즉, T 궤적에 대한 Pou5f1 궤적 및 프라이머 쌍 C 및 D에 대한 프라이머 쌍 A 및 B)를 각각 400 bp(도2C)에대한 DNA 얼룩을 초래하였다. 대안적으로, 멀티플렉스 PCR은 표적 A 및 C를 동시에 증폭시키기 위해 수행되었고(도2D)정제 후 유사한 단편 크기를 초래하였다(도2D). 4C 라이브러리 준비에 사용되는 프라이머(Pou5f1 및 T의로시)는 표 6에서찾을 수 있습니다.
데이터 분석을 위해, 원시 시퀀싱 판독은 먼저 리펜스 mm10 마우스 게놈에 대해 정렬되었고, 모두 복제되었고, 낮은 품질(&20) 판독이 제거되었다. 각 미끼에 대해, 각 제한 프래그먼트에 대한 정보는 판독 단편의 수를 계산하여 획득하였고, 원시 접촉 프로파일을 얻었다. 다음으로, 관심 영역은 미끼까지 2kbp 및 250 kbp 거리를 가진 모든 제한 단편으로 정의되었다. 각 제한 프래그먼트의 크기는 관심 영역에서 총 원시 접촉 수의 5%의 임계값에 도달할 때까지 프로파일을 매끄럽게 하기 위해 인접한 제한 단편을 순차적으로 집계함으로써 증가하였다. 복제본이 통합되고 조건을 비교하기 위해 제한 조각 수준에 경사와 임의 절편을 모두 포함시켰습니다. 그림 3에나타난 바와 같이 조건당 평균 프로파일과 이들 사이의 접기 변화가 플롯되었습니다. EB 분화 동안, 다능성 유전자 Pou5f1의 인핸서와 프로모터 사이의 접촉은 감소하였고, 메센도더름 계보의 인핸서-프로모터 접촉은 T증가(도3)로,이러한 발달 강화제에 대한 기능적 통찰력을 제공한다. T
그림 1: mESC 및 유래 배아 체의 대표적인 이미지. 0일째 mESC는 역척추 현미경에 의해 관찰된 혈청없는 조건(왼쪽) 및 균질한 6일째 EBs(오른쪽)에서 배양하였다. 배율 막대 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로토콜의 주요 단계의 4C 워크플로우 및 대표 이미지. (A)정량적 4C의 개략적 워크플로우. RS = 제한 사이트; 미국 = 업스트림; DS = 다운스트림; UP = 범용 프라이머; D = RS와 DS 사이의 거리는 이상적으로 5-15 bp.(B)MboI 소화 염색질 (I), 핵 결색 염색질 (II), 및 초음파 처리 된 염색질 (III)의 예. 왼쪽의 숫자는 각 샘플에 대해 DNA 사다리 실행에 의해 결정된 DNA 크기를 나타냅니다. (C)두 개의 로시에서의 PCR 증폭의 예: Pou5f1 (프라이머 A 및 B) 및 T(프라이머 C 및 D). (D)프라이머 A 및 C. ES=배아 줄기 세포를 이용한 Pou5f1 및 T 로시에서 멀티플렉스 PCR 증폭의 예; EB = 배아 몸. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 4C 프로파일의 예입니다. Pou5f1 및 T 유전자 프로모터에 위치한 미끼에 대한 정량적 4C 프로파일은 mESCs 및 6일째 EBS에서 분석하였다. 상단 패널은 두 개의 독립적인 생물학적 복제물에서 생성된 평균 접점의 플롯을 보여 주며; 하단 패널은 6일째 EBs 대 MESCs(두 복제의 평균)의 평균 접촉 접지 변화를 보여줍니다. 연한 파란색 상자는 분화 중에 동적 변화가 있는 강화제의 위치를 나타냅니다. 티안 외24에서적응 그림 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 5mL용 | |
| 1M 트리스-HCl, pH8.0 | 50 μL |
| 5M 나클 | 10 μL |
| 10% 이지팔 CA630 | 100 μL |
| 50x 로슈 완전 프로테아제 억제제 | 100 μL |
| 밀리큐 워터 | 4.74 mL |
표 1: Lysis 버퍼.
| 1000μL용 | |
| 밀리큐 워터 | 869 μL |
| 10X NEB T4 DNA 리가제 버퍼 | 120 μL |
| 20mg/mL 소 세럼 알부민 | 6 μL |
| 2000 U/μL T4 DNA 리가세 | 5 μL |
표 2: 결찰 마스터 혼합 제제.
| 15 μL용 | |
| 5배 빠른 결찰 반응 버퍼 | 10 μL |
| NEBNext 어댑터 | 3 μL |
| 퀵 T4 DNA 리가제 | 2 μL |
표 3: 어댑터 결찰 반응.
| PCR 설정 | |
| 어댑터 결부된 라이브러리 온 데드 | 10 μL |
| PCR 등급 물 | 20.25 μL |
| 10 μM 대상 특정 프라이머 | 3.75 μL |
| 10 μM NEB 지수 프라이머 | 3.75 μL |
| 헤라제 II 5X 버퍼 | 10 μL |
| 10 mm dNTP | 1.25 μL |
| 헤라제 II 폴리머라제 | 1 μL |
| 총 볼륨 | 50 μL |
| PCR 프로그램 | |
| 1단계: 98°C - 2분 | |
| 2단계: 98°C - 20대 | |
| 3단계: 65°C - 30대 | |
| 4단계: 72°C - 45s | |
| 5 단계 : 2 단계로 이동하여 총 15-18 사이클을 만듭니다. | |
| 6단계: 72°C - 3분 | |
| 7단계: 4°C – 홀드 |
표 4: 4C 크로마틴 상호 작용 라이브러리 증폭, 첫 번째 PCR.
| 중첩된 PCR 설정 | |
| 첫 번째 PCR에서 DNA 단편 | 10 μL |
| PCR 등급 물 | 20.25 μL |
| 10 μM 특이프라이머+P5 일루미나 프라이머 | 3.75 μL |
| 10 μM P7 일루미나 프라이머 | 3.75 μL |
| 헤라제 II 5X 버퍼 | 10 μL |
| 10 mm dNTP | 1.25 μL |
| 헤라제 II 폴리머라제 | 1 μL |
| 총 볼륨 | 50 μL |
| 중첩 된 PCR 프로그램 | |
| 1단계: 98°C - 2분 | |
| 2단계: 98°C - 20대 | |
| 3단계: 65°C - 30대 | |
| 4단계: 72°C - 45s | |
| 5 단계 : 2 단계로 이동하여 총 15-18 사이클을 만듭니다. | |
| 6단계: 72°C - 3분 | |
| 7단계: 4°C – 홀드 |
표 5: 4C 크로마틴 상호 작용 라이브러리 증폭, 중첩 된 PCR.
| 이름 | 시퀀스 (5'-3') |
| DS-100-A | 아타그그그카카카가트CTCTACACGACG CTCTTCTCTCtTGCAAGATAACTAGCACCAGGCCAG |
| 미국-10월4일 | CtCTTGCAAAGAACTAAGCACCAGGCC |
| DS-104-B | 아타그그그카카카가트CTCTACACGACG CTCTTGGGGGCGCGCGGCGCT |
| 미국-10월 4-B | ACCAGGGTGTGGTGGGCGCT |
| DS-T-C | 아타그그그카카카가트CTCTACACGACG CTCTTGCTTGGTCCCTGCACATCGCCAAAGC |
| US-T-C | 가타카크그GTCCCTG카차트CGCCAA |
| DS-T-D | 아타그그그카카카가트CTCTACACGACG CTCTTGCTTGGGGGGGCAAGGAGACGGG |
| 미국-T-D | GCTGAGGCTGGGGGCAAGGAGACC |
| UP-4C | 카카가가가가악카카카카카가 |
| 아다프-i1 | 카가가가가가가가가가가가카카가가 가트GT가그가그가가가 CGTGTGCCTTCC가트 |
| 아다프-i2 | 카가가가가가가가아카카타카그그그그가그가가가 CGTGTGCCTTCC가트 |
| 아다프-i3 | 카가가가가가가가가가가락가카가가 CGTGTGCCTTCC가트 |
| 아다프-i4 | 카가가가가가가가가가가가트카그그그가그가그가가가가 CGTGTGCCTTCC가트 |
표 6: 4C 라이브러리 준비에 사용되는 프라이머.
Discussion
교수형 낙하 배양 방법은 추가적인 성장 인자 또는 사이토카인을 필요로 하지 않으며, 소정의 수의 mESCs5로부터의 EB의 균질한 집단을 재현가능하게 생성한다. 여기서 우리는 EB 분화 모델에서 계보 특이적 전사 인자의 인핸서-프로모터 접촉을 정량화하기 위해 UMI-4C 접근법으로부터 적응된 정량적 4C의 프로토콜을 기술한다. 우리는 EB 분화 도중 역동적인 방식으로 Pou5f1및 T 유전자의 프로모터를 접촉하는 염색질 지구를 확인했습니다. Pou5f1은 EB 분화 및 Pou5f1 프로모터와 그 말단 증강기 사이의 접촉 빈도 감소 동안 하향 조절되었다. 반대로, T는 EB 분화 동안 업조절되었고, 우리는 그들의 프로모터와의 접촉 주파수가 감소되는 3가지 인핸서를 확인하였다(그림3). 확인을 위해, 활성 히스톤 마크 H3K27ac의 염색질 면역침전(ChIP) 분석실험은24를수행할 수 있으며, 이러한 히스톤 마크는 인핸서 활성화및 인핸서가 불활성화(11) 동안 이 마크를 잃는 것으로 나타났다.11
표준 4C 기술은 특정 게놈부위(25)의염색질 접촉 프로파일을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 접근법은 PCR 단편 크기의 이질성에 의해 도입된 편견과 PCR 중복을 구별할 수 없기 때문에 광범위한정규화(26,,27,,28) 후에도 정량적으로 해석하기 어렵다. 우리의 정량적 4C 방법은 초음파 처리 및 중첩 결찰 매개 PCR 단계를 사용하여 단일 분자의 정량화를 허용하는 UMI-4C 기술과 크게 동일하여 고전적인 4C 접근법23의한계를 우회합니다. 그러나, 독특한 분자 식별자를 사용하는 UMI-4C와는 달리, 우리의 정량적 4C 프로토콜은 초음파 처리 단계에 의해 생성된 특정 DNA 파손에 근거를 둔 단일 분자의 정량화를 허용합니다. 이 프로토콜은 상용 DNA 라이브러리 준비 키트와 호환되며 고유한 분자 식별자를 가진 프라이머의 필요성을 없애줍니다.
우리의 프로토콜은 고려해야 할 몇 가지 주요 단계를 포함한다. 고전적인 4C 방법28에서와같이, 우리의 프로토콜의 중요한 요소는 3C 분자의 제조 동안 소화 및 결찰의 효율이다. 낮은 소화/결찰 효율성은 관심 있는 단편과의 상호 작용의 복잡성을 크게 감소시켜 분해능을 감소시킬 수 있습니다. 앞서설명한 23,프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 라이브러리 증폭을 위한 프라이머의 설계이다. 제2 PCR 반응 프라이머는 심문된 제한 부위로부터 5-15 nt에 위치해야 한다. 75nt 시퀀싱 읽기에서는 매핑을 위해 캡처 길이의 최소 40nt 를 허용합니다. 제1 PCR 반응에 사용된 프라이머는 중첩 없이 제2 프라이머의 상류로 설계되어야 하며 둘 다 효율적인 DNA 증폭을 보장하기에 충분히 특이적이어야 한다. 멀티플렉싱의 경우 프라이머는 60-65°C의m용융 온도(Tm)를 목표로 독립적으로 설계되어야 합니다. 더욱이, 다른 3C 기술에 관해서는, 정량적 4C 방법의 분해능은 프로토콜25에사용되는 제한 효소에 의해 결정된다. 이 프로토콜은 4 bp 인식 부위인 MboI를 가진 제한 효소를 사용한다. 이 효소를 가진 최대 해결책은 약 500 bp입니다, 그러나 이것은 높게 궤적 의존적이고 거의 달성되지 않습니다. 또 다른 제한은 동일한 제한 조각에 있는 요소 간에 발생하는 상호 작용을 감지할 수 없다는 것입니다. 또한 하나의 제한 사이트의 거리에서 발생하는 상호 작용은 소화되지 않은 배경과 구별할 수 없습니다. 결찰 전에 채우기 단계를 사용하면 이러한 상호 작용의 검출을 허용할 수 있다.
정량적 4C는 표적 로시의 크로마틴 접촉을 심문하는 데 이상적입니다. 그러나, 특정 PCR 증폭 단계는 동시에 조사될 수 있는 궤적의 수를 제한한다. 표적 화된 위치의 수를 증가시키는 방법은 여러 표적을 동시에 증폭시키기 위해 PCR 단계를 멀티플렉싱하는 것이지만, 이는 구현 하기 전에 사용되는 프라이머및 테스트의 호환성을 필요로 한다. 프로모터에서 크로마틴 아키텍처의 글로벌 변화가 요구되는 경우, Hi-C, PC Hi-C, 또는 HiChIP와 같은 게놈 전체 접근법이29,,30,,31보다더 적합할 것이다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 F. 르 딜리, R. Stadhouders 및 그라프 연구소의 회원들에게 조언과 토론에 감사드립니다. G.S.는 마리 스클로도우스카-퀴리 펠로우십(H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), 후안 데 라 시에르바 박사 후 펠로우십(MINECO, FJCI-2014-22946)의 지원을 받았습니다. 이 작품은 7번째 프레임 워크 프로그램 FP7 (ERC 시너지 그랜트 4D-게놈, T.G.에 부여 계약 609989), EMBL 파트너십에 스페인 경제, 산업 및 경쟁력 (MEIC) 아래 유럽 연구위원회에 의해 지원되었다, 센트로 드 엑셀로 오초아 2013-2017 및 CERCA 프로그램 일반.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
| AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
| Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
| BSA | NEB | B9000S | 4C |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
| CIP | NEB | M0212 | 4C |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
| dNTP | NEB | N0447S | 4C |
| ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
| Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
| Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
| Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
| Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
| Knockout DMEM | 10829018 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
| MboI | NEB | R0147M | 4C |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
| NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
| NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
| PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
| RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
| Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |
References
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