Summary
Informamos de la aplicación de la captura cuantitativa de conformación cromosómica seguida de la secuenciación de alto rendimiento en cuerpos embrionarios generados a partir de células madre embrionarias. Esta técnica permite identificar y cuantificar los contactos entre potenciadores putativos y regiones promotoras de un gen dado durante la diferenciación de células madre embrionarias.
Abstract
Durante el desarrollo de los mamíferos, los destinos celulares se determinan mediante el establecimiento de redes reguladoras que definen la especificidad, el momento y los patrones espaciales de la expresión génica. Los cuerpos embrionarios (EB) derivados de células madre pluripotentes han sido un modelo popular para estudiar la diferenciación de las tres capas principales de gérmenes y definir circuitos reguladores durante la especificación del destino celular. Aunque es bien sabido que los potenciadores específicos de los tejidos desempeñan un papel importante en estas redes al interactuar con los promotores, asignarlos a sus genes objetivo relevantes sigue siendo un desafío. Para que esto sea posible, se necesitan enfoques cuantitativos para estudiar los contactos potenciador-promotor y su dinámica durante el desarrollo. Aquí, adaptamos un método 4C para definir potenciadores y sus contactos con promotores cognados en el modelo de diferenciación EB. El método utiliza con frecuencia enzimas de restricción de corte, sonicación y un protocolo de PCR mediado por ligación anidada compatible con kits de preparación de bibliotecas de ADN comerciales. Posteriormente, las bibliotecas 4C son sometidas a secuenciación de alto rendimiento y analizadas bioinformáticamente, permitiendo la detección y cuantificación de todas las secuencias que tienen contactos con un promotor elegido. Los datos de secuenciación resultantes también se pueden utilizar para obtener información sobre la dinámica de los contactos potenciador-promotor durante la diferenciación. La técnica descrita para el modelo de diferenciación EB es fácil de implementar.
Introduction
En ratones, la masa celular interna (MIC) de embriones de 3,5 días de edad contiene células madre pluripotentes embrionarias. El MIC se desarrolla aún más en el epiblasto en el día 4.5, generando ectodermos, células de mesodermo y endodermo, las tres principales capas germinales en el embrión. Aunque las células pluripotentes en el MIC sólo existen transitoriamente in vivo, pueden ser capturadas en cultivo mediante el establecimiento de células madre embrionarias de ratón (mESC)1,2,3. Los mESC permanecen en un estado indiferenciado y proliferan indefinidamente, pero sobre estímulos intrínsecos y extrínsecos también son capaces de salir del estado de pluripotencia y generar células de las tres capas germinales del desarrollo2,,4. Curiosamente, cuando se cultiva en suspensión en pequeñas gotas, los mESC forman agregados tridimensionales (es decir, EBs) que se diferencian en las tres capas germinales5. El ensayo de formación de EB es una herramienta importante para estudiar el proceso de especificación de linaje temprano.
Durante la especificación del linaje, las células de cada capa germinal adquieren un programa específico de expresión génica4. La expresión espaciotemporal precisa de genes está regulada por diversos elementos cis-reguladores, incluyendo promotores de núcleos, potenciadores, silenciadores y aislantes6,,7,,8,,9. Los potenciadores, segmentos de ADN reguladores que normalmente abarcan unos pocos cientos de pares de bases, coordinan la expresión génica específica del tejido8. Los potenciadores se activan o silencian mediante la unión de factores de transcripción y cofactores que regulan la estructura de cromatina local8,10. Las técnicas comúnmente utilizadas para identificar potenciadores putativos son la inmunoprecipitación de cromatina en todo el genoma seguida de la secuenciación (ChIP-seq) y el ensayo para la cromatina accesible a la transposasa utilizando técnicas de secuenciación (ATAC-seq). Así, los potenciadores activos se caracterizan por marcas de histona activas específicas y por el aumento de la accesibilidad local al ADN11,12,13,14. Además, potenciadores del desarrollo se cree que requieren interacción física con su promotor de cognado8,9. De hecho, se ha demostrado que las variantes de potenciadory y eliminaciones que interrumpen los contactos potenciador-promotor pueden conducir a malformaciones del desarrollo15. Por lo tanto, es necesario una técnica novedosa que proporcione información adicional para la identificación de potenciadores funcionales que controlan la expresión génica del desarrollo.
Desde el desarrollo de la técnica16de la captura de conformación cromosómica (3C), el mapeo de contactos cromosómicos se ha utilizado intensamente para evaluar la distancia física entre los elementos reguladores. Es importante destacar que recientemente se han desarrollado variantes de alto rendimiento de técnicas 3C, proporcionando diferentes estrategias para la fijación, digestión, ligadura y recuperación de contactos entre fragmentos de cromatina17. Entre ellos, in situ Hi-C se ha convertido en una técnica popular que permite la secuenciación de productos de ligadura 3C genoma-ancho18. Sin embargo, los altos costos de secuenciación necesarios para alcanzar una resolución adecuada para el análisis de los contactos potenciador-promotor hacen que esta técnica no sea práctica para el estudio de loci específicos. Por lo tanto, se desarrollaron métodos alternativos para analizar loci específicos a mayor resolución19,20,21,22. Uno de estos métodos, a saber, 4C, conocido como una estrategia uno contra todos, permite la detección de todas las secuencias que se comunican con un sitio seleccionado como punto de vista. Sin embargo, una desventaja de la técnica 4C estándar es la PCR inversa requerida, que amplifica fragmentos de diferente tamaño, favoreciendo productos pequeños y cuantificación de sesgo después de la secuenciación de alto rendimiento. Recientemente, UMI-4C, una nueva variante de la técnica 4C utilizando identificadores moleculares únicos (UMI) se ha desarrollado para la elaboración de perfiles de contacto cromosómico cuantitativos y dirigidos que elude este problema23. Este enfoque utiliza cortadores frecuentes, sonicación y un protocolo de PCR mediado por ligaduras anidadas, lo que implica la amplificación de fragmentos de ADN con una distribución de longitud relativamente uniforme. Esta homogeneidad reduce los sesgos en el proceso de amplificación de las preferencias de PCR para secuencias más cortas y permite una recuperación eficiente y un recuento preciso de moléculas/fragmentos conectados espacialmente.
Aquí describimos un protocolo que adapta la técnica UMI-4C para identificar y cuantificar los contactos de cromatina entre promotores y potenciadores de los factores de transcripción instructiva del linaje durante la diferenciación de EB.
Protocol
1. Generación del cuerpo embrionario a partir de células madre embrionarias de ratón
- Preparar el medio de cultivo libre de suero mESC: DMEM/F12 y medio neurobasal mezclado sin una proporción de 1:1. El medio de cultivo se complementa con solución de aminoácidos no esenciales MEM (1x), piruvato sódico (1 mM), L-glutamina (2 mM), penicilina-estreptomicina (100 U/ml), beta-mercaptoetanol (50 m), suplementos de N2 y B27 (1x), PD0325901 (1 m), CHIR99021 (3 m) y factor inhibitorio de la leucemia (LIF) (1.000 U/ml).
- Preparar el medio de diferenciación EB: DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), aminoácidos no esenciales MEM (1x), piruvato sódico (1 mM), L-glutamina (2 mM), penicilina-estreptomicina (100 U/ml), beta-mercaptoetanol (50 mM).
- Cultivo de mESC en platos de plástico de 10 cm recubiertos con 0,1% (p/v) gelatina en medio libre de suero de cultivo mESC.
- Cuando los mESC alcancen una confluencia del 60%, retire el medio de cultivo y lave suavemente 1x con 2 ml de PBS esterilizado.
- Retire el PBS por completo y agregue 2 mL del medio de desprendimiento de celda. Incubar el plato de cultivo a 37oC durante 5 min.
- Inactivar la reacción añadiendo 8 ml de medio de diferenciación EB en el plato.
- Disociar las colonias de mESC pipeteando arriba y abajo 15-20 veces para obtener una suspensión de una sola célula.
- Centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min y retirar cuidadosamente el sobrenadante.
- Contar las células (por ejemplo, usar un hemocaquímetro).
- Resuspenda el pellet celular con un medio de diferenciación EB y ajuste la concentración a 2 x 104 células/ml.
- Invierta la tapa de un plato de cultivo de 15 cm y utilice una pipeta multicanal de 200 l para depositar gotas de 20 l de células resuspendidas (400 células/gota) en la tapa.
- Invierta la tapa cuidadosamente sobre la cámara inferior e incubar el plato con gotas colgantes a 37 oC con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 3 días.
- Recoja los EB lavando suavemente la tapa con 10 ml de PBS y transfiera la suspensión que contiene EB a un tubo de plástico de 50 ml.
- Coloque el tubo en RT durante 30 minutos, de modo que los EB se hundan en el fondo por gravedad. Retire con cuidado el sobrenadante.
- Resuspender los EBs suavemente con 10 ml de medio de diferenciación EB fresco y transferirlos a un plato bacteriológico Petri de 10 cm.
- Compruebe la formación de EB 3-6 días después con un microscopio invertido. Los EB generados deben ser redondos y homogéneos en tamaño.
- Incubar los cultivos a 37oC con un 5% deCO2 y un 95% de humedad. Los EB continuarán diferenciándose en las tres capas germinales y se pueden recolectar en varios puntos de tiempo para su análisis.
2. Disociación de los EB
- Recoger los EBs de dos a tres platos de 10 cm en un tubo de plástico de 50 ml. Centrifugar los EB a 300 x g a RT durante 5 min, luego retire cuidadosamente el sobrenadante.
- Resuspenda los EB con 10 ml de PBS. Centrifugar EBs a 300 x g a RT durante 3 min y retire el sobrenadante.
- Añadir 2 ml de trippsina-EDTA (0,25%) al pellet e incubar el tubo a 37oC durante 15 minutos.
- Añadir 8 ml de medio de diferenciación de EB para detener la reacción de trippsina. Compruebe la disociación de la EB bajo el microscopio y cuente las células.
3. Fijación
- Resuspenda las células en un nuevo medio de cultivo de EB a 1 x 106 células/ml. Para un tubo de 50 ml, utilice un máximo de 4,5 x 107 celdas en 45 ml de medio.
- Añadir paraformaldehyde de un 37% stock (no mayor de 6 meses) a una concentración final del 1%.
ADVERTENCIA: Siga las normas de salud y seguridad apropiadas mientras manipula paraformaldehído porque es un producto químico peligroso. - Incubar durante 10 min en RT bajo rotación.
- Aplacar el formaldehído añadiendo glicina a una concentración final de 0,125 M.
- Incubar durante 5 min en RT bajo rotación.
- Transfiera las células fijas al hielo y mantenga el frío a 4 oC a partir de ahora.
- Reventar las células a 300 x g durante 5 minutos en una centrífuga refrigerada.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en PBS frío (1 ml para 5 x 106 células), luego transfiera a tubos de bloqueo seguro de 1,5 ml.
- Peletlas a 300 x g durante 5 min a 4oC, deseche el sobrenadante y congele a presión los gránulos en nitrógeno líquido. Conservar a -80oC o continuar con el protocolo que se indica a continuación.
4. Lisis celular y digerido enzimático de restricción
- Resuspenda suavemente el pellet celular en 0,25 ml de tampón de lisis helada recién preparada (10 mM Tris-HCl pH a 8,0, 10 mM de NaCl, 0,2% de Igepal CA630 y 1x inhibidores de la proteasa) por 2-5 x 106 células. Para preparar 5 ml de búfer de lisis, véase el Cuadro 1.
- Incubar las células durante 15 minutos sobre hielo.
- Centrífuga a 1.000 x g durante 5 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y contenga el pellet, que contiene los núcleos.
- Lave los núcleos peletizados con 500 ml de tampón de lisis fría.
- Resuspenda suavemente el pellet en un tubo de 1,5 ml con 50 ml de SDS al 0,5% en 1ta tampón 2, luego incuba el tubo en un bloque de calentamiento a 62 oC durante 10 minutos.
- Retire los tubos del bloque de calentamiento y añada 170 ml de tampón de digestión que contenga 25 ml de 10% de tríton X-100 para saciar la SDS. Mezclar bien pipeteando, evitando la formación de espuma excesiva.
- Incubar a 37oC durante 15 min.
- Añadir 25 l de tampón de digestión, mezclar invirtiendo y tomar 8 l como un control no digerido. Mantenga la muestra de control no digerida a -20 oC. Añadir la enzima de restricción de 100 U MboI (4 l de un stock de 25 U/L) a los núcleos restantes y digerir la cromatina durante 2 h a 37 oC bajo rotación. Añadir otra alícuota de 100 U de MboI e incubar por 2 h adicionales.
- Añadir otros 100 U de MboI e incubar bajo rotación durante la noche a 37 oC.
- Al día siguiente, añadir otros 100 U de MboI e incubar durante 3 h a 37 oC bajo rotación.
- Tomar 8 l como muestra de control digerida. Muestras de control digeridas de des-cruce y las muestras de control no digeridas del paso 4.8 mediante la adición de 80 s l de tampón TE (10 mM Tris pH a 8, 1 mM EDTA) y 10 ml de proteinasa K (10 mg/ml). Incubar a 65oC durante 1 h.
- Ejecuta alícuotas de 20 l en un gel del 0,6% para comprobar la eficiencia de la digestión. Las digestiones exitosas muestran principalmente fragmentos en el rango de 3.0-0.5 kb.
5. Ligadura de proximidad y inversión de enlace cruzado
- Incubar las muestras digeridas por MboI a 65 oC en un bloque de calentamiento durante 20 minutos para inactivar MboI, luego enfriar a RT.
- Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 x g en RT, retirar el sobrenadante y disolver el pellet en 200 ml de tampón de ligasa fresca.
- Añadir 1.000 l de la mezcla maestra de ligación a cada muestra. Para preparar 1.000 l de la mezcla maestra de la ligadura, véase la Tabla 2.
- Mezclar invirtiendo e incubar a RT durante la noche con rotación lenta (9 rpm).
- Elimine el ARN y los residuos de proteínas añadiendo 100 ml de proteinasa K (10 mg/ml) y 10 ml de RNase A (10 mg/ml). Incubar muestras a 55oC durante 45-60 min.
- Continúe incubando muestras a 65oC durante 4 h adicionales.
6. Cizallamiento de ADN y selección de tamaño
- Enfríe los tubos a RT.
- Centrífuga durante 5 min a 1.000 x g a 4oC.
- Divida la muestra en tres alícuotas de 400 ml en tubos de 2 ml y agregue 2 ml de glucógeno (20 mg/m), 40 ml de acetato de sodio (3 M, pH a 5,2) y 2,5 x volúmenes (1 ml) de etanol al 100% a cada tubo. Mezclar invirtiendo e incubar a -80oC durante 45-60 min.
- Centrífuga a 16.000 x g a 4oC durante 25 minutos. Mantener los tubos sobre hielo después de girar y retirar cuidadosamente el sobrenadante pipeteando.
- Lavar los gránulos de ADN resuponiendo en 800 s de etanol al 70%. Centrífuga a 16.000 x g a 4oC durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y realice el lavado una vez más con 800 s de etanol al 70%.
- Disolver el pellet en 130 oC de 1x Tampón Tris (10 mM Tris-HCl, pH a 8) e incubar a 37 oC durante 15 minutos para disolver completamente el ADN. Si es necesario, utilice pipeteo para resuspender cualquier precipitado.
- Medir el rendimiento del ADN; Se pueden esperar 2,5-5 g de cromatina para 1 x 106 células. Compruebe la ligadura ejecutando el valor de 200 ng del producto 3C en un gel de agarosa al 0,6%. Las ligaduras exitosas muestran principalmente fragmentos de ADN > 3 kb. Almacene las muestras a -20 oC.
- Diluir una muestra en un tubo de 0,65 ml adecuado para sonicación a 10 ng/L en 100 ml de 1 x volumen tampón Tris (1 g por tubo). La cantidad estándar utilizada para la preparación de la biblioteca es de 3 g, por lo que realizar la sonicación en tres tubos separados si es necesario.
- Cortar el ADN a un tamaño de 150-700 bp (promedio de 400-500 bp) utilizando los siguientes parámetros en el sonicador: Ciclos: 6-8 de 20 s en -60 s apagado. Esto debería hacer que el ADN sea adecuado para la preparación de la biblioteca de secuenciación de alto rendimiento utilizando secuenciadores de Illumina.
- Transfiera el ADN cizallado a un nuevo tubo de bloqueo seguro normal. Agrupa múltiples sonicaciones de la misma muestra.
- Caliente una botella de cuentas de purificación de ADN en RT. A partir de ahora, utilice puntas de encuadernación bajas.
- Añadir 1.8x volúmenes de cuentas al tubo de ADN y resuspender suavemente.
- Incubar a RT durante 5 min.
- Recoge las perlas con un bastidor magnético. Lave las perlas 2x con 1 ml de etanol al 80% recién preparado mientras mantiene los tubos en el bastidor magnético.
NOTA: Retire todo el etanol, incluidas las gotas residuales. - Seque brevemente las perlas (2-3 min) en RT.
NOTA: No seque las perlas durante más de 5 min. Esto disminuirá el rendimiento del ADN. - Resuspenda las perlas con 90 s de búfer Tris 1x (10 mM Tris-HCl, pH n.o 8) para eluir el ADN.
- Mida el rendimiento del ADN y analice una alícuota de 5 l en un gel de 1,5%. Debe haber muy poca pérdida en comparación con el rendimiento de presonicación.
7. Preparación de la biblioteca para la secuenciación
- Añadir 15 l de mezcla maestra desde el kit de preparación de la biblioteca. Para reparar los extremos del ADN cizallado, combine 10 ml de búfer de reacción de reparación de extremo 10x y 5 l de mezcla enzimática de reparación final.
- Incubar a RT durante 30 min.
- Añadir 1.1x volumen de cuentas de purificación de ADN y resuspender suavemente.
- Incubar a RT durante 5 min.
- Recoge las perlas con un bastidor magnético. Lave las perlas dos veces con 1 ml de etanol al 80% recién preparado mientras mantiene los tubos en el bastidor magnético. Retire el etanol.
- Secar al aire las perlas durante 2-3 min en RT. Resuspenda las perlas con 42 s de tampón Tris de 1x (10 mM Tris-HCl, pH n.o 8) para eluir el ADN.
- Añadir 8 l de mezcla maestra de cola dA a cada muestra. Para preparar la mezcla maestra de cola dA, combine 5 l de búfer de reacción de cola dA de 10x dA y 3 l de fragmento de Klenow exo menos.
- Incubar a 37oC durante 30 min.
- Añadir la fosfatasa alcalina intestinal de la pantorrilla (CIP) para defosforilar el ADN.
- Incubar durante 30 min a 37oC, y luego 60 min a 50oC.
- Añadir 1.1x volúmenes de cuentas de purificación de ADN y resuspender suavemente.
- Incubar a RT durante 5 min.
- Recoge las perlas con un bastidor magnético. Lave las perlas 2x con 1 ml de etanol al 80% recién preparado mientras mantiene los tubos en el bastidor magnético.
- Secar brevemente las perlas al aire (2-3 min) en RT. Resuspender perlas con 35 sdem de 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH n.o 8) para eluir el ADN.
- Realice la reacción de ligadura del adaptador. Utilice concentraciones reducidas de adaptador/ligas como se menciona en la Tabla 3.
- Incubar a 20oC durante 15 min.
- Añadir 3 l de la mezcla de coloricosa de ADN uracilo y enzima endonucleasa VII de ADN glucosilasa (p. ej., USUARIO), mezclar mediante pipeteo e incubar a 37 oC durante 15 minutos.
- Aumente el volumen a 100 oL con agua, hierva 5 minutos a 96 oC y, a continuación, mantenga las muestras en hielo.
- Añadir 1.1x volúmenes de cuentas de purificación de ADN y resuspender suavemente.
- Incubar a RT durante 5 min.
- Recoge las perlas con un bastidor magnético. Lave las perlas 2x con 1 ml de etanol al 80% recién preparado mientras mantiene los tubos en el bastidor magnético.
- Secar al aire las perlas durante 2-3 min en RT. Resuspenda las perlas con 50 s de tampón Tris de 1x (10 mM Tris-HCl, pH n.o 8) para eluir el ADN.
8. Amplificación y purificación de la biblioteca de interacción con la cromatina 4C
- Amplifique la biblioteca 4C utilizando 10 s de biblioteca para llevar a cabo la primera PCR. La configuración y el programa de PCR se pueden encontrar en la Tabla 4.
- Realice pcR anidado. La configuración y el programa de PCR anidados se pueden encontrar en la Tabla 5.
- Productos de PCR de piscina para cada biblioteca y purificar con una perla de purificación de ADN 1.1x.
- Mida el rendimiento del ADN y analice una alícuota de 5 l en un gel del 1,5%.
- Ajuste la concentración de la biblioteca y secuenciar la biblioteca. Si se indizan, las bibliotecas se pueden agrupar antes de la secuenciación.
Representative Results
Seis días después de la inducción de la diferenciación ESC en las gotas colgantes, obtuvimos una población homogénea de EB que se utilizaron para análisis posteriores(Figura 1). Adaptamos el método UMI-4C23 para cuantificar la interacción específica de la cromatina en promotores de genes específicos de linaje en EBs24. En la Figura 2Ase muestra una descripción esquemática del protocolo con geles de control de calidad representativos en diferentes pasos. El primer control de calidad se llevó a cabo para determinar la eficiencia de la digestión enzimática de restricción de MboI. La digestión eficiente mostró un tamaño de fragmento de menos de 3 kbp(Figura 2B). Cabe destacar que la digestión de la cromatina de mESC y EB fue difícil y, a veces, persistió la cromatina no digerida residual. El segundo control de calidad se llevó a cabo después de la ligadura para verificar que la mayoría de los fragmentos eran ahora > 3 kbp(Figura 2B). Luego, los fragmentos de cromatina obtenidos después de la sonicación fueron analizados por electroforesis de gel. Se esperaban tamaños de fragmentos de 400-500 bp(Figura 2B).
Después de la defosforilación y la ligadura del adaptador de un solo extremo, se realizaron dos rondas de PCR para amplificar los objetivos de interés. Se utilizó un enfoque anidado para diseñar un conjunto de dos imprimaciones para cada locus. Esto ayudó a mejorar la especificidad. Cada objetivo se amplificaba por separado con dos pares de imprimación diferentes para optimizar las condiciones de PCR (es decir, los pares de imprimación A y B para el locus Pou5f1 y los pares de imprimación C y D para el locus T, respectivamente) y dio lugar a un frotis de ADN alrededor de 400 bp(Figura 2C). Alternativamente, el PCR multiplex se realizó para amplificar los objetivos A y C simultáneamente(Figura 2D)y dio lugar a un tamaño de fragmento similar después de la purificación(Figura 2D). Los imprimaciones utilizadas para la preparación de la biblioteca 4C (loci de Pou5f1 y T) se pueden encontrar en la Tabla 6.
Para el análisis de datos, las lecturas de secuenciación sin procesar se alinearon primero con el genoma del ratón refence mm10, se duplicaron todas y se eliminaron las lecturas de baja calidad (< 20). Para cada cebo, la información de cada fragmento de restricción se obtuvo calculando el número de fragmentos leídos y se obtuvo un perfil de contacto sin procesar. A continuación, la región de interés se definió como todos los fragmentos de restricción con 2 kbps y 250 kbps de distancia al cebo. El tamaño de cada fragmento de restricción se incrementó agregando los fragmentos de restricción adyacentes secuencialmente para suavizar los perfiles hasta que se alcanzó un umbral del 5% del número total de contactos sin procesar en la región de interés. Para garantizar que las réplicas se integraran y se compararan las condiciones, incluimos tanto pendientes como interceptaciones aleatorias en el nivel de fragmento de restricción. El perfil medio por condición y el cambio de pliegue entre ellos se trazaron como se muestra en la Figura 3. Durante la diferenciación del EB, los contactos entre los potenciadores y el promotor del gen de la pluripotencia Pou5f1 disminuyeron, mientras que los contactos potenciador-promotor del factor de transcripción instructiva de linaje mesendoderm T aumentaron(Figura 3),proporcionando información funcional sobre estos potenciadores del desarrollo.
Figura 1: Imágenes representativas de mESC y cuerpos embrionarios derivados. Día 0 mESC cultivado en condiciones libres de suero (izquierda) y día homogéneo 6 EBs (derecha) observado por un microscopio invertido. Barra de escala a 500 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo 4C e imágenes representativas de los pasos principales del protocolo. (A) Flujo de trabajo esquemático del 4C cuantitativo. RS - sitio de restricción; EE.UU. - aguas arriba; DS - aguas abajo; UP - imprimación universal; D - la distancia entre RS y DS debe ser idealmente de 5-15 bp. (B) Ejemplos de cromatina digerida por MboI (I), cromatina ligada en núcleos (II) y cromatina sonónica (III). Los números de la izquierda indican los tamaños de ADN determinados por la escalera de ADN para cada muestra. (C) Ejemplos de amplificación de PCR en los dos loci: Pou5f1 (primers A y B) y T (primer C y D). (D) Ejemplos de amplificación de PCR multiplex en Pou5f1 y T loci utilizando imprimaciones A y C. ES - células madre embrionarias; EB - cuerpos embrionarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de perfiles 4C. Perfiles cuantitativos 4C para cebos ubicados en los promotores de genes Pou5f1 y T ensayos en mESC y el Día 6 EBS. El panel superior muestra las gráficas de contactos promedio generados a partir de dos réplicas biológicas independientes; el panel inferior muestra el cambio promedio de pliegue de contacto del Día 6 de los EB frente a los mESC (promedio de las dos réplicas). Las cajas azules claros indican la ubicación de los potenciadores con cambios dinámicos durante la diferenciación. Figura adaptada de Tian et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Para 5mL | |
| 1M Tris-HCl, pH8.0 | 50 l |
| 5M NaCl | 10 l |
| 10% Igepal CA630 | 100 l |
| 50x Roche inhibidores completos de la proteasa | 100 l |
| MilliQ Water | 4,74 ml |
Tabla 1: Tampón de lysis.
| Para 1000 l | |
| MilliQ Water | 869 l |
| 10X NEB T4 DNA Ligase Buffer | 120 l |
| 20mg/mL Bovine Serum Albumin | 6 L |
| 2000 U/L T4 Ligase de ADN | 5 l |
Tabla 2: Preparación de mezcla smasteración de la ligadura.
| Para 15 sL | |
| 5X Búfer de reacción de ligadura rápida | 10 l |
| Adaptador NEBNext | 3 L |
| Ligasa rápida de ADN T4 | 2 l |
Tabla 3: Reacción de ligadura del adaptador.
| Configuración de PCR | |
| Adaptador ligado biblioteca-en-muertos | 10 l |
| Agua de grado PCR | 20,25 l |
| 10 M Imprimación específica de destino | 3,75 l |
| Imprimación de índice NEB de 10 m | 3,75 l |
| Búfer Herculase II 5X | 10 l |
| DNTPs de 10 Mm | 1.25 l |
| Herculasa II polimerasa | 1 L |
| Volumen total | 50 l |
| Programa PCR | |
| Paso 1: 98oC - 2 min | |
| Paso 2: 98oC - 20s | |
| Paso 3: 65oC - 30s | |
| Paso 4: 72oC - 45s | |
| Paso 5: vaya al paso 2 para hacer un total de 15-18 ciclos | |
| Paso 6: 72oC - 3 min | |
| Paso 7: 4 oC – sostener |
Tabla 4: Amplificación de la biblioteca de interacción de cromatina 4C, primer PCR.
| Configuración de PCR anidada | |
| Fragmento de ADN del primer PCR | 10 l |
| Agua de grado PCR | 20,25 l |
| Imprimación específica de 10 M+Imprimación de iluminación P5 | 3,75 l |
| Imprimación de 10 M P7 Illumina | 3,75 l |
| Búfer Herculase II 5X | 10 l |
| DNTPs de 10 Mm | 1.25 l |
| Herculasa II polimerasa | 1 L |
| Volumen total | 50 l |
| Programa de PCR anidado | |
| Paso 1: 98oC - 2 min | |
| Paso 2: 98oC - 20s | |
| Paso 3: 65oC - 30s | |
| Paso 4: 72oC - 45s | |
| Paso 5: vaya al paso 2 para hacer un total de 15-18 ciclos | |
| Paso 6: 72oC - 3 min | |
| Paso 7: 4 oC – sostener |
Tabla 5: Amplificación de la biblioteca de interacción de cromatina 4C, PCR anidado.
| Nombre | Secuencia (5'-3') |
| DS-Oct4-A | AATGATACGGCGACCACCACCGAGATCTCTTCCCTACACGACGAC CTCTTCCGATCTTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGCAG |
| US-Oct4-A | TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC |
| DS-Oct4-B | AATGATACGGCGACCACCACCGAGATCTCTTCCCTACACGACGAC CTCTTCCGATCTGTGATGGGCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCT |
| US-Oct4-B | ACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCT |
| DS-T-C | AATGATACGGCGACCACCACCGAGATCTCTTCCCTACACGACGAC CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCACCATCTCCACAAAGGAAG |
| US-T-C | GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA |
| DS-T-D | AATGATACGGCGACCACCACCGAGATCTCTTCCCTACACGACGAC CTCTTCCGATCTGGCTTTGGAGAGGTCAAAGCCCGGGGGAGGAG |
| US-T-D | GCTGAGGCTTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC |
| UP-4C | CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGA |
| Adap-i1 | CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTAGTA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i2 | CAAGCAGAAGAAGGGCATACGAGATACATCGGACTGGAGTAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i3 | CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTAGTAGTA CGTGTGCTCTTCCGATC |
| Adap-i4 | CAAGCAGAAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTAGTA CGTGTGCTCTTCCGATC |
Tabla 6: Imprimaciones utilizadas para la preparación de la biblioteca 4C.
Discussion
El método de cultivo de gotas colgantes no necesita factores de crecimiento o citoquinas adicionales y genera reproduciblemente poblaciones homogéneas de EBs a partir de un número predeterminado demESC5. Aquí describimos un protocolo de 4C cuantitativo adaptado del enfoque UMI-4C para cuantificar el contacto potenciador-promotor de factores de transcripción específicos del linaje en el modelo de diferenciación EB. Identificamos regiones de cromatina que contactan a los promotores de los genes Pou5f1 y T de forma dinámica durante la diferenciación de EB. Pou5f1 fue regulado durante la diferenciación de EB y la frecuencia de contacto entre el promotor de Pou5f1 y su potenciador distal disminuyó. Por el contrario, T fue regulado al alza durante la diferenciación de EB e identificamos tres potenciadores para los cuales las frecuencias de contacto con su promotor disminuyen(Figura 3). Para confirmar la identificación, se puede realizar un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la marca de histona activa H3K27ac24,ya que se ha demostrado que esta marca de histona está asociada con la activación del potenciador y los potenciadores pierden esta marca durante su inactivación11.
Una técnica 4C estándar se ha utilizado ampliamente para examinar el perfil de contacto de cromatina de sitios genómicos específicos25. Sin embargo, este enfoque es difícil de interpretar cuantitativamente incluso después de una normalización extensa26,27,28 debido a los sesgos introducidos por la heterogeneidad del tamaño del fragmento de PCR y la imposibilidad de distinguir los duplicados de PCR. Nuestro método cuantitativo 4C es en gran medida idéntico a la técnica UMI-4C que permite la cuantificación de moléculas individuales utilizando sonicación y un paso pcR mediado por liga-ligación anidada para eludir la limitación del enfoque 4C clásico23. Sin embargo, a diferencia del UMI-4C que utiliza identificadores moleculares únicos, nuestro protocolo cuantitativo 4C permite la cuantificación de moléculas individuales basadas en la rotura específica del ADN producida por el paso de sonicación. Hace que nuestro protocolo sea compatible con kits de preparación de bibliotecas de ADN comerciales, obviando la necesidad de imprimadores con identificadores moleculares únicos.
Nuestro protocolo implica varios pasos clave que deben ser considerados. Al igual que en el método 4C clásico28,los factores críticos de nuestro protocolo son la eficiencia de la digestión y la ligadura durante la preparación de las moléculas 3C. Las bajas eficiencias de digestión/ligación pueden disminuir drásticamente la complejidad de la interacción con un fragmento de interés, lo que resulta en una resolución reducida. Como se describió anteriormente23, otro paso crítico del protocolo es el diseño de las imprimaciones para la amplificación de la biblioteca. Los segundos imprimadores de reacción PCR deben estar situados 5-15 nt desde el sitio de restricción interrogado. En una lectura de secuenciación de 75 nt, esto permite por lo menos 40 nt a la izquierda de la longitud de la captura para la asignación. La imprimación utilizada en la primera reacción PCR debe diseñarse aguas arriba de la segunda imprimación sin solapamiento y ambas deben ser lo suficientemente específicas como para garantizar una amplificación eficiente del ADN. Para la multiplexación, las imprimaciones deben diseñarse de forma independiente, apuntando a una temperatura de fusión (Tm) de 60-65 oC. Además, en cuanto a otras técnicas 3C, la resolución del método cuantitativo 4C viene determinada por la enzima de restricción utilizada en el protocolo25. Este protocolo utiliza una enzima de restricción con un sitio de reconocimiento de 4 bp, MboI. La resolución máxima con esta enzima es de alrededor de 500 bp, pero esto es altamente dependiente del locus y rara vez se logra. Otra limitación es que las interacciones que se producen entre los elementos ubicados en el mismo fragmento de restricción no son detectables. Además, las interacciones que se producen a una distancia de un sitio de restricción no se pueden distinguir del fondo no digerido. El uso de un paso de relleno antes de la ligadura podría permitir la detección de estas interacciones.
Quantitative 4C es ideal para interrogar contactos de cromatina de loci dirigidos. Sin embargo, el paso de amplificación de PCR específico limita el número de loci que se pueden investigar simultáneamente. Una manera de aumentar el número de loci dirigidos es multiplexar los pasos de PCR para amplificar simultáneamente varios objetivos, pero esto requiere compatibilidad de los imprimadores utilizados y probar cada par de imprimación antes de la implementación. Si se desean cambios globales de la arquitectura de la cromatina en los promotores, los enfoques de todo el genoma como Hi-C, PC Hi-C o HiChIP serían más apropiados29,30,31.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a F. Le Dily, R. Stadhouders y a los miembros del laboratorio Graf por sus consejos y discusiones. G.S. fue apoyado por una beca Marie Sklodowska-Curie (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T por una beca postdoctoral Juan de la Cierva (MINECO, FJCI-2014-22946). Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación en el marco del7o Programa Marco 77 (ERC Synergy Grant 4D-Genome, acuerdo de subvención 609989 a T.G.), el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (MEIC) de España a la asociación EMBL, el Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 y el Programa Generalitat de Catalunya DE CERCA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
| AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
| Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
| BSA | NEB | B9000S | 4C |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
| CIP | NEB | M0212 | 4C |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
| dNTP | NEB | N0447S | 4C |
| ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
| Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
| Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
| Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
| Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
| Knockout DMEM | 10829018 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
| MboI | NEB | R0147M | 4C |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
| NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
| NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
| PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
| RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
| Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |
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