Summary
Целью этого протокола является анализ деления клеток в нетронутой ткани живой и фиксированной клеточной микроскопией с использованием дрозофилы мейотических сперматозитов. Протокол демонстрирует, как изолировать целые, нетронутые яички от личинок Дрозофилы и ранних куколок, и как обрабатывать и монтировать их для микроскопии.
Abstract
Экспериментальный анализ клеток, делящихся в живых, нетронутых тканей и органов имеет важное значение для нашего понимания того, как деление клеток интегрируется с развитием, ткани гомеостаза, и болезни процессов. Дрозофилы сперматоцитов, проходящих мейоз идеально подходит для этого анализа, потому что (1) целые яички Drosophila, содержащие сперматозиты относительно легко подготовиться к микроскопии, (2) сперматозитов 'большой размер делает их хорошо подходит для изображения высокого разрешения, и (3) мощные дрозофилы генетические инструменты могут быть интегрированы с виво-анализом. Здесь мы представляем легко доступный протокол для подготовки целых яичек из Drosophila третьих личинок и ранних куколк. Мы описываем, как идентифицировать мейотические сперматозиты в подготовленных целых яичках и как их изобразить с помощью замедленной микроскопии. Предусмотрены также протоколы фиксации и иммуноспоминации целых яичек. Использование личиночных яичек имеет ряд преимуществ по сравнению с имеющимися протоколами, которые используют взрослые яички для анализа сперматозоидов. Самое главное, личиночные яички меньше и менее переполнены клетками, чем взрослые яички, и это значительно облегчает высокое разрешение изображения сперматоций. Чтобы продемонстрировать эти преимущества и применение протоколов, мы представляем результаты, показывающие перераспределение эндоплазмического ретикулума по отношению к микротрубочкам шпинделя во время деления клеток в одном сперматоции, изображенном замедленной конфокальной микроскопией. Протоколы могут сочетаться с экспрессией любого количества флуоресцентно маркированных белков или маркеров органелл, а также генных мутаций и других генетических инструментов, что делает этот подход особенно мощным для анализа механизмов деления клеток в физиологическом контексте целых тканей и органов.
Introduction
Разделение клеток часто изучается с помощью клеточных линий, выращенных в культуре1. Хотя мы получили богатство бесценного понимания и понимания фундаментальных механизмов из этих исследований2, клетки, выращенные в культуре не может полностью резюмировать физиологии деления клеток, как это происходит в нетронутой, живой ткани. Например, в нетронутых тканей и органов, клетки должны делиться в нужном месте и в нужное время, так что потомство клетки должным образом расположены в ткани, так что они могут пройти соответствующую дифференциацию или функциональные программы, и так, что пролиферация клеток правильно координируется с ростом тканей или гомеостаза3. Для клеток, выращенных в культуре, с другой стороны, деление клеток, как правило, регулируется факторами роста в культуре среды4, и, таким образом, мы не можем узнать из этих клеток, как in vivo экологических факторов, таких как архитектура тканей или развития сигнализации влияние процесса деления. Важно также отметить, что многие из клеточных линий, используемых для изучения деления клеток, таких как Клетки HeLa и U2OS, были получены из метастатических опухолей5. Таким образом, многие аспекты основной физиологии этих раковых клеток, такие как механизмы регулирования клеточного цикла и хромосомной стабильности, вероятно, были изменены по сравнению со здоровыми клетками. Полное понимание физиологии клеточного деления, таким образом, зависит от нашей способности изучать деленительные клетки в их родной, в виво-среде, которые сохраняют физиологические регуляторные механизмы и архитектуру тканей.
Достижениям в понимании того, как деление клеток действует в нетронутых тканях и органах, препятствуют трудности, присущие анализу in vivo или ex vivo. Во-первых, это может быть трудно или невозможно получить доступ к деления клеток для микроскопического анализа в крупных органах или толстых тканей. Во-вторых, часто трудно предсказать, когда отдельные клетки будут делиться в vivo. В-третьих, физиология тканей может быстро ухудшаться во время культуры ex vivo. В этом протоколе мы описываем легко доступные методы для живого и фиксированного анализа дрозофилы меланогастер сперматозитов, как они проходят meiotic клеточных делений в полностью нетронутыми яичками. Эти клетки идеально подходят для живого, экс-виво-анализа, потому что они легко доступны со стандартными оптическими методами, такими как конфокальная микроскопия, они делятся в предсказуемое время и места, и нетронутыми яичками могут быть сохранены в культуре ex vivo до около 24 ч. Кроме того, дрозофилы сперматозиты большие круглые клетки (примерно 20-30 мкм в диаметре), которые не меняют форму, когда они делятся, что делает их идеальными для высокого разрешения, замедленного изображения клеточных компонентов, таких как шпиндельный аппарат и цитоплазматические органеллы. Хотя эти клетки проходят мейоз в отличие от митоза, многие из основных процессов деления клеток очень похожи между этими двумя механизмами деления клеток6. Эти преимущества, в сочетании с мощными drosophila генетических инструментов, сделали Drosophila сперматоцитов широко используется модель для анализа ex vivo основных процессов деления клеток, включая образование шпинделя и регулирование, цитокинез, и органеллы ремоделирования и секционирования7,,99,10,11.
Сперматоциты являются клетки, которые находятся на мейотической стадии сперматогенеза. В Drosophila, сперматогенез начинается с группой зародышевых стволовых клеток, которые расположены в небольшой области или "хаб" на одном полюсе яичка12,13. Эти клетки делятся на асимметричный митоз, что приводит к одному дифференцированному сперматогоногу. Сперматогония затем проходят четыре синхронных митозы для производства группы из 16 клеток, которые остаются тесно связаны в одной кисты. На этом этапе клетки переходят от митотического к мейотическому клеточному циклу и называются сперматоцитами. Сперматоциты проводят около двух-трех дней в расширенной стадии G2 клеточного цикла, во время которого они резко растут и претерпевают цитологические изменения в подготовке к двум мейотическим делениям и последующем спермиогенезу13,14. Вся группа из 16 сперматозитов в пределах одной кисты затем ввести первый мейотического деления в то же время. Таким образом, несколько мейотических сперматозитов могут быть изображены одновременно, как они проходят через деление клеток. Первое meiotic разделение продолжает сярвые для приблизительно 1.5 h и последовано за почти немедленно вторым meiotic разделением, принося 64 полные сперматидов которые идут дальше продифференцировать в возмужалые spermatozoa.
Уникальное преимущество использования сперматозитов для изучения деления клеток в живой, нетронутой ткани является то, что группы или кисты клеток постоянно прогрессируют через различные стадии сперматогенеза, и клетки на всех стадиях сперматогенеза обычно могут быть определены в любой данный яичка (см. Рисунок 3A). Таким образом, это относительно легко найти мейотических клеток в целых яичках. Как правило, мы фокусируем наш анализ на первом, а не на втором мейозе, потому что эти клетки гораздо больше и более поддаются изображению с высоким разрешением, но весь процесс, охватывающий оба мейотических деления, может быть успешно отображен. Следует также отметить, что общий протокол для подготовки тести и культуры могут быть использованы для анализа других процессов сперматогенеза, а также, таких, как ранее митотических стволовых клеток или сперматогонических подразделений или цитологические изменения, которые происходят, как сперматозоиды созревают в сперматозоид15. Многие из этих аспектов сперматогенеза очень сохраняются между Дрозофилой и людьми16.
Дрозофилы сперматоцитов начинают достигать мейотической фазы сперматогенеза во время третьей стадии личинок в звезде развития Drosophila 13. Таким образом, яички, изолированные от стадий жизненного цикла, начиная с третьей личинок в звезде и в том числе куски и взрослые могут быть использованы для анализа деления сперматоций. Несколько отличных протоколов доступны для извлечения яичек из взрослых самцов мух для живого и фиксированного анализа сперматогенеза17,,18,,19. Эти протоколы могут быть предпочтительнее для изучения поздних стадиях сперматогенеза или, если генетические маркеры, которые видны только у взрослых должны быть использованы. Протокол фокусируется вместо этого на подготовке тести из личинок и ранних куколок, потому что яички на этих стадиях имеют несколько преимуществ, которые имеют непосредственное отношение к анализу деления клеток с высоким разрешением, замедленной микроскопией. Во-первых, яички от личинок и куски меньше, чем у взрослых, и клетки в органе менее переполнены. Из-за этого, деление сперматоцитов часто можно изображением вблизи внешней поверхности личиночных яичек, без необходимости проникать через несколько слоев светосеющих тканей. Во-вторых, взрослые яички двигаются ритмично из-за сокращений прикрепленных органов аксессуаров, и эти движения делают замедленное изображение отдельных клеток сложной задачей. И в-третьих, личинок яички являются выгодными при изучении генных мутаций, которые вызывают pupal или взрослых летальности. Наши методы оптимизированы для долгосрочной культуры яичек на стадии микроскопа, что позволяет для визуализации нескольких раундов деления клеток или прогрессирования отдельных клеток через несколько стадий сперматогенеза в том же препарате. Мы также описываем протокол фиксации и иммуностоинга целых яичек. В целом, наши протоколы особенно полезны для тех, кто заинтересован в изучении деления клеток в нетронутой ткани, и способность сочетать анализ сперматозитов с высокоуступчивыми генетическими инструментами Drosophila делает это особенно мощным подходом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка животных, инструментов и средств массовой информации для вскрытия
- Крест мужчины и женщины мух, чтобы получить потомство желаемого генотипа. Полезные трансгенные маркеры для идентификации и постановки мейотических сперматозитов включают GFP-тубулин для обозначения мейотического шпинделя и RFP-histone 2A для обозначения хромом8. Используйте от пяти до десяти самок на крест и поддерживать кресты на стандартной мухи пищи во флаконах в инкубаторе 25 градусов по Цельсию до тех пор, пока третий instar личинки начинают ползать по бокам флакона (4-5 дней). Ранние белые куски начнут формироваться на день позже.
- Получить две пары прямых щипцы с прекрасными советами. Убедитесь, что кончики острые, даже в длину, и прямой(рисунок 1A). Используйте эти щипточки только для вскрытия, и крышка с 10 юл пипетки советы, когда не используется.
-
Подготовьте инструмент скальпеля.
- Вставьте тупой конец черного анодированного стального штифта насекомых в штырь держатель, и скрутить винт держателя, чтобы обеспечить штифт на месте. Используя пару щипц и под рассекающим микроскопом, схватите булавку насекомого посередине и согните его, чтобы сформировать внутренний угол 135 "(рисунок 1B). Острый конец предназначен для резки ткани, в то время как край используется для передачи яичек между каплями носителя.
- Крышка с наконечником пипетки 1000 л, когда они не используются.
- Работая в капюшоне культуры ткани, подготовить 5 мл aliquots средств массовой информации Шнайдера и хранить на 4 кВ до времени использования. Когда готовы начать вскрытия, тепло й 5 мл медиа aliquot до комнатной температуры. Затем перенесите разогретую среду для вскрытия в шприц 10 мл и прикрепите фильтр шприца 0,22 мкм.
2. Рассечение яичек из ларьков и ранних купаний
- Используйте шприц для заполнения фильтра, чтобы исключить три капли носителя (по 50 л каждый) в верхней, средней и нижней части стеклянной горки.
- Используйте рассекающий зонд для передачи от пяти до десяти третьих личинок в звезде или ранних кусков (кукула, которые все еще белые или желтые) на верхнюю каплю. Аккуратно агитировать личинок и кусков в средствах массовой информации с вскрытия зонда для удаления любой пищи или мусора.
- Под рассекающим микроскопом, поверните одну личинку или куколку на своей стороне с рассекающим зондом для того чтобы определить 2 двусторонних яички если присытствыю, то которые появляются как овальные сформированные полупрозрачные структуры в задней трети тела (Рисунок 2A, B). Звери, которым не хватает яичек, являются женскими и должны быть отброшены.
- Когда самец личинки или кулачица найден и чист, переместить его на вторую каплю носителей. Повторяйте до тех пор, пока 3 или 4 мужских личинок и/или куски не будут переведены на вторую каплю носителей.
- Работая во второй капли носителей, хватать одну самецскую личинку или кукуницу с парой щипцов в его середине области, просто передние яички. Используйте вторую пару щипков, чтобы аккуратно разорвать животное пополам.
- Держите задний конец личинки или куколки вниз на стеклянной горке с парой щипц. Начиная только рядом с щипцы, нажмите вниз на кутикулу с помощью края скальпеля инструмент и переместить скальпель к разрезу конца животного. Это позволит изгнать внутренние органы животного, которые включают в себя кишки, жировые тела и яички.
- Аккуратно дразнить друг от друга яички из остальных органов. Яички ясны, овальной формы органов, встроенных в ленты жира тела(рисунок 2C).
- Переносите яички по одному на третью каплю носителей. Для этого вставьте край скальпеля под жировое тело, поднимите ткань из носителя и быстро переместите ее на третью каплю.
- Кроме того, если не хватает жира тела по-прежнему прилагается к яичкам, чтобы успешно поднять ткани, осторожно передать ткани с помощью стекла Пастер pipette, который был предварительно увлажненный с вскрытием средств массовой информации.
- Используйте острый конец скальпеля инструмент мягко отрезать избыток жира тела от яичек, оставляя только небольшой край жира тела по краям(Рисунок 2C). Это не обязательно, чтобы удалить все жировое тело, и попытка сделать это, скорее всего, приведет к повреждению или разрыв яичек.
- Повторите выше шаги для всех мужских личинок на стеклянной горке.
- Приступить к шагу 3 или шаг 5.
3. Монтаж яичек для live микроскопических изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура монтажа была адаптирована из недавно опубликованного протокола для визуализации drosophila личиночного мозга нейроблассов20. Дополнительные сведения можно найти в этой ссылке.
- Используйте фильтр шприц, чтобы депонировать одну каплю носителей Шнайдера (около 30 л) на центр 50-мм газопроницаемого блюда культуры.
- Используйте предварительно увлажненный пастерный пипетку, чтобы перенести подготовленные яички в каплю на газопроницаемом блюде. Яички, как правило, плавают на поверхность капли.
- Используйте инструмент скальпеля, чтобы аккуратно нажать яички вниз на газпроницаемой мембраны. Позаботьтесь о разрыве газопроницаемой мембраны острой точкой скальпеля. Нажмите все яички в центр капли.
- Используйте 1 мл шприца, наполненного галоуглеродным маслом, чтобы сделать четыре капли масла, около 30 л каждая, на газпроницаемой мембране. Пространство капли масла вокруг капли средств массовой информации, содержащей яички, чтобы соответствовать четырем углам 22 мм стекла крышкой.
- Выровняй углы 22-мм стеклянного покрывала с четырьмя каплями галоуглеродного масла и аккуратно опустите крышку на носители и масло. Разрешить coverslip урегулировать и для средств, содержащих яички распространяться между каплями масла.
- Удалите избыток носителя, чтобы крышка оседална на поверхности яичек. При наблюдении яичек под рассекающим микроскопом, вставьте угол деликатной задачи протрите в средствах массовой информации под крышкой, чтобы фитиль от небольшого количества жидкости. Wick прочь достаточно средств массовой информации, пока стекло coverslip просто вступает в контакт с поверхностью крупнейших яичек. Очень важно не удалить слишком много носителей и снизить coverslip слишком далеко, так как это будет оказывать давление на яички и привести их к разрыву (см. Рисунок 5).
4. Live Изображения меиотических сперматоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Сперматоциты могут быть изображены с помощью лазерного сканирования или спиннинг диска конфокальный микроскоп. Система должна иметь достаточную скорость и чувствительность, чтобы избежать фотоотбеления флуоресцентных белков или фотоповреждения тканей.
- Поместите каплю масла погружения на стеклянный покрывало чуть выше яичек. Переверните блюдо и поместите его на стадии микроскопа и переместить микроскоп цели (40x или 60x) в масло, пока он не чуть ниже яичек. Используйте передаваемый свет, чтобы найти один яичко и привести его в фокус.
- Во время захвата быстрых изображений с конфокал, переместить яички вокруг, чтобы изучить организацию клеток. Один конец яичка будет иметь много маленьких, плотно упакованных ячеек. Этот конец содержит зародышевые стволовые клетки и сперматого. Двигаясь к другому концу органа, выявляя все более крупные клетки, организованные в дискретные кластеры или кисты. Эти крупные клетки являются сперматоцитами(Рисунок 3A).
- При визуализации GFP-тубулин, определить сперматоцитов, которые начнутся мейоз в течение 30-60 минут при наличии двух ярких микротрубочных астр (т.е. центросомы), расположенных в коре головного мозга клетки(Рисунок 3B, C).
- После того, как киста мейотических сперматозитов была определена, создать параметры приобретения для захвата z-стеки изображений с течением времени. Как правило, приобретение 15-20 изображений, расположенных на 1,5 мкм друг от друга в z-измерении, достаточно, чтобы захватить полный объем нескольких сперматозитов в пределах одной кисты.
- Приобретайте полный z-стеки каждые 2 мин, если изображение всего первого мейотического деления, которое занимает около 1,5 часов. Можно использовать более быстрые темпы приобретения, особенно если только конкретное событие мейоза, чтобы быть проанализированы. Тем не менее, позаботьтесь, чтобы не вызвать фотоотбеление или фотоповреждения из-за повторного воздействия образца на лазерное возбуждение.
- Используйте непрерывную автоматическую систему управления фокусировкой, чтобы предотвратить фокусный дрейф в течение длительного времени приобретения. Контроль температуры образца на стадии микроскопа, как правило, не является необходимым, предполагая, комнатная температура примерно 22-23 градусов по Цельсию. Если контроль температуры доступен, поддерживайте образец при температуре на стадии микроскопа на уровне 25 градусов по Цельсию.
- Если мейотические сперматозиты не найдены, храните образец в течение нескольких часов или на ночь в инкубаторе 25 градусов по Цельсию и изображение снова.
5. Фиксация и иммуностоидинг
- От шага 2.10 выше, используйте стеклянный пипетка Pasteur для переноса яичек в скважину в 9-словесной стеклянной рассекающей тарелке, содержащей 0,5 мл 8% параформальдегида PBSTx (фосфат буферный сосуд с 0,3% Triton X-100). Убедитесь, что яички лежат на дне тарелки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид является токсичным и должны быть обработаны с перчатками в дым капот. - Исправьте яички в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Перенесите яички в колодец, содержащий 0,5 мл PBSTx. Вымойте в течение 5 минут с нежным возбуждением. Повторите шаг мытья в новых скважинах со свежим PBSTx еще два раза.
- Разбавить первичные антитела до желаемой концентрации в 0,5 мл PBSTx, содержащий 5% бычьего сывороточная альбумин (BSA) в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки. Перенесите яички из 9-колодца, рассекающего блюдо, в трубку разбавленных первичных антител и инкубация на ночь при 4 градусах Цельсия с нежным раскачиванием или орехами.
- Вымойте яички в 0,5 мл PBSTx в течение 5 минут в колодце 9-колодец рассекающей блюдо. Повторите шаг мытья со свежим PBSTx еще два раза.
- Разбавить вторичные антитела в 250 Л PBSTx, содержащих 5% BSA и обойтись в чистый колодец 9-колодец рассекающей блюдо. При желании добавьте DAPI, чтобы запятнать ДНК. Перенесите яички в колодец, содержащее вторичные антитела, накройте полиэтиленовой пленкой и инкубируют в темноте нежным возбуждением в течение 4 часов при комнатной температуре.
- Перенесите яички в чистый колодец, заполненный 0,5 мл PBSTx. Промойте свежим PBSTx дважды в течение 5 мин и в третий раз за 30 мин.
6. Монтаж фиксированных яичек
- Перенесите яички из последней стирки на слайд стеклянной микроскопии с помощью пипетки Pasteur. При необходимости используйте край скальпеля, чтобы подтолкнуть яички вниз на поверхность слайда.
- Используйте угол деликатной задачи протрите фитиль от лишнего жидкости из яичек. Удалите как можно больше жидкости.
- Нанесите на яички 30-50 л микроскопии.
- Поместите 22 мм coverslip на падение монтажа среды и позволяют coverslip урегулировать и монтаж среды распространяться под крышкой. При необходимости нанесите мягкое давление на крышку, чтобы выжать излишки монтажной среды и дать крышке отдохнуть на поверхности яичек.
- Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края крышки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда этот протокол будет успешно выполнен, яички останутся полностью нетронутыми для визуализации с помощью конфокальной микроскопии или других методов флуоресценции микроскопии. Как видно на рисунке 3A, клеточная организация яичек сохраняется, и прогрессирование клеточной дифференциации от одного конца яичка к другому, включая сперматогонию, сперматозиты и гаплоидные сперматиды видны. GFP-тубулин является полезным маркером для выявления деления сперматозитов и для живой визуализации прогрессирования клеток через мейоз. Как показано на рисунке 3B, сперматоцитов о начале мейозможет может быть определена их два видных микротрубочного астра. По метафазе большие мейотические шпиндели красиво помечены GFP-тубулин(рисунок 3C).
Drosophila сперматоцитов 'большой размер и их относительно медленное прогрессирование через мейоз делают их идеальными для анализа динамики и реорганизации клеточных компонентов, таких как цитоплазматические органеллы во время деления клеток8,11,21. На рисунке 4 и видео 1 показан живой анализ изображений динамической реорганизации эндоплазмического ретикулума (ER) в отношении микротрубок в течение мейоза. Как описано выше, во время позднего межфаза незадолго до начала мейоза, две центросомы, расположенные в коре головного мозга клетки, хорошо видны по флуоресценции GFP-тубулина. На данном этапе, ER-таргетированных RFP (RFP-KDEL) флуоресценция показывает, что ER равномерно распределены по всей цитоплазмы. Центросомы затем начинают мигрировать на противоположные стороны ядерного конверта, чтобы установить два шпинделя полюсов. В течение этого времени, ER быстро накапливается вокруг центросомальных микротрубок и постепенно очищается от остальной части цитоплазмы. Разбивка ядерного конверта (НЭБ) проявляется в появлении фторесценции GFP-тубулина в ядерном регионе. Следует отметить, что дрософила клетки делятся полуоткрытым митозом или мейозом, что означает, что ядерные компоненты конверта распадаются и рассеиваются и большие цитоплазменные молекулы попадают в ядерную область, но оболочка ER-производных мембран окружает шпиндель и хроматиды по всему клеточному делению22,23,24. К тому времени, НЭБ и прогрессирует через метафазы, ER почти полностью связана с астральными микротрубоками, которые окружают две центросомы шпинделя. Эти два астрального микротрубока накопления ER затем раздел атьев к двум дочерним клеткам во время анафазы, обеспечивая надлежащее наследование ER вновь образованными клетками8,11.
На рисунке 5 показаны последствия разрыва яичка на живое изображение сперматоцитов. Как описано в протоколе, необходимо проявлять большую осторожность, чтобы не опустить крышку слишком далеко на поверхность яичек во время монтажных ступеней, так как это будет оказывать давление на яички и заставить их лопнуть. Как видно на рисунке 5 и видео 2, кисты сперматозитов быстро вытекают из разорванного яичка, и это движение клеток делает живой, замедленной визуализации чрезвычайно трудно.
Рисунок 1: Инструменты, необходимые для успешного вскрытия. (A) Forceps, используемых для вскрытия должны быть прямыми и имеют острые, непрерывные советы (указано зеленым знаком проверки). Не используйте щипцвы с изогнутыми или сломанными кончиками (красные x знаки), так как они будут неэффективны при захвате личинок и дразнить друг от друга тканей. (B) Для подготовки скальпеля инструмент, согните черный анодированный стальной штифт насекомых на внутренний угол около 135 ". Острая точка используется в качестве ножа, чтобы прорезать ткани, и прямой край используется для движущихся тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Идентификация личинок и яичек для яичек. (A) Изображения мужских и женских личинок. Яички идентифицируются у самца как круговые или овальные полупрозрачные структуры в задней трети животного (стрелка). Обратите внимание на отсутствие аналогичной структуры у женщины. (B) Изображение раннего самца куколки, с двумя полупрозрачными яичками, указанными наконечниками стрел. (C) Яички с прикрепленными жировыми телами после вскрытия. Два яичка слева имеют чрезмерное жира органов по-прежнему прилагается, которые должны быть обрезаны прочь. Два яичка справа были правильно обрезаны их жировые тела и готовы к визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Идентификация мейотических сперматозитов в успешно подготовленном яичках. (A) Confocal изображение успешно подготовлены жить, нетронутыми яичка, выражающие GFP-тубулин. Концентратор стволовых клеток расположен к нижней оконечности яичка, хотя это не идентифицируется в этом препарате. Несколько слоев малых сперматогонии указаны, и они следуют многочисленные кисты сперматозитов. Киста сперматоцитов в первом мейотаческом делении идентифицируется на основе большого размера клеток (примерно 20 - 30 мкм в диаметре) и наличия GFP-тубулина помечены meiotic шпиндель. Сперматоциты во втором мейотаческом делении также имеют шпиндель, но эти клетки примерно в два раза меньше клеток мейоза I. Пост-мейотические сперматозоиды также видны, как и удлинение сперматозоидов. (B) Сперматоциты, которые начнут мейоз в течение 30 - 60 мин могут быть определены их два больших, очень ярких микротрубчатых астр (указано стрелками головы) помечены GFP-тубулин. Киста домейотических клеток очерчена пунктирной желтой линией. (C) Клетки в мейозе идентифицируются по их большим мейотическим шпинделям, которые легко визуализируются с помощью GFP-тубулина. Киста мейотических клеток очерчена пунктирной желтой линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Замедленное изображение мейоза в одном сперматоците. Один сперматоцит совместно выражающий GFP-тубулин и RFP, ориентированные на ER (RFP-KDEL) был изображен каждые две минуты в ходе мейоза. Показаны репрезентативные изображения сперматоцитов на определенных стадиях мейоза, начиная с позднего межфаза и прогрессируя через телофазу. Времена в минутах. Каждое изображение представляет собой одну оптическую плоскость из стека из пятнадцати оптических ломтиков, приобретенных в каждый момент времени. Эта цифра была изменена с Карабашевой и Смит, 20198. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Репрезентативные изображения яичка до и после разрыва. Изображение слева, помеченное "Intact", показывает GFP-тубулин, выражающий яички непосредственно перед разрывом. Изображение справа показывает те же яички после разрыва. Кисты сперматоцитов можно увидеть потоковое из разорванного яичка. Наконечники стрел указывают на кисту мейотических сперматозитов; обратите внимание на значительное движение этих сперматоцитов после разрыва яичка, что делает визуализацию этих сперматоцитов с течением времени чрезвычайно сложной задачей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Полное мейотическое деление одного сперматоцита. Показан полный промежуток времени GFP-тубулин и RFP-KDEL, выражающие сперматоциты на рисунке 4. Изображения были сняты каждые две минуты, а скорость воспроизведения составляет три кадра в секунду. Это видео было изменено из Карабашева и Смит, 20198. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Видео 2: Разорванные яички. Промежуток времени яичка до и после разрыва. Разрыв очевиден из-за внезапной потоковой кисты клеток через левый нижний угол яичка. Изображения были сняты каждые две минуты, а скорость воспроизведения составляет три кадра в секунду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали протокол для подготовки личинок или ранних яичек pupal Drosophila, оптимизированный для долгосрочной, живой визуализации деления клеток сперматоцитов. Это мощный метод анализа деления клеток в физиологическом контексте нетронутой ткани. Сила этого метода еще больше расширяется в сочетании с генетическими инструментами Drosophila, такими как специфические генные мутации, тканево-специфическое подавление РНК и флуоресцентно помеченные маркеры белка и органеллы. Кроме того, небольшой размер личиночных и pupal яичек, а также способность к изображению деления клеток очень близко к стеклянной крышкой, сделать метод идеально подходит для изображения с высоким разрешением, включая супер-разрешение подходов. Универсальность этой экспериментальной системы демонстрируется репрезентативными результатами, описывающими динамическую реорганизацию ER во время деления клеток. Дрозофилы сперматоцитов особенно полезны для такого анализа динамики органелл ы во время деления клеток из-за большого размера этих клеток и относительно медленного транзита через мейоз. Кроме того, те же клетки могут быть изображены пост-мейотически, чтобы понять, как изменения в динамике органеллы или механизмы деления клеток влияют на последующие события сперматогенеза. Таким образом, существует большой потенциал с этим экспериментальным подходом, чтобы понять физиологию деления клеток в более широком контексте развития тканей и дифференциации клеток, результаты, которые недостижимы при изучении клеток, выращенных в культуре.
Протокол включает в себя несколько элементов, которые облегчают долгосрочную культуру ex vivo яичек на срок до 24 часов. Во-первых, средства массовой информации Шнайдера, который был разработан для поддержания клеток культуры ткани Дрозофилы, содержит легкодоступные источники энергии и оптимизирован для поддержания физиологического рН в атмосферном воздухе. Во-вторых, газопроницаемая мембрана, используемая для монтажа яичек, обеспечивает быстрый обмен газа. Важным преимуществом долгосрочной культуры является то, что если клетки на нужной стадии развития или мейоз не обнаруживаются сразу после подготовки образца, образец может быть сохранен и изображен снова на более позднее время. Мы проверили, что тесты, поддерживаемые в инкубаторе 25 градусов по Цельсию в течение ночи, в общей сложности 16-24 часов, являются жизнеспособными и кажутся здоровыми на основе рутинного присутствия клеток, активно претерпевающих мейоз и продвигающихся через более поздние стадии дифференциации спермы. Тем не менее, меры предосторожности должны быть приняты при культивирования яичек в течение более 2-3 часов, чтобы гарантировать, что физиология тканей не влияет. Самое главное, яички продолжают расти в культуре, как клетки размножаться и созревания спермы удлинить. Это может привести к увеличению яичек до такой степени, что они лопнут из-за ограничительного пространства между мембраной и coverslip, что делает яички непригодными для живого изображения по причинам, описанным ниже. Кроме того, если долгосрочные культуры должны регулярно использоваться в экспериментах, желательно проверить, являются ли лабораторные расширенные условия культуры привести к мейотических аномалий, таких как длительные мейотические продолжительности или увеличение частот отстающих хромосом или цитокинез неудачи.
Для того, чтобы изображение отдельных клеток в течение длительного времени курсы, важно, чтобы клетки не двигаться значительно, как только подготовленные яички находятся на стадии микроскопа. Таким образом, при выполнения протокола важно, чтобы яички оставались нетронутыми и неповрежденными, потому что клетки выплескиваются из поврежденных яичек, и все клетки в органе движутся в результате (см. Рисунок 5 и Видео 2). Это все еще может быть возможным для изображения сперматозитов в поврежденных яичках, если клетки в конечном итоге оседают и остановить движение, хотя к тому времени это происходит этапы мейоза, что один намерен проанализировать, возможно, уже произошло. Кроме того, нельзя сбрасывать со счетов влияние повреждения тканей на сам процесс деления клеток. Повреждение яичек может произойти при очистке от жировых тел после удаления яичек из личинок. Поэтому необходимо проявлять большую осторожность, чтобы избежать пирсинга или дергания органов во время этого шага протокола. В самом деле, это часто не нужно, чтобы удалить очень много жиров, до тех пор, пока они не скрывают визуализации яичка. Чаще всего, повреждение яичек является результатом удаления слишком много культуры среды после размещения coverslip во время монтажа процедуры для живой визуализации (шаг 3.6). По мере удаления среды, крышка падает ниже и оказывает давление на яички, и избыточное давление приведет к разрыву яичек. Таким образом, в то время как важно, чтобы coverslip был как можно ближе к яичкам для облегчения оптимальной визуализации сперматоцитов, некоторая практика необходима, чтобы избежать удаления слишком много среднего и снижения coverslip слишком далеко. Полезно также отметить, что для некоторых применений, таких как острое воздействие сперматозитов на наркотики или другие мелкие молекулы, это может быть выгодно, чтобы нарушить яички и разогнать кисты сперматозитов для анализа. Несколько отличных протоколов доступны для подготовки и культуры рассеянных сперматоцитов кисты18,25.
Важным соображением при использовании сперматозитов для анализа деления клеток является то, что эти клетки выполняют мейотические, в отличие от митотических делений. Важно отметить, что многие из основных аспектов механики деления клеток, таких как архитектура шпинделя и цитокинез, похожи между мужским мейозом и митозом6. Таким образом, механистические идеи, полученные в результате изучения сперматоцитоцитов мейоза, могут быть широко применимы к общим механизмам деления клеток животных7. Однако, в зависимости от механистических вопросов, которые рассматриваются, важные различия между сперматозитотами и митотическими клетками в таких процессах, как хромосомальная динамика и регулирование клеточного цикла, возможно, потребуется рассмотреть26. В то же время, дрозофилы сперматозитов представить уникальную возможность сравнить митотические и мейотические клетки в рамках той же ткани и зародышевой линии. Например, тот же препарат яичка может быть использован для анализа зародышевых стволовых клеток или сперматогония, проходящих митоз и сперматоциты, проходящие мейоз. Мы, как правило, не пытаются изображение зародышевой стволовых клеток или сперматогонных митозах в живых препаратов testis, потому что сроки этих подразделений трудно предсказать. Тем не менее, мы случайно захватили эти разделения в наших экспериментах, демонстрируя, что общий протокол может быть применен к анализу митотических клеток в яичках, а также.
Представленная методология фокусируется на подготовке тести для живой визуализации сперматоцита мейоза, так как это позволяет в режиме реального времени анализировать клеточную и молекулярную динамику. Мы также предоставляем метод фиксации и иммуностоинга нетронутых яичек, так как этот подход может быть предпочтительнее, если необходимые флуоресцентно помеченные конструкции выражения не доступны или чтобы избежать смешанных эффектов переэкспрессии белка. Важным соображением, однако, является то, что фиксация не всегда добросовестно сохранить родной ткани и клеточной архитектуры. Например, мы и другие обнаружили, что фиксация часто приводит к фрагментации или нарушению ER11,27. Некоторые из этих проблем могут быть решены с помощью различных фиксаторов или методов подготовки тканей, и поэтому некоторые устранения неполадок могут быть необходимы для определения оптимального протокола фиксации для сохранения конкретного компонента клеток или белковой организации. К счастью, ряд дополнительных протоколов для фиксации дрозофилы сперматоцитов также доступны18,28,29.
В заключение, мы описали универсальные методы для подготовки тестиdro Drosophila для живого и фиксированного клеточного анализа сперматоцитов мейоз. Конкретные сильные стороны этого экспериментального подхода включают анализ деления клеток в нетронутой ткани, высокое разрешение изображения больших клеток, и интеграция с Drosophila генетических инструментов. Эксперименты с использованием методологии имеют потенциал, чтобы внести важный вклад в наше понимание того, как деление клеток интегрируется со сложными механизмами развития тканей и гомеостаза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Министерством обороны стартовых средств j.T.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
