Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60961
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, F. Edward Hébert School of Medicine, Uniformed Services University of the Health Sciences

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو تحليل انقسام الخلايا في الأنسجة السليمة عن طريق المجهر الخلية الحية والثابتة باستخدام الحيوانات المنوية الميواتية Drosophila. يوضح البروتوكول كيفية عزل الخصيتان الكاملة والسليمة من يرقات دروسوفيلا والخوخ المبكر ، وكيفية معالجتها وتركيبها للتنظير المجهري.

Abstract

التحليل التجريبي للخلايا التي تنقسم في الأنسجة والأعضاء الحية والسليمة أمر ضروري لفهمنا لكيفية تكامل انقسام الخلايا مع التطور وتناط الأنسجة وعمليات المرض. الخلايا المنوية Drosophila التي تخضع للmeiosis مثالية لهذا التحليل لأن (1) اختبارات Drosophila كاملة تحتوي على الخلايا المنوية من السهل نسبيا لإعداد للميكروسسكوبية، (2) حجم الحيوانات المنوية كبيرة يجعلها مناسبة تماما للتصوير عالية الدقة، و (3) أدوات قوية Drosophila الوراثية يمكن دمجها مع في تحليل الجسم الحي. هنا ، نقدم بروتوكولًا يسهل الوصول إليه لإعداد الخصيتين الكاملتين من يرقات الانستار الثالثة Drosophila والخوخ المبكر. نحن نصف كيفية تحديد الحيوانات المنوية meiotic في الخصيتين كله أعدت وكيفية تصويرها تعيش عن طريق المجهر الفاصل الزمني. كما يتم توفير بروتوكولات التثبيت والاختبارات الكاملة المناعية. استخدام الخصية اليرقات له العديد من المزايا على البروتوكولات المتاحة التي تستخدم الخصية الكبار لتحليل الحيوانات المنوية. الأهم من ذلك، الخصيتين اليرقات هي أصغر وأقل ازدحاما مع الخلايا من الخصيتين الكبار، وهذا يسهل إلى حد كبير التصوير عالية الدقة من الخلايا المنوية. لإثبات هذه المزايا وتطبيقات البروتوكولات، نقدم نتائج تبين إعادة توزيع التبهيل الإندوسلي في ما يتعلق بالميكروتوبولين المغزل أثناء انقسام الخلية في صورة واحدة من الحيوانات المنوية التي تم تصويرها بواسطة المجهر confocal الفاصل الزمني. يمكن الجمع بين البروتوكولات مع التعبير عن أي عدد من البروتينات الموسومة بفلوريأو علامات العضين ، وكذلك الطفرات الجينية وغيرها من الأدوات الوراثية ، مما يجعل هذا النهج قويًا بشكل خاص لتحليل آليات تقسيم الخلايا في السياق الفسيولوجي للأنسجة والأعضاء الكاملة.

Introduction

وغالبا ما يدرس انقسام الخلية باستخدام خطوط الخلية نمت في الثقافة1. في حين أننا قد اكتسبت ثروة من البصيرة لا تقدر بثمن وفهم الآليات الأساسية من هذه الدراسات2، والخلايا التي تزرع في الثقافة لا يمكن تلخيصها تماما فيزيولوجيا انقسام الخلايا كما يحدث في سليمة ، والأنسجة الحية. على سبيل المثال ، في الأنسجة والأعضاء السليمة ، يجب تقسيم الخلايا في المكان المناسب وفي الوقت المناسب بحيث تكون الخلايا الذرية موجودة بشكل صحيح داخل الأنسجة ، بحيث يمكن أن تخضع للتمايز المناسب أو البرامج الوظيفية ، وحتى يتم تنسيق انتشار الخلايا بشكل صحيح مع نمو الأنسجة أو التوازن3. بالنسبة للخلايا التي تزرع في الثقافة من ناحية أخرى ، يتم تنظيم انقسام الخلايا بشكل عام من خلال عوامل النمو في الثقافة المتوسطة4، وبالتالي لا يمكننا أن نتعلم من هذه الخلايا كيف تؤثر العوامل البيئية في الجسم الحي مثل بنية الأنسجة أو إشارات النمو على عملية التقسيم. من المهم أيضًا ملاحظة أن العديد من خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة انقسام الخلايا ، مثل خلايا HeLa و U2OS ، كانت مشتقة من الأورام النقيلية5. لذلك ، من المرجح أن يتم تغيير العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء الأساسي لهذه الخلايا السرطانية ، مثل الآليات التنظيمية لدورة الخلية والاستقرار الكروموسومي ، مقارنة بالخلايا السليمة. الفهم الكامل لفسيولوجيا انقسام الخلية ، لذلك ، يعتمد على قدرتنا على دراسة تقسيم الخلايا في مواطنها ، في بيئات الجسم الحي التي تحافظ على الآليات التنظيمية الفسيولوجية وهندسة الأنسجة.

ويعوق التقدم في فهم كيفية عمل انقسام الخلية داخل الأنسجة والأعضاء سليمة من الصعوبات الكامنة في تحليل الجسم الحي أو الجسم الحي. أولاً، قد يكون من الصعب أو المستحيل الوصول إلى الخلايا المنقسمة للتحليل المجهري داخل الأعضاء الكبيرة أو الأنسجة السميكة. ثانياً، غالباً ما يكون من الصعب التنبؤ بالوقت الذي ستنقسم فيه الخلايا الفردية في الجسم الحي. ثالثا، قد تتدهور فسيولوجيا الأنسجة بسرعة خلال زراعة الجسم الحي السابق. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طرق يمكن الوصول إليها بسهولة لتحليل الحية والثابتة من الحيوانات المنوية drosophila melanogaster لأنها تخضع لانقسامات الخلايا meiotic داخل الخصيتين سليمة تماما. هذه الخلايا مثالية لتحليل الحية، على سبيل المثال على الجسم الحي لأنها يمكن الوصول إليها بسهولة مع الأساليب البصرية القياسية مثل المجهر الكونستبكي، فإنها تقسم في أوقات ومواقع يمكن التنبؤ بها، ويمكن الحفاظ على الخصيتين سليمة في ثقافة الجسم الحي على ما يصل إلى حوالي 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، فإن خلايا الحيوانات المنوية في دروسوفيلا هي خلايا مستديرة كبيرة (قطرها حوالي 20-30 ميكرون) لا تغير الشكل عند تقسيمها، مما يجعلها مثالية للدقة العالية والتصوير الفاصل الزمني للمكونات الخلوية مثل جهاز المغزل والعضيات السيتوبلازمية. على الرغم من أن هذه الخلايا تخضع للmeiosis بدلا من الانقسام ، فإن العديد من عمليات تقسيم الخلايا الأساسية متشابهة للغاية بين هاتين الآليتين لانقسام الخلايا6. جعلت هذه المزايا، جنبا إلى جنب مع أدوات قوية Drosophila الوراثية، Drosophila spermatocytes نموذج يستخدم على نطاق واسع لتحليل الجسم الحي من عمليات تقسيم الخلايا الأساسية بما في ذلك تشكيل المغزل والتنظيم، cytokinesis، وإعادة عرض organelle وتقسيم7،8،9،10،11.

الخلايا المنوية هي الخلايا التي هي في مرحلة meiotic من تكوين الحيوانات المنوية. في دروسوفيلا، يبدأ تكوين الحيوانات المنوية بمجموعة من الخلايا الجذعية الجرثومية التي تقع في منطقة صغيرة أو "محور" في قطب واحد من الخصية12،13. تنقسم هذه الخلايا بسبب الانقسام غير المتماثل ، مما يؤدي إلى وجود نطاف واحد متمايز. الحيوانات المنوية ثم الخضوع لأربعة mitoses متزامن لإنتاج مجموعة من 16 الخلايا التي لا تزال مرتبطة ارتباطا وثيقا داخل كيس واحد. في هذه المرحلة، تنتقل الخلايا من دورة الخلايا الميطيّة إلى دورة الخلية الميّواتية ويشار إليها باسم الخلايا المنوية. الخلايا المنوية تنفق حوالي يومين إلى ثلاثة أيام في مرحلة G2 الموسعة من دورة الخلية، والتي تنمو بشكل كبير والخضوع لتغيرات الخلوي استعدادا للقسمين meiotic والحيوانات المنوية اللاحقة13،14. المجموعة بأكملها من 16 الخلايا المنوية داخل كيس واحد ثم أدخل الانقسام meiotic الأولى في نفس الوقت. وهكذا، يمكن أن يتم التصوير العديد من الحيوانات المنوية meiotic في وقت واحد لأنها تتحرك من خلال انقسام الخلية. يشرع القسم الميوتيكي الأول لمدة 1.5 ساعة تقريبًا ويتبعها على الفور تقريبًا القسم الميوطي الثاني ، مما ينتج عنه 64 من الحيوانات المنوية الإجمالية التي تستمر في التفريق إلى الحيوانات المنوية الناضجة.

ميزة فريدة من نوعها لاستخدام الخلايا المنوية لدراسة انقسام الخلايا في الأنسجة الحية وسليمة هي أن مجموعات أو الخراجات من الخلايا تتقدم باستمرار من خلال مراحل مختلفة من تكوين الحيوانات المنوية، والخلايا في جميع مراحل تكوين الحيوانات المنوية يمكن عادة تحديدها في أي الخصية معينة (انظر الشكل 3A). لذلك ، من السهل نسبيًا العثور على خلايا ميوتيكية في الخصيتين الكاملتين. نحن نركز بشكل عام تحليلاتنا على الأول بدلاً من meiosis الثاني لأن هذه الخلايا أكبر بكثير وأكثر قابلية للتصوير عالي الدقة ، ولكن العملية بأكملها التي تشمل كلا القسمين meiotic يمكن تصويرها بنجاح. تجدر الإشارة أيضا إلى أن البروتوكول العام لإعداد الخصية والثقافة يمكن استخدامها لتحليل العمليات الأخرى لتكوين الحيوانات المنوية كذلك، مثل الخلايا الجذعية mitotic في وقت سابق أو الانقسامات المنوية أو التغيرات الخلوية التي تحدث كما الحيوانات المنوية تنضج في الحيوانات المنوية15. يتم الحفاظ على العديد من هذه الجوانب من تكوين الحيوانات المنوية بشكل كبير بين دروسوفيلا والبشر16.

الخلايا المنوية Drosophila تبدأ في الوصول إلى مرحلة meiotic من تكوين الحيوانات المنوية خلال المرحلة الثالثة من اليرقات instar من تطوير Drosophila 13. لذلك ، يمكن استخدام الخصيتين المعزولات من مراحل دورة الحياة بدءًا من يرقات الإنستار الثالثة بما في ذلك الخوخ والبالغين لتحليل تقسيم الخلايا المنوية. تتوفر العديد من البروتوكولات الممتازة لاستخراج الخصيات من الذباب الذكور البالغين للتحليل الحي والثابت لتكوين الحيوانات المنوية17،18،19. قد تكون هذه البروتوكولات مفضلة لدراسة المراحل المتأخرة من تكوين الحيوانات المنوية أو إذا كان يجب استخدام العلامات الوراثية التي لا تظهر إلا لدى البالغين. يركز البروتوكول بدلاً من ذلك على إعداد الخصية من اليرقات والخوخ المبكر ، لأن الخصيتين في هذه المراحل لها العديد من المزايا التي ترتبط على وجه التحديد بتحليل انقسام الخلايا عن طريق التحليل الدقيق العالي والمجهر الفاصل زمنيًا. أولاً ، الخصيتان من اليرقات والخوخ أصغر من تلك التي من البالغين ، والخلايا داخل الجهاز أقل ازدحامًا. وبسبب هذا، يمكن في كثير من الأحيان تقسيم الخلايا المنوية يمكن أن تكون صورة بالقرب من السطح الخارجي للاختبارات اليرقات، دون الحاجة إلى اختراق من خلال طبقات متعددة من الأنسجة المتناثرة الضوء. ثانياً، تتحرك خصيّات البالغين بشكل إيقاعي بسبب تقلصات الأعضاء الملحقة، وهذه الحركات تجعل تصوير الخلايا الفردية ينطوي على ضيق زمني. وثالثاً، تكون اختبارات اليرقات مفيدة عند دراسة الطفرات الجينية التي تسبب الفتك الجروية أو البالغة. تم تحسين أساليبنا لثقافة طويلة الأجل من الخصيتين على مرحلة المجهر ، مما يسمح بتصوير جولات متعددة من انقسام الخلايا أو تطور الخلايا الفردية من خلال مراحل متعددة من تكوين الحيوانات المنوية في نفس الإعداد. كما أننا نصف بروتوكول لتثبيت ومناعة الخصيتين بأكملها. وعموما، بروتوكولاتنا مفيدة بشكل خاص لأولئك المهتمين في دراسة انقسام الخلايا في الأنسجة سليمة، والقدرة على الجمع بين تحليل الحيوانات المنوية مع أدوات الحمض العضلي ة القابلة للاستغناء عن الأدوات الوراثية دروسوفيلا يجعل هذا النهج قوية خاصة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحيوانات والأدوات ووسائل الإعلام للتشريح

  1. عبر الذباب الذكور والإناث للحصول على ذرية من النمط الجيني المطلوب. علامات معدلة مفيدة لتحديد والتدريج من الحيوانات المنوية meiotic تشمل GFP-tubulin لتسمية المغزل meiotic وRFP-histone 2A لتسمية الكروموس8. استخدم خمس إلى عشر إناث لكل صليب وحافظ على الصلبان على طعام الذباب القياسي في قوارير في حاضنة 25 درجة مئوية حتى تبدأ يرقات الإنستار الثالثة في الزحف على جانبي القارورة (4-5 أيام). سيبدأ الخوخ الأبيض المبكر في التشكل بعد يوم واحد.
  2. الحصول على اثنين من أزواج من ملقط على التوالي مع نصائح غرامة. تأكد من أن النصائح حادة ، حتى في الطول ، ومستقيمة(الشكل 1A). استخدام هذه الملقط فقط للتشريح، والغطاء مع نصائح ماصة 10 ميكرولتر عندما لا تكون في الاستخدام.
  3. إعداد أداة مشرط.
    1. أدخل النهاية الحادة لدبوس حشرة فولاذية سوداء في حامل دبوس ، ولف المسمار الخاص بالحامل لتأمين الدبوس في مكانه. باستخدام زوج من الملقط وتحت المجهر تشريح، فهم دبوس الحشرة في الوسط وثنيه لتشكيل زاوية داخلية من 135 درجة(الشكل 1B). النهاية الحادة هي لقطع الأنسجة ، في حين يتم استخدام الحافة لنقل الخصيتين بين قطرات من الوسائط.
    2. غطاء مع 1000 μL تلميح ماصة عندما لا تكون في الاستخدام.
  4. العمل في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وإعداد 5 مل aliquots من وسائل الإعلام شنايدر وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى وقت الاستخدام. عندما تكون جاهزة لبدء تشريح، دافئة واحدة 5 مل وسائل الإعلام aliquot إلى درجة حرارة الغرفة. ثم نقل وسائل الإعلام تشريح دافئ إلى حقنة 10 مل وإرفاق مرشح حقنة 0.22 ميكرون.

2. تشريح الخصية من اليرقات والخوخ المبكر

  1. استخدم حقنة التصفية المملوءة بالوسائط لطرد ثلاث قطرات من الوسائط (50 ميكرولتر لكل منها) في الجزء العلوي والأوسط والسفلي من الشريحة الزجاجية.
  2. استخدم مسبار تشريح لنقل يرقات الانستار من خمسة إلى عشرة ثالث أو الخوخ المبكر (الخوخ الذي لا يزال أبيض أو أصفر) إلى أعلى قطرة. تهيّج اليرقات والخوخ بلطف في وسائل الإعلام مع مسبار التشريح لإزالة أي طعام أو حطام.
  3. تحت المجهر تشريح، بدوره اليرقة واحد أو الخوخ على جانبها مع التحقيق تشريح لتحديد الخصيتين الثنائية إذا كانت موجودة، والتي تظهر كهياكل شفافة بيضاوية الشكل في الثلث الخلفي من الجسم(الشكل 2A، B). الحيوانات التي تفتقر إلى الخصيتين هي أنثى وينبغي التخلص منها.
  4. عندما يتم العثور على يرقة ذكر أو الخوخ ونظيفة، نقله إلى قطرة الثانية من وسائل الإعلام. كرر حتى 3 أو 4 يرقات الذكور و / أو الخواق قد تم نقلها إلى قطرة الثانية من وسائل الإعلام.
  5. العمل في قطرة الثانية من وسائل الإعلام، فهم يرقة ذكر واحد أو الخوخ مع زوج من ملقط في منتصف المنطقة، فقط في وضع الأمام للخصيب. استخدام الزوج الثاني من ملقط لتمزيق بلطف الحيوان في النصف.
  6. عقد النهاية الخلفية لليرقة أو الخوخ أسفل على الشريحة الزجاجية مع زوج من ملقط. بدءا من جانب الملقط، ودفع أسفل على بشرة باستخدام حافة أداة مشرط وتحريك مشرط نحو نهاية قطع من الحيوان. وهذا سوف يطرد الأعضاء الداخلية للالحيوان، والتي تشمل الشجاعة والهيئات الدهنية، والخصيات.
  7. ندف بلطف بصرف النظر عن الخصيات من بقية الأجهزة. الخصيتين واضحة، والأعضاء البيضاوية الشكل جزءا لا يتجزأ من شرائط من الجسم الدهون(الشكل 2C).
  8. نقل الخصية واحد في وقت واحد إلى قطرة الثالثة من وسائل الإعلام. لتحقيق ذلك، أدخل حافة المشرط تحت الجسم الدهني، ورفع الأنسجة من وسائل الإعلام، وتحريكه بسرعة إلى قطرة الثالثة.
  9. بدلا من ذلك، إذا لم يكن هناك ما يكفي من الجسم الدهون لا تزال تعلق على الخصيتين لرفع الأنسجة بنجاح، ونقل بلطف الأنسجة باستخدام ماصة باستور الزجاج التي تم الرطب قبل مع وسائل الإعلام تشريح.
  10. استخدام نهاية حادة من أداة مشرط لشريحة بلطف بعيدا الدهون الزائدة الجسم من الخصيتان، وترك مجرد حافة صغيرة من الجسم الدهون حول حواف(الشكل 2C). ليس من الضروري إزالة جميع الجسم الدهون، ومحاولة القيام بذلك من المرجح أن يؤدي إلى إتلاف أو تمزق الخصيتين.
  11. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لجميع يرقات الذكور على الشريحة الزجاجية.
  12. المضي قدما إما إلى الخطوة 3 أو الخطوة 5.

3. تركيب الاختبارات للتصوير المجهري الحي

ملاحظة: تم تكييف هذا الإجراء المتصاعد من بروتوكول نشر مؤخرا لتصوير اليرقات اليرقات الخلايا العصبية في الدماغ drosophila20. يمكن العثور على تفاصيل إضافية في هذا المرجع.

  1. استخدم حقنة التصفية لإيداع قطرة واحدة من وسائط شنايدر (حوالي 30 ميكرولتر) في مركز طبق ثقافة نفاذ الغاز 50 مم.
  2. استخدم ماصة باستور مبللة مسبقًا لنقل الخصيتين المعدتين إلى القطرة على الطبق القابل للنفاذ بالغاز. سوف تطفو الخصية عموما على سطح القطرة.
  3. استخدم أداة المشرط لدفع الخصية بلطف إلى أسفل على الغشاء نفاذالغاز. الحرص على عدم تمزق الغشاء نفاذ الغاز مع نقطة حادة من مشرط. دفع جميع الخصيات إلى وسط قطرة.
  4. استخدام حقنة 1 مل مليئة زيت الهالوكربون لجعل أربع قطرات من النفط، حوالي 30 ميكرولتر لكل منهما، على غشاء الغاز نفاذي. الفضاء قطرات من النفط حول قطرة من وسائل الإعلام التي تحتوي على الخصيتين لتتوافق مع الزوايا الأربع من غطاء الزجاج 22 ملم.
  5. اصطف زوايا غطاء زجاجي 22 مم مع أربع قطرات من زيت الهالكربون وتخفض بلطف قسيمة الغطاء على وسائل الإعلام والنفط. السماح لغطاء لتسوية ولوسائل الإعلام التي تحتوي على الخصيتين لتنتشر بين قطرات النفط.
  6. قم بإزالة الوسائط الزائدة للسماح لقسيمة الغطاء بالاستقرار على سطح الخصيات. أثناء مراقبة الخصيات تحت المجهر التشريحي ، أدخل زاوية مهمة حساسة مسح في وسائل الإعلام تحت غطاء لفتيل كمية صغيرة من السائل. ويك بعيدا ما يكفي من وسائل الإعلام حتى الغطاء الزجاجي يجعل مجرد اتصال مع سطح أكبر الخصية. من الأهمية بمكان عدم إزالة الكثير من الوسائط وخفض قسيمة الغطاء بعيدًا جدًا ، لأن هذا سيمارس الضغط على الخصيين ويسبب لهم التمزق (انظر الشكل 5).

4. التصوير الحي من الحيوانات المنوية Meiotic

ملاحظة: يمكن تصوير الخلايا المنوية باستخدام المسح الضوئي بالليزر أو تدوير المجهر البؤري للقرص. يجب أن يكون النظام سرعة كافية وحساسية لتجنب التبييض الضوئي للبروتينات الفلورية أو تلف ضوئي للأنسجة.

  1. ضع قطرة من زيت الغمر على غطاء الزجاج فوق الخصية. الوجه على الطبق ووضعه على مرحلة المجهر وتحريك الهدف المجهر (40x أو 60x) في النفط حتى يكون أقل من الخصية. استخدم الضوء المرسل للعثور على خصية واحدة وجعلها في بؤرة التركيز.
  2. أثناء التقاط صور سريعة مع بؤرة الاتصال، حرك الخصية لفحص تنظيم الخلايا. واحدة من نهاية الخصية سيكون لها العديد من الخلايا الصغيرة ومعبأة بكثافة. تحتوي هذه النهاية على الخلايا الجذعية الجرثومية والحيوانات المنوية. تتحرك نحو الطرف الآخر من الجهاز، وتحديد الخلايا أكبر تدريجيا نظمت في مجموعات منفصلة أو الخراجات. هذه الخلايا الكبيرة هي الخلايا المنوية(الشكل 3A).
  3. إذا كان التصوير GFP-tubulin، وتحديد الخلايا المنوية التي ستبدأ meiosis في غضون 30-60 دقيقة من خلال وجود اثنين من أستر microtubule مشرق (أي المركزية) الموجودة في قشرة الخلية(الشكل 3B، C).
  4. مرة واحدة تم تحديد كيس من الخلايا المنوية meiotic، إعداد معايير الاستحواذ لالتقاط z-أكوام من الصور مع مرور الوقت. عادة، اقتناء 15-20 صور متباعدة 1.5 ميكرومتر بعيدا في البعد z كافية لالتقاط الحجم الكامل لعدة خلايا الحيوانات المنوية داخل نفس الكيس.
  5. الحصول على كامل z-مداخن كل 2 دقيقة إذا كان التصوير تقسيم meiotic الأول بأكمله، الذي يستغرق حوالي 1.5 ساعة. من الممكن استخدام معدلات اقتناء أسرع ، خاصة إذا كان سيتم تحليل حدث معين من meiosis فقط. ومع ذلك، الحرص على عدم التسبب في التبييض الضوئي أو تلف ضوئي بسبب التعرض المتكرر للعينة لإثارة الليزر.
  6. استخدم نظام التحكم المستمر والتلقائي في التركيز لمنع الانجراف البؤري على مدار فترة طويلة من الاستحواذ. التحكم في درجة الحرارة من العينة على مرحلة المجهر عموما ليست ضرورية، على افتراض درجة حرارة الغرفة من حوالي 22-23 درجة مئوية. إذا كان التحكم في درجة الحرارة متاحًا، فحافظ على العينة عند 25 درجة مئوية على مرحلة المجهر.
  7. إذا لم يتم العثور على الخلايا المنوية meiotic، تخزين العينة لعدة ساعات أو بين عشية وضحاها في حاضنة 25 درجة مئوية والصورة مرة أخرى.

5. التثبيت والمناعة

  1. من الخطوة 2.10 أعلاه، استخدم ماصة بستر زجاجية لنقل الخصيتين إلى بئر في طبق تشريح زجاج 9 بئر يحتوي على 0.5 مل من بارامايدهايد 8٪ في PBSTx (الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا مع 0.3٪ تريتون X-100). تأكد من أن الخصيتان تضعان على الجزء السفلي من الطبق.
    ملاحظة: بارافورماديهايد سام ويجب التعامل معه بقفازات في غطاء الدخان.
  2. إصلاح الخصيتين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. نقل الخصيتين إلى بئر يحتوي على 0.5 مل PBSTx. غسل لمدة 5 دقيقة مع الانفعالات لطيف. كرر خطوة غسل في آبار جديدة مع PBSTx الطازجة مرتين أكثر.
  4. تمييع الأجسام المضادة الأولية إلى التركيز المطلوب في 0.5 مل PBSTx تحتوي على 5٪ من الزل المصل البقري (BSA) في أنبوب ميكروالطرد المركزي 1.5 مل. نقل الخصيتين من 9 بئر الزجاج تشريح الطبق إلى أنبوب الأجسام المضادة الأولية المخففة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع هزاز لطيف أو الجوز.
  5. غسل الخصيتين في 0.5 مل من PBSTx لمدة 5 دقيقة في بئر من 9 بئر الزجاج تشريح الطبق. كرر خطوة غسل مع PBSTx الطازجة مرتين أكثر.
  6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في 250 ميكرولتر من PBSTx تحتوي على 5٪ BSA والاستغناء في بئر نظيفة من طبق تشريح الزجاج 9 بئر. إذا رغبت في ذلك، إضافة DAPI لوصمة عار الحمض النووي. نقل الخصيتين إلى البئر الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية، وتغطية مع غلاف بلاستيكي، واحتضان في الظلام مع الانفعالات لطيف لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  7. نقل الخصيتين إلى نظيفة مليئة جيدا مع 0.5 مل من PBSTx. غسل مع PBSTx الطازجة مرتين لمدة 5 دقيقة ولمرة ثالثة لمدة 30 دقيقة.

6. تركيب الخصيات الثابتة

  1. نقل الخصيات من غسل الماضي على شريحة المجهر الزجاج باستخدام ماصة باستور. إذا لزم الأمر، استخدم حافة أداة المشرط لدفع الخصية إلى أسفل على سطح الشريحة.
  2. استخدام زاوية مسح مهمة حساسة لفتيل بعيدا السائل الزائد من الخصيات. إزالة أكبر قدر ممكن من السائل.
  3. تطبيق قطرة 30-50 ميكرولتر من تركيب المجهر المتوسطة إلى الخصيات.
  4. ضع قسيمة تغطية 22 مم على قطرة متوسطة التركيب واسمح لقسيمة الغطاء بالاستقرار والوسائط المتصاعدة للانتشار تحت قسيمة الغطاء. تطبيق ضغط لطيف على coverslip إذا لزم الأمر للضغط على الزائدة تصاعد المتوسطة والسماح للغطاء للراحة على سطح الخصية.
  5. استخدام طلاء الأظافر لختم حواف الغطاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، ستبقى الخصيتين سليمتين تمامًا للتصوير عن طريق المجهر المحوري أو طرق المجهر الفلورية الأخرى. كما رأينا في الشكل 3A، يتم الحفاظ على التنظيم الخلوي للخصيتين ، ويكون تطور تمايز الخلية من نهاية واحدة من الخصية إلى الطرف الآخر بما في ذلك الحيوانات المنوية ، والخلايا المنوية ، والحيوانات المنوية haploid مرئية. GFP-tubulin هو علامة مفيدة لتحديد تقسيم الخلايا المنوية والتصوير الحي لتطور الخلايا من خلال meiosis. كما هو مبين في الشكل 3B، يمكن التعرف على الحيوانات المنوية حول meiosis البداية من قبل اثنين من أستر microtubule بارزة. بواسطة metaphase المغزل meiotic كبيرة وصفت بشكل جميل من قبل GFP-tubulin(الشكل 3C).

Drosophila spermatocytes 'حجم كبير وتطورها البطيء النسبي من خلال meiosis جعلها مثالية لتحليل ديناميات وإعادة تنظيم المكونات الخلوية مثل organelles السيتوبلازمية خلال انقسام الخلية8,11,21. الشكل 4 والفيديو 1 تظهر تحليل التصوير الحي لإعادة التنظيم الديناميكي للريتيكولومي الإندوبلازم (ER) فيما يتعلق microtubules من خلال مسار meiosis. كما هو موضح أعلاه ، خلال الطور المتأخر قبل بداية داء الميوس ، يظهر اثنان من السنتروسات الموجودة في قشرة الخلية بوضوح بواسطة فلوريس سينسيG-tubulin. في هذه المرحلة، يكشف الفلورسال RFP (RFP-KDEL) الموجه ERP (RFP-KDEL) أن ER موزعة بالتساوي في جميع أنحاء السيتوبلازم. ثم تبدأ السنتروسومات في الهجرة إلى طرفي نقيض من المغلف النووي لإنشاء القطبين المغزلين. خلال هذا الوقت ، يتراكم ER بسرعة حول microtubules المركزية ويتم مسحها تدريجيا من بقية السيتوبلازم. يتم الكشف عن انهيار المغلف النووي (NEB) من خلال ظهور فلوران GFP-tubulin داخل المنطقة النووية. تجدر الإشارة إلى أن خلايا دروسوفيلا تنقسم على الانقسام شبه المفتوح أو الميوز، وهذا يعني أن مكونات المغلف النووي تنهار وتتفرق وتدخل جزيئات السيتوبلازمالكبيرة الكبيرة المنطقة النووية، ولكن مغلفامن الأغشية المشتقة من ER يحيط بالمغزل والكروماتيدات في جميع أنحاء انقسام الخلايا22،23،24. بحلول وقت NEB والتقدم من خلال metaphase ، يرتبط ER بشكل كامل تقريبًا مع microtubules النجمية التي تحيط بسنتروس القطب المغزل. هذه تراكمات microtubule نجمي اثنين من ER ثم تقسيم إلى الخلايا ابنة اثنين خلال anaphase, ضمان الميراث المناسب ER بواسطة الخلايا شكلت حديثا8,,11.

ويبين الشكل 5 آثار تمزق الخصية على التصوير الحي للخلايا المنوية. كما هو موضح في البروتوكول ، يجب توخي الحذر الشديد في عدم خفض الغطاء بعيدًا جدًا على سطح الخصيتين أثناء الخطوات المتصاعدة ، لأن هذا سيضغط على الخصيتين ويتسبب في انفجارها. كما رأينا في الشكل 5 والفيديو 2، وأكياس الحيوانات المنوية تتدفق بسرعة من الخصية تمزق ، وهذه الحركة من الخلايا يجعل العيش ، والتصوير الفاصل الزمني صعبة للغاية.

Figure 1
الشكل 1: الأدوات المطلوبة للتشريح الناجح. (أ)يجب أن تكون الملقط المستخدمة للتشريح مستقيمة وتحتوي على نصائح حادة غير منكسرة (المشار ة بواسطة علامة الاختيار الخضراء). لا تستخدم ملقط مع عازمة أو كسر نصائح (علامات X الحمراء)، لأنها سوف تكون غير فعالة في استيعاب اليرقات وإغاظة الأنسجة. (ب)لإعداد أداة المشرط ، ثني دبوس حشرة فولاذية سوداء ممسّجة إلى زاوية داخلية تبلغ حوالي 135 درجة. يتم استخدام النقطة الحادة كسكين لقطع الأنسجة ، ويتم استخدام الحافة المستقيمة للأنسجة المتحركة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحديد اليرقات والخصيات الجراءية. (أ)صور يرقات الذكور والإناث. يمكن التعرف على الخصيتين في الذكر على أنها الهياكل الشفافة الدائرية أو البيضاوية في الثلث الخلفي من الحيوان (رأس السهم). لاحظ عدم وجود بنية مماثلة في الأنثى. (ب)صورة لجروا ذكر في وقت مبكر، مع اثنين من الخصيتين شفافة المشار لها من قبل رؤوس الأسهم. (ج)الخصيات مع الهيئات الدهون المرفقة بعد تشريح. الخصيتين على اليسار والهيئات الدهون المفرطة لا تزال تعلق التي تحتاج إلى قلص بعيدا. وقد تم تقليم الخصيتين على اليمين بشكل صحيح من أجسامهم الدهنية وعلى استعداد للتصوير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد الخلايا المنوية الميوتيكية في الخصية المعدة بنجاح. (A)صورة Confocal من الحية أعدت بنجاح، testis سليمة التعبير عن GFP-tubulin. يقع محور الخلايا الجذعية نحو الطرف السفلي من الخصية ، على الرغم من أنه لا يمكن التعرف عليه في هذا الإعداد. يشار إلى عدة طبقات من الحيوانات المنوية الصغيرة ، ويتبع هذه العديد من الخراجات من الخلايا المنوية. يمكن التعرف على كيس من الخلايا المنوية في أول انقسام ميوتيك بناءً على الحجم الكبير للخلايا (حوالي 20 - 30 ميكرومتر في القطر) ووجود GFP-tubulin المسمى المغزل الميوطي. الحيوانات المنوية في الانقسام meiotic الثاني وبالمثل المغزل، ولكن هذه الخلايا هي ما يقرب من نصف حجم الخلايا meiosis I. الحيوانات المنوية بعد meiotic هي أيضا مرئية، وكذلك إطالة الحيوانات المنوية. (ب)يمكن تحديد الخلايا المنوية التي ستبدأ meiosis في غضون 30 - 60 دقيقة من قبل اثنين من كبير، مشرق جدا microtubule أستير (المشار إليها من قبل رؤساء الأسهم) التي وصفت GFP-tubulin. يتم تحديد كيس الخلايا قبل meiotic من قبل الخط الأصفر متقطعة. (C)يمكن التعرف على الخلايا في meiosis من خلال المغزل الميوتيك الكبيرة التي يتم تصورها بسهولة مع GFP-tubulin. يتم تحديد كيس الخلايا meiotic بواسطة الخط الأصفر متقطعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصوير الفاصل الزمني للmeiosis في الخلايا المنوية واحد. صورة واحدة الحيوانات المنوية المشتركة في التعبير عن GFP-tubulin وRFP المستهدفة إلى ER (RFP-KDEL) تم صورة كل دقيقتين من خلال مسار meiosis. تظهر صور تمثيلية لخلايا الحيوانات المنوية في مراحل محددة من داء الميوز، بدءا من مرحلة لاحقة والتقدم من خلال telophase. الأوقات في دقائق. كل صورة هي مستوى بصري واحد من كومة من خمس عشرة شريحة بصرية تم الحصول عليها في كل نقطة زمنية. تم تعديل هذا الرقم من كاراباشيفا وسميث، 20198. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور تمثيلية لالخصية قبل وبعد التمزق. الصورة على اليسار، والمسمى "سليمة"، يظهر GFP-tubulin التعبير عن الخصية قبل التمزق. الصورة على اليمين يظهر نفس الخصية بعد تمزق. يمكن رؤية أكياس الخلايا المنوية تتدفق من الخصية الممزقة. رؤوس الأسهم تشير إلى كيس من الخلايا المنوية meiotic; لاحظ الحركة الكبيرة لهذه الخلايا المنوية بعد تمزق الخصية، مما يجعل التصوير هذه الخلايا المنوية مع مرور الوقت صعبة للغاية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: تقسيم meiotic الكامل من الخلايا المنوية واحد. يظهر هو مرور الوقت الكامل من GFP-tubulin وRFP-KDEL التعبير عن الحيوانات المنوية في الشكل 4. تم التقاط الصور كل دقيقتين ، ومعدل التشغيل هو ثلاثة إطارات في الثانية. تم تعديل هذا الفيديو من كاراباشيفا وسميث، 20198. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 2: تمزق الخصية. الفاصل الزمني للخصية قبل وبعد التمزق. التمزق واضح بسبب التدفق المفاجئ لأكياس الخلايا من خلال الزاوية اليسرى السفلى من الخصية. تم التقاط الصور كل دقيقتين ، ومعدل التشغيل هو ثلاثة إطارات في الثانية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد وصفنا بروتوكولًا لإعداد اختبارات اليرقات أو الجرو المبكر ة Drosophila ، الأمثل للتصوير الحي على المدى الطويل لانقسام خلايا الحيوانات المنوية. هذا هو وسيلة قوية لتحليل انقسام الخلايا في السياق الفسيولوجي للأنسجة سليمة. يتم توسيع قوة هذه الطريقة عند دمجها مع الأدوات الوراثية Drosophila ، مثل الطفرات الجينية المحددة ، والقمع بوساطة RNAi الخاصة بالأنسجة ، والبروتين والعلامات المنزرعة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحجم الصغير لليرقات والخصيتين الجراء ، والقدرة على تصوير الخلايا المنقسمة قريبة جدًا من الغطاء الزجاجي ، تجعل الطريقة مثالية للتصوير عالي الدقة بما في ذلك النهج فائقة الدقة. ويتجلى تعدد استخدامات هذا النظام التجريبي من خلال النتائج التمثيلية التي تصف إعادة التنظيم الديناميكية لـ ER أثناء تقسيم الخلايا. الخلايا المنوية Drosophila مفيدة بشكل خاص لمثل هذا التحليل لديناميات العضي خلال انقسام الخلايا بسبب حجم هذه الخلايا الكبير والعبور البطيء نسبيا من خلال meiosis. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون نفس الخلايا صورة بعد meiotically لفهم كيف تؤثر التغيرات في ديناميات العضية أو آليات انقسام الخلايا على الأحداث اللاحقة لتكوين الحيوانات المنوية. وبالتالي ، هناك إمكانات كبيرة مع هذا النهج التجريبي لفهم فسيولوجيا انقسام الخلايا ضمن السياق الأوسع لتطوير الأنسجة والتمايز الخلوي ، وهي نتائج لا يمكن تحقيقها عند دراسة الخلايا التي تزرع في الثقافة.

يتضمن البروتوكول العديد من العناصر التي تسهل على المدى الطويل على المدى الطويل على المدى الطويل على المدى القصير ثقافة الاختبارات لمدة تصل إلى حوالي 24 ساعة. أولاً، تحتوي وسائل الإعلام شنايدر، التي تم تطويرها لصيانة خلايا زراعة الأنسجة Drosophila، على مصادر الطاقة المتاحة بسهولة وتم تحسينها للحفاظ على درجة الحموضة الفسيولوجية في الهواء الجوي. ثانياً، يسمح الغشاء القابل للنفاذ بالغاز المستخدم في تركيب الخصية بتبادل الغاز السريع. ميزة هامة للثقافة على المدى الطويل هو أنه إذا لم يتم العثور على الخلايا في المرحلة المرجوة من التنمية أو meiosis مباشرة بعد إعداد العينة ، يمكن تخزين العينة وصورتها مرة أخرى في وقت لاحق. لقد تحققنا من أن الخصيتين التي تم الحفاظ عليها في حاضنة 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، لما مجموعه 16-24 ساعة ، قابلة للتطبيق وتبدو صحية استنادًا إلى الوجود الروتيني للخلايا التي تخضع بنشاط للmeiosis وتتقدم خلال مراحل لاحقة من تمايز الحيوانات المنوية. ومع ذلك ، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند زراعة الخصية لفترة أطول من 2-3 ساعات لضمان عدم تأثر فسيولوجيا الأنسجة سلبًا. الأهم من ذلك، تستمر الخصيتين في النمو في الثقافة مع تكاثر الخلايا وإطالة الحيوانات المنوية الناضجة. وهذا قد يسبب الخصيين لتكبير لدرجة أنها انفجرت بسبب المساحة التقييدية بين الغشاء وغطاء، مما يجعل الخصيين غير مناسبة للتصوير الحي لأسباب موضحة أدناه. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان الثقافات طويلة الأجل يجب أن تستخدم بشكل روتيني في التجارب ، فمن المستحسن اختبار ما إذا كانت ظروف الثقافة الموسعة الخاصة بالمختبر تؤدي إلى تشوهات meiotic مثل المدد الميوتيكية المطولة أو زيادة ترددات الكروموسومات المتخلفة أو فشل الخلايا.

من أجل تصوير الخلايا الفردية على مدى دورات زمنية طويلة ، من المهم أن الخلايا لا تتحرك بشكل كبير بمجرد أن تكون الخصيتين المعدة على مرحلة المجهر. وبالتالي ، من الضروري عند تنفيذ البروتوكول أن تظل الخصيات سليمة وغير تالفة ، لأن الخلايا تتسرب من الخصيات التالفة وجميع الخلايا داخل الجهاز تتحرك نتيجة لذلك (انظر الشكل 5 والفيديو 2). قد يكون لا يزال من الممكن صورة الحيوانات المنوية في الخصيتين التالفة إذا استقرت الخلايا في نهاية المطاف وتتوقف عن التحرك ، على الرغم من أنه بحلول الوقت الذي يحدث فيه هذا قد حدثت بالفعل مراحل meiosis التي ينوي المرء تحليلها. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن خصم آثار تلف الأنسجة على عملية تقسيم الخلايا نفسها. يمكن أن يحدث تلف الخصيتان عند إزالة الأجسام الدهنية بعد إزالة الخصيتان من اليرقات. ولذلك يجب توخي الحذر الشديد لتجنب ثقب أو التجاذبات على الأجهزة خلال هذه الخطوة من البروتوكول. في الواقع ، فإنه غالبا ما لا يكون من الضروري إزالة الكثير من الهيئات الدهنية ، طالما أنها لا تحجب التصور من الخصية. أكثر شيوعا، الضرر الخصية هو نتيجة لإزالة الكثير من ثقافة المتوسطة بعد وضع الغطاء أثناء إجراء تركيب للتصوير الحي (الخطوة 3.6). كما تتم إزالة المتوسطة، وcoverslip يقع أقل ويمارس الضغط على الخصية، والضغط الزائد سوف يسبب الخصيات لتمزق. وهكذا ، في حين أنه من المهم لcoverslip أن تكون قريبة قدر الإمكان من الخصيتين لتسهيل التصوير الأمثل للخلايا المنوية ، وبعض الممارسات ضرورية لتجنب إزالة الكثير من المتوسطة وخفض الغطاء بعيدا جدا. ومن المفيد أيضا أن نشير إلى أنه بالنسبة لبعض التطبيقات، مثل التعرض الحاد للخلايا المنوية للأدوية أو جزيئات صغيرة أخرى، يمكن أن يكون من المفيد تعطيل الخصيتين وتفريق الخراجات من الخلايا المنوية للتحليل. العديد من البروتوكولات الممتازة المتاحة لإعداد وثقافة الخراجات المنوية مشتتة18،25.

اعتبار مهم عند استخدام الخلايا المنوية لتحليل انقسام الخلايا هو أن هذه الخلايا تنفيذ meiotic بدلا من الانقسامات mitotic. الأهم من ذلك، العديد من الجوانب الأساسية للميكانيكا انقسام الخلية، مثل العمارة المغزل والسيتوكينيز، متشابهة بين meiosis الذكور وmitosis6. وهكذا، يمكن أن تكون الأفكار الميكانيكية التي تم جمعها من دراسة meiosis الحيوانات المنوية الخلايا المنوية قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الآليات العامة لتقسيم الخلايا الحيوانية7. ومع ذلك ، اعتمادا على الأسئلة الميكانيكية التي يجري تناولها ، قد تحتاج الاختلافات الهامة بين خلايا الحيوانات المنوية والخلايا الميتومية في عمليات مثل ديناميات الكروموسومات وتنظيم دورة الخلية إلى اعتبار26. في الوقت نفسه، تقدم الخلايا المنوية Drosophila فرصة فريدة لمقارنة الخلايا الميتوكتيك وميوتيك داخل نفس النسيج ونسب الجراثيم. على سبيل المثال ، يمكن استخدام نفس إعداد الخصية لتحليل الخلايا الجذعية الجرثومية أو الحيوانات المنوية التي تخضع للتقان وخلايا الحيوانات المنوية التي تخضع للداء المَيَوَيَق. نحن عادة لا نحاول صورة الخلية الجذعية الجرثومية أو mitoses الحيوانات المنوية في الاستعدادات الخصية الحية لأن توقيت هذه الانقسامات من الصعب التنبؤ بها. ومع ذلك ، فقد التقطنا هذه الانقسامات بشكل واضح في تجاربنا ، مما يدل على أن البروتوكول العام يمكن تطبيقه على تحليل الخلايا الميتوتية داخل الخصيتين أيضًا.

تركز المنهجية المقدمة على إعداد الخصية للتصوير الحي لداء الحيوانات المنوية، لأن هذا يسمح بتحليل الديناميات الخلوية والجزيئية في الوقت الحقيقي. كما نقدم طريقة لتثبيت وتلطيخ المناعة للاختبارات السليمة ، حيث قد يكون هذا النهج أفضل إذا لم تكن بنيات التعبير المسماة بالفلورسنت مطلوبة متوفرة أو لتجنب الآثار المربكة للتعبير المفرط للبروتين. اعتبار مهم على الرغم من أن التثبيت لا يحافظ دائما بإخلاص الأنسجة الأصلية والهندسة المعمارية الخلوية. على سبيل المثال، وجدنا نحن وآخرون أن التثبيت غالباً ما يؤدي إلى تجزئة أو تعطيل ER11،27. يمكن تخفيف بعض هذه المشاكل باستخدام مثبتات مختلفة أو طرق إعداد الأنسجة، وبالتالي قد يكون من الضروري استكشاف بعض الأخطاء وإصلاحها لتحديد بروتوكول التثبيت الأمثل للحفاظ على مكون خلية معينة أو منظمة بروتين. لحسن الحظ، وهناك عدد من البروتوكولات الإضافية لتثبيت الحيوانات المنوية Drosophila متوفرة أيضا18،28،29.

في الختام ، لقد وصفنا طرقًا متعددة الاستخدامات لإعداد الخصيتين Drosophila لتحليل الخلايا الحية والثابتة لداء الحيوانات المنوية. وتشمل نقاط القوة المحددة لهذا النهج التجريبي تحليل انقسام الخلايا في الأنسجة السليمة، والتصوير عالية الدقة للخلايا الكبيرة، والتكامل مع الأدوات الوراثية Drosophila. التجارب التي تستخدم المنهجية لديها القدرة على تقديم مساهمات هامة لفهمنا لكيفية تكامل انقسام الخلايا مع الآليات المعقدة لتطوير الأنسجة والتوازن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع بدء الأموال لJ.T.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
  2. Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
  3. Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
  4. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
  5. Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
  6. Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
  7. Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
  8. Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
  9. Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
  10. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
  11. Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
  12. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
  13. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
  14. Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
  15. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
  16. Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
  17. Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
  18. Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
  19. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  20. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  21. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
  22. Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
  23. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  24. Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
  25. Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
  26. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
  27. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
  29. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 159، دروسوفيلا،الحيوانات المنوية، الخصية، الانقسام، المقوسة، انقسام الخلايا، microtubule، المغزل، الإندوبلازم reticulum
إعداد <em>دروسوفيلا</em> رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karabasheva, D., Smyth, J. T.… More

Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter