Summary
이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
세포 분열이 발달, 조직 항상성 및 질병 과정과 어떻게 통합되는지에 대한 우리의 이해에 필수적입니다. (1) 정자를 포함하는 전체 Drosophila 고환은 현미경 검사법을 위해 준비하기 가 상대적으로 쉽기 때문에, (2) 정자 세포의 큰 크기는 고해상도 화상 진찰을 위해 그(것)들을 잘 적색하고, (3) 강력한 Drosophila 유전 공구는 생체 내 분석과 통합될 수 있기 때문에 만연증을 겪고 있는 혈소판 세포는 이 분석을 위해 이상적입니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 제 3 instar 애벌레 및 초기 pupae에서 전체 고환의 준비를 위한 쉽게 접근가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 준비된 전체 고환에 있는 meiotic 정자 를 확인하는 방법과 시간 경과 현미경 검사법에 의해 그(것)들을 사는 심상하는 방법을 기술합니다. 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜도 제공됩니다. 애벌레 고환의 사용은 정자 세포 분석을 위해 성인 고환을 사용하는 사용 가능한 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 것은, 애벌레 고환은 성인 고환 보다는 세포로 더 작고 적게 혼잡하고, 이것은 크게 정액 세포의 고해상도 화상 진찰을 촉진합니다. 이러한 장점과 프로토콜의 적용을 입증하기 위해, 우리는 시간 경과 공초점 현미경검사법에 의해 이미지된 단일 정자 세포에서 세포 분열 동안 스핀들 미세소관에 대하여 소포체의 재분배를 보여주는 결과를 제시한다. 프로토콜은 형광 태그 단백질 또는 세포 기관 마커의 수의 발현과 결합 될 수있다, 유전자 돌연변이 및 기타 유전 도구뿐만 아니라, 전체 조직과 장기의 생리적 맥락에서 세포 분열 메커니즘의 분석을 위해이 접근 방식을 특히 강력.
Introduction
세포 분열은 배양1에서자란 세포주를 사용하여 종종 연구된다. 우리는 이 연구 결과2에서근본적인 기계장치의 귀중한 통찰력 그리고 이해의 재산을 얻고 있는 동안, 배양에서 성장한 세포는 온전하고 살아있는 조직에서 생기는 세포 분열의 생리학을 완전히 되풀이할 수 없습니다. 예를 들어, 손상되지 않은 조직 및 장기에서 세포는 자손 세포가 조직 내에 적절하게 위치할 수 있도록 적절한 장소와 적절한 시기에 분할하여 적절한 분화 또는 기능적 프로그램을 겪을 수 있도록 하고 세포 증식이 조직 성장 또는 항상성과 적절하게 조정되도록 해야 합니다3. 한편, 배양에서 성장한 세포의 경우, 세포 분열은 일반적으로 배양 배지4의성장 인자에 의해 조절되며, 따라서 우리는 이러한 세포로부터 조직 구조 또는 발달 신호전달과 같은 환경적 요인이 분열 과정에 어떻게 영향을 미치는지 배울 수 없다. HeLa 및 U2OS 세포와 같은 세포 분열을 연구하는 데 사용되는 많은 세포주가 전이성 종양5에서유래되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 이러한 암세포의 기본 생리학의 많은 양상, 예: 세포 주기 조절 기전 및 염색체 안정성은 건강한 세포에 비해 변경되었을 가능성이 있다. 세포 분열 생리학의 완전한 이해는, 그러므로, 생리적인 규정 기계장치 및 조직 건축을 보존하는 그들의 네이티브, 생체 내 환경에서 분할 세포를 공부하는 우리의 기능에 달려 있습니다.
세포 분열이 손상되지 않은 조직 및 기관 내에서 어떻게 작동하는지 이해하는 발전은 생체 내 또는 생체 내 분석에 내재된 어려움에 의해 방해받습니다. 첫째, 큰 기관 또는 두꺼운 조직 내의 현미경 분석을 위해 분할 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있습니다. 둘째, 개별 세포가 생체 내에서 분할 될 때 예측하는 것은 종종 어렵습니다. 셋째, 조직 생리학은 생체 배양 동안 급속히 악화될 수 있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 완전히 온전한 고환 내의 meiotic 세포 분열을 겪을 때 Drosophila melanogaster 정액 세포의 살아있는 및 고정된 분석을 위한 쉽게 접근가능한 방법을 기술합니다. 이 세포는 공초점 현미경 검사법과 같은 표준 광학 방법으로 쉽게 접근할 수 있기 때문에 생체 내 생체 분석에 이상적이며, 예측 가능한 시간과 위치에서 분할되며, 손상되지 않은 고환은 최대 약 24 시간 동안 생체 배양에서 유지될 수 있습니다. 또한, Drosophila 정자 세포는 큰 둥근 세포 (약 20-30 μm 직경) 그들은 분할 할 때 모양을 변경하지 않습니다, 스핀들 장치 및 세포질 세포기관과 같은 세포 구성 요소의 고해상도, 시간 경과 이미징에 이상적이다. 이 세포는 유사분열과 반대로 만피증을 겪더라도, 많은 필수 세포 분열 프로세스는 이 2개의 세포 분열 기계장치6사이에서 아주 유사합니다. 이러한 장점은, 강력한 Drosophila 유전 도구와 결합, 스피들 형성 및 조절, 사이토 카인시스, 및 소기관 리모델링 및 분할7,8,8,9,,10,,11을포함하여 필수 세포 분열 과정의 생체 분석을 위해 광범위하게 사용되는 모델로 Drosophila 정자 세포를 만들었습니다.
정자 세포는 정자 발생의 meiotic 단계에 있는 세포입니다. Drosophila에서정자 발생은 고환12,,13의한 극에서 작은 영역 또는 "허브"에 위치한 생식선 줄기 세포의 그룹으로 시작됩니다. 이 세포는 비대칭 유사분열에 의해 분할되고, 단 하나 분화한 정자를 초래합니다. Spermatogonia는 그 때 단 하나 낭종 내의 밀접하게 연관된 남아 있는 16의 세포의 단을 생성하기 위하여 4개의 동기 미토를 겪습니다. 이 단계에서, 세포는 meiotic 세포 주기에 유사분열에서 전이하고 정액 세포로 불립니다. 정자 세포는 세포 주기의 확장된 G2 단계에서 약 2~3일을 소비하며, 이 기간 동안 극적으로 성장하고 두 가지 메소다 분열 및 후속 정자 발생에 대비하여 세포학적 변화를 겪는다13,,14. 단일 낭종 내의 16 정자 세포의 전체 그룹은 동시에 첫 번째 meiotic 분열을 입력합니다. 따라서, 몇몇 meiotic 정자 는 세포 분열을 통해서 진행하는 때 동시에 심상될 수 있습니다. 첫번째 meiotic 분할은 대략 1.5 시간 동안 진행하고 성숙한 정자로 분화하기 위하여 계속하는 64의 총 정자를 산출하는 두 번째 meiotic 분할에 의해 거의 즉시 따릅니다.
살아있는 세포 분열을 연구하기 위하여 정액 세포를 사용하는 유일한 이점은, 온전한 조직은 세포의 단 또는 낭종이 정액 발생의 다른 단계를 통해 지속적으로 점진하고, 정액 발생의 모든 단계에서 세포는 일반적으로 어떤 주어진 된 고환에서 확인될 수 있습니다 (그림 3A참조). 따라서 전체 고환에서 meiotic 세포를 찾는 것이 비교적 쉽습니다. 우리는 일반적으로 이 세포가 고해상도 화상 진찰에 훨씬 더 크고 더 순종하기 때문에 두 번째 만두와 반대로 첫번째에 우리의 분석을 집중합니다, 그러나 두 meiotic 분할을 포괄하는 전체 프로세스는 성공적으로 심상될 수 있습니다. 또한 고환 제제 및 배양을 위한 일반적인 프로토콜은 정자 의전증으로 성숙함에 따라 발생하는 초기 유사분열 줄기 세포 또는 정자 분열 또는 세포학적 변화와 같은 정자 발생의 다른 과정을 분석하는데 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다15. 정자 발생의 이러한 측면의 대부분은 매우 초파리와 인간 사이에 보존16.
초파리 정자세포는 초파리 발달13의세 번째 유충 단계에서 정자 발생의 메소형성 단계에 도달하기 시작한다. 따라서, 세 번째 instar 애벌레로 시작하고 pupae 및 성인을 포함하여 수명 주기 단계에서 격리된 고환은 정자 세포의 분할 분석용으로 사용될 수 있습니다. 몇 가지 우수한 프로토콜은 정자 발생의 라이브 및 고정 분석을위한 성인 남성 파리에서 고환의 추출을 위해 사용할 수 있습니다17,,18,,19. 이 프로토콜은 정자 발생의 후기 단계를 공부하기 위해 바람직할 지도 모릅니다 또는 성인에서만 보이는 유전 마커가 이용되어야 하는 경우에. 이 프로토콜은 이 단계에서 고환이 고해상도, 시간 경과 현미경 검사법에 의하여 세포 분열 분석에 특히 관련되는 몇몇 이점이 있기 때문에, 애벌레와 초기 pupae에서 고환 준비에 대신 집중합니다. 첫째, 애벌레와 번데기의 고환은 성인보다 작고 장기 내의 세포는 덜 혼잡합니다. 이 때문에, 분할 정자 세포는 종종 빛 산란 조직의 여러 층을 통해 침투 할 필요없이, 애벌레 고환의 외부 표면 근처에 이미지 화 될 수있다. 둘째, 성인 고환은 연결된 부속 기관의 수축으로 인해 리드미컬하게 움직이며, 이러한 움직임은 개별 세포의 시간 경과 이미징을 어렵게 만듭니다. 셋째, 애벌레 고환은 pupal 또는 성인 치사성을 일으키는 유전자 돌연변이를 연구할 때 유리합니다. 우리의 방법은 현미경 단계에 고환의 장기 문화를 위해 최적화되어, 동일한 준비에 있는 정액 발생의 다중 단계를 통해 세포 분열의 다중 라운드 또는 개별 세포의 진행의 화상 진찰을 허용합니다. 우리는 또한 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜을 기술합니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜은 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 공부에 관심이 있는 사람들을 위해 특히 유용하고, 고도로 견인성 Drosophila 유전 공구와 정액 세포 분석을 결합하는 기능은 이것을 특히 강력한 접근하게 합니다.
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Protocol
1. 해부를 위한 동물, 도구 및 미디어 준비
- 수컷과 암컷이 날아다니는 것을 교차하여 원하는 유전자형의 자손을 얻습니다. meiotic spermatocytes의 확인 및 발판을 위한 유용한 형질전환 마커는 meiotic 스핀들 및 RFP-히스톤 2A를 표지하는 GFP-tubulin을 포함합니다8. 십자가 당 5 ~10 암컷을 사용하고 세 번째 instar 애벌레가 바이알의 측면을 크롤링 시작할 때까지 25 °C 인큐베이터에서 바이알에 표준 플라이 푸드에 십자가를 유지 (4-5 일). 일찍 흰 새끼가 하루 후에 형성되기 시작합니다.
- 미세 한 팁 으로 직선 집게 두 쌍을 가져옵니다. 팁이 날카로운지, 심지어 길이가 길고, 곧게 펴야합니다(그림 1A). 이러한 포셉은 해부용으로만 사용하며 사용하지 않을 때는 10 μL 파이펫 팁이 있는 캡을 사용하십시오.
-
메스 도구를 준비합니다.
- 검은 색 양극 산화 강철 곤충 핀의 무딘 끝을 핀 홀더에 넣고 홀더의 나사를 비틀어 핀을 제자리에 고정시다. 한 쌍의 집게와 해부 현미경 으로, 중간에 곤충 핀을 잡고 135 °(그림 1B)의내부 각도를 형성하기 위해 구부립니다. 날카로운 끝은 조직을 절단하기위한 것이고 가장자리는 매체 방울 사이에 고환을 전달하는 데 사용됩니다.
- 사용하지 않을 때는 1,000 μL 파이펫 팁이 있는 캡.
- 조직 배양 후드에서 작업하고, 슈나이더 의 배지의 5 mL aliquots를 준비하고 사용 시점까지 4 °C에서 저장한다. 해부를 시작할 준비가 되면 실온으로 5 mL 미디어 aliquot를 따뜻하게 하십시오. 그런 다음 온난해부를 10 mL 주사기로 옮기고 0.22 μm 주사기 필터를 부착한다.
2. 애벌레와 초기 pupae에서 고환의 해부
- 용지 채워진 필터 주사기를 사용하여 유리 슬라이드의 위, 중간 및 하단에 3 방울의 용지(각각 50 μL)를 배출합니다.
- 해부 프로브를 사용하여 5-10번째 instar 애벌레 또는 초기 번데기(여전히 흰색 또는 노란색인 번데기)를 상부 드롭으로 옮니다. 해부 프로브로 매질 제거 프로브로 매개체에서 애벌레와 번데기를 부드럽게 교반하여 음식이나 이물질을 제거합니다.
- 해부 현미경의 밑에, 바디의 후방 3에 있는 타원형 모양 반투명 구조물로 나타나는 존재하는 경우에 두 양측 고환을 확인하기 위하여 해부 탐사기로 그것의 측에 단 하나 애벌레 또는 pupa를 돌립니다(그림 2A, B). 고환이 없는 동물은 암컷이며 버려야 합니다.
- 수컷 유충이나 강아지가 발견되고 깨끗하면 두 번째 미디어 드롭으로 옮기입니다. 3 또는 4 마리의 수컷 애벌레 및/또는 번데기가 두 번째 매체 로 옮겨질 때까지 반복합니다.
- 매체의 두 번째 방울에서 작업, 그것의 중간 지역에 집게의 쌍으로 단일 남성 애벌레 또는 강아지를 잡아, 고환에 단지 앞쪽. 두 번째 집게를 사용하여 동물을 반으로 부드럽게 찢습니다.
- 포셉 한 쌍으로 유리 슬라이드에 애벌레 또는 강아지의 후방 끝을 잡고. 집게 바로 옆에서 시작하여 메스 도구의 가장자리를 사용하여 표피를 아래로 밀고 메스를 동물의 절단 끝쪽으로 이동합니다. 이것은 동물의 내부 장기를 추방 합니다., 용기를 포함 하는, 뚱뚱한 시체, 그리고 고환.
- 부드럽게 장기의 나머지 부분에서 고환을 떨어져 애타게. 고환은 지방 체의 리본에 내장 된 명확한 타원형 모양의 기관입니다(그림 2C).
- 고환을 한 번에 하나씩 미디어 의 세 번째 드롭으로 전송합니다. 이를 위해 지방 체 아래에 메스 의 가장자리를 삽입하고, 미디어를 들어 올리고, 신속하게 세 번째 방울로 이동하십시오.
- 대안적으로, 고환에 아직 부착된 지방체가 충분하지 않은 경우 조직을 성공적으로 들어올리려면, 해부매체로 미리 습적인 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 옮김을 전달한다.
- 메스 도구의 날카로운 끝을 사용하여 고환에서 과도한 지방 체체를 부드럽게 슬라이스하여 가장자리 주위에 지방 체의 작은 테두리만 남습니다(그림 2C). 그것은 지방 시체를 모두 제거 할 필요가 없습니다, 그렇게하려고하면 가능성이 손상 또는 고환의 파열귀착될 것입니다.
- 유리 슬라이드의 모든 수컷 애벌레에 대해 위의 단계를 반복합니다.
- 3단계 또는 5단계로 진행합니다.
3. 살아있는 현미경 화상 진찰을 위한 장착 고환
참고: 이 장착 절차는 Drosophila 애벌레 뇌 신경 아세포20의화상 진찰을 위한 최근에 간행된 프로토콜에서 적응되었습니다. 추가 세부 정보는 이 참조에서 찾을 수 있습니다.
- 필터 주사기를 사용하여 슈나이더 의 배지 한 방울(약 30 μL)을 50mm 가스 투과성 배양 접시의 중앙에 증착합니다.
- 미리 습윤 된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 준비된 고환을 가스 투과성 접시의 드롭으로 옮김하십시오. 고환은 일반적으로 낙하의 표면에 떠있을 것입니다.
- 메스 도구를 사용하여 고환을 가스 투과성 멤브레인에 부드럽게 밀어 넣습니다. 메스의 날카로운 점으로 가스 투과 성 멤브레인이 파열되지 않도록주의하십시오. 모든 고환을 드롭의 중앙으로 밀어 넣습니다.
- 할로카본 오일로 채워진 1mL 주사기를 사용하여 가스 투과성 멤브레인에 각각 약 30 μL의 오일 4방울을 만듭니다. 22mm 유리 커버슬립의 네 모서리에 해당하도록 고환을 포함하는 매체 의 방울 주위에 오일 방울을 공간.
- 22mm 유리 커버슬립의 모서리에 4방울의 할로카본 오일을 넣고 커버슬립을 용지와 오일에 부드럽게 낮춥시다. 커버슬립이 가라앉고 고환이 들어있는 매체가 오일 방울 사이에 퍼지도록 하십시오.
- 커버슬립이 고환의 표면에 가라앉을 수 있도록 여분의 용지를 제거합니다. 해부 현미경으로 고환을 관찰하는 동안, 작은 양의 액체를 심지 위해 커버 슬립 아래의 매체에 섬세한 작업의 모서리를 닦아 넣습니다. 유리 커버 슬립이 가장 큰 고환의 표면과 접촉 할 때까지 충분한 용지를 지두하십시오. 너무 많은 매체를 제거하고 커버슬립을 너무 멀리 낮추지 않는 것이 중요합니다. Figure 5
4. Meiotic 정자 세포의 살아있는 화상 진찰
참고: 정자 세포는 레이저 스캐닝 또는 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 이미지 화 될 수있다. 시스템은 형광 성 단백질의 광 표백 이나 조직의 광 손상을 피하기 위해 적절 한 속도 및 감도 있어야 합니다.
- 고환 바로 위의 유리 커버 슬립에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 접시를 뒤집어 현미경 단계에 놓고 현미경 목표 (40 x 또는 60x)를 고환 바로 아래에 놓을 때까지 오일로 옮니다. 투과된 빛을 사용하여 단일 고환을 찾아 초점을 맞춥니다.
- 공초점으로 빠른 이미지를 캡처하는 동안 고환을 이동하여 세포의 구성을 검사합니다. 고환의 한쪽 끝에는 작고 조밀하게 포장 된 세포가 많이 있습니다. 이 끝에는 생식줄기세포와 정자가 포함됩니다. 기관의 다른 쪽 끝으로 이동, 이산 클러스터 또는 낭종으로 조직 점진적으로 더 큰 세포를 식별. 이들 큰 세포는 정자 세포이다(도3A).
- GFP-tubulin을 화상 진찰하는 경우에, 세포의 피질에 있는 2개의 밝은 microtubule asters (즉, centrosomes)의 존재에 의해 30-60 분 안에 만이제이오즘을 개시할 정액세포를 확인합니다(그림 3B, C).
- meiotic 정자 세포의 낭종이 확인되면, 시간이 지남에 따라 이미지의 z 스택을 캡처하기 위해 수집 매개 변수를 설정합니다. 전형적으로, z 차원에서 떨어져 1.5 μm 간격으로 15-20개의 심상을 취득하는 것은 동일 낭종 내의 몇몇 정자 세포의 전체 부피를 포착하기에 충분하다.
- 전체 z-스택 을 취득 2 분 전체 첫 번째 meiotic 부문을 이미징 하는 경우, 약 소요 1.5 시간. 특히 특정 한 사건만 분석할 경우 더 빠른 획득 률을 사용할 수 있습니다. 그러나 레이저 여기시 샘플의 반복노출로 인해 광표백이나 광손상이 발생하지 않도록 주의하십시오.
- 연속자동 초점 제어 시스템을 사용하여 오랜 기간 동안 초점 드리프트를 방지합니다. 현미경 단계에서 시료의 온도 조절은 일반적으로 약 22-23 °C의 실온을 가정할 때 필요하지 않습니다. 온도 조절이 가능한 경우 현미경 스테이지에서 시료를 25°C로 유지합니다.
- meiotic 정자세포가 발견되지 않는 경우에, 25°C 인큐베이터및 심상에 몇 시간 또는 밤새 동안 견본을 저장합니다.
5. 고정 및 면역 염색
- 위의 단계 2.10에서, PBSTx에서 8 % 파라 포름 알데히드의 0.5 mL을 포함하는 9 웰 유리 해부 접시에 잘 고환을 전송하기 위해 유리 파스퇴르 파이펫을 사용합니다 (0.3 % 트리톤 X-100와 인산 완충 식염수). 고환이 접시의 바닥에 누워 있는지 확인하십시오.
참고: 파라 포름 알데히드는 독성이 있으며 연기 후드에 장갑으로 처리해야합니다. - 실온에서 20 분 동안 고환을 고정하십시오.
- 고환을 0.5 mL PBSTx를 함유한 우물로 옮기고 부드러운 교반으로 5분 동안 세척합니다. 신선한 PBSTx로 새 우물에서 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 1차 항체를 1.5 mL 미세원원지 튜브에서 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 0.5 mL PBSTx에서 원하는 농도로 희석한다. 희석된 1차 항체의 튜브로 9웰 유리 해부 접시에서 고환을 옮기고 부드러운 흔들림 또는 영양분으로 4°C에서 밤새 배양한다.
- 고환을 PBSTx 0.5 mL로 9웰 유리 해부 접시에 5분 동안 세척합니다. 신선한 PBSTx로 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 5% BSA를 함유하는 PBSTx의 250 μL에서 이차 항체를 희석하고 9웰 유리 해부 접시의 깨끗한 우물로 분배합니다. 원하는 경우 DNA 얼룩에 DAPI를 추가합니다. 고환을 이차 항체를 함유하고, 플라스틱 랩으로 덮고, 실온에서 4 시간 동안 부드러운 교반으로 어둠 속에서 배양하십시오.
- 고환을 0.5 mL의 PBSTx로 채워진 깨끗한 우물로 옮기고, 신선한 PBSTx로 5분 동안 두 번, 30분 동안 세 번째로 씻어줍니다.
6. 고정 고환 장착
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 마지막 세척에서 유리 현미경 슬라이드로 고환을 옮김. 필요한 경우 메스 도구의 가장자리를 사용하여 고환을 슬라이드 표면으로 밀어 넣습니다.
- 고환에서 여분의 액체를 심지 섬세한 작업 닦아의 모서리를 사용합니다. 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오.
- 고환에 현미경 장착 매체의 30-50 μL 드롭을 적용하십시오.
- 22mm 커버슬립을 장착 매체의 드롭에 놓고 커버슬립이 가라앉고 장착 매체가 커버슬립 아래에 퍼질 수 있도록 합니다. 필요한 경우 커버슬립에 부드러운 압력을 가하여 과도한 장착 매체를 짜내고 커버슬립이 고환 표면에 놓이도록 하십시오.
- 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉하십시오.
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Representative Results
이 프로토콜이 성공적으로 실행되면, 고환은 공초점 현미경 검사법 또는 그밖 형광 현미경 방법에 의하여 화상 진찰을 위해 완전히 손상되지 않을 것입니다. 그림 3A에서볼 수 있듯이, 고환의 세포 조직이 보존되고, 정자 세포, 및 haploid 정자를 포함하여 다른 고환의 한쪽 끝에서 다른 세포 분화의 진행이 볼 수 있습니다. GFP-tubulin는 분할 정자 세포를 확인하고 만피증을 통해 세포의 진행의 살아있는 화상 진찰을 위한 유용한 마커입니다. 도 3B에도시된 바와 같이, 시작 된 만막증에 대한 정자 세포는 그들의 두 개의 눈에 띄는 미세 소관 아스터에 의해 식별 될 수있다. 메타페이즈에 의해 큰 meiotic 스핀들은 GFP-tubulin에 의해 아름답게 표지됩니다(그림 3C).
초파리 정자의 큰 크기와 이들의 상대적인 느린 진행은 세포 분열8,,11,,21동안 세포질 세포기관과 같은 세포 성분의 역학 및 재구성의 분석및 재구성에 이상적이다. 도 4 및 비디오 1은 자궁근막의 과정을 통해 미세소관에 대하여 소포체(ER)의 동적 재구성에 대한 실시간 이미징 분석을 보여준다. 위에서 설명한 바와 같이, 간막염이 발병하기 직전에, 세포의 피질에 위치한 2개의 중심체는 GFP-tubulin 형광에 의해 명확하게 보입니다. 이 단계에서, ER 표적 RFP (RFP-KDEL) 형광은 ER이 세포질 전체에 고르게 분포된다는 것을 밝힙니다. 그런 다음 중심도는 핵 봉투의 반대쪽으로 이동하여 두 개의 스핀들 기둥을 설정하기 시작합니다. 이 시간 도중, ER은 급속하게 중심도 미세소관의 주위에 축적하고 세포질의 나머지 부분에서 점진적으로 삭제됩니다. 핵 봉투 고장 (NEB)은 핵 지역 내의 GFP tubulin 형광의 출현에 의해 드러난다. Drosophila 세포는 반 개방 유사분열 또는 만두증으로 나뉘는데, 이는 핵 봉투 성분이 분해되어 분산되고 큰 세포질 분자가 핵 영역으로 진입한다는 것을 의미하지만, ER 유래 멤브레인의 봉투는 세포 분열22,,23,,24를통해 스핀들과 염색체를 둘러싸고 있습니다. NEB의 시간으로 및 메타페이즈를 통해서 점진하는, ER은 2개의 스핀들 극 심소체를 포위하는 천체 microtubules와 거의 완전히 연관됩니다. 이러한 두 개의 아스트랄 미세소관 축적은 ER의 축적후 아나페이즈 동안 두 딸 세포로 분할하고, 새로 형성된세포8,,11에의한 적절한 ER 상속을 보장한다.
그림 5는 정자 세포의 살아있는 화상 진찰에 고환 파열의 효력을 보여줍니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이, 장착 단계 동안 고환의 표면에 커버슬립을 너무 멀리 낮추지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다. 그림 5 및 비디오 2에서볼 수 있듯이, 정자 세포의 낭종은 파열 된 고환에서 빠르게 흘러 나오고, 세포의 이 움직임은 살아있는 시간 경과 이미징을 매우 어렵게 만듭니다.
그림 1: 성공적인 해부에 필요한 도구입니다. (A)해부에 사용되는 집게는 직선이어야 하며 날카롭고 끊어지지 않은 팁이 있어야 합니다(녹색 확인 표시로 표시). 그들은 애벌레를 잡고 떨어져 조직을 괴롭히는 효과가 있을 것입니다 으로 구부러지거나 깨진 팁 (빨간 X 마크)와 집게를 사용하지 마십시오. (B)메스 공구를 준비하려면 검은색 양극 산화 강철 곤충 핀을 약 135°의 내부 각도로 구부립니다. 날카로운 점은 조직을 절단하는 칼로 사용되며, 직선 가장자리는 조직을 이동하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 애벌레 와 푸팔 고환의 식별. (A)수컷과 암컷 애벌레의 이미지. 고환은 동물의 후방 세 번째 (화살촉)에서 원형 또는 타원형 반투명 구조로서 남성에서 식별 할 수 있습니다. 여성의 유사한 구조의 부족을 유의하십시오. (B)화살촉으로 표시된 두 개의 반투명 고환과 함께 초기 남성 강아지의 이미지. (C)해부 후 지방체가 부착된 고환. 왼쪽에 있는 두 고환은 아직도 멀리 손질될 필요가 있는 붙어 있는 과도한 뚱뚱한 바디가 있습니다. 오른쪽에 있는 두 고환은 제대로 그들의 뚱뚱한 바디의 손질되고 화상 진찰을 위한 준비되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성공적으로 준비된 고환에서 메소드 정자의 식별. (A)GFP-튜불린을 발현하는 성공적으로 준비된 살아있는 그대로의 고환의 공초점 이미지. 줄기 세포의 허브는 이 준비에서 식별할 수 없지만 고환의 아래쪽 끝을 향해 있습니다. 작은 정자의 몇몇 층은 표시되고, 이들은 정자 세포의 수많은 낭종에 선행됩니다. 첫번째 meiotic 분할에 있는 정액 세포의 낭종은 세포의 큰 크기 (직경에 있는 대략 20 - 30 μm) 및 GFP-tubulin의 존재에 근거를 둔 식별할 수 있습니다 meiotic 가시를 표시했습니다. 제2 meiotic 분단에 있는 정자 세포는 유사하게 스핀들을 가시합니다, 그러나 이 세포는 대략 반 크기 만이기 아저세포입니다. Meiotic 정자는 또한 볼 수 있습니다, 길쭉한 정자와 같이. (B)30 - 60 분 이내에 간피증을 시작할 정자 세포는 GFP-tubulin에 의해 표지된 그들의 2개의 크고, 아주 밝은 microtubule asters (화살표 헤드에 의해 표시)에 의해 확인될 수 있습니다. 전 meiotic 세포의 낭종은 파선 된 노란색 선으로 묘사됩니다. (C)감피증의 세포는 GFP-tubulin으로 쉽게 시각화되는 큰 meiotic 스핀들로 식별 할 수 있습니다. meiotic 세포의 낭종은 파선 된 노란색 선으로 묘사됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 정자 세포에서 만장폐증의 시간 경과 이미징. ER(RFP-KDEL)을 표적으로 하는 단일 정자 세포및 RFP를 동시 발현하는 것은 후두증의 과정을 통해 2분마다 영상화되었다. 표시는 남성 분열의 특정 단계에서 정자 세포의 대표적인 이미지, 늦은 중간에서 시작 하 고 말 단 말 단 면을 통해 진행. 시간은 몇 분 입니다. 각 이미지는 각 시점에서 획득한 15개의 광학 조각 스택에서 하나의 광학 평면입니다. 이 그림은 카라바세바와 Smyth, 20198에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 파열 전후의 고환의 대표적인 이미지. 왼쪽 에 있는 이미지, 레이블 "그대로", 파열 직전에 고환을 표현 하는 GFP-tubulin를 보여줍니다. 오른쪽 이미지는 파열 후 동일한 고환을 보여줍니다. 정자 세포의 낭종은 파열 된 고환에서 스트리밍 볼 수 있습니다. 화살촉은 meiotic 정자 세포의 낭종을 나타냅니다; 고환 파열 후에 이 정액 세포의 중요한 운동은, 시간이 지남에 따라 이 정액 세포를 화상 진찰을 극단적으로 도전합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 단일 정자 세포의 전체 meiotic 분할. 도 4에서정자세포를 발현하는 GFP-튜불린 및 RFP-KDEL의 풀타임 경과를 도시한다. 이미지는 2분마다 캡처되었으며 재생 속도는 초당 3프레임입니다. 이 비디오는 카라바세바와 Smyth, 20198에서수정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 파열된 고환. 파열 전후의 고환의 시간 경과. 파열은 고환의 왼쪽 아래 모서리를 통해 세포의 낭종의 갑작스런 스트리밍으로 인해 분명합니다. 이미지는 2분마다 캡처되었으며 재생 속도는 초당 3프레임입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 정액 세포 분열의 장기, 살아있는 화상 진찰을 위해 최적화된 애벌레 또는 초기 pupal Drosophila 고환의 준비를 위한 프로토콜을 기술했습니다. 이것은 손상되지 않은 조직의 생리적 맥락에서 세포 분열을 분석하기위한 강력한 방법입니다. 이 방법의 힘은 특정 유전자 돌연변이, 조직 특이적 RNAi 매개 억제 및 형광 표지된 단백질 및 세포기관 마커와 같은 Drosophila 유전 도구와 결합될 때 더욱 확장됩니다. 또한, 애벌레와 pupal 고환의 작은 크기, 유리 커버 슬립에 매우 가까운 분할 세포를 이미지 할 수있는 능력, 초고해상도 접근을 포함한 고해상도 이미징에 이상적인 방법을 합니다. 이 실험 시스템의 다양성은 세포 분열 동안 ER의 동적 재구성을 설명하는 대표적인 결과에 의해 입증된다. 초파리 정자 세포는 이러한 세포의 큰 크기와 상대적으로 느린 전달으로 인해 세포 분열 동안 세포 역학의 이러한 분석에 특히 유용합니다. 추가적으로, 동일 세포는 세포역학 역학 또는 세포 분열 기계장치에 있는 변경이 정액 발생의 후속 사건에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위하여 사후 meiotically 심상될 수 있습니다. 따라서, 조직 발달 및 세포 분화의 더 큰 맥락 내에서 세포 분열의 생리학을 이해하기 위한 이러한 실험적 접근법으로 큰 잠재력이 있는데, 이는 배양에서 성장한 세포를 연구할 때 달성할 수 없는 결과이다.
프로토콜은 최대 24시간 동안 고환의 장기 생체 배양을 용이하게 하는 여러 요소를 포함한다. 첫째, Drosophila 조직 배양 세포의 유지를 위해 개발 된 슈나이더의 매체는 쉽게 사용할 수있는 에너지 원을 포함하고 대기 공기에서 생리적 pH를 유지하도록 최적화되어 있습니다. 둘째, 장착 고환에 사용되는 가스 투과성 멤브레인은 신속한 가스 교환을 가능하게 합니다. 장기 배양의 중요한 장점은 세포가 원하는 발달 단계 또는 만피증이 시료 제조 직후에 발견되지 않으면 나중에 샘플을 다시 저장하고 이미지화 할 수 있다는 것입니다. 우리는 총 16-24 시간 동안 밤새 25 °C 인큐베이터에서 유지 된 고환이 생존 가능하고 적극적으로 감피증을 겪고 정자 분화의 나중 단계를 통해 진행되는 세포의 일상적인 존재에 따라 건강하게 나타난다는 것을 확인했습니다. 그러나, 조직 생리학이 부정적인 영향을 받지 않도록 2-3 시간 이상 고환을 배양 할 때 예방 조치를 취해야합니다. 가장 중요 한 것은, 고환 세포 증식 하 고 정자 를 성숙 으로 문화에서 성장을 계속 합니다. 이것은 그(것)들이 막과 덮개 슬립 사이 제한적인 공간으로 인해 파열하는 점에 고환이, 아래에 기술된 이유를 위해 살아있는 화상 진찰을 위해 부적당한 고환을 렌더링하는 점까지 확대하는 원인이 될 수 있습니다. 또한 장기 배양이 실험에서 일상적으로 사용되는 경우 실험실별 확장 배양 조건이 장기간 의 된 meiotic 기간 또는 지연 염색체 또는 사이토 카인증 실패의 증가 된 주파수와 같은 meiotic 이상을 초래하는지 여부를 테스트하는 것이 좋습니다.
긴 시간 과정을 통해 개별 세포를 심상하기 위하여는, 준비한 고환이 현미경 단계에 일단 세포가 현저하게 움직이지 않는 것이 중요합니다. 따라서, 고환이 손상되고 손상되지 않은 상태로 남아 있는 프로토콜을 실행하는 경우, 세포가 손상된 고환에서 유출되고 기관 내의 모든 세포가 결과적으로 이동하기 때문에 필수적이다(도 5 및 비디오 2참조). 세포가 결국 정착하고 이동을 중지하는 경우 손상된 고환에 있는 정액 세포를 심상하는 것이 아직도 가능할 지도 모릅니다, 그러나 이 것의 시간까지 이것은 분석하고자 하는 만인지의 단계가 이미 일어났을 지도 모릅니다. 또한, 세포 분열 과정 자체에 조직 손상의 효과 할인 될 수 없습니다. 고환에 손상은 유충에서 고환의 제거 다음 지방 시체를 제거 할 때 발생할 수 있습니다. 따라서 프로토콜의이 단계에서 장기를 관통하거나 잡아 당기는 것을 피하기 위해 세심한주의를 기울여야합니다. 사실, 고환의 시각화를 모호하게하지 않는 한 지방 체를 매우 많이 제거 할 필요가 없습니다. 보다 일반적으로, 고환 손상은 라이브 이미징을 위한 장착 절차 동안 커버슬립의 배치 후 너무 많은 배양 배지를 제거한 결과이다(단계 3.6). 매체가 제거되면 커버슬립이 낮아지고 고환에 압력이 가해지며 과도한 압력으로 인해 고환이 파열됩니다. 따라서, 정자 세포의 최적 화상 진찰을 촉진하기 위하여 표지 슬립이 고환에 가능한 한 가깝게 하는 것이 중요하지만, 몇몇 사례는 너무 많은 매체를 제거하고 커버슬립을 너무 멀리 낮추는 것을 피하기 위하여 필요합니다. 또한 약물이나 다른 작은 분자에 정자 세포의 급성 노출과 같은 일부 응용 프로그램의 경우 고환을 방해하고 분석을 위해 정자 세포의 낭종을 분산시키는 것이 유리할 수 있음을 지적하는 것이 도움이됩니다. 몇몇 우수한 프로토콜은 분산된 정자 낭종18,,25의제조 및 배양을 위해 유효하다.
세포 분열 분석을 위한 정자 세포를 사용할 때 중요한 고려 사항은 이 세포가 유사분열과 반대로 meiotic를 실행한다는 것입니다. 중요한 것은, 스핀들 구조 및 사이토카인시스와 같은 세포 분열 역학의 많은 필수적인 양상은, 남성 만기증과 유사분열 사이 유사합니다6. 따라서, 정자 간구 간이시증을 연구하여 수집한 기계적 통찰력은 동물 세포 분열7의일반적인 메커니즘에 광범위하게 적용될 수 있다. 그러나, 해결되는 기계론적 질문에 따라, 염색체 역학 및 세포 주기 규칙과 같은 프로세스에 있는 정자 세포와 유사분열 세포 사이 중요한 다름은26고려될필요가 있을 수 있습니다. 동시에, Drosophila 정자 세포는 동일한 조직 과 생식선 혈통 내의 유사체 및 meiotic 세포를 비교하는 유일한 기회를 제시합니다. 예를 들면, 동일 고환 준비는 memline 줄기 세포 또는 mitosis를 겪고 있는 정자 및 정자 세포가 만이제증을 겪고 분석하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리는 전형적으로 이 분열의 타이밍이 예측하기 어렵기 때문에 살아있는 고환 준비에 있는 생식줄기 세포 또는 정액 mitoses를 심상하는 것을 시도하지 않습니다. 그러나, 우리는 다행히 우리의 실험에서 이 분열을 붙잡습니다, 일반적인 프로토콜이 고환 내의 유사분열 세포의 분석에 또한 적용될 수 있다는 것을 보여주는.
제시된 방법론은 세포와 분자 역학의 실시간 분석을 허용하기 때문에 정자 간구 인막염의 살아있는 화상 진찰을 위한 고환 준비에 집중합니다. 우리는 또한 본래 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 방법을 제공하며, 이 접근법은 형광표지된 발현 구이스가 사용할 수 없거나 단백질 과발현의 혼란스러운 효과를 피하기 위해 필요한 경우에 바람직할 수 있다. 중요한 고려 사항은 고정이 항상 충실하게 기본 조직과 세포 아키텍처를 보존하지 않는다는 것입니다. 예를 들어, 우리와 다른 사람들은 고정이 종종 ER11,27의조각화 또는 중단을 초래한다는 것을 발견했습니다. 이러한 문제 중 일부는 상이한 고정제 또는 조직 제제 방법을 사용하여 완화될 수 있으며, 일부 트러블슈팅은 특정 세포 성분 또는 단백질 조직의 보존을 위한 최적의 고정 프로토콜을 식별하는 데 필요할 수 있습니다. 다행히도, Drosophila 정자 세포 고정에 대한 추가 프로토콜의 숫자는 또한 사용할 수 있습니다18,,28,,29.
결론적으로, 우리는 정자 간구 인감합의 살아있는 고정 세포 분석을위한 Drosophila 고환의 준비를위한 다양한 방법을 설명했습니다. 이 실험적인 접근의 특정 강점은 손상되지 않은 조직에 있는 세포 분열의 분석, 큰 세포의 고해상도 화상 진찰 및 Drosophila 유전 공구와의 통합을 포함합니다. 방법론을 사용하는 실험은 세포 분열이 조직 발달및 항상성의 복잡한 메커니즘과 어떻게 통합되는지에 대한 우리의 이해에 중요한 기여를 할 가능성이 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 J.T.S에 국방부 창업 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
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