Summary
Målet med denne protokol er at analysere celledeling i intakt væv ved levende og fast celle mikroskopi ved hjælp af Drosophila meiotiske spermatocytter. Protokollen viser, hvordan man isolere hele, intakte testikler fra Drosophila larver og tidlig pupper, og hvordan man behandler og montere dem til mikroskopi.
Abstract
Eksperimentel analyse af celler, der deler sig i levende, intaktvæv og organer er afgørende for vores forståelse af, hvordan celledeling integreres med udvikling, vævhomøostase, og sygdomsprocesser. Drosophila spermatocytter gennemgår meiose er ideelle til denne analyse, fordi (1) hele Drosophila testikler indeholdende spermatocytter er relativt nemme at forberede til mikroskopi, (2) spermatocytternes store størrelse gør dem velegnede til billeddannelse i høj opløsning, og (3) kraftige Drosophila genetiske værktøjer kan integreres med in vivo analyse. Her præsenterer vi en let tilgængelig protokol til fremstilling af hele testikler fra Drosophila tredje instar larver og tidlig pupper. Vi beskriver, hvordan man identificerer meiotiske spermatocytter i forberedte hele testikler, og hvordan man billede dem leve af time-lapse mikroskopi. Der findes også protokoller for fiksering og immunfarvning af hele testiklerne. Brugen af larve testikler har flere fordele i forhold til tilgængelige protokoller, der bruger voksne testikler til spermatocyt analyse. Vigtigst er det, larve testikler er mindre og mindre overfyldt med celler end voksne testikler, og dette i høj grad letter høj opløsning billeddannelse af spermatocytter. For at demonstrere disse fordele og anvendelsen af protokollerne præsenterer vi resultater, der viser omfordelingen af det endeoplasmiske reticulum med hensyn til spindelmikrotubuli under celledeling i en enkelt spermatocyt, der er afbildet ved time-lapse konfokal mikroskopi. Protokollerne kan kombineres med ekspression af et vilkårligt antal fluorescerende mærkede proteiner eller organelle markører samt genmutationer og andre genetiske værktøjer, hvilket gør denne fremgangsmåde særlig kraftfuld til analyse af celledelingsmekanismer i den fysiologiske kontekst af hele væv og organer.
Introduction
Celledeling studeres ofte ved hjælp af cellelinjer dyrket i kultur1. Mens vi har fået et væld af uvurderlig indsigt og forståelse af grundlæggende mekanismer fra disse undersøgelser2, celler dyrket i kultur kan ikke fuldt ud opsummere fysiologi celledeling, da det forekommer i intakt, levende væv. For eksempel, i intakt væv og organer, celler skal opdele på det rigtige sted og på det rigtige tidspunkt, således at afkom celler er korrekt placeret i vævet, så de kan gennemgå passende differentiering eller funktionelle programmer, og således at cellespredning er ordentligt koordineret med vævvækst eller homøostase3. For celler, der dyrkes i kultur på den anden side, er celledeling generelt reguleret af vækstfaktorer i kulturmediet4, og derfor kan vi ikke lære af disse celler, hvordan in vivo miljømæssige faktorer som vævsarkitektur eller udviklingssignalering påvirker delingsprocessen. Det er også vigtigt at bemærke, at mange af de cellelinjer, der anvendes til at studere celledeling, såsom HeLa og U2OS celler, var afledt af metastatiske tumorer5. Derfor, mange aspekter af den grundlæggende fysiologi af disse kræftceller, såsom cellecyklus regulerende mekanismer og kromosomale stabilitet, er sandsynligvis blevet ændret i forhold til raske celler. Fuldstændig forståelse af celledeling fysiologi, derfor afhænger af vores evne til at studere dividere celler i deres oprindelige, in vivo miljøer, der bevarer fysiologiske regulerende mekanismer og væv arkitektur.
Fremskridt med hensyn til at forstå, hvordan celledeling fungerer inden for intaktvæv og -organer, hæmmes af vanskeligheder, der er forbundet med in vivo- eller ex vivo-analyser. For det første kan det være vanskeligt eller umuligt at få adgang til deleceller til mikroskopisk analyse i store organer eller tykt væv. For det andet er det ofte vanskeligt at forudsige, hvornår de enkelte celler vil opdele in vivo. For det tredje kan vævsfysiologi hurtigt forværres under ex vivo kultur. I denne protokol beskriver vi let tilgængelige metoder til levende og fast analyse af Drosophila melanogaster spermatocytter, da de gennemgår meiotiske celledelinger inden for fuldt intakte testikler. Disse celler er ideelle til levende, ex vivo analyse, fordi de er let tilgængelige med standard optiske metoder såsom konfokal mikroskopi, de deler på forudsigelige tidspunkter og steder, og intakte testikler kan opretholdes i ex vivo kultur i op til omkring 24 timer. Desuden er Drosophila spermatocytter store runde celler (ca. 20-30 μm i diameter), der ikke ændrer form, når de deler sig, hvilket gør dem ideelle til høj opløsning, time-lapse billeddannelse af cellulære komponenter såsom spindelapparat og cytoplasmatiske organeller. Selv om disse celler gennemgår meiose i modsætning til mitose, mange af de væsentlige celledeling processer er meget ens mellem disse to celledeling mekanismer6. Disse fordele, kombineret med kraftfulde Drosophila genetiske værktøjer, har gjort Drosophila spermatocytter en flittigt anvendt model for ex vivo analyse af væsentlige celledeling processer, herunder spindel dannelse og regulering, cytokinese, og organelle remodeling og partitionering7,8,9,10,11.
Spermatocytter er celler, der er på det meiotiske stadium af spermatogenese. I Drosophilabegynder spermatogenese med en gruppe kønsceller , der er placeret i en lille region eller "hub" på en pæle af testiklerne12,13. Disse celler divideres med en asymmetrisk mitose, hvilket giver anledning til et enkelt differentieret spermatogonium. Spermatogonia derefter gennemgå fire synkrone midoser til at producere en gruppe på 16 celler, der forbliver tæt forbundet med en enkelt cyste. På dette stadium, cellerne overgangen fra en mitotic til en meiotisk celle cyklus og kaldes spermatocytter. Spermatocytter tilbringer omkring to til tre dage i en udvidet G2 fase af cellecyklussen, hvor de vokser dramatisk og undergår cytologiske ændringer i forberedelsen til de to meiotiske divisioner og efterfølgende spermiogenesis13,14. Hele gruppen af 16 spermatocytter inden for en enkelt cyste derefter indtaste den første meiotiske division på samme tid. Således kan flere meiotiske spermatocytter afbildes samtidigt, når de fortsætter gennem celledeling. Den første meiotiske division fortsætter i ca 1,5 timer og efterfølges næsten øjeblikkeligt af den anden meiotiske division, hvilket giver 64 samlede spermatids, der går på at differentiere i modne spermatozoer.
En unik fordel ved at bruge spermatocytter til at studere celledeling i levende, intakt væv er, at grupper eller cyster af celler konstant fremskridt gennem de forskellige stadier af spermatogenese, og celler på alle stadier af spermatogenesis kan normalt identificeres i en given testis (se figur 3A). Derfor er det relativt nemt at finde meiotiske celler i hele testikler. Vi fokuserer generelt vores analyser på den første i modsætning til anden meiose, fordi disse celler er meget større og mere modtagelige for billeddannelse i høj opløsning, men hele processen, der omfatter både meiotiske divisioner, kan afbildes med succes. Det skal også bemærkes, at den generelle protokol for testis forberedelse og kultur kan bruges til at analysere andre processer i spermatogenese samt, såsom den tidligere mitotiske stamceller eller spermatogonial divisioner eller cytologiske ændringer, der opstår som spermatids modnes til spermatozoa15. Mange af disse aspekter af spermatogenese er stærkt bevaret mellem Drosophila og mennesker16.
Drosophila spermatocytter begynder at nå den meiotiske fase af spermatogenesis under den tredje instar larve fase af Drosophila udvikling13. Derfor kan testikler, der er isoleret fra livscyklusstadier, der begynder med tredje instarlarver og indeholder pupper og voksne, anvendes til analyse af dividere sædceller. Flere fremragende protokoller er tilgængelige for udvinding af testikler fra voksne mandlige fluer til levende og fast analyse af spermatogenesis17,18,19. Disse protokoller kan være at foretrække for at studere sene stadier af spermatogenese, eller hvis genetiske markører, der kun er synlige hos voksne, skal anvendes. Protokollen fokuserer i stedet på testis præparat fra larver og tidlig pupper, fordi testiklerne på disse stadier har flere fordele, der er specifikt relevante for celledeling analyse ved høj opløsning, time-lapse mikroskopi. For det første er testiklerne fra larver og pupper mindre end fra voksne, og cellerne i orglet er mindre overfyldte. På grund af dette, dividere spermatocytter kan ofte afbildes nær den ydre overflade af larve testikler, uden at skulle trænge gennem flere lag af lys spredning væv. For det andet, voksne testikler bevæge sig rytmisk på grund af sammentrækninger af de vedhæftede tilbehør organer, og disse bevægelser gør time-lapse billeddannelse af de enkelte celler udfordrende. Og for det tredje, larve testikler er fordelagtige, når man studerer genmutationer, der forårsager pupal eller voksen dødelighed. Vores metoder er optimeret til langsigtet kultur af testikler på mikroskopstadiet, hvilket giver mulighed for billeddannelse af flere runder af celledeling eller progression af individuelle celler gennem flere stadier af spermatogenesis i samme præparat. Vi beskriver også en protokol for fiksering og immunfarvning af hele testikler. Samlet set vores protokoller er særligt nyttige for dem interesseret i at studere celledeling i intakt væv, og evnen til at kombinere spermatocyt analyse med meget tractable Drosophila genetiske værktøjer gør dette til en særlig kraftfuld tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered dyr, værktøjer og medier til dissektion
- Cross mandlige og kvindelige fluer for at opnå afkom af den ønskede genotype. Nyttige transgene markører til identifikation og iscenesættelse af meiotiske sædceller omfatter GFP-tubulin til mærkning af meiotiske spindel og RFP-histone 2A til mærkning af kromosomer8. Brug fem til ti hunner pr. kors og hold kors på standard fluemad i hætteglas i en 25 °C-inkubator, indtil tredje instarlarver begynder at kravle op langs siderne af hætteglasset (4-5 dage). Tidlig hvid pupper vil begynde at danne en dag senere.
- Få to par lige pincet med fine spidser. Sørg for, at spidserne er skarpe, selv i længden og lige (Figur 1A). Brug kun disse pincet til dissektioner, og dæk den med 10 μL pipettespidser, når de ikke er i brug.
-
Forbered en skalpel værktøj.
- Sæt den stumpe ende af en sort annodiseret stål insektstift i en stiftholder, og drej holderens skrue for at fastgøre stiften på plads. Brug et par pincet og under et dissekeret mikroskop, tag fat i insektstiften i midten og bøj den for at danne en indvendig vinkel på 135° (Figur 1B). Den skarpe ende er til at skære væv, mens kanten bruges til at overføre testikler mellem dråber af medier.
- Cap med en 1.000 μL pipettespids, når den ikke er i brug.
- Arbejde i en vævskultur hætte, forberede 5 ml aliquots af Schneiders medier og opbevares ved 4 °C indtil tidspunktet for brug. Når du er klar til at begynde dissektioner, varm en 5 ml medier aliquot til stuetemperatur. Overfør derefter de opvarmede dissektionsmedier til en 10 ml sprøjte, og fastgør et 0,22 μm sprøjtefilter.
2. Dissektion af testikler fra larver og tidlig pæle
- Brug den mediefyldte filtersprøjte til at udsende tre dråber medier (50 μL hver) øverst, midte og bunden af en glasrutsjebane.
- Brug en dissekering sonde til at overføre fem til ti tredje instar larver eller tidlig pupper (pupper, der stadig er hvide eller gule) til den øverste dråbe. Ryst forsigtigt larver og pupper i medierne med dissekeringssonden for at fjerne mad eller snavs.
- Under et dissekeret mikroskop drejes en enkelt larver eller pupper på siden med en dissekeringssonde for at identificere de to bilaterale testikler, hvis de findes, og som fremstår som ovale gennemskinnelige strukturer i den bageste tredjedel af kroppen (figur 2A, B). Dyr, der mangler testikler, er kvinder og bør kasseres.
- Når en mandlig larver eller pupper er fundet og er ren, flytte den til den anden dråbe af medier. Gentages indtil 3 eller 4 hanske larver og/eller pupper er blevet overført til den anden dråbe medier.
- Arbejde i den anden dråbe af medier, forstå en enkelt mandlig larver eller puppe med et par pincet på sin mid-region, bare anterior til testiklerne. Brug det andet par pincet til forsigtigt at rive dyret i halve.
- Hold den bageste ende af larven eller pupper ned på glasrutsjebanen med et par pincet. Starter lige ved siden af pincet, skubbe ned på neglebånd ved hjælp af kanten af skalpel værktøj og flytte skalpel mod den afskårne ende af dyret. Dette vil udvise dyrets indre organer, som omfatter tarme, fedt organer, og testikler.
- Forsigtigt drille fra hinanden testiklerne fra resten af organerne. Testiklerne er klare, ovale organer indlejret i bånd af fedt krop (Figur 2C).
- Overfør testiklerne en ad gangen til den tredje dråbe medier. For at opnå dette, indsætte kanten af skalpel under fedt kroppen, løfte vævet ud af medierne, og hurtigt flytte den til den tredje dråbe.
- Alternativt, hvis der ikke er nok fedt krop stadig er knyttet til testiklerne til at løfte vævet, forsigtigt overføre vævet ved hjælp af et glas Pasteur pipette, der er blevet præ-fugtet med dissektion medier.
- Brug den skarpe ende af skalpelværktøjet til forsigtigt at skære overskydende fedtlegeme væk fra testiklerne, så der kun efterlades en lille kant af fedtlegeme omkring kanterne (Figur 2C). Det er ikke nødvendigt at fjerne alle de fede krop, og forsøger at gøre det vil sandsynligvis resultere i skadelige eller brud af testiklerne.
- Gentag ovenstående trin for alle de mandlige larver på glasdiaset.
- Fortsæt enten til trin 3 eller trin 5.
3. Montering testikler til levende mikroskopisk imaging
BEMÆRK: Denne monteringprocedure blev tilpasset fra en nyligt offentliggjort protokol til billeddannelse af Drosophila larve hjerne neuroblaster20. Yderligere oplysninger kan findes i denne reference.
- Brug filtersprøjten til at deponere en enkelt dråbe Schneiders medier (ca. 30 μL) på midten af en 50 mm gaspermeable dyrkningsskål.
- Brug en forvåd Pasteur pipette til at overføre de forberedte testikler til dråben på den gasgennemtrængelige skål. Testiklerne vil generelt flyde til overfladen af dråben.
- Brug skalpelværktøjet til forsigtigt at skubbe testiklerne ned på den gasgennemtrængelige membran. Pas på ikke at sprænge den gasgennemtrængelige membran med det skarpe punkt på skalpel. Skub alle testiklerne til midten af dråben.
- Brug en 1 ml sprøjte fyldt med halocarbonolie til at lave fire dråber olie, ca. 30 μL hver, på gaspermeable membran. Rum dråber af olie omkring dråbe af medier, der indeholder testiklerne til at svare til de fire hjørner af en 22 mm glas dæksel.
- Line up hjørnerne af en 22 mm glas dæksel med de fire dråber halocarbon olie og forsigtigt sænke coverslip på medier og olie. Lad dæksedlen falde til ro, og at de medier, der indeholder testiklerne, spredes mellem oliedråberne.
- Fjern overskydende medier, så dæksedlen kan falde på overfladen af testiklerne. Mens observere testiklerne under en dissekere mikroskop, indsætte hjørnet af en delikat opgave tørre ind i medierne under dæksel til væge væk en lille mængde væske. Væger nok medier væk, indtil glasdækslet bare kommer i kontakt med overfladen af de største testikler. Det er vigtigt ikke at fjerne for mange medier og sænke dæksedlen for langt, da dette vil lægge pres på testiklerne og få dem til at briste (se figur 5).
4. Live Imaging af meiotiske sædceller
BEMÆRK: Spermatocytter kan afbildes ved hjælp af en laserscanning eller roterende disk konfokal mikroskop. Systemet skal have tilstrækkelig hastighed og følsomhed til at undgå fotoblegning af fluorescerende proteiner eller fotoskader i vævet.
- Placer en dråbe nedsænkningsolie på glasdækslet lige over testiklerne. Vend skålen og læg den på mikroskopscenen og flyt mikroskopmålet (40x eller 60x) ind i olien, indtil den er lige under testiklerne. Brug transmitteret lys til at finde en enkelt testis og bringe det i fokus.
- Mens du optager hurtige billeder med konfokale, skal du flytte testiklerne rundt for at undersøge organiseringen af cellerne. Den ene ende af testiklerne vil have mange små, tætpakkede celler. Denne ende indeholder germline stamceller og spermatogonia. Bevæger sig mod den anden ende af orglet, identificere gradvist større celler organiseret i diskrete klynger eller cyster. Disse store celler er spermatocytter (Figur 3A).
- Hvis billeddannelse GFP-tubulin, identificere spermatocytter, der vil påbegynde meiose inden for 30-60 min ved tilstedeværelse af to lyse microtubule asters (dvs. centrosomer) placeret på cortex af cellen (Figur 3B, C).
- Når en cyste af meiotiske spermatocytter er blevet identificeret, oprette erhvervelse parametre til at fange z-stakke af billeder over tid. Typisk erhvervelse af 15-20 billeder fordelt 1,5 μm fra hinanden i z-dimension er tilstrækkelig til at fange den fulde volumen af flere spermatocytter inden for samme cyste.
- Anskaf fuld z-stacks hvert 2 min, hvis billeddannelse hele første meiotiske division, som tager omkring 1,5 timer. Det er muligt at bruge hurtigere erhvervelse satser, især hvis kun en bestemt begivenhed af meiose skal analyseres. Men pas på ikke at forårsage fotoblegning eller fotoskader på grund af gentagen eksponering af prøven for laser excitation.
- Brug et kontinuerligt, automatisk fokuskontrolsystem for at forhindre fokal afdrift i løbet af det lange opkøbsforløb. Temperaturkontrol af prøven på mikroskopstadiet er generelt ikke nødvendig under forudsætning af stuetemperatur på ca. 22-23 °C. Hvis der findes temperaturkontrol, opbevares prøven ved 25 °C på mikroskopstadiet.
- Hvis der ikke findes meiotiske sædceller, opbevares prøven i flere timer eller natten over i en 25 °C-inkubator og et billede igen.
5. Fiksering og immunfarvning
- Fra trin 2.10 ovenfor skal du bruge en pasteurpipette i glas til at overføre testikler til en brønd i en 9-brønds glasdissekerskål indeholdende 0,5 ml 8% paraformaldehyd i PBSTx (fosfatbufferet saltvand med 0,3% Triton X-100). Sørg for, at testiklerne ligger på bunden af skålen.
BEMÆRK: Paraformaldehyd er giftigt og skal håndteres med handsker i en røghætte. - Fastgør testiklerne i 20 min ved stuetemperatur.
- Testiklerne overføres til en brønd, der indeholder 0,5 ml PBSTx. Vask i 5 min med let omrøring. Gentag vasketrinnet i nye brønde med frisk PBSTx to gange mere.
- Det primære antistof fortyndes med den ønskede koncentration i 0,5 ml PBSTx indeholdende 5% bovinserumalbumin (BSA) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Testiklerne overføres fra 9-brønds glasdissekerskåltil røret af fortyndet primært antistof og inkuberes natten over ved 4 °C med skånsom rokkende eller nøddeagtighed.
- Testiklerne vaskes i 0,5 ml PBSTx i 5 min. i en brønd af en 9-brønds glasdissekerskål. Vasktrinnet gentages med frisk PBSTx to gange mere.
- Fortyndes sekundært antistof i 250 μL PBSTx indeholdende 5% BSA og dispenseres i en ren brønd af en 9-brønd glasdissekerskål. Hvis det ønskes, tilføje DAPI til pletten DNA. Overfør testiklerne til brønden, der indeholder sekundært antistof, dække med plastfolie, og inkubere i mørke med blid omrøring i 4 timer ved stuetemperatur.
- Testiklerne overføres til en ren brønd fyldt med 0,5 ml PBSTx. Vask med frisk PBSTx to gange i 5 min. og en tredje gang i 30 min.
6. Montering faste testikler
- Overfør testiklerne fra den sidste vask på et glasmikroskopidias ved hjælp af en Pasteur-pipette. Brug om nødvendigt kant af skalpelværktøjet til at skubbe testiklerne ned på overfladen af slæden.
- Brug hjørnet af en delikat opgave tørre at væge væk overskydende væske fra testiklerne. Fjern så meget væske som muligt.
- Påfør en 30-50 μL dråbe mikroskopi monteringmedium til testiklerne.
- Anbring en 22 mm dæksel på dråben af monteringsmediet, og dækstrækket kan slås ned, og monteringsmediet kan spredes under dækstrækket. Påfør forsigtigt tryk på dækstrækket, hvis det er nødvendigt for at presse overskydende monteringsmedium ud og lade dæksellen hvile på overfladen af testiklerne.
- Brug neglelak til at forsegle kanterne af dækstrækket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når denne protokol er gennemført med succes, vil testiklerne forblive helt intakte til billeddannelse ved konfokal mikroskopi eller andre fluorescensmikroskopimetoder. Som det ses i figur 3A, den cellulære organisation af testiklerne bevares, og udviklingen af celle differentiering fra den ene ende af testiklerne til den anden, herunder spermatogoni, spermatocytter, og haploid spermatids er synlig. GFP-tubulin er en nyttig markør til identifikation af dividere spermatocytter og til levende billeddannelse af cellernes progression gennem meiose. Som vist i figur 3B, spermatocytter om begyndelsen meiose kan identificeres ved deres to fremtrædende microtubule asters. Ved metafase er de store meiotiske spindler smukt mærket af GFP-tubulin (Figur 3C).
Drosophila spermatocytters store størrelse og deres relative langsomme progression gennem meiose gør dem ideelle til analyse af dynamikken og reorganiseringen af cellulære komponenter såsom cytoplasmatiske organeller under celledeling8,11,21. Figur 4 og video 1 viser live imaging analyse af den dynamiske reorganisering af det entoplasmiske reticulum (ER) med hensyn til mikrotubuli gennem løbet af meiose. Som beskrevet ovenfor, i slutningen af indfase lige før starten af meiose, to centrosomer placeret på cortex af cellen er klart synlige ved GFP-tubulin fluorescens. På dette stadium afslører ER-målrettet RFP (RFP-KDEL) fluorescens, at ER er jævnt fordelt over hele cytoplasmaet. Centrosomerne begynder derefter at migrere til modsatte sider af den nukleare kuvert for at etablere de to spindelstænger. I løbet af denne tid ophobes ER hurtigt omkring centrosomal mikrotubuli og fjernes gradvist fra resten af cytoplasmaet. Nuklear kuvert opdeling (NEB) er afsløret ved fremkomsten af GFP-tubulin fluorescens i det nukleare område. Det skal bemærkes, at Drosophila celler dividere med semi-åbne mitose eller meiose, hvilket betyder, at nukleare kuvert komponenter nedbryde og sprede og store cytoplasmatiske molekyler ind i det nukleare område, men en kuvert af ER-afledte membraner omgiver spindel og kromatid i hele celledeling22,23,24. På tidspunktet for NEB og skrider frem gennem metafase, er ER næsten helt forbundet med de astrale mikrotubuli, der omgiver de to spindelstang centrosomer. Disse to astrale mikrotubule akkumulering er derefter partition er til de to datter celler i løbet af enaphase, sikre korrekt ER arv af de nydannede celler8,11.
Figur 5 viser virkningerne af testis brud på levende billeddannelse af spermatocytter. Som beskrevet i protokollen, skal der udvises stor omhu for ikke at sænke dæksedlen for langt på overfladen af testiklerne under monteringstrinnene, da dette vil lægge pres på testiklerne og få dem til at briste. Som det ses i figur 5 og video 2, cyster af spermatocytter hurtigt flyde ud af den bristede testis, og denne bevægelse af cellerne gør levende, time-lapse imaging yderst vanskeligt.
Figur 1: Nødvendige værktøjer til vellykket dissektion. (A) Pincet, der anvendes til dissektion, skal være lige og have skarpe, ubrudte spidser (angivet med grøn markering). Brug ikke pincet med bøjede eller knækkede spidser (røde X-mærker), da de vil være ineffektive til at gribe larver og drille væv fra hinanden. (B) For at forberede skalpelværktøjet skal du bøje en sort annodiseret insektstift til en indvendig vinkel på ca. 135°. Det skarpe punkt bruges som en kniv til at skære gennem væv, og den lige kant bruges til at flytte væv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Identifikation af larve- og hvalpetestikler. (A) Billeder af han- og hundyr. Testiklerne kan identificeres i hannen som de cirkulære eller ovale gennemskinnelige strukturer i den bageste tredjedel af dyret (pilespids). Bemærk manglen på en lignende struktur hos hunnen. (B) Billede af en tidlig mandlig puppe, med de to gennemskinnelige testikler angivet med pilespidser. cC) Testikler med påsatte fedtlegemer efter dissektion. De to testikler til venstre har overdreven fedt organer stadig er knyttet, der skal trimmes væk. De to testikler til højre er blevet ordentligt trimmet af deres fedt organer og er klar til billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Identifikation af meiotiske sædceller i en vellykket forberedt testis. (A) Konfokal billede af en vellykket forberedt levende, intakt testis udtrykker GFP-tubulin. Navet af stamceller er placeret mod den nederste spids af testiklerne, selv om det ikke kan identificeres i dette præparat. Flere lag af små spermatogoni er indiceret, og disse efterfølges af talrige cyster af spermatocytter. En cyste af spermatocytter i den første meiotiske division kan identificeres baseret på cellernes store størrelse (ca. 20 – 30 μm i diameter) og tilstedeværelsen af GFP-tubulin mærket meiotiske spindler. Spermatocytter i den anden meiotiske division har ligeledes spindler, men disse celler er ca. halvdelen af størrelsen meiose I-celler. Post-meiotiske spermatids er også synlige, som er aflange spermatozoer. (B) Spermatocytter, der vil begynde meiose inden for 30 til 60 min kan identificeres ved deres to store, meget lyse microtubule asters (angivet med pilespidser) mærket af GFP-tubulin. Cysten af præmeiotiske celler afgrænses af den stiplede gule linje. (C) Celler i meiose kan identificeres ved deres store meiotiske spindler, der er let visualiseres med GFP-tubulin. Cysten af meiotiske celler afgrænses af den stiplede gule linje. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Time-lapse billeddannelse af meiose i en enkelt spermatocyt. En enkelt spermatocyt co-ekspresning GFP-tubulin og RFP målrettet til ER (RFP-KDEL) blev afbildet hvert andet minut gennem løbet af meiose. Vist er repræsentative billeder af spermatocyt på bestemte stadier af meiose, der begynder i slutningen af indfase og skrider frem gennem telophase. Tiderne er på få minutter. Hvert billede er et enkelt optisk plan fra en stak af femten optiske skiver erhvervet på hvert tidspunkt. Dette tal blev ændret fra Karabasheva og Smyth, 20198. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative billeder af en testia før og efter brud. Billedet til venstre, mærket "Intakt", viser en GFP-tubulin udtrykke testis lige før brud. Billedet til højre viser de samme testikler efter brud. Cyster af spermatocytter kan ses streaming ud af den bristede testis. Pilespidserne angiver en cyste af meiotiske spermatocytter; bemærk den betydelige bevægelse af disse spermatocytter efter testiklerne brister, hvilket gør billeddannelse disse spermatocytter over tid ekstremt udfordrende. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Fuld meiotisk opdeling af en enkelt spermatocyt. Vist er fuld tid-bortfalder af GFP-tubulin og RFP-KDEL udtrykke spermatocyt i figur 4. Der blev taget billeder hvert andet minut, og afspilningshastigheden er tre billeder pr. sekund. Denne video blev ændret fra Karabasheva og Smyth, 20198. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Bristede testikler. Tidsforskydning af en tester før og efter brud. Bruddet er tydeligt på grund af den pludselige streaming af cyster af celler gennem nederste venstre hjørne af testiklerne. Der blev taget billeder hvert andet minut, og afspilningshastigheden er tre billeder pr. sekund. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en protokol til fremstilling af larve eller tidlige pupal Drosophila testikler, optimeret til langsigtet, levende billeddannelse af spermatocyt celledeling. Dette er en kraftfuld metode til analyse af celledeling i den fysiologiske sammenhæng med intakt væv. Effekten af denne metode er yderligere udvidet, når det kombineres med Drosophila genetiske værktøjer, såsom specifikke genmutationer, væv-specifikke RNAi-medieret undertrykkelse, og fluorescerende mærket protein og organelle markører. Hertil kommer, at den lille størrelse af larve og pupal testikler, og evnen til at billedet dividere celler meget tæt på glasset coverslip, gør metoden ideel til høj opløsning billeddannelse herunder super-opløsning tilgange. Alsidigheden i dette forsøgssystem fremgår af de repræsentative resultater, der beskriver den dynamiske reorganisering af eregruppen under celledeling. Drosophila spermatocytter er særligt nyttige til en sådan analyse af organelle dynamik under celledeling på grund af disse cellers store størrelse og relativt langsom transit gennem meiose. Desuden kan de samme celler afbildes post-meiotically at forstå, hvordan ændringer i organelle dynamik eller celledeling mekanismer påvirker efterfølgende begivenheder af spermatogenese. Således er der stort potentiale med denne eksperimentelle tilgang til at forstå fysiologi celledeling inden for større sammenhæng af vævsudvikling og celledifferentiering, resultater, der er uopnåelige, når man studerer celler dyrket i kultur.
Protokollen indeholder flere elementer, der letter langsigtet ex vivo-kultur af testikler i op til omkring 24 timer. For det første indeholder Schneiders medier, som er udviklet til vedligeholdelse af Drosophila vævskulturceller, let tilgængelige energikilder og er optimeret til at opretholde fysiologisk pH i atmosfærisk luft. For det andet giver den gasgennemtrængelige membran, der anvendes til montering af testikler, mulighed for hurtig gasudveksling. En vigtig fordel ved langsigtet kultur er, at hvis celler på det ønskede udviklingstrin eller meiose ikke findes umiddelbart efter prøveforberedelsen, kan prøven lagres og afbildes igen på et senere tidspunkt. Vi har kontrolleret, at testiklerne, der opretholdes i en 25 °C-inkubator natten over, i alt 16-24 timer, er levedygtige og virker sunde baseret på den rutinemæssige tilstedeværelse af celler, der aktivt gennemgår meiose og udvikler sig gennem senere stadier af sæddifferentiering. Der bør dog tages forholdsregler ved dyrkning af testikler i mere end 2-3 timer for at sikre, at vævsfysiologien ikke påvirkes negativt. Vigtigst er det, testiklerne fortsætte med at vokse i kulturen som celler formere sig og modning sperm langlongat. Dette kan få testiklerne til at forstørre til det punkt, at de brister på grund af det restriktive mellemrum mellem membranen og dækslip, hvilket gør testiklerne uegnede til levende billeddannelse af årsager, der er beskrevet nedenfor. Hvis der skal rutinemæssigt anvendes langsigtede kulturer i forsøg, er det desuden tilrådeligt at teste, om laboratoriespecifikke udvidede dyrkningsbetingelser resulterer i meiotiske abnormiteter såsom forlængede meiotiske varigheder eller øgede hyppigheder af haltende kromosomer eller cytokinesesvigt.
For at forestille individuelle celler over lange tidsforløb er det vigtigt, at cellerne ikke bevæger sig væsentligt, når de forberedte testikler er på mikroskopstadiet. Det er således vigtigt, når protokollen udføres, at testiklerne forbliver intakte og ubeskadigede, fordi cellerne løber ud af beskadigede testikler, og alle cellerne i organet bevæger sig som følge heraf (se figur 5 og video 2). Det kan stadig være muligt at billedet spermatocytter i beskadigede testikler, hvis cellerne i sidste ende bosætte sig og stoppe med at bevæge sig, men med den tid, dette sker de faser af meiose, at man har til hensigt at analysere kan allerede har fundet sted. Desuden kan virkninger af vævsskader på selve celledelingsprocessen ikke diskonteres. Skader på testiklerne kan forekomme, når clearing væk fedt organer efter fjernelse af testiklerne fra larverne. Der skal derfor udvises stor omhu for at undgå piercing eller slæbning på organerne under dette trin i protokollen. Faktisk er det ofte ikke nødvendigt at fjerne meget af fedt organer, så længe de ikke obskure visualisering af testiklerne. Mere almindeligt er testisskader resultatet af at fjerne for meget dyrkningsmedium efter placering af dækstrækket under monteringsproceduren for levende billeddannelse (trin 3.6). Som medium er fjernet, coverslip falder lavere og udøver pres på testiklerne, og overtryk vil få testiklerne til at briste. Således, mens det er vigtigt for coverslip at være så tæt som muligt på testiklerne for at lette optimal billeddannelse af spermatocytter, nogle praksis er nødvendig for at undgå at fjerne for meget medium og sænke coverslip for langt. Det er også nyttigt at påpege, at for nogle applikationer, såsom akut eksponering af spermatocytter til narkotika eller andre små molekyler, kan det være en fordel at forstyrre testiklerne og sprede cyster af spermatocytter til analyse. Flere fremragende protokoller er tilgængelige for fremstilling og kultur af spredte spermatocyt cyster18,25.
En vigtig overvejelse, når du bruger spermatocytter til celledeling analyse er, at disse celler udføre meiotic i modsætning til mitotiske divisioner. Vigtigere er det, mange af de væsentlige aspekter af celledeling mekanik, såsom spindel arkitektur og cytokinese, er ens mellem mandligmeiose og mitose6. Således kan mekanistiske indsigter indsamlet fra at studere spermatocyt meiose være bredt anvendelig til generelle mekanismer i dyrecelledeling7. Afhængigt af de mekanistiske spørgsmål, der behandles, kan det dog være nødvendigt at overveje vigtige forskelle mellem sædceller og mitotiske celler i processer som kromosomdynamik og regulering af cellecyklus26. Samtidig præsenterer Drosophila spermatocytter den enestående mulighed for at sammenligne mitotiske og meiotiske celler inden for samme væv og germline afstamning. For eksempel kan det samme testis præparat bruges til at analysere germline stamceller eller spermatogoni undergår mitose og spermatocytter gennemgår meiose. Vi forsøger typisk ikke at afbilde germline stamceller eller spermatogoniale midoser i levende testis præparater, fordi timingen af disse divisioner er vanskelig at forudsige. Men vi har tilfældigt fanget disse opdelinger i vores eksperimenter, der viser, at den generelle protokol kan anvendes til analyse af mitotiske celler i testiklerne så godt.
Den præsenterede metode fokuserer på testis forberedelse til levende billeddannelse af spermatocyt meiose, da dette giver mulighed for real-time analyse af cellulære og molekylære dynamik. Vi leverer også en metode til fiksering og immunfarvning af intakte testikler, da denne fremgangsmåde kan være at foretrække, hvis det kræves fluorescerende mærket udtrykkonstruktioner, der ikke er tilgængelige, eller for at undgå konfunderende virkninger af proteinoverekspression. En vigtig overvejelse er dog, at fiksering ikke altid trofast bevare indfødte væv og cellulære arkitektur. For eksempel har vi og andre konstateret, at fiksering ofte resulterer i fragmentering eller afbrydelse af ER11,27. Nogle af disse problemer kan afhjælpes ved hjælp af forskellige fiksatorer eller vævsforberedelsesmetoder, og det kan derfor være nødvendigt med fejlfinding for at identificere den optimale fikseringsprotokol til bevarelse af en bestemt cellekomponent eller proteinorganisation. Heldigvis, en række ekstra protokoller for Drosophila spermatocyt fiksering er også tilgængelige18,28,29.
Afslutningsvis har vi beskrevet alsidige metoder til fremstilling af Drosophila testikler til levende og fast celleanalyse af spermatocyt meiose. Specifikke styrker ved denne eksperimentelle tilgang omfatter analyse af celledeling i intakt væv, billeddannelse i høj opløsning af store celler og integration med Drosophila genetiske værktøjer. Eksperimenter med at anvende metoden har potentiale til at yde vigtige bidrag til vores forståelse af, hvordan celledeling integreres med komplekse mekanismer for vævsudvikling og homøostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Department of Defense start-up midler til J.T.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
