Summary
Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.
Abstract
Experimentele analyse van cellen die zich verdelen in levende, intacte weefsels en organen is essentieel voor ons begrip van hoe celdeling integreert met ontwikkeling, weefselhomeostase en ziekteprocessen. Drosophila spermatocyten die meiose ondergaan zijn ideaal voor deze analyse omdat (1) hele Drosophila-testes die spermatocyten bevatten relatief eenvoudig te bereiden zijn op microscopie, (2) de grote afmetingen van de spermatocyten maken ze zeer geschikt voor beeldvorming met hoge resolutie en (3) krachtige Drosophila genetische hulpmiddelen kunnen worden geïntegreerd met in vivo analyse. Hier presenteren we een gemakkelijk toegankelijk protocol voor de voorbereiding van hele teelballen van Drosophila derde instar larven en vroege poppen. We beschrijven hoe je meiotische spermatocyten identificeren in voorbereide hele teelballen en hoe ze in beeld kunnen worden gebracht door time-lapse microscopie. Protocollen voor fixatie en immunostaining hele teelballen zijn ook voorzien. Het gebruik van larve teelballen heeft verschillende voordelen ten opzichte van beschikbare protocollen die volwassen teelballen gebruiken voor spermatocytenanalyse. Het belangrijkste is dat larve teelballen kleiner en minder vol zijn met cellen dan volwassen teelballen, en dit vergemakkelijkt sterk hoge resolutie beeldvorming van spermatocyten. Om deze voordelen en de toepassingen van de protocollen aan te tonen, presenteren we resultaten die de herverdeling van het endoplasmatische reticulum tonen met betrekking tot spindelmicrotubuli tijdens celdeling in een enkele spermatocyten die zijn afgebeeld door time-lapse confocale microscopie. De protocollen kunnen worden gecombineerd met expressie van een willekeurig aantal fluorescerende gelabelde eiwitten of organellemarkers, evenals genmutaties en andere genetische hulpmiddelen, waardoor deze benadering bijzonder krachtig is voor de analyse van celdelingmechanismen in de fysiologische context van hele weefsels en organen.
Introduction
Celdeling wordt vaak bestudeerd met behulp van cellijnen gekweekt in cultuur1. Hoewel we een schat aan waardevol inzicht en begrip van fundamentele mechanismen uit deze studies hebben opgedaan2,kunnen cellen die in cultuur worden gekweekt de fysiologie van celdeling niet volledig samenvatten omdat het voorkomt in intact, levend weefsel. In intacte weefsels en organen moeten cellen zich bijvoorbeeld op de juiste plaats en op het juiste moment verdelen, zodat nageslachtcellen zich goed in het weefsel bevinden, zodat ze passende differentiatie of functionele programma's kunnen ondergaan, zodat celproliferatie goed wordt gecoördineerd met weefselgroei of homeostase3. Voor cellen die in cultuur worden gekweekt, wordt celdeling over het algemeen geregeld door groeifactoren in het kweekmedium4, en dus kunnen we niet van deze cellen leren hoe in vivo omgevingsfactoren zoals weefselarchitectuur of ontwikkelingssignalering het delingproces beïnvloeden. Het is ook belangrijk op te merken dat veel van de cellijnen die worden gebruikt om celdeling te bestuderen, zoals HeLa en U2OS-cellen, waren afgeleid van gemetastaseerde tumoren5. Daarom zijn veel aspecten van de basisfysiologie van deze kankercellen, zoals celcyclus regulerende mechanismen en chromosomale stabiliteit, waarschijnlijk veranderd in vergelijking met gezonde cellen. Volledig begrip van de fysiologie van de celdeling hangt daarom af van ons vermogen om delende cellen in hun eigen, in vivo omgevingen te bestuderen die fysiologische regulerende mechanismen en weefselarchitectuur behouden.
Vooruitgang bij het begrijpen van de werking van celdeling in intacte weefsels en organen wordt belemmerd door moeilijkheden die inherent zijn aan in vivo of ex vivo analyse. Ten eerste kan het moeilijk of onmogelijk zijn om toegang te krijgen tot delende cellen voor microscopische analyse in grote organen of dikke weefsels. Ten tweede is het vaak moeilijk te voorspellen wanneer individuele cellen zich in vivo zullen verdelen. Ten derde kan de weefselfysiologie snel verslechteren tijdens de ex vivo-cultuur. In dit protocol beschrijven we gemakkelijk toegankelijke methoden voor live en vaste analyse van Drosophila melanogaster spermatocyten omdat ze meiotische celdelingen ondergaan binnen volledig intacte teelballen. Deze cellen zijn ideaal voor live, ex vivo analyse omdat ze gemakkelijk toegankelijk zijn met standaard optische methoden zoals confocale microscopie, ze verdelen op voorspelbare tijden en locaties, en intacte teelballen kunnen worden gehandhaafd in ex vivo cultuur voor ongeveer 24 uur. Bovendien zijn Drosophila spermatocyten grote ronde cellen (ongeveer 20-30 μm in diameter) die niet van vorm veranderen wanneer ze zich verdelen, waardoor ze ideaal zijn voor hoge resolutie, time-lapse beeldvorming van cellulaire componenten zoals het spindelapparaat en cytoplasmale organellen. Hoewel deze cellen meiose ondergaan in tegenstelling tot mitose, zijn veel van de essentiële celdelingprocessen zeer vergelijkbaar tussen deze twee celdelingmechanismen6. Deze voordelen, gecombineerd met krachtige Drosophila genetische hulpmiddelen, hebben Drosophila spermatocyten een veelgebruikt model voor ex vivo analyse van essentiële celdelingprocessen met inbegrip van asvorming en regelgeving, cytokinese, en organelle het remodelleren en het verdelen7gemaakt,8,9,10,11.
Spermatocyten zijn cellen die zich in het meinotische stadium van spermatogenese bevinden. In Drosophilabegint spermatogenese met een groep kiembaanstamcellen die zich in een klein gebied bevinden of "hub" op één pool van de testis12,13. Deze cellen delen door een asymmetrische mitose, die aanleiding geeft tot een enkele gedifferentieerde spermatogonium. Spermatogonia ondergaan vervolgens vier synchrone mitosen om een groep van 16 cellen te produceren die nauw verbonden blijven binnen een enkele cyste. In dit stadium gaan de cellen over van een mitotische naar een menotische celcyclus en worden ze spermatocyten genoemd. Spermatocyten brengen ongeveer twee tot drie dagen door in een verlengde G2-fase van de celcyclus, waarin ze dramatisch groeien en cytologische veranderingen ondergaan in de voorbereiding op de twee meiotische divisies en de daaropvolgendezaadsperma13,14. De hele groep van 16 spermatocyten binnen een enkele cyste gaat vervolgens tegelijkertijd de eerste meiotische divisie in. Zo kunnen verschillende meiotische spermatocyten tegelijkertijd worden afgebeeld terwijl ze door celdeling gaan. De eerste meiotische divisie gaat ongeveer 1,5 uur te werk en wordt vrijwel onmiddellijk gevolgd door de tweede menotische divisie, die in totaal 64 spermatids oplevert die zich gaan onderscheiden in volwassen spermatozoa.
Een uniek voordeel van het gebruik van spermatocyten om celdeling in levend, intact weefsel te bestuderen, is dat groepen of cysten van cellen voortdurend vooruitgang boeken in de verschillende stadia van spermatogenese, en cellen in alle stadia van spermatogenese kunnen meestal worden geïdentificeerd in een bepaalde testis (zie figuur 3A). Daarom is het relatief eenvoudig om meiotische cellen in hele teelballen te vinden. Over het algemeen richten we onze analyses op de eerste in plaats van op tweede meiose, omdat deze cellen veel groter en beter vatbaar zijn voor beeldvorming met hoge resolutie, maar het hele proces dat beide meiotic-divisies omvat, kan met succes worden weergegeven. Er moet ook worden opgemerkt dat het algemene protocol voor testisvoorbereiding en -cultuur ook kan worden gebruikt om andere processen van spermatogenese te analyseren, zoals de eerdere mitotische stamcel- of spermatogonale divisies of de cytologische veranderingen die optreden als spermatids rijpen in spermatozoa15. Veel van deze aspecten van spermatogenese zijn zeer bewaard gebleven tussen Drosophila en mensen16.
Drosophila spermatocyten beginnen de meiotische fase van spermatogenese te bereiken tijdens het derde instar larve stadium van Drosophila ontwikkeling13. Daarom kunnen teelballen geïsoleerd vanaf levenscyclusstadia die beginnen met derde instarlarven en met inbegrip van poppen en volwassenen worden gebruikt voor de analyse van delende spermatocyten. Er zijn verschillende uitstekende protocollen beschikbaar voor de extractie van teelballen van volwassen mannelijke vliegen voor levende en vaste analyse van spermatogenese17,18,19. Deze protocollen kunnen de voorkeur hebben voor het bestuderen van late stadia van spermatogenese of als genetische markers die alleen zichtbaar zijn bij volwassenen moeten worden gebruikt. Het protocol richt zich in plaats daarvan op testisvoorbereiding van larven en vroege poppen, omdat teelballen in deze stadia verschillende voordelen hebben die specifiek relevant zijn voor celdelinganalyse door hoge resolutie, time-lapse microscopie. Ten eerste zijn teelballen van larven en poppen kleiner dan die van volwassenen en zijn de cellen in het orgaan minder druk. Hierdoor kunnen delende spermatocyten vaak worden afgebeeld in de buurt van het buitenoppervlak van larve teelballen, zonder dat ze door meerdere lagen lichtverstrooiend weefsel hoeven te dringen. Ten tweede bewegen volwassen teelballen ritmisch als gevolg van samentrekkingen van de bijgevoegde accessoireorganen, en deze bewegingen maken time-lapse beeldvorming van individuele cellen uitdagend. En ten derde, larve teelballen zijn voordelig bij het bestuderen van genmutaties die pop of volwassen dodelijkheid veroorzaken. Onze methoden zijn geoptimaliseerd voor de lange termijn cultuur van teelballen op de microscoop fase, waardoor beeldvorming van meerdere rondes van celdeling of de progressie van individuele cellen door meerdere stadia van spermatogenese in hetzelfde preparaat. We beschrijven ook een protocol voor fixatie en immunostaining van hele teelballen. Over het algemeen zijn onze protocollen bijzonder nuttig voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van celdeling in intact weefsel, en de mogelijkheid om spermatocytenanalyse te combineren met zeer hardnekkige Drosophila genetische hulpmiddelen maakt dit een bijzonder krachtige aanpak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dieren, hulpmiddelen en media voorbereiden op dissectie
- Kruis mannelijke en vrouwelijke vliegen om nakomelingen van het gewenste genotype te verkrijgen. Nuttige transgene markers voor de identificatie en enscenering van meiotische spermatocyten omvatten GFP-tubuline om de meiotische spindel en RFP-histone 2A te labelen om chromsomes8te etiketteren. Gebruik vijf tot tien vrouwtjes per kruis en onderhoud kruisen op standaard vliegvoedsel in flacons in een 25 °C incubator totdat derde instar larven beginnen te kruipen langs de zijkanten van de flacon (4-5 dagen). Vroege witte poppen zal beginnen vormen een dag later.
- Verkrijg twee paar rechte tangen met fijne tips. Zorg ervoor dat de tips scherp zijn, zelfs in lengte, en recht(figuur 1A). Gebruik deze tangen alleen voor dissecties, en dop met 10 μL pipet tips wanneer niet in gebruik.
-
Bereid een scalpel gereedschap voor.
- Steek het stompe uiteinde van een zwarte geanodiseerde stalen insectpen in een pinhouder en draai de schroef van de houder om de pin op zijn plaats te zetten. Met behulp van een paar tangen en onder een ontledenmicroscoop, pak de insectenspeld in het midden en buig deze om een interne hoek van 135° (Figuur 1B) te vormen. Het scherpe uiteinde is voor snijweefsel, terwijl de rand wordt gebruikt voor het overbrengen van teelballen tussen druppels media.
- Dop met een 1.000 μL pipettip wanneer deze niet in gebruik is.
- Werken in een weefselkweekkap, bereid 5 mL aliquots van Schneider's media en bewaar op 4 °C tot het moment van gebruik. Wanneer klaar om te beginnen dissecties, warm een 5 mL media aliquot tot kamertemperatuur. Breng vervolgens de opgewarmde dissectiemedia over op een spuit van 10 mL en bevestig een spuitfilter van 0,22 μm.
2. Dissectie van testes van larven en vroege poppen
- Gebruik de met media gevulde filterspuit om drie druppels media (elk 50 μL) aan de boven-, midden- en onderkant van een glazen schuif te verdrijven.
- Gebruik een ontledensonde om vijf tot tien derde instar larven of vroege poppen (poppen die nog steeds wit of geel) naar de bovenste druppel. Roer de larven en poppen voorzichtig in de media met de ontledende sonde om voedsel of vuil te verwijderen.
- Onder een ontledenmicroscoop, draai een enkele larve of pop op zijn kant met een ontleden sonde om de twee bilaterale teelballen te identificeren indien aanwezig, die verschijnen als ovale gevormde doorschijnende structuren in het achterste derde van het lichaam (Figuur 2A, B). Dieren die geen teelballen hebben, zijn vrouwelijk en moeten worden weggegooid.
- Wanneer een mannelijke larve of pop wordt gevonden en schoon is, verplaats het naar de tweede druppel media. Herhaal dit totdat 3 of 4 mannelijke larven en/of poppen zijn overgebracht naar de tweede druppel media.
- Werken in de tweede druppel van de media, pak een enkele mannelijke larve of pop met een paar tangen in het midden van het gebied, net voorste aan de teelballen. Gebruik het tweede paar tangen om het dier voorzichtig doormidden te scheuren.
- Houd het achterste uiteinde van de larve of pop naar beneden op de glazen glijbaan met een paar tangen. Begin net naast de tangen, duw naar beneden op de cuticula met behulp van de rand van de scalpel tool en beweeg de scalpel naar de cut-end van het dier. Dit zal verdrijven van het dier interne organen, waaronder de ingewanden, vetlichamen, en teelballen.
- Plaag voorzichtig de teelballen van de rest van de organen. De teelballen zijn heldere, ovale organen ingebed in linten van vet lichaam (Figuur 2C).
- Breng de teelballen een voor een naar de derde druppel media. Om dit te bereiken, steek de rand van de scalpel onder het vetlichaam, til het weefsel uit de media, en snel verplaatsen naar de derde druppel.
- Als alternatief, als er niet genoeg vet lichaam nog steeds aan de teelballen om met succes het weefsel op te heffen, voorzichtig overdracht van het weefsel met behulp van een glazen Pasteur pipet dat is voorbevochtigd met dissectie media.
- Gebruik het scherpe uiteinde van de scalpel tool om voorzichtig weg te snijden overtollig vet lichaam uit de teelballen, waardoor slechts een kleine rand van vet lichaam rond de randen(figuur 2C). Het is niet nodig om al het vetlichaam te verwijderen, en een poging om dit te doen zal waarschijnlijk resulteren in beschadiging of scheuren van de teelballen.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor alle mannelijke larven op de glazen glijbaan.
- Ga door naar stap 3 of stap 5.
3. Montage Testes voor Live Microscopische beeldvorming
LET OP: Deze montageprocedure werd aangepast van een recent gepubliceerd protocol voor beeldvorming van Drosophila larve hersenen neuroblasten20. Aanvullende details zijn te vinden in deze referentie.
- Gebruik de filterspuit om een enkele druppel media van Schneider (ongeveer 30 μL) op het midden van een 50 mm gasdoorlatende kweekschotel te deponeren.
- Gebruik een voorbevochtigde Pasteur pipet om de bereide teelballen over te brengen naar de druppel op de gasdoorlatende schotel. De teelballen zullen over het algemeen drijven naar het oppervlak van de druppel.
- Gebruik het scalpelgereedschap om de teelballen voorzichtig op het gasdoorlatende membraan te duwen. Zorg ervoor dat u het gasdoorlatende membraan niet scheurt met het scherpe punt van de scalpel. Duw alle teelballen naar het midden van de druppel.
- Gebruik een 1 mL spuit gevuld met halocarbon olie om vier druppels olie te maken, ongeveer 30 μL per stuk, op het gas doorlatende membraan. Plaats de druppels olie rond de druppel media die de teelballen bevatten, om overeen te komen met de vier hoeken van een 22 mm glazen afdekking.
- Line-up van de hoeken van een 22 mm glazen coverslip met de vier druppels halocarbon olie en zachtjes lager de coverslip op de media en olie. Laat het afdekkingsformulier bezinken en laat de media die de teelballen bevatten zich tussen de druppels olie verspreiden.
- Verwijder overtollige media zodat het uitglijder zich op het oppervlak van de teelballen kan nestelen. Tijdens het observeren van de teelballen onder een ontleden microscoop, steek de hoek van een delicate taak veeg in de media onder de coverslip af te voeren een kleine hoeveelheid vloeistof. Wick weg genoeg media totdat de glazen coverslip maakt gewoon contact met het oppervlak van de grootste testis. Het is van cruciaal belang om niet te veel media te verwijderen en het uitglijder te ver te laten zakken, omdat dit druk uitoefent op de teelballen en ervoor zorgt dat ze scheuren (zie figuur 5).
4. Live imaging van Meiotic Spermatocyten
LET OP: Spermatocyten kunnen worden afgebeeld met behulp van een laser scannen of spinnen schijf confocale microscoop. Het systeem moet voldoende snelheid en gevoeligheid hebben om fotobleekte van fluorescerende eiwitten of fotoschade van het weefsel te voorkomen.
- Plaats een druppel onderdompelingsolie op de glazen afdekking net boven de teelballen. Flip over de schotel en plaats het op de microscoop fase en verplaats de microscoop doelstelling (40x of 60x) in de olie totdat het net onder de teelballen. Gebruik uitgezonden licht om een enkele testis te vinden en in beeld te brengen.
- Terwijl u snelle beelden vastlegt met de confocale, verplaatst u de testis om de organisatie van de cellen te onderzoeken. Het ene uiteinde van de testis zal veel kleine, dicht opelkaar gepakte cellen hebben. Dit uiteinde bevat de kiembaan stamcellen en spermatogonie. Bewegen naar het andere uiteinde van het orgaan, identificeren geleidelijk grotere cellen georganiseerd in discrete clusters of cysten. Deze grote cellen zijn de spermatocyten (figuur 3A).
- Als beeldvorming GFP-tubulin, identificeren spermatocyten die meiose zal beginnen binnen 30-60 min door de aanwezigheid van twee heldere microtubuli asters (dat wil zeggen, centrosomen) gelegen in de cortex van de cel (Figuur 3B, C).
- Zodra een cyste van meiotische spermatocyten is geïdentificeerd, het opzetten van acquisitie parameters om z-stapels beelden vast te leggen na verloop van tijd. Typisch, verwerving van 15-20 beelden verdeeld 1,5 μm uit elkaar in de z-dimensie is voldoende om het volledige volume van verschillende spermatocyten binnen dezelfde cyste vast te leggen.
- Verwerf volledige z-stacks om de 2 min als beeldvorming van de gehele eerste meiotische divisie, die duurt ongeveer 1,5 uur. Het is mogelijk om snellere acquisitietarieven te gebruiken, vooral als alleen een specifieke gebeurtenis van meiose moet worden geanalyseerd. Zorg er echter voor dat het geen fotobleekte of fotoschade veroorzaakt als gevolg van herhaalde blootstelling van het monster aan laserexcitatie.
- Gebruik een continu, automatisch focuscontrolesysteem om brandpuntsdrift over de lange tijdsloop van acquisitie te voorkomen. Temperatuurregeling van het monster op het microscoopstadium is over het algemeen niet nodig, uitgaande van een kamertemperatuur van ongeveer 22-23 °C. Als er temperatuurregeling beschikbaar is, houdt u het monster op 25 °C op het microscoopstadium.
- Als er geen meiotische spermatocyten worden gevonden, bewaar het monster dan enkele uren of 's nachts in een couveuse van 25 °C en afbeelding opnieuw.
5. Fixatie en immunostaining
- Gebruik vanaf stap 2.10 een glazen Pasteur pipet om te testen over te brengen naar een put in een 9-well glazen ontleedschaal met 0,5 mL van 8% paraformaldehyde in PBSTx (fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,3% Triton X-100). Zorg ervoor dat de teelballen op de bodem van de schotel liggen.
LET OP: Paraformaldehyde is giftig en moet worden behandeld met handschoenen in een rookkap. - Bevestig de teelballen gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Breng de teelballen over naar een put met 0,5 mL PBSTx. Was gedurende 5 min met zachte agitatie. Herhaal de wasstap in nieuwe putten met verse PBSTx nog twee keer.
- Verdun het primaire antilichaam tot de gewenste concentratie in 0,5 mL PBSTx met 5% runderserumalbumine (BSA) in een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Breng tegoeden van de 9-well glasontleden naar de buis van verdund primair antilichaam en incubeer 's nachts bij 4 °C met zachte schommeling of noot.
- Was de teelballen in 0,5 mL PBSTx gedurende 5 min in een put van een 9-well glazen ontleedschaal. Herhaal de wasstap nog twee keer met verse PBSTx.
- Verdun secundair antilichaam in 250 μL PBSTx met 5% BSA en bedien in een schone put van een 9-well glazen ontleedschaal. Voeg indien gewenst DAPI toe aan het dna te bevlekken. Breng tegoeden naar de put met secundair antilichaam, dek af met plastic folie en inhet donker met zachte agitatie gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
- Breng de teelballen over naar een schone put gevuld met 0,5 mL PBSTx. Was twee keer met verse PBSTx gedurende 5 min en een derde keer gedurende 30 min.
6. Montage vaste teelballen
- Breng de teelballen van de laatste wasbeurt over op een glazen microscopieplaat met behulp van een Pasteur pipet. Gebruik indien nodig de rand van het scalpelgereedschap om de teelballen op het oppervlak van de dia naar beneden te duwen.
- Gebruik de hoek van een delicate taak af te vegen om afvoer van overtollige vloeistof uit de teelballen. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof.
- Breng een 30-50 μL-val van microscopiemontagemedium aan op de teelballen.
- Plaats een afdekkingsslip van 22 mm op de val van het bevestigingsmedium en laat het afdekkingsformulier zich nestellen en het montagemedium zich onder het afdekkingsformulier verspreiden. Breng indien nodig een zachte druk uit op het uitglijder om overtollig montagemedium uit te persen en laat het uitglijder op het oppervlak van de teelballen rusten.
- Gebruik nagellak om de randen van de coverslip te verzegelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer dit protocol met succes wordt uitgevoerd, blijven teelballen volledig intact voor beeldvorming door confocale microscopie of andere fluorescentiemicroscopiemethoden. Zoals te zien in figuur 3A, wordt de cellulaire organisatie van de teelballen bewaard en is de progressie van celdifferentiatie van het ene uiteinde van de testis naar de andere, waaronder spermatogonie, spermatocyten en haploid-spermatids zichtbaar. GFP-tubulin is een nuttige marker voor het identificeren van delende spermatocyten en voor live beeldvorming van de progressie van de cellen door meiose. Zoals blijkt uit figuur 3B, spermatocyten over het begin meiose kan worden geïdentificeerd door hun twee prominente microtubuli asters. Door metafase worden de grote meiotische spindels prachtig gelabeld door GFP-tubulin (Figuur 3C).
Drosophila spermatocyten ' grote omvang en hun relatieve langzame progressie door meiose maken ze ideaal voor de analyse van de dynamiek en reorganisatie van cellulaire componenten zoals cytoplasmale organellen tijdens celdeling8,11,21. Figuur 4 en Video 1 tonen live beeldanalyse van de dynamische reorganisatie van het endoplasmische reticulum (ER) met betrekking tot microtubuli in het verloop van meiose. Zoals hierboven beschreven, tijdens de late interfase net voor het begin van meiose, twee centrosomes gelegen aan de cortex van de cel zijn duidelijk zichtbaar door GFP-tubulin fluorescentie. In dit stadium blijkt uit de fluorescentie van RFP (RFP-KDEL) dat de ER gelijkmatig over het cytoplasma wordt verdeeld. De centrosomes beginnen dan te migreren naar tegenovergestelde zijden van de nucleaire envelop om de twee spindelpolen vast te stellen. Gedurende deze tijd hoopt de ER zich snel op rond de centromaal microtubuli en wordt geleidelijk gewist van de rest van het cytoplasma. Kernenvelopverdeling (NEB) blijkt uit het verschijnen van gfp-tubulinfluorescentie in het nucleaire gebied. Opgemerkt moet worden dat Drosophila-cellen zich delen door semi-open mitose of meiose, wat betekent dat onderdelen van nucleaire enveloppen afbreken en verspreiden en grote cytoplasmamoleculen het nucleaire gebied binnenkomen, maar een envelop met ER-afgeleide membranen omringt de as en chromatiden gedurende celdeling22,23,24. Tegen de tijd van NEB en vordert door middel van metafase, de ER is bijna volledig geassocieerd met de astrale microtubuli die de twee spindel pool centrosomes omringen. Deze twee astrale microtubuli accumulaties van de ER vervolgens partitie aan de twee dochtercellen tijdens anafase, zorgen voor een goede ER overerving door de nieuw gevormde cellen8,11.
Figuur 5 toont de effecten van testis breuk op live beeldvorming van spermatocyten. Zoals beschreven in het protocol, moet er veel zorg worden verricht om het afdekkingsformulier niet te ver op het oppervlak van de teelballen te laten zakken tijdens de montagestappen, omdat dit druk zal uitoefenen op de teelballen en ervoor zorgt dat ze barsten. Zoals te zien in figuur 5 en video 2,cysten van spermatocyten snel stromen uit de gescheurde testis, en deze beweging van de cellen maakt live, time-lapse beeldvorming uiterst moeilijk.
Figuur 1: Hulpmiddelen die nodig zijn voor een succesvolle dissectie. (A) Tangen die worden gebruikt voor dissectie moeten recht zijn en scherpe, ongebroken uiteinden hebben (aangegeven door groen vinkje). Gebruik geen tangen met gebogen of gebroken tips (rode X-markeringen), omdat ze niet effectief zijn bij het grijpen van larven en het uit elkaar plagen van weefsels. (B) Om het scalpelgereedschap voor te bereiden, buig een zwart geanodiseerde stalen insectpend tot een interne hoek van ongeveer 135°. Het scherpe punt wordt gebruikt als een mes te snijden door weefsel, en de rechte rand wordt gebruikt voor het verplaatsen van weefsels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Identificatie van larven- en pupaltees. (A) Beelden van mannelijke en vrouwelijke larven. De teelballen zijn bij het mannetje herkenbaar aan de cirkelvormige of ovale doorschijnende structuren in het achterste derde deel van het dier (pijlpunt). Let op het ontbreken van een vergelijkbare structuur in het vrouwtje. (B) Afbeelding van een vroege mannelijke pop, met de twee doorschijnende teelballen aangegeven door pijlpunten. cC) teelballen met aangehechte vetlichamen na dissectie. De twee teelballen aan de linkerkant hebben overmatige vetlichamen nog steeds bevestigd die moeten worden weggesneden. De twee testes aan de rechterkant zijn goed bijgesneden van hun vetlichamen en zijn klaar voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Identificatie van meiotische spermatocyten in een met succes voorbereide testis. (A) Confocale beeld van een met succes voorbereide levende, intacte testis uitdrukken GFP-tubulin. De hub van stamcellen bevindt zich in de richting van de onderste punt van de testis, hoewel het niet identificeerbaar is in dit preparaat. Verschillende lagen van kleine spermatogonie zijn aangegeven, en deze worden gevolgd door tal van cysten van spermatocyten. Een cyste van spermatocyten in de eerste meiotische verdeling is identificeerbaar op basis van de grote omvang van de cellen (ongeveer 20 – 30 μm in diameter) en de aanwezigheid van GFP-tubulin eaniet gelabeld meiotische spindels. Spermatocyten in de tweede meiotische divisie hebben ook spindels, maar deze cellen zijn ongeveer de helft van de grootte meiose I cellen. Post-meiotische spermatids zijn ook zichtbaar, evenals het langwerpige spermatozoa. (B) Spermatocyten die meiose zal beginnen binnen 30 – 60 min kan worden geïdentificeerd door hun twee grote, zeer heldere microtubuli asters (aangegeven door pijlpunten) gelabeld door GFP-tubulin. De cyste van pre-meiotische cellen wordt afgebakend door de gestippelde gele lijn. (C) Cellen in meiose zijn herkenbaar aan hun grote meiotische spindels die gemakkelijk worden gevisualiseerd met GFP-tubuline. De cyste van meioticcellen wordt afgebakent door de gestippelde gele lijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Time-lapse beeldvorming van meiose in één spermatocyt. Een enkele spermatocyten co-expressing GFP-tubulin en RFP gericht op de ER (RFP-KDEL) werd afgebeeld om de twee minuten door de loop van meiose. Getoond zijn representatieve beelden van de spermatocytie in specifieke stadia van meiose, te beginnen in de late interfase en vordert door telofase. De tijden zijn binnen enkele minuten. Elk beeld is een enkel optisch vlak uit een stapel van vijftien optische segmenten verworven op elk moment. Dit cijfer is gewijzigd van Karabasheva en Smyth, 20198. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve beelden van een testis voor en na het scheuren. De afbeelding aan de linkerkant, met het label "Intact", toont een GFP-tubulin uitdrukken testis net voor het scheuren. De afbeelding aan de rechterkant toont dezelfde testis na het scheuren. Cysten van spermatocyten kunnen worden gezien streaming uit de gescheurde testis. De pijlpunten wijzen op een cyste van meiotische spermatocyten; let op de aanzienlijke beweging van deze spermatocyten na de testis breuken, waardoor beeldvorming deze spermatocyten na verloop van tijd zeer uitdagend. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: Volledige meiotic verdeling van een enkele spermatocytocyte. Getoond is de full time-lapse van de GFP-tubulin en RFP-KDEL uitdrukken spermatoicyten in figuur 4. Afbeeldingen werden om de twee minuten vastgelegd en de afspeelsnelheid is drie frames per seconde. Deze video is gewijzigd van Karabasheva en Smyth, 20198. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Gescheurde testis. Time-lapse van een testis voor en na het scheuren. De breuk is duidelijk te wijten aan de plotselinge streaming van cysten van cellen door de linkerbenedenhoek van de testis. Afbeeldingen werden om de twee minuten vastgelegd en de afspeelsnelheid is drie frames per seconde. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een protocol beschreven voor de voorbereiding van larve of vroege pupal Drosophila-teelballen, geoptimaliseerd voor langdurige, live beeldvorming van spermatocytenceldeling. Dit is een krachtige methode voor de analyse van celdeling in de fysiologische context van intact weefsel. De kracht van deze methode wordt verder uitgebreid in combinatie met Drosophila genetische hulpmiddelen, zoals specifieke genmutaties, weefselspecifieke RNAi-gemedieerde onderdrukking en fluorescerend gelabelde eiwit- en organellemarkers. Bovendien maken de kleine omvang van larve- en popteelteeltees, en de mogelijkheid om delende cellen zeer dicht bij de glazen afdekking te beelden, de methode ideaal voor beeldvorming met hoge resolutie, inclusief benaderingen met superresolutie. De veelzijdigheid van dit experimentele systeem wordt aangetoond door de representatieve resultaten die de dynamische reorganisatie van de ER tijdens celdeling beschrijven. Drosophila spermatocyten zijn bijzonder nuttig voor een dergelijke analyse van organelle dynamica tijdens celdeling als gevolg van deze cellen 'grote omvang en relatief trage doorvoer door meiose. Verder kunnen dezelfde cellen post-meiotically worden afgebeeld om te begrijpen hoe veranderingen in organelledynamica of celdelingmechanismen de volgende gebeurtenissen van spermatogenese beïnvloeden. Zo is er een groot potentieel met deze experimentele aanpak om de fysiologie van celdeling te begrijpen binnen de grotere context van weefselontwikkeling en celdifferentiatie, resultaten die onbereikbaar zijn bij het bestuderen van cellen die in cultuur worden gekweekt.
Het protocol bevat verschillende elementen die de lange termijn ex vivo cultuur van teelballen voor maximaal ongeveer 24 uur te vergemakkelijken. Ten eerste bevatten schneiders media, die zijn ontwikkeld voor het onderhoud van drosophila weefselkweekcellen, direct beschikbare energiebronnen en zijn ze geoptimaliseerd om fysiologische pH in atmosferische lucht te behouden. Ten tweede zorgt het gasdoorlatende membraan dat wordt gebruikt voor het monteren van teelballen voor een snelle gasuitwisseling. Een belangrijk voordeel van de cultuur op lange termijn is dat als cellen in het gewenste ontwikkelingsstadium of meiose niet onmiddellijk na de monstervoorbereiding worden gevonden, het monster op een later tijdstip opnieuw kan worden opgeslagen en weergegeven. We hebben geverifieerd dat teelballen die 's nachts in een couveuse van 25 °C worden gehouden, gedurende een totaal van 16-24 uur, levensvatbaar zijn en gezond lijken op basis van de routinematige aanwezigheid van cellen die actief meiose ondergaan en in latere stadia van spermadifferentiatie doorlopen. Er moeten echter voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het kweken van tests langer dan 2-3 uur om ervoor te zorgen dat de weefselfysiologie niet negatief wordt beïnvloed. Belangrijker nog, teelballen blijven groeien in de cultuur als cellen vermenigvuldigen en rijpen sperma langwerpig. Dit kan ertoe leiden dat de teelballen zo ver worden dat ze barsten als gevolg van de beperkende ruimte tussen het membraan en de afdekking, waardoor de teelballen om onderstaande redenen ongeschikt zijn voor live beeldvorming. Bovendien is het raadzaam om te testen of labspecifieke uitgebreide kweekomstandigheden leiden tot meiotische afwijkingen zoals langdurige meinotische duur of verhoogde frequenties van achterblijvende chromosomen of cytokinesefalen.
Om individuele cellen over lange tijd-cursussen te beeld, is het belangrijk dat de cellen niet beduidend bewegen zodra de voorbereide teelballen op het microscoopstadium zijn. Het is dus essentieel bij het uitvoeren van het protocol dat de teelballen intact en onbeschadigd blijven, omdat cellen uit beschadigde teelballen en alle cellen in het orgaan vloeien (zie figuur 5 en video 2). Het kan nog steeds mogelijk zijn om spermatocyten in beschadigde teelballen beeld als de cellen uiteindelijk vestigen en stoppen met bewegen, hoewel tegen de tijd dat dit gebeurt de stadia van meiose die men van plan is te analyseren kan al hebben plaatsgevonden. Bovendien kunnen effecten van weefselschade op het celdelingproces zelf niet worden verdisconteerd. Schade aan de teelballen kan optreden bij het opruimen van vetlichamen na verwijdering van de teelballen uit larven. Grote zorg moet daarom worden genomen om te voorkomen dat piercing of trekken aan de organen tijdens deze stap van het protocol. In feite is het vaak niet nodig om heel veel van de vetlichamen te verwijderen, zolang ze de visualisatie van de testis niet verdoezelen. Meer in het algemeen is testisschade het gevolg van het verwijderen van te veel kweekmedium na plaatsing van de coverslip tijdens de montageprocedure voor live imaging (stap 3.6). Als medium wordt verwijderd, valt het uitglijder lager en oefent druk uit op de teelballen, en overmatige druk zal ervoor zorgen dat de teelballen scheuren. Hoewel het dus belangrijk is dat het uitglijder zo dicht mogelijk bij de teelballen ligt om een optimale beeldvorming van de spermatocyten te vergemakkelijken, is enige praktijk noodzakelijk om te voorkomen dat het te veel medium wordt verwijderd en het coverslip te ver wordt verlaagd. Het is ook nuttig om erop te wijzen dat voor sommige toepassingen, zoals acute blootstelling van spermatocyten aan drugs of andere kleine moleculen, het voordelig kan zijn om de teelballen te verstoren en de cysten van spermatocyten te verspreiden voor analyse. Verschillende uitstekende protocollen zijn beschikbaar voor de voorbereiding en cultuur van verspreide spermatocyten cysten18,25.
Een belangrijke overweging bij het gebruik van spermatocyten voor celdeling analyse is dat deze cellen uitvoeren meiotisch in tegenstelling tot mitotische desklassen. Belangrijk is dat veel van de essentiële aspecten van celdeling mechanica, zoals spindel architectuur en cytokinese, zijn vergelijkbaar tussen mannelijke meiose en mitose6. Zo kunnen mechanistische inzichten die zijn verzameld uit het bestuderen van spermatocyten meiose breed toepasbaar zijn op algemene mechanismen van dierlijke celdeling7. Afhankelijk van de gemechanistische vragen die worden aangepakt, moeten echter belangrijke verschillen tussen spermatocyten en mitotische cellen in processen zoals chromosomale dynamica en celcyclusregulatie worden overwogen26. Tegelijkertijd bieden Drosophila-spermatocyten de unieke kans om mitotische en meiotische cellen te vergelijken binnen hetzelfde weefsel en kiemlijn. Hetzelfde testispreparaat kan bijvoorbeeld worden gebruikt om kiembaanstamcellen of spermatogonie te analyseren die mitose en spermatose ondergaan en zich aan meiose laten ondergaan. We meestal niet proberen om kiembaan stamcel of spermatogonale mitoses beeld in live testis preparaten, omdat de timing van deze divisies is moeilijk te voorspellen. We hebben deze verdeeldheid echter toevallig vastgelegd in onze experimenten, waaruit blijkt dat het algemene protocol ook kan worden toegepast op de analyse van mitotische cellen in teelballen.
De gepresenteerde methodologie richt zich op testis voorbereiding voor live beeldvorming van spermatocyten meiose, omdat dit zorgt voor real-time analyse van cellulaire en moleculaire dynamiek. We bieden ook een methode voor fixatie en immunostaining van intacte teelballen, omdat deze aanpak de voorkeur kan hebben indien nodig fluorescerende gelabelde expressieconstructies niet beschikbaar zijn of om verstorende effecten van eiwitoverexpressie te voorkomen. Een belangrijke overweging is echter dat fixatie niet altijd trouw inheemse weefsel en cellulaire architectuur te behouden. Wij en anderen hebben bijvoorbeeld vastgesteld dat fixatie vaak leidt tot fragmentatie of verstoring van de ER11,27. Sommige van deze problemen kunnen worden verholpen door verschillende fixatiemiddelen of weefselbereidingsmethoden te gebruiken, en sommige probleemoplossing kan daarom nodig zijn om het optimale fixatieprotocol voor het behoud van een bepaalde celcomponent of eiwitorganisatie te identificeren. Gelukkig zijn er ook een aantal aanvullende protocollen voor Drosophila spermatocyten fixatie beschikbaar18,28,29.
Tot slot hebben we veelzijdige methoden beschreven voor de bereiding van Drosophila-tees voor live- en vaste celanalyse van spermatocyte meiose. Specifieke sterke punten van deze experimentele aanpak zijn analyse van celdeling in intact weefsel, hoge resolutie beeldvorming van grote cellen, en integratie met Drosophila genetische hulpmiddelen. Experimenten met behulp van de methodologie hebben het potentieel om belangrijke bijdragen te leveren aan ons begrip van hoe celdeling integreert met complexe mechanismen van weefselontwikkeling en homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie start-up fondsen aan J.T.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
