Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Extracellulär Multi-Unit Inspelning från luktnerven av Teleosts

Published: October 6, 2020 doi: 10.3791/60962
Automatic Translation
1, 1,2
1Centro de Ciências do Mar, 2Universidade do Algarve

Summary

Extracellulär multi-enhetsregistrering från luktnerven är en känslig, robust och reproducerbar metod för bedömning av luktkänslighet hos marina fiskar. Den registrerar primär sensorisk ingång och är oberoende av extern salthalt.

Abstract

Nyligen genomförda studier har visat att havsförsurning påverkar luktdrivet beteende hos fisk. Detta kan delvis bero på en minskning av luktkänsligheten i högt PCO2/lågt pH-vatten. För att bedöma effekterna av havet försurning, eller lukt känslighet i marina fiskar i allmänhet, föreslår vi att extracellulära flera enheter inspelning från luktnerven är metoden för val. Även om invasiva, det är känslig, robust, reproducerbara och oberoende av yttre salthalt (till skillnad från elektro-olfactogram [EOG], till exempel). Vidare registrerar den en primär sensorisk ingång i CNS, före all centralbearbetning. Vi visar att denna metod kan visa en minskning av lukt känslighet som är både tillfälliga och luktberoende- beroende, med hjälp av en rad aminosyror att konstruera koncentration-respons kurvor och beräkna tröskelvärdena för detektion.

Introduction

Fisk är starkt beroende av olfaction för många aspekter av deras liv, inklusive att hitta mat, undvika rovdjur, bedöma potentiella kompisar och migration, bland annat1,2,3. Därför bedöma luktkänslighet i fisk (Vad luktar de? Hur känsliga är de för dessa föreningar?) är livsviktigt för att till fullo förstå dessa processer. Vidare kan antropogena effekter på miljön, såsom havsförsurning och föroreningar, ha djupgående effekter på luktsystemet, även vid subletala nivåer, eftersom det nödvändigtvis är i intim kontakt med det omgivande vattnet4. In vivo elektrofysiologi är den experimentella metoden i valet att bedöma luktkänslighet i fisk. Tre huvudtekniker finns: elektro-olfactogram (EOG), elektro-encefalogrammet (EEG) som registrerats från luktbulben, och multienhetsregistrering från luktnerven5.

EOG är den mest använda av dessa tre6. Det är en likström (DC) fält potential registreras ovanför lukt epitel och tros vara den summerade generator potentialer av dessa luktreceptor nervceller (ORNs) svarar på en given lukt. Men eftersom det registreras i vattnet, snarare än inuti fisken, är amplituden av svar inte bara beroende av den signal som fisken genererar, men också på ledningsförmågan hos det omgivande vattnet; ju högre ledningsförmåga (eller ju lägre motståndet är), desto lägre blir amplituden. Detta kan innebära att EOG är en mindre känslig metod i havsvatten än sötvatten7.

EEG registreras från luktbulben är också allmänt används i undersökningen av olfaction i fisk. Luktbulben är dock första ordningens bearbetningscenter för luktsensorisk ingång8; det är mycket organiserad i glomeruli, och följaktligen svaret registreras beror starkt på positionen för inspelningen elektroder. Till exempel, den input från ORNs upptäcka aminosyror bearbetas av glomeruli i den laterala regionen av luktlökar, medan att från conspecific-derived kemikalier riktas till den mediala regionen9,10,11,12. Feromonal ingång kan riktas till mycket lokaliserade glomeruli inom luktbulben. Beroende också på anatomin hos arten i fråga, kan den idealiska inspelningspositionen för en given luktdyr inte vara lättillgänglig.

Flera enheter inspelning från lukt nerv kringgår de viktigaste problemen med EOG och EEG beskrivs ovan. Eftersom det registrerar åtgärder potentialer passerar ner axoner av ORNs från epitel till glödlampan, det är en primär sensorisk signal. Och eftersom det registreras inuti fisken, amplituden av svar är oberoende av yttre salthalt. Ändå har det naturligtvis vissa nackdelar. För det första, beroende på anatomin av arten, mer omfattande kirurgi krävs för att exponera luktnerven än för EOG. För det andra, eftersom signalen är mindre än EOG, kräver det något mer sofistikerad, och därför dyr, utrustning. En allmän beskrivning av andra experimentella metoder ges av John Caprio5. Syftet med denna artikel är att beskriva hur man registrerar extracellulära flera enheter svar från luktnerven i havsbrädet (Sparus aurata) in vivo till aminosyra luktämnen som ett exempel på denna teknik, och hur man kan identifiera, och övervinna, några av de mer vanliga problem som uppstått i ett sådant experiment.

Protocol

Djurunderhåll och djurförsök utfördes i certifierade försöksanläggningar och följde den portugisiska nationella lagstiftningen (DL 113/2013) enligt en "grupp-1"-licens av Det veterinära generaldirektoratet, ministeriet för jordbruk, landsbygdsutveckling och fiske i Portugal. Eftersom detta protokoll omfattar djurhantering måste det godkännas av det lokala och/eller nationella organ som reglerar välbefinnandet hos djur som används i vetenskapliga experiment, dessutom måste forskare ha lämplig utbildning och tillstånd att genomföra sådana förfaranden.

1. Stimulus förberedelse

OBS: De flesta fiskar har mycket känsligt luktsystem, således måste stor försiktighet tas vid beredning av luktstimuli som ska användas i försöket. De glasvaror som används för att göra upp stimuli ska tvättas i 5% blekmedel (natriumhypoklorit), sköljas noggrant med kranvatten och torkas. Omedelbart före användning skölj glasvarorna noggrant med havsvatten (samma vatten som används för att göra stimulansen utspädningar). Var försiktig så att inget av detta vatten kommer i kontakt med bar hud.

  1. Gör 100 mL av 10-2 M L-glutamin, L-leucin och L-serin; förvara 1 mL alikvoter av varje vid -20 °C tills användning.
  2. På dagen för experimentet, förbereda från dessa alikvoter, 10-3 M till 10-7 M lösningar (i steg av x10 utspädning) med hjälp av både kontroll och hög CO2 havsvatten.
    OBS: L-serin (10-3 M) kommer att användas som en positiv kontroll, eller standard. Vatten som används för att göra upp utspädningarna av stimuli, och behandlas på exakt samma sätt som de stimuli men utan tillsats av någon lukt, kommer att användas som den negativa kontrollen eller blank.

2. Beredning av kontroll och högt CO2-vatten

  1. Förbered kontroll vatten genom att samla 1 L av kol-filtrerat havsvatten.
    1. Med hjälp av en pH-sond, kontrollera pH; det ska vara runt 8,2. Om inte, bubbla med atmosfärisk luft tills detta pH-värde nås.
    2. Med hjälp av en alkalinitet titrator mäta alkaliniteten i vattnet.
    3. Mät vattentemperaturen och salthalten.
  2. Förbered högt CO2 vatten genom att filtrera 1 L havsvatten, sedan bubbla CO2 tills önskad pH nås.
    1. Med hjälp av en pH-sond, kontrollera pH; det ska vara runt 7,7.
    2. Med hjälp av en alkalinitetstitrator, mät vattnets alkalinitet.
    3. Mät vattentemperaturen och salthalten.
  3. Bestäm CO2-tryck i både kontroll och högt CO2-vatten med hjälp av en programvara som är utformad för att beräkna CO2-parametrar i vatten (t.ex. CO2Calc-programvara13).
    1. I ingångsfönstret tillsätt värdena vatten pH, temperatur, salthalt och total alkalinitet (Bild 1).
    2. Välj konstanterna, enheterna och skalorna (se de rekommenderade värdena i figur 2).
    3. Tryck på knappprocessen för att bestämma CO2-tryck.
      OBS: Bild 3 visar ett exempel på ett resultatblad.

3. Beredning av fisken

OBS: En havsbryggning på 200−400 g används i detta protokoll.

  1. Bedöva fisken genom nedsänkning i luftat naturligt havsvatten som innehåller MS222 (etyl-3-aminobensoat metansulfonatsalt). När svar på en svans nypa har slutat, injicera i flanken muskeln den neuromuskulära blockeraren gallamin trietiodide (10 mg·kg-1 i fysiologisk koksaltlösning).
    OBS: Koncentrationen av bedövningsmedel som används varierar mellan arter; för ett havsbryggebröd på 200−400 g, använd 200 mg· L-1 buffrad med 400 mg· L-1 NaHCO3.
  2. Placera den sövda fisken på ett dämpat stöd. Den exakta formen och storleken beror på modellarten; för sjöbrygga (200−400 g), använd ett vadderat V-format stöd, tillverkat i hus.
  3. Placera ett kiselrör (diameter = 10 mm) i munnen, anslut röret till en nedsänkbar pump i en behållare med anestesihaltigt, luftat havsvatten, och pumpa vatten över gälarna vid ~100 mL·min-1·kg-1.
    OBS: Storleken på det använda kiselröret kommer att bero på fiskens storlek.
  4. Sätt in jordningstappen i flankmuskeln och anslut den till förstärkarens huvudsteg).
  5. Täck fisken med fuktig trasa (eller pappershandduk) med endast huvudet exponerat, vilket garanterar att övertäckningen inte hindrar utloppet från vatten från gälarna.
    OBS: Ögonen kan täckas med bitar av fuktigt papper/trasa eller svart plast.
  6. Placera röret av stimulans-leveranssystemet, dvs, glasröret ansluten till en tillförsel av bakgrund havsvatten, i näsborren.
    OBS: Mikro-hematokritrör kan användas (längd = 75 mm, ID = 1,15 mm, OD = 1,55 mm); dessa kan dras till en finare punkt på en elektrod puller för användning med mindre fisk. Det är viktigt att se till att luktepitelet hålls vått under operationen (beskrivs nedan).
  7. Exponera luktnerven genom att ta bort skallens hud och ben mellan ögonen (luktnerverna brukar springa samman mellan ögonen) med hjälp av en tandläkar (helst) eller hobby (t.ex., Dremel) borr eller juvelerares polermaskin (med tandborr-bitar) under ett dissekerande mikroskop (inuti en Faraday-bur).
    1. I havsbågen, ta bort den del av skallen omedelbart ovanför ögonen, med en cirkelsåg, från bara främre till ögonen till bara bakre till dem. Sedan, med hjälp av en borrkrona, ta bort benet mellan ögonen; luktnerverna ligger mellan ögonen.
  8. När tillräckligt ben har rensats, ta bort fett och bindväv överliggande nerverna med hjälp av fina tlys; ta hand om att inte skada nerverna eller punktera några blodkärl.
    OBS: Erfarenhet kommer att bidra till att förfina dissektionen; desto mindre dissektion, desto stabilare blir beredningen. Tillräcklig vävnad måste dock rensas; för de oerfarna, när luktlökar är bara synliga, klart något mer anteriorly att exponera den del av nerverna som de ansluter sig till lökar för att möjliggöra korrekt positionering av elektroderna.
  9. Rengör elektroderna före användning genom att ansluta dem till negativ pol av en 3V DC-källa (t.ex. två AA-batterier i serie) och placera spetsen i fysiologisk koksaltlösning (eller havsvatten utspädd 1:3 i sötvatten) för 20−30 s; en stadig ström av små bubblor bör ses som kommer från spetsen.
  10. När luktnerverna är utsatta, för in de inspelningselektroderna (som hålls på mikromanipulatorer) i en position som ger maximal respons på standarden (t.ex. 10-3 M L-serin), och ett minimalt svar på det tomma. Använd parylenbelagda volframelektroder (Table of Materials) som är anslutna till huvud-stadiet av en växelström (AC) förförstärkare.
    OBS: I sjöbölden ses oftast de starkaste svaren på aminosyror med elektroderna placerade i nervens laterala sida, nära där den förenar luktbulben. Detta kan hålla sant för andra arter, som glomerular organisationen av glödlampan är i stort sett liknande bland arter. Erfarenhet är dock alltid den bästa läraren.

4. Elektrofysiologisk inspelning

OBS: Som med de flesta elektrofysiologi, behöver multi-enhet inspelning ske inom en Faraday bur. Extracellulär inspelning kräver dock vanligtvis inte ett vibrationsdämpande bord; mest rörelse kommer att komma från fisken. Trots det krävs ett starkt, stabilt bord med en metallyta för att säkra mikromanipulatorstativens magnetiska baser.

  1. Inrätta ett stimulansleveranssystem för att möjliggöra den snabba övergången från rent bakgrundsvatten till stimulanshaltigt vatten, t.ex. Anslut det gemensamma utloppet till röret som transporterar vatten till luktrosetten, och placera den ena linjen i en havsvattenreservoar och den andra i testlösningen.
    OBS: När ventilen slås om (genom att passera likström) växlar vattenflödet från bakgrundsvatten till den som innehåller luktdyran. Stimulansen bör ges tillräckligt länge för att se en tydlig topp i den integrerade responsen, följt av en period av boende; tiden som används i det aktuella protokollet är 4 s, men längre tid kan vara nödvändig beroende på art.
  2. Anslut ventilföraren till utlösaren av en analog-digital omvandlare (t.ex. Digidata); när ventilen växlas från bakgrund till stimulans-innehållande linje, kommer detta att starta registreringen av data. Konfigurera programvaran för att börja spela in vid utlösningshändelsen och fortsätta under en förutbestämd period (t.ex. 10 s).
    OBS: Tio sekunder bör räcka, men detta kan förkortas eller förlängas, beroende på den experimentella frågan.
  3. Kontrollera preparatens stabilitet genom att testa (registrera och mäta amplituden för det integrerade svaret) upprepade gånger med standarden, 10-3 M L-serin i detta fall, och tillåta 1 min att förflyta mellan på varandra följande stimuli.
    OBS: Beroende på art och lukt bör svaren ha en amplitud inom 10% av varandra (som en tumregel), och bör ha en snabb debut, stiga till maximal aktivitet, och återgå till baslinjen efter att stimulansen är frånvarande (Figur 4).
  4. Registrera luktnerven svaren på aminosyror i kontroll havsvatten (från den lägsta till den högsta koncentrationen) och låt 1 min att förflyta mellan successiva stimuli.
    OBS: Det är möjligt att, för vissa arter och / eller vissa luktämnen, mer tid är nödvändig. Men för aminosyror och havsbream är 1 min tillräcklig.
  5. Registrera svaret på 10-3 M serin och en kontrollvattentomlösning.
  6. Ändra bakgrundsvattnet från kontroll havsvatten till hög CO2 havsvatten, genom att placera bakgrundslinjen i flaskan med hög CO2 havsvatten.
    OBS: Det är lämpligt att sätta in ett annat hematokritrör (eller motsvarande) i slutet av stimulans- och bakgrundslinjerna för att undvika att vidröra vattnet och säkerställa att rörets ände finns kvar i vattnet.
  7. Före testning av olfaktoriska nervens svar på aminosyror i högt CO2 havsvatten, villkora luktepitelet med högt CO2-vatten genom att följa det höga CO2-vattnet över luktepitelet i några minuter.
    OBS: Erfarenheten har visat att det för sjöbräde är tillräckligt med 5 min.
  8. Registrera luktnerven svar på aminosyror i hög CO2 havsvatten (från den lägsta till den högsta koncentrationen).
  9. Registrera svaret på en hög CO2 vatten tomlösning.
  10. Registrera svaret på 10-3 M serin och en kontrollvattentomlösning.
    OBS: Den råa signalen (nervaktivitet) ska filtreras (lågpass runt 2,000−5,000 Hz, high pass 50−300 Hz) och skickas till en analog-digital omvandlare (Table of Materials). För enklare kvantifiering av nervaktivitet kan råsignalen även integreras med hjälp av en läckande integratör (Table of Materials) och skickas till den analog-digitala omvandlaren, och därifrån, både råa och integrerade signaler till en dator som kör lämplig programvara (t.ex.

5. Dataanalys

  1. Subtrahera amplituden för det integrerade svaret på blindprovet (i mV) från amplituden för de integrerade svaren på alla stimuli.
  2. Normalisera svar på stimuli genom att dividera amplituden av det tidigare svaret på standarden (10-3 M serin); detta minskar variabiliteten mellan och inom fisk.
  3. Beräkna tröskelvärdena för detektion genom linjär regression av koncentrations-responskurvorna (på en semi-logaritmisk tomt), enligt formelloggen(N + 1.5) = enlog C + B, där C är molarkoncentrationen, N är den normaliserade responsens amplitud och a och b ärkonstanter 7,14.
    OBS: Tröskeln för detektering är sedan värdet för x där y = 0,1761 (dvs. logg 1,5; N = 0); koncentrationen över vilken ett svar kommer att ses (dvs. fisken kan känna lukten av det). Vissa luktämnen framkalla sigmoidal koncentration-respons kurvor när plottas semi-logarithmically (t.ex., kalcium15,16; i detta fall, de normaliserade data kan monteras på en tre-parameter Hill tomt som kommer att ge maximal respons amplitud och EG50 (dvs. [odorant] som ger halv-maximalt svar; också ett mått på känslighet).
  4. Jämför tröskelvärdena för detektion och/eller den maximala responsamplitudenoch EC 50 av stimuli som testats i kontrollvatten och de som testats i högt CO2-vatten.

Representative Results

Ett typiskt svar på den positiva kontrollen (10-3 M L-serin; Figur 4A) och negativ kontroll (blank; Figur 4B) som registrerats från luktnerven hos ett havsbröd visas i figur 4. I närvaro av den stimulans (svart horisontell bar; i lukthålan, i kontakt med luktepitel), notera den snabba ökningen av aktivitet (återspeglas i uppåtgående avböjning av den integrerade signalen) till en topp inom ungefär en sekund av stimulans inset, följt av en period av boende (medan stimulansen är fortfarande närvarande), och en återgång till baslinjen verksamhet när stimulansen har upphört. Den absoluta amplituden av svaret är starkt beroende av elektrodposition; om ett lågt amplitudsvar registreras, försök att ändra elektrodpositionerna. En långsammare ökning av toppaktivitet kan bero på att röret som transporterar det stimulansinnehållande vattnet till luktepitelet placeras för långt bort från epitelet; prova att flytta nos-röret närmare (men inte röra) epitelet. Observera att däremot väcker det tomma lite eller inget svar. Ett signifikant positivt svar (dvs. aktivitetsökning) på blindprovet kan tyda på förorening av det vatten som används för att göra stimulis utspädningar; göra färska utspädningar med rent vatten (och glas) bör lösa detta. Om inte, kan en mer grundlig rengöring av vattensystemet (inklusive aktivt kolfilter) vara nödvändigt. Ett negativt svar (dvs. minskning av aktivitet) kan tyda på en lätt förändring av flödeshastigheten när ventilen slås på grund av exempelvis en blockering i ventilen.

En typisk koncentration-responskurva (plottad semi-logaritmiskt), i detta fall till L-leucin (10-7 M till 10-3 M), visas i figur 5A. Observera att ökande koncentrationer av luktämnet framkalla allt större ökningar av aktivitet, och därför, i amplituden av de integrerade svaren. En tomt på de normaliserade uppgifterna, och motsvarande linjära regression, visas i figur 5B. Det uppskattade tröskelvärdet för detektering kan beräknas från värdet av x när y = 0,1761 (dvs. log1,5; där N = 0). I detta fall är detta värde -7,48; det vill säga den beräknade tröskeln för L-leucin i denna fisk är 10-7,48 M. Exponenten α kan på motsvarande sätt uppskattas från linjär regression av de normaliserade datan på enloggtäpp; logN = αlog[odorant] + konstant. Faktorn γ ger sedan den ökning av odorantkoncentration som krävs för att öka svarsamplituden med en logenhet; det vill säga, det är en uppskattning av brantheten i koncentrations-responskurvan17. I det här exemplet α = 0,277 och γ = 3,61; därför, för att öka responsen amplituden tiofaldigt (dvs. en logenhet; log10 = 1), måste stimulanskoncentrationen ökas med 103,61-faldigt (4,074-faldigt).

En typisk sigmooidal koncentration-responskurva (Figur 6A) när man ritar halvdygarniskt, i detta fall till L-glutamin, visas i figur 6B. En liknande koncentrationsberoende ökning av svarsamplitud ses; dock vid de högre koncentrationerna blir denna ökning mindre så att responsens amplitud når ett maximum (Nmax). Detta gör att data som ska monteras på en tre parameter Hill ekvation:
Equation 1

På så sätt kan EC50 (den luktiga koncentrationen vid vilken en 50% maximal respons framkallas) och Hill co-efficient (ett mått på brantheten i lutningen på den linjära delen av sigmoidealkurvan) beräknas.

Figure 1
Bild 1: Programvara skärmdump som visar inmatningsfönstret från programmet CO2Calc. Markerad (röda rutor) är de fält som krävs för karbonat parameterberäkning. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Programvara skärmdump som visar inmatningsfönstret för lämpliga konstanter, enheter och skalor. Värden som visas rekommenderas för förhållanden under vilka de beskrivna experimenten utfördes, de kan komma att ändras. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Skärmbild av programvara som visar resultatfönstret. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Typiska svar med flera enheter som registrerats extracellulärt från luktnerven hos sjöbröst in vivo som svar på 10-3 M L-serin (A) och blankt (B). Övre spår visar de integrerade svaren och lägre spår visar den råa (nerv) signalen. Stimuli applicerades på luktepitelet (horisontella staplar). Notera den snabba ökningen av aktiviteten under exponeringens 1-s,en topp i aktivitet, följt av en period av inkvartering (medan luktämnet fortfarande levererades till epitelet) och en återgång till baslinjenivåerna när odorantleveransen har upphört. Liten eller ingen ökning av aktiviteten ses efter stimulering med vatten som behandlas på samma sätt som odorant utspädningar, med undantag för att lägga till någon lukt (blank). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Typisk koncentration-responskurva för L-leucin som registrerats extracellulärt från luktnerven in vivo. (A) Eftersom koncentrationen av L-leucin som appliceras på luktepitelet (horisontella staplar) ökar från 10-7 M till 10-3 M, ses en samtidig ökning av aktiviteten i nerven. Övre spår visar de integrerade svaren och lägre spår visar den råa (nerv) signalen. (B) Linjär regression (R2 = 0,97) av normaliserade data plottade semi-logaritmiskt för att beräkna tröskelvärde för detektering som värdet för log[L-leucin] när log(N + 1.5) = 0.1761 (dvs. där N = 0). I det här exemplet är detta värde -7,48; den beräknade tröskeln för detektion för L-leucin i denna fisk är därför 10-7,48 M. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Typisk koncentration-responskurva för L- glutamin som registrerats extracellulärt från luktnerven in vivo. (A) Eftersom koncentrationen av L-glutamin som appliceras på luktepitelet (horisontella staplar) ökar från 10-7 M till 10-3 M, ses en samtidig ökning av aktiviteten i nerven. Övre spår visar de integrerade svaren och lägre spår visar den råa (nerv) signalen. (B) Semi-logaritmisk tomt av normaliserade data som är monterade på en treparameter Hill ekvation (R2 = 0,99). För detta exempel, den beräknade EC50 = 3,11 μM, och Hill co-efficient = 0,565). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Discussion

Den aktuella studien beskriver användningen av flerenhets (extracellulär) inspelning från luktnerven i havsbjälkar (S. aurata), en marin sparid av stor betydelse inom vattenbruket. Denna experimentella metod kan dock i stort sett tillämpas på andra fiskar; kommer kirurgi och exakt placering av elektroder klart beroende av luktsystemets anatomi, och valet och koncentrationen av bedövningsmedel kan bero på de arter som studeras. Till exempel är luktnerven av guldfisken (Carassius auratus) kort; i detta fall, inspelning av EEG från luktbulben skulle vara lättare. Valet av luktrant kan också i viss mån bero på arten. Den aktuella studien använde aminosyror. Såvitt författarna känner till, alla fiskarter undersökts hittills har luktkänslighet för aminosyror1,18. Denna känslighet har varit inblandad är olika processer såsom mat plats, kemisk kommunikation och erkännande av natala vatten19,20,21,22,23. Olika arters känslighet är dock i stort sett ganska lika och beror inte på livsstil eller livsmiljö. De är också väldefinierade molekyler och är billigt och lätt tillgängliga. Dessa skäl gör dem till ideala teststimuli för studier på olfaction i fisk, särskilt de som undersöker effekterna av antropogena störningar (t.ex., försurning eller föroreningar), där resultaten lätt kan jämföras över art24.

Beroende på arten i fråga kan förberedelserna för flerenhetsregistrering förbli stabila i flera timmar; amplituden för respons på den interna standarden (10-3 M L-serin i den aktuella studien) inte bör variera med mer än 10% mellan successiva tester. Varje betydande avvikelse från denna tumregel skulle kunna bero på: (i) förflyttning av fisken, och därför förskjutning av elektroderna och / eller nos-röret; ii) Förorening av vattnet, till exempel genom att komma i kontakt med försöksörens händer (särskilt om lägre koncentrationer av en given luktämne ger större svar än högre koncentrationer). eller (iii) försämring av preparatens hälsa). I fall i bör fisken kontrolleras för att ha flyttat; om så är, placera om den, och tillsätt mer bedövningsmedel till vattnet och / eller ge en annan dos av gallamin trietiodide. Låt 5 min och testa standarden igen. Om svaret fortfarande är mindre, flytta sedan om elektroderna och/eller nosröret tills ett tillräckligt stort svar registreras. I fall (ii), helt enkelt remake en färsk utspädning serie av lukt, med hjälp av rena glas och vatten. I fall iii, kontrollera att vattenflödet över fiskens gälar är tillräckligt, att vattnet rinner över gälarna (dvs. utträde via opercula, snarare än munnen), och vattnet är väl luftat. Olika fiskarter har vitt skilda temperaturpreferenser; se till att laboratoriets) temperatur (och det vatten som kommer i kontakt med fisken) ligger så nära temperaturen att fisken hålls vid som möjligt. Se också till att fisken inte är stressad och undvik att flytta dem (även från en tank till en annan) i minst en vecka före inspelningen. Elektriskt brus är naturligtvis bane av en elektrofysiolog liv; dock, den nuvarande artikeln är inte lämpligt medium för att diskutera hur man kan övervinna / minska detta. Ändå är 'The Axon Guide' (finns fritt som en pdf för nedladdning från tillverkarens hemsida) en källa till praktiska råd om bullerminimering. När en stor, stabil respons framkallas av standard stimulans, och en koncentrationsserie ger en koncentrationsberoende ökning av amplitud, med minimal respons på det tomma, kan inspelningssvar för att testa stimuli börja. Vissa författare ger samma stimulans tre gånger, och beräknar det aritmetiska medelvärdet för efterföljande dataanalys. Dessa är dock tekniska replikat, och detta tillvägagångssätt kommer att öka den tid en inspelningssession tar med trefaldigt. De nuvarande författarna föredrar att testa en given lukt en gång, men alltid en del av en koncentration-responskurva. Detta tillåter inte bara beräkning av tröskelvärdet för detektion eller EC50 (enligt beskrivningen), utan säkerställer också att koncentrationer nära dem som fisken skulle uppleva i sin naturliga miljö testas (detta är inte alltid känt). Dessutom är eventuella extremreaktioner, på grund av kontaminering till exempel, lättare att upptäcka; dessa kan sedan upprepas med hjälp av ett nygrigt prov om så behövs.

Multi-enhet inspelning från luktnerven kan vara invasiva, men det är mer känslig än EOG när registreras i havsvatten7, eftersom det är oberoende av yttre salthalt. Det kan därför användas för att bedöma luktkänslighet för luktämnen, såsom kalcium och natrium, förändringar i koncentrationerna av vilka också skulle påverka ledningsförmågan och följaktligen spänningar som registrerats15. Som en uppskattning av antalet ORNs som svarar på en given lukt (dvs. aktionspotentialer som färdas längs ORN-axoner från luktepitel till glödlampan) representerar den en rå, obearbetad signal (initial bearbetning av luktinmatning börjar i glödlamporna). Därför är det en bättre parameter att bedöma de direkta effekterna av föroreningar, såsom tungmetaller, och miljöförändringar, såsom pH, på luktsystemet än EOG eller EEG24,25. Inspelning från luktbulben i havsvatten med hög PCO2 (och därför lågt pH) kan påverkas av centrala effekter av pH på neural bearbetning; den 'GABAEn receptor teori' av havet försurning26, varvid minskning av vatten pH orsakar en omfördelning av Cl- och HCO3- jon i CSF och en därav följande förskjutning av GABAergic aktivering från hämmande (hyperpolariserande) till excitatoriska (depolariserande). I sådana studier är det dessutom viktigt att bedöma effekterna av försurning eller föroreningar som använder luktkoncentrationer liknande dem som fisken sannolikt kommer att stöta på i sin naturliga miljö. För aminosyror, Detta är i nano till mikromolar intervall27,28,29; nära tröskelvärdet för detektion av dessa föreningar i fisk1,18. Skattning av tröskeln för detektion för en given lukt kan ge en uppfattning om olfaktorkänslighetens betydelse och/eller biologiska roll. Till exempel har havets nejonögat (Petromyzon marinus) hög luktkänslighet för specifika gallsyror som frigörs av larver ner till en tröskel på 10-13 M30; denna känslighet gör det möjligt för vuxna att lokalisera och identifiera lämpliga lekområden, och fungerar därför som en flyttande feromon över långa avstånd. På samma sätt har mogen kvinnlig havsneony hög luktkänslighet för spermin (tröskel 10-14 M), en polyamin som frigörs i milten av hanar, som sedan lockar dem till bon av spermiating hanar31. Annan fisk har också luktkänslighet för polyaminer32,33,34,35, men inte med tillräckligt låga tröskelvärden för detektion för att stödja en liknande feromonalitet roll; istället föreslås undvikande av förfallna fiskar. Trots detta med så höga luktkänsligheter, är det möjligt att föreställa sig att en liten minskning av känsligheten (dvs. höjning av tröskelvärdet), även när svarsamplituden inte minskas dramatiskt, skulle kunna orsaka svåra problem för fisk24.

När plottas semi-logaritmically, koncentration-respons kurvor till luktämnen kan vara exponentiell, linjär eller sigmoidal18. När det gäller aminosyror är sådana halvdologeritmiska koncentration-responskurvor antingen linjära (dvs. logaritmiska), sigmooidala eller effektfunktioner7. Att ingen mättnad av svaret ses (dvs. ingen platå i koncentration-responskurvan, även vid supra-miljökoncentrationer) beror förmodligen på flera receptorer som binds till enskilda aminosyror, beroende på deras koncentration, snarare än varje aminosyrabindning till en specifik receptor; som koncentrationen av en given aminosyra ökar, fler receptorer kan binda den och därför svara. Trots det kan fisk skilja mellan blandningar av aminosyror36,37,38,39; detta är sannolikt på grund av kombinatoriska mönster av aktivitet framkallas i luktlökar12,40; axoner av alla ORNs som uttrycker den samma receptorproteinet avslutar på samma glomeruli i luktglödorna41,42, och en amino syra kan aktivera mer än en glomerulus.

Mycket specifika luktämnen, såsom feromoner, kan dock framkalla sigmooidala eller kvasi-sigmoidala koncentration-responskurvor43,44. Slutsatsen, även om inte empiriskt testas, är att dessa luktsvar beror på mycket specifika receptorer som binder feromonmolekylen och lite annat. Därför, över en given koncentration, alla receptorer är upptagna, och ytterligare ökningar kommer att framkalla några ytterligare svar i andra ORNs. Därför kan dessa uppgifter monteras på en tre-parameter Hill tomt, och maximal respons, EG50 och Hill co-effektiv kan beräknas15,45,46. Detta kan ge värdefull information, såsom skenbar affinitet och skenbart receptortal, som linjära eller exponentiella koncentration-responskurvor inte kan ge.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Arbetet i författarnas labb stöds av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, projekten PTDC/BIA-BMA/30262/2017 och UID/Multi/04326/2019 och kontraktsprogrammet DL57/2016/CP1361/CT0041 till ZV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC pre-amplifier Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL104 Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording.
Digidata Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) 1440A Analogue-digital converter.
EMG Integrator Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL703 Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve.
Faraday cage Made in-house To reduce electrical noise.
Filter Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL125/6 Filter module for electrophysiological recording.
Gallamine triethiodide Sigma-Aldrich (Portugal) G8134 Neuromuscular blocker
L-glutamine Sigma-Aldrich (Portugal) G3126 Amino acid used as odorant
L-leucine Sigma-Aldrich (Portugal) L80000 Amino acid used as odorant
L-serine Sigma-Aldrich (Portugal) S4500 Amino acid used as odorant
Metalic base-plate Any Provides base for micro-manipulators.
Micro-hematocrit tubes Any To position water supply to the olfactory epithelium
Micro-manipulators Narishige International Ltd (London, UK) M-152 Position electrodes
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Sigma-Aldrich (Portugal) E10505 Anesthetic
pH probe Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI12302 Probe to measure pH of water.
Refractometer Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI96822 Refractometer to measure water salinity
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Portugal) 746398 For saline solution
Solenoid valves The Lee Co. (Essex, CT, USA) LFAA1201618H For switching between background water and stimuus solutions (no longer available)
Stereo-microscope Zeiss, Leica, Olympus Any suitable model. For dissection and placement of electrodes.
Titrator Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI84531 Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature.
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ World Precision Instruments (Hitchin, UK) TM31A10 Extracellular electrodes.
Valve Driver Made in-house 12 V DC source for operating solenoid valves.
Water pump (submersible) Any To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasumyan, A. O. The olfactory system in fish: structure, function, and role in behaviour. Journal of Ichthyology. 44 (Suppl 2), S180-S223 (2004).
  2. Michel, W. C. Chemoreception. The Physiology of Fishes. Evans, D. H., Claiborne, J. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 471-497 (2006).
  3. Wisenden, B. D. Chemical cues that indicate risk of predation. Fish Pheromones and Related Cues. Sorensen, P. W., Wisenden, B. D. , John Wiley & Sons Inc. Ames, IA. 131-148 (2015).
  4. Tierney, K. B., et al. Olfactory toxicity in fishes. Aquatic Toxicology. 96 (1), 2-26 (2010).
  5. Caprio, J. In vivo olfactory and taste recordings in fish. Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. Current Techniques and Protocols. Spielman, A. I., Brand, J. G. , CRC Press. Boca Raton, FL. 251-261 (1995).
  6. Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electoolfactogram: a review of its history and uses. Microscopy Research and Technique. 58, 152-160 (2002).
  7. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Ozório, R. O. A., Valente, L. M. P., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to amino acids in the blackspot seabream (Pagellus bogaraveo): a comparison between olfactory receptor recording techniques in seawater. Journal of Comparative Physiology A. 197 (8), 839-849 (2011).
  8. Hamdani, E. H., Døving, K. B. The functional organization of the fish olfactory system. Progress in Neurobiology. 82 (2), 80-86 (2007).
  9. Hara, T. J., Zhang, C. Topographic bulbar projections and dual neural pathways of the primary olfactory neurons in salmonid fishes. Neuroscience. 82 (1), 301-313 (1998).
  10. Thommesen, G. The spatial distribution of odour induced potentials in the olfactory bulb of the char and trout (Salmonidae). Acta Physiologica Scandinavica. 102, 205-217 (1978).
  11. Nikonov, A. A., Caprio, J. Electrophysiological evidence for a chemotopy of biologically relevant odors in the olfactory bulb of the channel catfish. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 1869-1876 (2001).
  12. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Chemotopic, combinatorial, and noncombinatorial odorant representations in the olfactory bulb revealed using a voltage-sensitive axon tracer. Journal of Neuroscience. 18 (23), 9977-9988 (1998).
  13. Pierrot, D. E., Lewis, E., Wallace, D. W. R. MS Excel programme developed for CO2 system calculations. ORNL/CDIAC-105a, Carbon Dioxide Information Analysis Center. , Oak Ridge National Laboratory, US Department of Energy, Oak Ridge, TN. (2006).
  14. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to catecholamines and their metabolites in the goldfish. Chemical Senses. 28 (3), 207-218 (2003).
  15. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the marine teleost Sparus aurata. Journal of Experimental Biology. 203 (24), 3821-3829 (2000).
  16. Hubbard, P. C., Ingleton, P. M., Bendell, L. A., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the freshwater teleost Carassius auratus: an olfactory role for the Ca2+-sensing receptor? Journal of Experimental Biology. 205, 2755-2764 (2002).
  17. Byrd, R. P. Jr, Caprio, J. Comparison of olfactory receptor (EOG) and bulbar (EEG) responses to amino acids in the catfish, Ictalurus punctatus. Brain Research. 249 (1), 73-80 (1982).
  18. Hara, T. J. The diversity of chemical stimulation in fish olfaction and gustation. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4 (1), 1-35 (1994).
  19. Kawabata, K. Induction of sexual behavior in male fish (Rhodeus ocellatus ocellatus) by amino acids. Amino Acids. 5 (3), 323-327 (1993).
  20. Shoji, T., Yamamoto, Y., Nishikawa, D., Kurihara, K., Ueda, H. Amino acids in stream water are essential for salmon homing migration. Fish Physiology and Biochemistry. 28 (1-4), 249-251 (2003).
  21. Yamamoto, Y., Hino, H., Ueda, H. Olfactory imprinting of amino acids in lacustrine sockeye salmon. PLoS ONE. 5 (1), e8633 (2010).
  22. Kutsyna, O., Velez, Z., Canário, A. V. M., Keller-Costa, T., Hubbard, P. C. Variation in urinary amino acids in the Mozambique tilapia: a signal of dominance or individuality?. Chemical Signals in Vertebrates 13. Schulte, B., Goodwin, T., Ferkin, M. , Springer. Cham, Switzerland. 189-204 (2016).
  23. Velez, Z., Hubbard, P. C., Hardege, J. D., Barata, E. N., Canário, A. V. M. The contribution of amino acids to the odour of a prey species in the Senegalese sole (Solea senegalensis). Aquaculture. 265, 336-342 (2007).
  24. Porteus, C. S., et al. Near-future CO2 levels impair the olfactory system of a marine fish. Nature Climate Change. 8 (8), 737-743 (2018).
  25. Velez, Z., Roggatz, C. C., Benoit, D. M., Hardege, J. D., Hubbard, P. C. Short- and medium-term exposure to ocean acidification reduces olfactory sensitivity in gilthead seabream. Frontiers in Physiology. 10, 731 (2019).
  26. Nilsson, G. E., et al. Near-future carbon dioxide levels alter fish behaviour by interfering with neurotransmitter function. Nature Climate Change. 2 (3), 201-204 (2012).
  27. Fuhrman, J. A., Ferguson, R. L. Nanomolar concentrations and rapid turnover of dissolved free amino acids in seawater: agreement between chemical and microbiological measurements. Marine Ecology - Progress Series. 33 (3), 237-242 (1986).
  28. Pomeroy, L. R., Macko, S. A., Ostrom, P. H., Dunphy, J. The microbial food web in Arctic seawater: concentration of dissolved free amino acids and bacterial abaundance and activity in the Arctic Ocean and in Resolute Passage. Marine Ecology - Progress Series. 61 (1-2), 31-40 (1990).
  29. Poulet, S. A., Williams, R., Conway, D. V. P., Videau, C. Co-occurrence of copepods and dissolved free amino acids in shelf sea waters. Marine Biology. 108 (3), 373-385 (1991).
  30. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  31. Scott, A. M., et al. Spermine in semen of male sea lamprey acts as a sex pheromone. PLoS Biology. 17 (7), e3000332 (2019).
  32. Da Silva, J. P., et al. Synthetic versus natural receptors: supramolecular control of chemical sensing in fish. ACS Chemical Biology. 9 (7), 1432-1436 (2014).
  33. Hussain, A., et al. High-affinity olfactory receptor for the death-associated odor cadaverine. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 19579-19584 (2013).
  34. Michel, W. C., Sanderson, M. J., Olson, J. K., Lipschitz, D. L. Evidence of a novel transduction pathway mediating detection of polyamines by the zebrafish olfactory system. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1697-1706 (2003).
  35. Rolen, S. H., Sorensen, P. W., Mattson, D., Caprio, J. Polyamines as olfactory stimuli in the goldfish Carassius auratus. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1683-1696 (2003).
  36. Kang, J., Caprio, J. Electro-olfactogram and multiunit olfactory receptor responses to complex mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of General Physiology. 98 (4), 699-721 (1991).
  37. Kang, J., Caprio, J. Electrophysiological responses of single olfactory bulb neurons to binary mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of Neurophysiology. 74 (4), 1435-1443 (1995).
  38. Valentincic, T., Kralj, J., Stenovec, M., Koce, A., Caprio, J. The behavioral detection of binary mixtures of amino acids and their individual components by catfish. Journal of Experimental Biology. 203, 3307-3317 (2000).
  39. Valentincic, T., Wegert, S., Caprio, J. Learned olfactory discrimination versus innate taste responses to amino acids in channel catfish (Ictalurus punctatus). Physiology and Behavior. 55 (5), 865-873 (1994).
  40. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  41. Vassar, R., et al. Topographic organization of sensory projections to the olfactory bulb. Cell. 79 (6), 981-991 (1994).
  42. Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87 (4), 675-686 (1996).
  43. Keller-Costa, T., et al. Identity of a tilapia pheromone released by dominant males that primes females for reproduction. Current Biology. 24 (18), 2130-2135 (2014).
  44. Sorensen, P. W., Hara, T. J., Stacey, N. E. Extreme olfactory sensitivity of mature and gonadally-regressed goldfish to a potent steroidal pheromone, 17a,20b-dihydroxy-4-pregnen-3-one. Journal of Comparative Physiology A. 160 (3), 305-313 (1987).
  45. Keller-Costa, T., Canário, A. V. M., Hubbard, P. C. Olfactory sensitivity to steroid glucuronates in Mozambique tilapia suggests two distinct and specific receptors for pheromone detection. Journal of Experimental Biology. 217 (23), 4203-4212 (2014).
  46. Hubbard, P. C., Mota, V., Keller-Costa, T., da Silva, J. P., Canário, A. V. M. Chemical communication in tilapia: a comparison of Oreochromis mossambicus with O. niloticus. General and Comparative Endocrinology. 207, 13-20 (2014).

Tags

Tillbakadragning olfaction känslighet nerv fisk försurning aminosyra elektrofysiologi extracellulär
Extracellulär Multi-Unit Inspelning från luktnerven av Teleosts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hubbard, P., Velez, Z. Extracellular … More

Hubbard, P., Velez, Z. Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts. J. Vis. Exp. (164), e60962, doi:10.3791/60962 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter