Anpassningsbart vinklat stereotaktiskt tillvägagångssätt för mångsidig neurovetenskaplig teknik

Summary

Beskrivs här är en stereotaktisk procedur som kan rikta sig till utmanande och svår att nå hjärnregioner (på grund av rumsliga begränsningar) med hjälp av en vinklad korona tillvägagångssätt. Detta protokoll är anpassningsbart till både mus- och råttmodeller och kan tillämpas på olika neurovetenskapliga tillämpningar, inklusive kanylimplantation och mikroinjektioner av viruskonstruktioner.

Abstract

Stereotaktisk kirurgi är ett viktigt verktyg i det moderna neurovetenskapliga labbet. Förmågan att exakt och exakt rikta in sig på svår att nå hjärnregioner utgör dock fortfarande en utmaning, särskilt när man riktar in sig på hjärnstrukturer längs mittlinjen. Dessa utmaningar inkluderar undvikande av överlägsen sagittal sinus och tredje ventrikel och förmågan att konsekvent rikta selektiva och diskreta hjärnan atomkärnor. Dessutom förlitar sig mer avancerade neurovetenskapliga tekniker (t.ex. optogenetik, fiberfotometri och två-fotonavbildning) på riktad implantation av betydande hårdvara till hjärnan, och rumsliga begränsningar är ett vanligt hinder. Presenteras här är ett modifierbart protokoll för stereotaktisk inriktning av gnagare hjärnstrukturer med hjälp av en vinklad koronala strategi. Det kan anpassas till 1) mus- eller råttmodeller, 2) olika neurovetenskapliga tekniker och 3) flera hjärnregioner. Som ett representativt exempel inkluderar det beräkningen av stereotaktiska koordinater för inriktning av musen hypotalamus ventromedial kärnan (VMN) för ett optogenetiskt hämningsexperiment. Detta förfarande börjar med bilaterala microinjection av en adeno-associerade virus (AAV) kodning en ljuskänslig klorid kanal (SwiChR ++) till en Cre-beroende mus modell, följt av vinklad bilaterala implantation av fiberoptiska kanyl. Med hjälp av detta tillvägagångssätt visar resultaten att aktivering av en delmängd av VMN nervceller krävs för intakt glukos motreglering svar på insulin-inducerad hypoglykemi.

Introduction

Neural kontroll av beteende, utfodring och metabolism innebär samordning av mycket komplexa, integrativa och redundanta neurokretsar. Ett drivande mål för neurovetenskapsfältet är att dissekera förhållandet mellan neuronal kretsstruktur och funktion. Även om klassiska neurovetenskapliga verktyg (dvs. lesioning, lokala farmakologiska injektioner och elektrisk stimulering) har upptäckt vital kunskap om rollen hos specifika hjärnregioner som kontrollerar beteende och metabolism, begränsas dessa verktyg av deras brist på specificitet och reversibilitet¹.

De senaste framstegen inom neurovetenskapsområdet har avsevärt förbättrat förmågan att förhöra och manipulera kretsfunktionen på ett celltypsspecifikt sätt med hög spatiotemporal upplösning. Optogenetiska^2- och kemogenetiska^3-metoder möjliggör till exempel snabb och reversibla manipulering av aktivitet hos genetiskt definierade celltyper av fritt rörliga djur. Optogenetik innebär användning av ljuskänsliga jonkanaler, så kallade channelrhodopsins, för att kontrollera neuronal aktivitet. Nyckeln till denna teknik är gen leverans av channelrhodopsin och en ljuskälla för att aktivera opsin. En vanlig strategi för genleverans är genom en kombination av 1) genetiskt konstruerade möss som uttrycker Cre-rekombinas i diskreta nervceller och 2) Cre-beroende virusvektorer kodning channelrhodopsin.

Medan optogenetik ger ett elegant, mycket exakt sätt att kontrollera neuronal aktivitet, är metoden beroende av framgångsrik stereotaktisk mikroinjektion av virusvektorn och fiberoptisk placering i en definierad hjärnregion. Även om stereotaktiska procedurer är vanliga inom det moderna neurovetenskapliga labbet (och det finns flera utmärkta protokoll som beskriver detta^{förfarande) 4,5,6}, att konsekvent och reproducerbart rikta diskreta hjärnregioner längs mittlinjen (dvs. den mediobasala hypotalamus, ett hjärnområde som är kritiskt för regleringen av homeostatiska funktioner⁷) innebär ytterligare utmaningar. Dessa utmaningar inkluderar undvikande av överlägsen sagittal sinus, tredje ventrikel och intilliggande hypotalamus atomkärnor. Dessutom finns det betydande rumsliga begränsningar för bilateral implantation av hårdvara som krävs för hämningsstudier. Med dessa utmaningar i åtanke presenterar detta protokoll häri ett modifierbart förfarande för att rikta in sig på diskreta hjärnregioner via en vinklad stereotaktisk strategi.

Protocol

Alla förfaranden godkändes i enlighet med National Institutes of Health, Guide for the Care and Use of Animals och godkändes av både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och Environmental Health and Safety vid University of Washington.

1. Beräkning av vinklade koordinater

1. Använd en koronajärnatlas, markera en rätt triangel så att hypotenus passerar genom målregionen av intresse. I det representativa exemplet (figur 1) är den hypotalamus ventromedialkärnan (VMN) inriktad på en 15° vinkel från koronal mittlinjen.
   OBS: Placeringen av rotationsaxeln som avbildas i figur 1 (och därmed längden på sidan C) är godtycklig och kan ändras för att rikta in sig på alla hjärnregionen. Även om detta kan verka kontraintuitivt, justerar senare steg i protokollet huvudets position i z-axeln så att denna punkt överensstämmer med den stereotaktiska rotationscentrumet (se avsnitt 6). Det rekommenderas dock att inte överskrida en koronal rotationsvinkel på 15° på grund av fysiska begränsningar hos huvudhållarapparaten.
2. Fastställa önskad vinkel (a) och uppskattad längd på sidan B och använd trigonometri för att beräkna längden på sidorna A och C. Detta steg är viktigt för korrekt positionering av huvudet under rotation.
   OBS: I exemplet i figur 1används atlasstödlinjer för att approximera längden på sidan B, vilket ger en längd på 7,576 mm. Denna information används för att beräkna längden på sidan A:
   
   I det här exemplet anger 2,03 mm R/L-avståndet från mittlinjen där den fiberoptiska kanylen kommer in i hjärnan när huvudet roteras med 15°.
   1. Om du vill kan du beräkna längden på sidan C för att approximera D/V-koordinaten:
      
      OBS: 1) Hypotenusens längd (C) representerar inte injektionsdjupet men kommer att vara till hjälp vid bestämning av D/V-koordinaten, som kan behöva justeras för att rymma den ökade längden jämfört med sidan B för raka injektioner. Det rekommenderas därför att utföra testinjektioner för att optimera D/V-koordinaten. 2) I det här exemplet med inriktning på VMN erhålls två uppsättningar koordinater: en för mikroinjektionen som inte är vinklad (A/P = -1,4, R/L = 0,4 vid 0°, D/V = -5,7) och en för den vinklade fiberoptiska implantationen (A/P = -1,4, R/L = 0,0 vid 15°, D/V = -5,4).

2. Förberedelse av stereoskatten för vinklat förfarande

1. Kontrollera att stereotaktisk ram och mikromanipulator har kalibrerats (se Kopf-handboken för fullständigt protokoll).
2. Placera mitthöjdmätaren i huvudhållarens bottenplatta.
3. Säkra centreringsomfånget i verktygshållaren och sikta sedan ner i omfånget. Justera mikromanipulatorns position tills hårkorset är justerat och fokuserat på mätarkorset.
   OBS: Under detta steg placeras omfånget i huvudhållarens rotationscentrums mittplan. När mikromanipulatorn har etablerats bör den inte flyttas under de återstående stegen.
4. Placera öronstängerna i hållarna och centrera dem så att indikatorlinjerna på båda sidor är på 0 (bild 3A).
5. Använd de mediala och främre bakre rattarna påhuvudhållaren (figur 2)för att centrera öronstängerna i x- och y-planen ovanför mitthöjdsmätarens hårkors (figur 3A).
6. För att justera öronstångens position i z-axeln, ta bort öronstängerna från hållaren och ta bort mitthöjdsmätaren. Byt ut öronstängerna och centrera dem igen vid 0.
7. Sikta ner i kikarsiktet. Använd den vertikala skiftknappen (figur 3B) respektive koronal tilt ratt för att sänka och rotera öronstängerna tills kikarkorset förblir centrerat mellan öronstängerna under hela koronal rotation.
8. Stereoskatten är nu kalibrerad och klar. Gör inga ytterligare justeringar av huvudhållarens läge.

3. Beredning av material för injektion/implantation

1. Se till att alla instrument, kirurgiska verktyg och material steriliseras och placeras i ett sterilt kirurgiskt fält bredvid stereoskatten.
2. Hantera och lagra virala konstruktioner enligt deras biosäkerhetsnivå och relevanta institutionella biosäkerhetskrav.
3. Dra upp viruset i sprutan, var noga med att använda korrekt hanteringspraxis och personlig skyddsutrustning.

4. Anestesi

1. Registrera musens kroppsvikt före operationen.
2. Söv musen djupt med isofluran.
3. Se till att musen är djupt bedövad genom att utföra ett tånyptest tills rycksvaret är frånvarande. Om djuret fortsätter att visa starka reflexer, öka anestesins koncentration och/eller varaktighet.
4. Applicera ögonsalva på varje öga för att hålla dem fuktiga under operationen.
5. Raka hårbotten från strax bakom öronen till strax bakom ögonen med en hårklippare.
6. Förse musen med IACUC-godkänd smärtstillande medel.
7. Övervaka djuret kontinuerligt under hela det kirurgiska ingreppet och ge termiskt stöd.

5. Kirurgiskt ingrepp

1. Placera huvudet i huvudhållaren genom att placera de övre snedställningarna i gapet i bettstången och se till att tungan är under bettstången.
2. Fäst huvudet i öronstängerna genom att försiktigt föra in öronstängerna i den yttre auditiva meatusen, vilket säkerställer att öronstängerna är symmetriskt placerade (vanligtvis mellan tre och fyra för en vuxen mus). Detta steg är avgörande för att säkerställa att huvudet är stabilt och centrerat för rotation.
3. Aseptiskt förbereda det rakade snittområdet med tre alternerande scrubs av betadin och alkohol svabbprover, eller med alternativa institutionellt godkända kirurgiska webbplats förberedelse.
4. Placera ett kirurgiskt draperi över djuret för att upprätthålla ett sterilt kirurgiskt fält och för att minska risken för postoperativ infektion.
5. Exponera skallen genom att göra ett snitt längs hårbottens sagittala mittlinje. Skrapa försiktigt skallens yta för att ta bort eventuell fascia och exponera suturerna.
   OBS: Om suturlinjer är svåra att visualisera kan väteperoxid appliceras på skallen med hjälp av en steril bomullsspetsad applikator för att förbättra suturvisualiseringen.
6. Placera centreringsomfånget i hållaren och centrera hårkorset på bregma(bild 4, vänster panel). Noll mikromanipulatorn.
7. Flytta hårkorset kaudally till lambda och notera bregma-lambda (B-L) avståndet.
   OBS: Om suturlinjerna inte följer en rak linje längs mittlinjen, rekommenderas att man upprättar mittlinjen med hjälp av "linjen för bästa passform" genom både bregma och lambda. Om ovanstående steg följs bör dock den ursprungliga placeringen av kikarsiktet vara halvvägs mellan öronstängerna och nära ungefärlig B-L-midline suturen.
8. Om B-L-avståndet är betydligt mindre eller större än 4,21 mm justerar du stegvis den tilldelade knäsmman för att få ett B-L-avstånd på 4,21 mm ± 0,2 mm.
9. Ersätt centreringsomfånget med justeringsindikatorn. Placera sonderna på lambda och bregma och justera den dorsala lutningsratten på huvudhållaren så att den planar ut i sagitalplanet (näsan vänd uppåt eller nedåt) och använd sedan centreringsomfånget för att omtilldela bregma.
10. Använd justeringsindikatorn för att plana ut i koronarplanet med hjälp av koronalutningsratten. Mät vid flera punkter i hela rostral/kaudalaxeln för att ta hänsyn till ytdeformationer i skallen.
11. Observera positionen på ratten på koronalutningsratten, eftersom det är 0° rotationsläge.

6. Rikta in rotationens centrala axlar för vinklade koordinater

1. Säkra centreringsomfånget i verktygshållaren och placera mikromanipulatorn på den beräknade koordinaten från avsnitt 1. Observera att R/L-koordinaten för den vinklade implantationen motsvarar längden på sidan A.
   1. I exemplet i figur 1är de vinklade koordinaterna för fiberoptisk placering som riktar sig till VMN (A/P = -1,4, R/L = [2,03] vid 0° korononarotation, [0,00] vid 15° korononering, D/V = -5,4).
2. Sikta ner omfånget och markera den här koordinaten (R/L 2,03 mm från mittlinjen enligt VMN-exemplet. Bild 4, mittpanelen). Detta märke representerar den punkt där kanylen kommer in i hjärnan när huvudet roteras.
3. Flytta mikromanipulatorn över mittlinjen (R/L = 0,00). Använd koronan tilt ratt för att rotera huvudet till den vinkel som beräknas i avsnitt 1.
   1. Om omfångets hårkors redan är i linje med märket fortsätter du till avsnitt 7.
   2. Om omfångets hårkors inte är i linje med referensmarkeringen justerar du huvudpositionen i z-axeln med hjälp av den vertikala skiftknappen (figur 2) tills hårkorset är så nära märket som möjligt.
4. Vrid tillbaka huvudet till 0° koronanläge. Om det lodräta skiftet justerades i steg 6.3 omtilldelar du bregma med hjälp av centreringsomfånget.
5. Upprepa steg 6.3 och 6.4 tills hårkorset konsekvent träffar referensmarkeringen när huvudet roteras (bild 4C).
6. Vid denna tidpunkt bör den godtyckliga rotationspunkt som fastställs i avsnitt 1 nu justeras med det stereotaktiska rotationscentrumet.

7. Mikroinjektion

1. Placera stereotaktisk borr i hållaren och manövrera mikromanipulatorn till den första injektionskoordinaten.
   1. Enligt exemplet för att rikta in vmn, borra på A /P = -1,4 och R/L = 0,4 medan huvudet är jämnt.
2. Sänk borren tills borrkron är precis ovanför skallen. Slå på borren och sänk försiktigt tills borrkron just har borrat genom skallen (inte duran).
3. Upprepa för kontralateral injektionsstället.
4. Använd en steril nåldriv förare för att föra in en 90° böjning i en 27-30G nål (t.ex. av en steril 0,5 ml insulinspruta) och använd den böjda nålen för att försiktigt peta genom dura mater.
5. OBS: Om blödning uppstår, tryck med en steril applikator med bomullsspets och rengör med sterilt vatten tills blödningen har upphört.
6. När du är redo att injicera, placera försiktigt en fylld Hamilton-spruta i stereotaktisk hållare.
   OBS: Koordinaterna på mikromanipulatorn gäller inte längre efter byte till ett nytt verktyg. Använd mitten av borrhålet som nytt mål för injektion.
7. Placera försiktigt nålen ovanför borrhålet.
8. Sänk nålen tills den något vidrör duran i mitten av borrhålet. KRITISK: Nollställ mikromanipulatorn endast i z-axeln, så att koordinaterna på mikromanipulatorn för det stereotaktiska centreringsomfånget och borren bibehålls.
9. Sänk långsamt nålen i hjärnan och titta noga för att säkerställa att nålen inte avböjer på kanten av borrhålet. Fortsätt att sänka tills 0,05 mm ventral till D/V injektionskoordinaten och vänta 1 min. Detta extra steg skapar en liten "ficka" för att minimera viralt återflöde vid borttagning av nålar.
10. Lyft långsamt nålen till D/V-koordinaten och starta injektionen.
    Obs: Flödeshastigheten och volymen varierar beroende på målregion och experimentell design. För optogenisk tystning av VMN-nervceller önskas tillräcklig täckning, så 200 nL virus injiceras med en hastighet av 1 nL/s.
11. Efter mikroinjektion, vänta 10 min på injektionsstället för att minimera utflödet av virus under utstinensen.
12. Dra långsamt ut mikropipetten från hjärnan med en ungefärlig hastighet av 1 mm/min.
13. När nålen är fri från skallen, mata ut en liten mängd virus för att säkerställa att nålen inte har täppt till med blod eller vävnad. Använd en steril applikator med bomullsspets för att ta bort viruset innan du fortsätter.
14. Upprepa steg 7.6–7.12 för kontralateralsidan.
15. Försegla mikroinjektionsborrhålen med benvax för att förbättra läkningen (Figur 5B).

8. Fiberoptisk implantation

OBS: Efter viral injektion implanteras bilaterala fiberoptiska kanyler i den beräknade vinkeln per avsnitt 1. Observera att dessa koordinater redan bör markeras på skallen från avsnitt 6.

1. Upprepa steg 7.1 –7.4 för de vinklade koordinaterna.
2. Sätt tillbaka huvudet i nivå 0°-läge.
3. Använd sedan handborren för att producera ytterligare fyra hål för benskruvarna: två ska placeras fram och två bakvänt(figur 5A). Dessa kommer att fungera som ankare för att fästa fiberoptikerna på skallen (Figur 5D).
   OBS: Se till att utrymmet hålen tillräckligt långt bort från de vinklade koordinatborrhålen för att rymma ferruledelen av fiberoptiska som sitter ovanför skallen.
4. Så försiktigt som möjligt, använd den lilla flathead skruvmejseln för att ställa in benskruvarna så att de sitter ordentligt i skallen men inte tränger in i hjärnan.
5. Kläm fast en fiberoptisk kanyl i kanylhållaren och placera den i stereotaktisk hållare.
6. Vrid huvudet till den beräknade vinkeln och antänd igen att koordinaterna på mikromanipulatorn inte gäller för det nya verktyget. Använd mitten av de vinklade borrhålen som implantationsmål.
7. Sänk fiberoptiska tills den bara vidrör duran i mitten av borrhålet (Figur 5C). Nollställ mikromanipulatorn i z-axeln och sakta långsamt fiberoptiska till den vinklade D/V-koordinaten (-5,4 enligt VMN-exemplet).
8. Använd cyanoakrylatgel för att ansluta den fiberoptiska ferrulen till de ensidiga ankarskruvarna och applicera sedan en accelerant med en mikropipettespets (Figur 5D).
9. När cyanoakrylatgelen har härdat helt lossar du kanylhållaren försiktigt och höjer tills den är fri från den fiberoptiska ferrule.
10. Upprepa steg 8,5–8,9 för den kontralaterala vinklade koordinaten och jämna sedan huvudet. För extra säkerhet, gör en extra anslutning mellan de två vinklade fiberoptiska kanylerna med cyanoakrylatgelen och acceleranten (Figur 5D).
11. Förbered en liten, relativt tunn mängd tandcement. Applicera på skallens yta och se till att noggrant täcka ankarskruvarna och basen på de fiberoptiska kanylerna. Lämna tillräckligt med ferrule ren för efterföljande parning med fiberoptiska patchkablar.
12. När cementet är klart, ta bort musen från stereotaktiska apparaten.
13. Placera musen i en återhämtningsbur med termiskt stöd. Låt den återhämta sig och överföras till hemburen när den verkar alert, mobil och grooming.

9. Postkirurgisk vård

1. Övervaka djur dagligen i 3 dagar postoperativt för beteende, hållning, aktivitet och grooming och för register över matintag och kroppsvikt.
2. Om djur uppvisar några allmänna indikatorer på smärta eller dålig hälsa, rådgör med veterinärtjänster.
3. Tillåt möss minst 2 veckor för återhämtning och för virusuttryck innan du påbörjar beteendestudier.

10. Optogenetik

1. För utförandet av optogenetikstudier, se Sidor et al.⁸.
2. Validera virusuttryck och fiberplacering när studierna är klara.

Representative Results

Detta protokoll beskriver ett kirurgiskt ingrepp för att utföra optogenetik studier för att förhöra rollen av hypotalamus VMN nervceller i glykemisk kontroll⁹. Först används var en standard (icke-vinklad) stereotaktisk strategi för bilaterala microinjection av en hämmande channelrhodopsin virus till VMN. Även om ett vinklat tillvägagångssätt också skulle vara lämpligt, valdes standardmetoden (icke-vinklad) eftersom det är tillräckligt för att rikta in sig på hjärnans intresseregion och är ett enkelt, tillförlitligt och konsekvent tillvägagångssätt. Med tanke på VMN:s närhet till mittlinjen, gjorde utrymmesbegränsningarna dock inte det möjligt att icke-vinklade implantation av bilaterala fiberoptik, vilket krävde utveckling av en kirurgisk strategi för exakt implantering av fiberoptiker i en vinkel (figur 6).

Med hjälp av denna kirurgiska strategi mikroinjected vi en Cre-beroende AAV uttrycker en modifierad channelrhodopsin anjon-ledande kanal smält med fluorescerande reporter, kallas en "SwiChR ++" virus¹⁰, bilateralt till VMN av Nos1-cre möss. Detta följdes av implantation av en fiberoptisk dorsolateral till varje injektionsställe i en 15° vinkel från mittlinjen. Som förväntat begränsades virusuttrycket till VMN och upptäcktes inte i andra hjärnområden.

Figur 1: Representativt exempel på beräkning av vinklade koordinater som är inriktade på hypotalamus ventromedialkärna. Vinklar och linjesegment ritas inte för att skalas. A)Denna längd bör beräknas med hjälp av grundläggande trigonometri. I det här exemplet A = 2,03 mm. (B) Uppskattad längd baserat på tilldelning av godtycklig rotationsaxel. I det här exemplet beräknade B = 7,576 mm. (C) hypotenus. Det bör noteras att djupet av fiberoptisk / nål insättning beror på önskad närhet till mål regionen, vilket kräver optimering. Denna siffra har ändrats från Faber et al. 2019¹¹. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Justeringsknappar för den stereotaktiska huvudhållarapparaten. Denna siffra har ändrats från Faber et al. 2019¹¹. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 3: Rikta in rotationshuvudhållarcentrum. A)Placering av öronstängerna. (B) Sikta ner omfånget under 0° nivå koronal rotation (vänster), under 15° rotation innan du justerar den vertikala skiftet, och rotationscentrum är feljusterat (mitten) och under 15° rotation efter justering av det vertikala skiftet, och rotationscentrum är korrekt justerat (höger). Denna siffra har ändrats från Faber et al. 2019¹¹. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4: Tilldela knäsmör och rikta djurhuvudet mot centrala rotationsaxlar. a)Representativ bild som anger typisk knägmaplacering. (B) Rita ett referensmärke medan huvudet är jämnt, före justering. (C) Korrekt justerad rotationsaxel, efter justering av den vertikala förskjutningen och justeringen av bregma. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 5: Fiberoptisk implantation. (A) Centreringsområdesvy av pilothål för mikroinjektion (m), fiberoptiska (f) och ankarskruvar (*). (B) Centreringsomfångsvy av implanterade ankarskruvar och borrhål med benvaxtäckt mikroinjektion. C)Placering av fiberoptiska på plats under vinklad implantation. D)Representativ bilateral vinklad fiberoptisk placering. Prickade svarta pilar indikerar områden där superlim används för att förankra fiberoptiska till ankarskruvarna och ensidig fiberoptisk. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 6: Representativa resultat för bilateral inriktning av ventromedial hypotalamus. (A) Schematisk som representerar bilateral mikroinjektion och vinklad fiberoptisk strategi för att rikta in sig på VMN. B)Representativ bild som visar bilaterala uttryck för SwiChR-GFP och vävnadsskador från vinklade fiberoptiska skrifter. 3V = tredje ventrikeln, ARC = arcuate nucleus och VMN = ventromedial nucleus. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

De senaste framstegen inom neurovetenskap har stött avancerad insikt och förståelse för aktiviteten och funktionen hos hjärnans neurokretsar. Detta inkluderar tillämpningen av optogenetisk och kemogenetisk teknik för att aktivera eller tysta diskreta neuronala populationer och deras projektionsplatser in vivo. På senare tid har detta inkluderat utveckling av genetiskt kodade kalciumindikatorer (t.ex. GCaMP, RCaMP) och andra fluorometriska biosensorer (t.ex. dopamin, noradrenalin) för in vivo-registrering av neuronal aktivitet i en definierad celltyp hos fritt rörliga djur. En effektiv anställning av dessa tekniker är dock beroende av en framgångsrik stereotaktisk kirurgi för att rikta in sig på den region där det är av intresse. Medan det finns flera etablerade protokoll som beskriver dessa metoder, som är lämpliga för att rikta in sig på många hjärnregioner, representerar inriktning på djupa hjärnregioner längs mittlinjen betydande ytterligare utmaningar. Demonstreras här är en detaljerad kirurgisk teknik för att rikta diskreta hjärnregioner via en vinklad stereotaktisk strategi. Viktigt är att denna teknik kan anpassas och tillämpas på ett brett spektrum av neurovetenskapliga tekniker (dvs optogenetik, chemogenetik och fiberfotometri).

Med detta tillvägagångssätt, Det visas att akut optogenetisk tystning av VMN nervceller uttrycker neuronal kväveoxid syntas (VMN^NOS1 nervceller) trubbiga glukagon svar på insulin-inducerad hypoglykemi hos möss⁹. Med hjälp av en något modifierad strategi, det är ytterligare visat att ensidiga aktivering av VMN^NOS1 nervceller 1) framkallar robust hyperglykemi som drivs av kontraregulatoriska svar som normalt är reserverade för svaret på hypoglykemi, och 2) framkallar defensiv orörlighet beteende. Dessutom innebär dessa beteendemässiga och metaboliska svar neuronala projektioner till distinkta hjärnområden. Specifikt är aktiveringen av VMN^{NOS1-nervceller} som projicerar till den främre sängkärnan i stria terminalis involverade i glykemiska svar, medan VMN^{NOS1-nervceller} som projicerar till periaqueductal gray är kopplade till rädsla-inducerad beteende svar⁹.

Det bör noteras att protokollet är mycket specifikt för Kopf Model 1900 stereotax och medföljande tillbehör. Även om detta system möjliggör exakt, reproducerbar implantation samt mikroinjektion till diskreta hjärnregioner (med en gemensam mittlinjeposition över flera verktyg), kan strategin och tillvägagångssättet anpassas för att passa andra stereotaxiska ramar. Specifikt, i stället för att rotera huvudet för att utföra vinklade mikroinjektioner och implantationer, är ett alternativt tillvägagångssätt att använda samma principer och rotera dorsal-ventral manipulatorn istället (se Correia et al.¹²).

Som med alla nya metoder är det viktigt för individer att optimera tekniken för att förbättra ett experiments tillförlitlighet, konsekvens och noggrannhet. Dessutom är det viktigt att inkludera nödvändiga lämpliga kontroller för korrekt analys och tolkning av uppgifter. Dessa inkluderar användning av Cre-negativa littermate kontroller, viral reporter kontroller (dvs. AAV-GFP), verifiering av ljusberoende neuronal avfyrning modulering med hjälp av elektrofysiologi, och (efter studien slutförande) validering av viral inriktning och fiberoptic placering i regionen av intresse. Det rekommenderas att Cardozo och Lammel^{13 offentliggör detta för} en detaljerad översyn av tekniska överväganden och föreslagna kontroller.

Sammanfattningsvis har införandet av mer avancerade och exakta neurovetenskapliga tekniker stött en betydande utveckling och förståelse av hjärnans roll i beteende, kognition och fysiologi, och dessa framsteg kan leda till potentiella terapier för CNS-relaterade sjukdomar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiberoptic Cannulae	Doric Lenses	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System	Kopf	Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge	Kopf	Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator	Kopf	Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator	Kopf	Model 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	--
Mouse bone screws	Plastics One	00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill