Denne protokollen beskriver en in vivo analyse av fagocytose som brukes til å vurdere og kvantifisere evnen til unge og alderen Drosophila melanogaster hemocytes til fagocytose bakterier.
Fagocytose er en viktig funksjon av den medfødte immunresponsen. Denne prosessen utføres av fagocytiske hemocytes hvis primære funksjon er å gjenkjenne et bredt spekter av partikler og ødelegge mikrobielle patogener. Etter hvert som organismene eldes, begynner denne prosessen å avta, men lite er kjent om de underliggende mekanismene eller det genetiske grunnlaget for immundeenscens. Her brukes en injeksjon basert på vivo fagocytoseanalyse til å vurdere aldersrelaterte endringer i ulike aspekter ved fagocytose, som binding, oppslukning og nedbrytning av internaliserte partikler, ved å kvantifisere fagocytiske hendelser i hemocytes hos voksne Drosophila. Drosophila melanogaster har blitt en ideell modell for å undersøke aldersrelaterte endringer i medfødt immunfunksjon av mange grunner. For det første er mange genetiske komponenter og funksjoner av den medfødte immunresponsen, inkludert fagocytose, evolusjonært bevart mellom Drosophila og pattedyr. På grunn av det, resultater fra å bruke denne protokollen er sannsynlig å være allment relevant for å forstå aldersrelaterte endringer i immunforsvaret i en rekke organismer. I tillegg merker vi oss at denne metoden gir kvantitative estimater av hemocyte fagocytisk evne, noe som kan være nyttig for en rekke forskningsemner, og trenger ikke være begrenset til studier av aldring.
Det medfødte immunsystemet, som består av fysiske og kjemiske barrierer mot infeksjon samt cellulære komponenter, er evolusjonært bevart på tvers av flercelledeorganismer 1,,2. Som den første forsvarslinjen spiller det medfødte immunsystemet en kritisk rolle i bekjempelse av invaderende patogener i alle dyr1,2,3. Komponentene i den medfødte immunresponsen inkluderer et bredt spekter av celletyper som er klassifisert på grunnlag av at de mangler spesifisitet og immunologisk minne2,,3,4. Hos mennesker inkluderer disse celletypene fagocytosymoncytter og makrofager, nøytrofiler og cytotoksiske naturlige drapsceller4,5. Mens det å ha et funksjonelt immunsystem er viktig for vertsoverlevelse, er det klart at funksjonen til immunceller avtar med alderen, et fenomen kjent som immundeenscens5,6. Å kunne vurdere aldersrelaterte endringer i immunresponsen, inkludert ulike aspekter ved prosessen med fagocytose, kan hjelpe til med vår forståelse av immundeenscens. Prosedyren vi beskriver her gir en effektiv og repeterbar tilnærming til å evaluere og kvantifisere fagocytiske hendelser ved hemocytter i Drosophila melanogaster.
Drosophila er en ideell modell for å studere immunresponsen av mange grunner. For det første er det et omfattende sett med genetiske verktøy tilgjengelig som gjør det mulig å enkelt manipulere genuttrykk på en vevsavhengig måte7. Disse verktøyene inkluderer en samling av mutanter, RNA interferens aksjer, GAL4 / UAS aksjer, og Drosophila Genetic Reference Panel som inneholder 205 forskjellige innavlede linjer som hele genomsekvenser er katalogisert8. Den korte livssyklusen til Drosophila og det store antallet individer som produseres, gjør det mulig for forskere å teste flere individer i et kontrollert miljø, på kort tid. Dette forbedrer i stor grad evnen til å identifisere subtile forskjeller i immunresponser på infeksjon blant genotyper, mellom kjønnene eller på tvers av aldre. Viktigere, mange genetiske komponenter og funksjoner av medfødt immunrespons, inkludert fagocytose, er evolusjonært bevart mellom Drosophila og pattedyr1,2.
I Drosophila utføres prosessen med fagocytose som følger infeksjon av fagocytiske hemocytter kalt plasmacytter, som tilsvarer pattedyrmakrofager9. Hetycytter er avgjørende for å gjenkjenne et bredt spekter av partikler og fjerne mikrobielle patogener9,,10,,11,,12,,13. Disse cellene uttrykker en rekke reseptorer som må skille seg fra ikke-selv, og initiere signalhendelser som trengs for å utføre den fagocytiske prosessen10,11,12,13,14,15. Når en partikkel er bundet, begynner den å bli internalisert ved omorganisering av actin cytoskeleton og ombygging av plasmamembranen for å utvide rundt partikkelen, og danner en fagocytisk kopp11,12,13,14. Under denne prosessen forteller et annet sett med signaler cellen å internalisere partikkelen ytterligere ved å lukke den fagocytiske koppen, danner en membranbundet fagbinding11,12,13,14,15. Den farosom deretter gjennomgår en modningsprosess, forbinder med ulike proteiner og fusjonerer med lysosomer, danner en sur phagolysosome11,12,13,14,15. På dette punktet kan partikler effektivt bli degradert og eliminert11,12,13,14,15. Drosophila studier har vist at eldre fluer (4 uker) har en redusert evne til å fjerne en infeksjon sammenlignet med yngre fluer (1 uke gammel), sannsynligvis skyldes, i hvert fall delvis, til en nedgang i noen aspekter av fagocytose16,17.
Metoden som er beskrevet her benytter to separate fluorescerende merkede varmedrepte E. coli-partikler, en som bærer en standard fluorofore og en som er pH-følsom, for å vurdere to forskjellige aspekter av fagocytose: den første oppslukningen av partikler, og nedbrytning av partikler i fagosofisk. I denne analysen er fluor-partikkelfluorescens observerbar når partiklene er bundet og oppslukt av hemocytter, mens pH-følsomme partikler fluoresce bare i de lave pH-forholdene i phagosome. Fluorescerende hendelser kan deretter observeres i hemocytes som lokaliserer langs dorsalfartøyet. Vi fokuserer på hecytter lokalisert til dorsalfartøyet, som gir et anatomisk landemerke for å lokalisere hemocytes som er kjent for å bidra til bakteriell clearance, og for å konsekvent isolere dem. Imidlertid er hemocytter i andre deler av kroppen og hemolymph også viktig for klaring. Selv om vi ikke har studert denne cellepopulasjonen, kan vår generelle prosedyre også gjelde for fagocytiske analyser av disse cellene. En fordel med vår tilnærming er at vi kan kvantifisere fagocytiske hendelser i individuelle hemocytes, slik at vi kan oppdage subtil variasjon i fagocytiske prosesser. Andre studier som visualiserer fluorescerende hendelser gjennom skjellaget18,19 tar ikke hensyn til forskjeller i antall hemocytes tilstede, noe som er spesielt viktig å vurdere i vårt tilfelle som total hemocyte teller forventes å endres med alder17.
Protokollen som er beskrevet her er en pålitelig måte å kvantifisere ulike aspekter ved fagocytose, under kontrollerte eksperimentelle forhold. Vi merker oss at vi bare har testet denne prosedyren med gram negative bakterielle partikler, og resultatene kan variere hvis gram positive bakterielle partikler brukes. Faktisk ville det være interessant å sammenligne de fagocytiske svarene med både gram negative og gram positive bakterier i forskjellige eksperimentelle forhold. Bruken av en nanoinjektor gir nøyaktig kontroll over injeksjonsvolumer, slik at hver fly injiseres med samme volum av partikler. En begrensning av protokollen kommer fra uoverensstemmelser i partikkelpreparater. Partikler vil aggregere når de er frosset, så små variasjoner i fortynningsvolumer, eller mangel på virvlende, kan påvirke partikkelkonsentrasjonen mellom eksperimenter. For å minimere mulige variasjoner i partikkelkonsentrasjoner mellom aldre, er det gunstig å injisere 1- og 5-ukers gamle fluer på samme dag, ved hjelp av samme nål og partikkelløsning. En annen potensiell ulempe er at under disseksjoner kan dorsalfartøyet og/eller skjellaget lett bli skadet hvis pinnene ikke håndteres riktig. For å unngå å forstyrre dorsalbeholderen, minimer antall pinner som brukes per disseksjon. Fordelen med denne disseksjonsmetoden er at alle fikserings-, vasketrinn og fargetrinn kan utføres i disseksjonsplaten. Fordi neglebåndene er festet, forhindrer dette at neglebåndene går tapt mellom trinnene.
Sammenlignet med eksisterende metoder18,19,25,26,27,28,29, den beskrevne protokollen har sine fordeler og begrensninger. Ved å dissekere dorsalfartøyet, er vi i stand til å visualisere og kvantifisere individuelle hemocytes på dette stedet. Dette gjør det mulig å oppdage subtile variasjoner i fagocytisk aktivitet mellom eksperimentelle grupper. Andre metoder visualiserer fluorescerende merkede partikler ved å samle hemocytes ved hjelp av en Bleed / Scrape analyse19,25,26,27, eller gjennom en intakt ventral cuticle18,19,28,29; Individuelle hemocytes kan imidlertid ikke vurderes når de visualiseres gjennom dorsal cuticle. Fordelen med denne protokollen, sammenlignet med Bleed / Scrape-metoden er at vår metode tillater oss å vurdere bare de hemocytes knyttet til dorsal fartøyet, og står for sirkulerende celler eller de langs kroppsveggen, som kan være funksjonelt annerledes. Dissecting dorsal fartøyet fjerner også behovet for å inkludere en andre runde med injeksjoner med en fluorescens quencher, som Trypan blå19,26. Dette er fordi eventuelle partikler som ikke er bundet til eller oppslukt av en celle, vil bli vasket bort under vasketrinn. Omvendt kan alternative metoder være lettere å utføre fordi de ikke krever disseksjoner. Selv om dissekering av dorsalfartøyet er lett å lære, legger dette trinnet til et kompleksitetsnivå som kanskje ikke er mulig i noen eksperimentelle design.
Selv om den beskrevne bruken av denne in vivo fagocytoseanalysen er å vurdere og kvantifisere fagocytiske hendelser mellom ulike aldre, er denne protokollen svært tilpasningsdyktig og kan brukes til å analysere ulike aspekter av fagocytose mellom genotype, kjønn eller vevstype. Med fagocytose er av sentral betydning for de fleste flercellede dyr, forstå hvordan denne prosessen avtar med alderen kan føre til bedre terapeutiske behandlinger for den aldrende befolkningen. Denne tilnærmingen gir langsiktig potensial for å belyse aspekter av aldersrelaterte endringer i immunresponsen, med spesielt fokus på fagocytose.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health R03 AG061484-02 og UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
35×10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
Glass slides | Premiere | D17026102 | |
Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55℃ Solenoid: 45 |
Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |