Summary
Dit protocol beschrijft een in vivo test van fagocytose die wordt gebruikt om het vermogen van jonge en oude Drosophila melanogaster hemocyten te beoordelen en te kwantificeren..
Abstract
Phagocytose is een essentiële functie van de aangeboren immuunrespons. Dit proces wordt uitgevoerd door fagocytische hemocyten waarvan de primaire functie is om een breed scala aan deeltjes te herkennen en microbiële pathogenen te vernietigen. Naarmate organismen ouder worden, begint dit proces te dalen, maar er is weinig bekend over de onderliggende mechanismen of de genetische basis van immunosenscentie. Hier wordt een injectie gebaseerd op vivo fagocytosetest gebruikt om leeftijdsgerelateerde veranderingen in verschillende aspecten van fagocytose te beoordelen, zoals binding, engulfment en afbraak van geïnternaliseerde deeltjes, door phagocytische voorvallen in hemocyten bij volwassen Drosophila te Drosophila kwantificeren. Voor een, veel genetische componenten en functies van de aangeboren immuunrespons, met inbegrip van fagocytose, zijn evolutionair bewaard gebleven tussen Drosophila en zoogdieren. Daarom zijn de resultaten van het gebruik van dit protocol waarschijnlijk op grote schaal relevant voor het begrijpen van de leeftijdsgerelateerde veranderingen in de immuunfunctie in een verscheidenheid van organismen. Bovendien merken we op dat deze methode kwantitatieve schattingen van hemocyte fagocytische vermogen biedt, die nuttig kunnen zijn voor een verscheidenheid van onderzoeksonderwerpen, en hoeft niet te worden beperkt tot studies van veroudering.
Introduction
Het aangeboren immuunsysteem, dat bestaat uit fysieke en chemische barrières voor infectie en cellulaire componenten, is evolutionair bewaard over meercellige organismen1,2. Als eerste verdedigingslinie speelt het aangeboren immuunsysteem een cruciale rol bij de bestrijding van binnenvallende ziekteverwekkers bij alle dieren1,2,3. De componenten van de aangeboren immuunrespons omvatten een breed scala aan celtypen die worden ingedeeld op basis van het feit dat ze specificiteit en immunologisch geheugen2,3,4missen . Bij mensen omvatten deze celtypen fagocytische monocyten en macrofagen, neutrofielen en cytotoxische natuurlijke killercellen4,5. Hoewel het hebben van een functioneel immuunsysteem noodzakelijk is voor de overleving van de gastheer, is het duidelijk dat de functie van immuuncellen afneemt met de leeftijd, een fenomeen dat bekend staat als immunosenescentie5,6. In staat zijn om leeftijdsgebonden veranderingen in de immuunrespons te beoordelen, inclusief verschillende aspecten van het proces van fagocytose, zou kunnen helpen bij ons begrip van immunosenescentie. De procedure die we hier beschrijven biedt een effectieve en herhaalbare aanpak om fagocytische voorvallen te evalueren en te kwantificeren door hemocyten in Drosophila melanogaster.
Drosophila is een ideaal model voor het bestuderen van de immuunrespons om vele redenen. Voor een, er is een uitgebreide set van genetische instrumenten beschikbaar die het mogelijk maken om gemakkelijk te manipuleren genexpressie in een weefsel-afhankelijke manier7. Deze tools omvatten een verzameling mutanten, RNA interferentie voorraden, GAL4 / UAS voorraden, en de Drosophila Genetic Reference Panel dat 205 verschillende inteelt lijnen bevat waarvoor de gehele genomen sequenties zijn gecatalogiseerd8. De korte levenscyclus van Drosophila en het grote aantal geproduceerde individuen stellen onderzoekers in staat om meerdere individuen te testen in een gecontroleerde omgeving, in een korte periode van tijd. Dit verbetert sterk het vermogen om subtiele verschillen in immuunrespons op infectie bij genotypen, tussen geslachten of over leeftijden te identificeren. Belangrijk is dat veel genetische componenten en functies van de aangeboren immuunrespons, waaronder fagocytose, evolutionair worden bewaard tussen Drosophila en zoogdieren1,2.
In Drosophila wordt het proces van fagocytose dat volgt op infectie uitgevoerd door fagocytische hemocyten genaamd plasmatocyten, die gelijkwaardig zijn aan macrofagen van zoogdieren9. Hemocyten zijn essentieel voor het herkennen van een breed scala aan deeltjes en het opruimen van microbiële pathogenen9,10,11,12,13. Deze cellen drukken een verscheidenheid aan receptoren uit die zich moeten onderscheiden van niet-zelf en signaleringsgebeurtenissen moeten initiëren die nodig zijn om het fagocytische proces uit te voeren10,11,12,13,14,15. Zodra een deeltje is gebonden, begint het te worden geïnternaliseerd door reorganisatie van de actine cytoskelet en remodelleren van het plasmamembraan uit te breiden rond het deeltje, de vorming van een fagocytische beker11,12,13,14. Tijdens dit proces, een andere set van signalen vertelt de cel om het deeltje verder te internaliseren door het sluiten van de fagocytische beker, de vorming van een membraan-gebonden fagosoom11,12,13,14,15. Het fagosoom ondergaat vervolgens een rijpingsproces, dat zich vergezelt met verschillende eiwitten en fuseert met lysosomen, waardoor een zure fagolyssom zos is11,12,13,14,15. Op dit punt kunnen deeltjes efficiënt worden afgebroken en geëlimineerd11,12,13,14,15. Drosophila studies hebben aangetoond dat oudere vliegen (4 weken oud) hebben een verminderd vermogen om een infectie te wissen in vergelijking met jongere vliegen (1 weken oud), waarschijnlijk te wijten, althans gedeeltelijk, aan een daling in sommige aspecten van fagocytose16,17.
De hier beschreven methode maakt gebruik van twee afzonderlijke fluorescerende e. coli-deeltjes met fluoresceren, een met een standaard fluorofofore en een die pH-gevoelig is, om twee verschillende aspecten van fagocytose te beoordelen: de eerste engulfment van deeltjes en de afbraak van deeltjes in het fagosomale. In deze test is fluordeeltjesfluorescentie waarneembaar wanneer de deeltjes gebonden en overspoeld worden door hemocyten, terwijl pH-gevoelige deeltjes alleen fluoresceren in de lage pH-omstandigheden van het fagosoom. Fluorescerende gebeurtenissen kunnen dan worden waargenomen in hemocyten die langs het dorsale vat lokaliseren. We richten ons op hemocyten gelokaliseerd op het dorsale vat, die een anatomisch oriëntatiepunt bieden om hemocyten te lokaliseren waarvan bekend is dat ze bijdragen aan bacteriële klaring, en om ze consequent te isoleren. Echter, hemocyten in andere delen van het lichaam en de hemolymph zijn ook belangrijk voor de klaring. Hoewel we deze celpopulatie niet hebben bestudeerd, kan onze algemene procedure ook van toepassing zijn op fagocytische testen van deze cellen. Een voordeel van onze aanpak is dat we fagocytische gebeurtenissen binnen individuele hemocyten kunnen kwantificeren, waardoor we subtiele variatie in fagocytische processen kunnen detecteren. Andere studies die fluorescerende gebeurtenissen visualiseren door middel van de cuticula18,19 niet goed voor verschillen in het aantal aanwezige hemocyten, die vooral belangrijk is om te overwegen in ons geval als totale hemocyte telt zal naar verwachting veranderen met de leeftijdvan 17.
Protocol
1. Verzamelen en leeftijd Drosophila
- Om dezelfde verouderde F1-vliegen te genereren voor het testen van fagocytose, voeg 5-10 maagdelijke vrouwtjes en 5 mannetjes van de juiste genotypen toe aan een flacon met vers vliegvoedsel. We gebruiken een maïsmeel melasse agar gebaseerd voedsel20,maar de methode moet werken, ongeacht het type dieet van de vliegen worden gekweekt. Voor dit experiment gebruikten we Hemese (Hij)-GAL4; UAS-GFP vliegt om hemocyten genetisch te labelen.
OPMERKING: Meer vliegen kunnen worden gebruikt, maar sommige lijnen van D. melanogaster kan niet paren of reproduceren goed wanneer overvol, en overbevolking kan nadelige effecten hebben op larve ontwikkeling21 en fagocytose. - Onderhoud vliegen onder de gewenste experimentele omstandigheden. Voor dit experiment, onderhouden He-GAL4; UAS-GFP vliegt bij 24 °C. Laat volwassen vliegen om te paren voor een week, en verwijder dan volwassenen. F1 vliegen zullen dan worden verzameld uit deze flesjes na eclosion voor experimenteel gebruik.
- Verzamel maagdelijke vliegen gedurende de week, of totdat het gewenste aantal vliegen worden verzameld. Maagden zijn niet nodig; paring kan echter van invloed zijn op de immuunrespons. Als F1 vliegen moeten worden getest als maagden, scheiden mannetjes en vrouwtjes binnen 8 uur na de sluiting en onderhouden in aparte flesjes om paring te voorkomen. Verzamel voldoende vliegen om de beoordeling van fagocytose mogelijk te maken bij ten minste 10 vliegen per genotype/behandeling/geslacht per leeftijd.
- Als de veroudering van de vliegen tot een week, verzamelen ten minste 50 vliegen in totaal, of 20 vliegen per behandeling voorwaarde voor elk deeltje, hetzij fluor-deeltjes of pH-gevoelige deeltjes, worden geïnjecteerd. Dit zorgt voor een minimum van 10 vliegen om te testen op het moment van het experiment.
- Als veroudering vliegt tot meer dan 3 weken, verzamelen ten minste 100-150 vliegen in totaal, of 50-75 vliegen per behandeling voorwaarde om ervoor te zorgen dat er genoeg vliegen beschikbaar zijn om fagocytose te meten. Bij veroudering vliegen in het laboratorium, gebruiken we meestal insectenkooien gehandhaafd op 24 °C in 12:12 L:D voorwaarden, en verander het voedsel om de andere dag. Als flacons worden gebruikt in plaats van kooien, tip vliegt in nieuwe flesjes om de 3-5 dagen, afhankelijk van de toestand van het voedsel in de flacon. Het aantal benodigde vliegen zal afhangen van hoe laat in leeftijd fagocytose zal worden geanalyseerd, en de leeftijd-specifieke overlevingskansen van dat genotype in een bepaalde milieu-conditie.
- Als jonge en oude vliegen zullen worden beoordeeld, plan dienovereenkomstig zodat 1 weken oude en oude vliegen zal worden geïnjecteerd op dezelfde dag. Dit minimaliseert variaties in deeltjesconcentratie tussen experimenten en zorgt ervoor dat het effect van leeftijd op de fagocytische meting niet verward is met het effect van de dag waarop de test werd uitgevoerd.
- Huis de verzamelde vliegen op 24 °C tot ze 5-7 dagen oud zijn, of onderhouden van de vliegen op de gewenste leeftijd.
2. Bereid fluorescerend gelabelde deeltjes
- Reconstitueer met warmte gedode E. coli fluordeeltjes of pH-gevoelige E. coli-deeltjes tot een voorraadconcentratie van respectievelijk 20 mg/mL of 1 mg/mL. Andere bacteriën zijn beschikbaar voor gebruik die geschikter kunnen zijn voor bepaalde experimenten, maar verwijzen naar de instructies van de fabrikant voor de juiste voorraadconcentraties.
- Voeg voor fluordeeltjes 990 μL 1x PBS (pH 7.4) of voorkeursbuffer en 10 μL van 2 mM (20%) toe natriumadeide. Vortex om te mengen.
OPMERKING: Natriumaing is een conserveermiddel dat kan worden weggelaten; Echter, deeltjes bereid zonder natrium azide niet zo lang duren. Fluordeeltjes moeten binnen 24 uur worden gebruikt en pH-gevoelige deeltjes moeten binnen 7 dagen worden gebruikt. - Voeg voor pH-gevoelige deeltjes 1.980 μL 1x PBS (pH 7.4) of voorkeursbuffer en 20 μL van 2 mM (20%) toe natriumadeide. Vortex om te mengen.
- Maak meerdere 20 μL-aliquoten voor eenmalig gebruik in microcentrifugebuizen van 1,5 mL. Bewaar fluordeeltjes tot een jaar bij -20 °C en pH-gevoelige deeltjes bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden, beschermd tegen licht.
- Voeg voor fluordeeltjes 990 μL 1x PBS (pH 7.4) of voorkeursbuffer en 10 μL van 2 mM (20%) toe natriumadeide. Vortex om te mengen.
- Verwijder op de dag van de injecties natriumaedide uit de deeltjes voor gebruik. Om dit te doen, centrifugeren de deeltjes gedurende 5 min op 15.000 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder de supernatant en was deeltjes twee maal door resuspending in 50 μL van 1x PBS of voorkeur buffer, en centrifuge gedurende 5 min op 15.000 x g.
- Verwijder na de tweede wasbeurt de supernatant en resuspend deeltjes in 100 μL van 1x PBS of voorkeursbuffer. Houd de oplossing in de buis en minimaliseer de blootstelling aan licht tijdens het experiment. Zodra het natriumaside is verwijderd, gebruik fluordeeltjes binnen 24 uur en gebruik pH-gevoelige deeltjes die binnen 5-7 dagen worden gebruikt.
OPMERKING: In onze eerdere experimenten, vonden we dat deze concentratie van deeltjes telbare aantallen fagocytische voorvallen en dat het aantal deeltjes beschikbaar voor fagocytose door hemocyten was nietbeperkend 17. Gebruikers van dit protocol kunnen echter resultaten willen vergelijken met behulp van andere concentraties om ervoor te zorgen dat er een voldoende aantal deeltjes beschikbaar is voor fagocytose door hemocyten in de omstandigheden van hun experimenten.- Als natriumainge werd weggelaten, verdun de deeltjes 1:5 in dezelfde buffer waarmee de deeltjes werden bereid, voor injecties.
- Voeg een druppel (~ 10 μL) van groene kleurstof toe aan de deeltjes. Dit maakt het gemakkelijker om ervoor te zorgen dat de vliegen zijn geïnjecteerd.
3. Injecteer de vliegen
- Bereid glazen naalden voor op injecties.
- Trek glazen naalden met behulp van een pipet trekker. Zet de pipettrekker kachel op 55 °C en de solenoïde op 45. Gebruik alleen de naalden die bij de injector zijn geleverd, omdat het niet gegarandeerd is dat andere naalden met dezelfde precisie werken.
- Vul een 1 mL steriele spuit met minerale olie en bevestig de 30-meter hypodermische (G) naald, voorzien van de nano-injector.
- Vul de getrokken capillaire naald door het inbrengen van de 30 G naald in het stompe uiteinde van de getrokken glazen naald en vul met minerale olie. Verwijder de naald van 30 G langzaam, zodat er geen luchtbellen in de naald zijn, omdat dit onjuiste injectievolumes kan veroorzaken. De injector werkt niet goed zonder de naald bij te vullen.
- Met behulp van tangen, breken de punt van de naald om een opening te creëren om uitwerping van de oplossing mogelijk te maken.
- Monteer de nano-injector.
LET OP: Andere injectoren kunnen worden gebruikt. De onderstaande methode is van toepassing op de nano-injector. Raadpleeg voor andere injectoren de gebruikershandleiding voor instructies.- Stel de injector in op het gewenste volume (tussen 46 nL en 69 nL).
- Verwijder de collet en plaats de afdichting O-ring, de witte spacer met de inkeping naar boven om de achterkant van de naald te ontvangen, en de grotere O-ring op de metalen zuiger, in die volgorde. Herknaak de collet zonder het aan te scherpen.
- Steek de metalen zuiger in het stompe uiteinde van de met olie gevulde glazen naald. Duw de naald voorzichtig naar beneden en plaats deze in de grotere O-ring. Draai collet tot ze veilig zijn.
LET OP: Als de metalen zuiger niet voorbij de collet loopt, houdt u 'LEEG' ingedrukt totdat de zuiger zichtbaar is. Dit maakt het gemakkelijker om ervoor te zorgen dat de zuiger in de naald wordt gestoken. - Houd 'LEEG' ingedrukt totdat de injector piept. Dit werpt het grootste deel van de minerale olie uit de naald, waardoor een klein volume van de olie te fungeren als een barrière tussen de twee vloeistoffen, evenals verwijdert luchtbellen.
- Vul de naald met fluordeeltjes of pH-gevoelige deeltjes door de punt van de glasnaald in de microcentrifugebuis met de bereide deeltjes te plaatsen.
- Houd 'FILL' ingedrukt tot de injector piept.
- Injecties
- Breng de vliegen die moeten worden geïnjecteerd in een lege flacon. Immobiliseer de vliegen door de flacon in ijs te plaatsen. CO2 kan ook worden gebruikt om de vliegen te immobiliseren. Houd er echter rekening mee dat bij het gebruik van pH-gevoelige deeltjes verhoogde CO2-niveaus buffers die worden gebruikt kunstmatig kunnen verzuren en achtergrondfluorescentie kunnen verheffen.
- Injecteer de vliegen in de achterstevenopleurale plaat van de thorax (Figuur 1A). De injectie is succesvol als groene kleurstof wordt gezien gaan in de vlieg(Figuur 1B). Als de vlieg niet groen wordt, zorg er dan voor dat de naald niet verstopt is.
OPMERKING: Als alternatief kunnen vliegen in de buik worden geïnjecteerd, maar houd de injectieplaats consistent in alle experimenten. - Plaats geïnjecteerd vliegen in een nieuw voedsel flesje, wijzend op de tijd dat de eerste en laatste vlieg werd geïnjecteerd. Om experimentele fouten te minimaliseren vanwege de hoeveelheid tijd die nodig is om injecties te voltooien, voltooien injecties tijdig. Met de praktijk, moet het niet langer dan 10 minuten duren om een set van vliegen te injecteren. Leg de flacon op zijn kant totdat alle vliegen zijn hersteld, om te voorkomen dat de vliegen vast komen te zitten in het voedsel.
- Laat vliegen 60-90 minuten herstellen, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Hier werd een hersteltijd van 60 minuten gebruikt. Merk op dat dit hersteltijdbereik optimaal was voor het tellen van fagocytische voorvallen in de experimentele omstandigheden in de Horn et al. studie17. Echter, onder sommige omstandigheden, dit kan te lang zijn om subtiele verschillen in fagocytose tussen behandelingsgroepen op te sporen. Het kan nuttig zijn om experimenten met tijdsloop uit te voeren zoals eerder17 werd gedaan om de hersteltijd te bepalen die maximale verschillen tussen controle en experimentele resultaten zal onthullen. Welke hersteltijd ook wordt gekozen, houd dit consistent in alle experimentele behandelingen.
- Gebruik bij het injecteren met fluordeeltjes en pH-gevoelige deeltjes op dezelfde dag een nieuwe naald voor elke oplossing. Injecteer geen individuele vliegen met beide deeltjes als ze allebei fluorescerend rood, omdat het resultaat geen onderscheid zou maken tussen de twee aspecten van fagocytose, deeltjesbinding/engulfment vs. deeltjesopname in het fagosoom.
4. Ontleden van het rugvat
- Nadat vliegen zijn hersteld voor 60-90 min, breng alle levende vliegen naar een lege flacon en immobiliseren op ijs.
- Breng een vlieg per keer op een siliconen elastomeer dissectie plaat.
OPMERKING: Bereid ontledingsplaten ten minste 1 week voor gebruik voor, bij het uitharden bij kamertemperatuur. Om dit te doen, bereid het elastomeer en giet het in een 33 mm x 10 mm petrischaal, het vullen van de schotel ongeveer halverwege. Tik voorzichtig op de schotel op een vlakke ondergrond om luchtbellen te minimaliseren. Laat de platen zitten op kamertemperatuur, ongestoord, voor ten minste een week.- Onder een ontleden stereomicroscoop, oriënteren van de vlieg ventrale kant omhoog.
- Met behulp van insectenspelden, pin de vlieg op de plaat door het invoegen van een pin door de thorax en een andere pin door de meest achterste uiteinde van de buik, in de buurt van de genitaliën (Figuur 2A). Het kan nuttig zijn om de pinnen in tweeën te snijden voordat het monster wordt vastgemaakt om de dissectie niet te belemmeren. Herhaal dit met maximaal 10 vliegen per dissectieplaat.
OPMERKING: Optioneel: Verwijder de vleugels en benen voordat u vlieg naar bord speldt. Dit zal helpen voorkomen dat een bel vormen rond de vlieg wanneer de media wordt toegevoegd. - Zodra alle vliegen zijn vastgemaakt aan de plaat, voeg genoeg dissectie media om de vliegen (~ 1 mL) met behulp van een transfer pipet te dekken.
- Verwijder met behulp van tangen of cuticulaschaar het hoofd.
- Met behulp van cuticula schaar, maak twee horizontale insnijdingen: een direct boven de achterste pin in de buik, en een ander aan de meest voorste einde van de buik, waar de thorax en buik voldoen(Figuur 2B, C). In figuur 2werd het hoofd intact gelaten om de oriëntatie te verduidelijken.
- Maak een verticale incisie, het aansluiten van de twee horizontale insnijdingen (de drie sneden lijken op de letter I). Dit opent de buikholte(figuur 2D).
- Met behulp van tangen, verwijder de inwendige organen en weefsel, het vermijden van de dorsale vat. Als ongestoord, kan het transparante dorsale vat vaak worden gezien pulserende in de buurt van het voorste uiteinde van de buik. Extra pinnen kunnen worden gebruikt om nieuwe snijuiteinden van de cuticula(figuur 2E, F)open te pinnen.
- Verwijder met behulp van een schnitige schaar de thorax. Als alternatief kan de thorax worden verwijderd voordat de ontleede nagelriemen en het rugvat op een microscoopdia worden gemonteerd.
- Herhaal dit met de resterende vliegen. ontleden vliegt tijdig, om mogelijke variaties in fagocytische snelheid te minimaliseren. Zodra alle vliegen zijn ontleed, laat de nagelriemen met de bijgevoegde rugvat vastgepind aan de plaat. Stap 5 wordt uitgevoerd in de dissectieplaat. Dit voorkomt beschadiging of per ongeluk weggooien van nagelriemen tussen de stappen.
5. Fixatie en kleuring
- Fix ontleed cuticles with attached dorsal vessel in 4% paraformaldehyde (PFA).
- Met behulp van een nieuwe wegwerp overdracht pipet voor elke stap, gooi de dissectie media, en vervangen door 1 mL van 4% PFA. Houd de dissecties zoveel mogelijk beschermd tegen licht tijdens de fixatie en kleuring.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met schommelen bij 20 rpm. Laat niet dissecties te zitten in fixatieve voor meer dan 20 minuten, omdat dit zou kunnen beginnen met het weefsel te beschadigen.
- Was nagelriemen 2x in 1x PBS + 0,1% Tween (PBST).
- Verwijder fixatief en vervang door 1 mL van 1x PBST.
- Was op kamertemperatuur gedurende 15 minuten met schommelen.
- Herhaal 1x.
OPMERKING: Ontleed, vast weefsel kan worden opgeslagen bij 4 °C, voor maximaal 3 dagen, beschermd tegen licht, na de eerste wasbeurt door het vervangen van de was door verse PBST. Bewaar vast weefsel niet als er antilichamen worden gebruikt. Antilichamen moeten worden gebruikt met vers weefsel voor de beste resultaten.
- Optioneel: Antilichaam kleuring. Antilichamen kunnen worden gebruikt om het dorsale vat duidelijk te visualiseren(figuur 3),of om hemocyte specifieke markers te detecteren. Dit kan ervoor zorgen dat alleen cellen langs het dorsale vat worden geteld of om het membraan van de hemocyten te markeren.
- Verwijder de tweede was, voeg primaire antilichaam bij de juiste verdunning. Incubeer 's nachts bij 4 °C, met schommelen.
- Verwijder primaire antilichaam, en was twee keer met PBST gedurende 15 minuten met schommelen.
- Voeg fluorescerend secundair antilichaam toe. We raden een groen fluorescerend antilichaam aan, zodat het de fluorescerende deeltjes niet verduistert. Incubeer bij kamertemperatuur voor 2 h, met schommelen.
- Verwijder secundair antilichaam, was twee keer gedurende 15 minuten per stuk met PBST.
- Vlek met DAPI.
- Verwijder de laatste wasbeurt en vervang deze door 1 mL DAPI verdund in PBST (1:1000).
- Vlek voor 20 minuten met schommelen op kamertemperatuur.
- Verwijder DAPI en was 2x (herhaal stap 5.2).
- Vervang de laatste wasbeurt door verse 1x PBST.
LET OP: Vliegen kunnen worden opgeslagen bij 4 °C, voor maximaal 3 dagen, beschermd tegen licht, na de eerste wasbeurt door het vervangen van de was door verse PBST.
6. Montage van nagelriemen op microscoopdia's en beeldvorming
- Bereid ontleede nagelriemen.
- Onder de ontleden stereomicroscoop, afgesneden overtollige cuticula die kunnen interfereren met de beeldvorming.
- Breng met behulp van tangen de nagelriemen met bevestigd dorsale vat over in een 1,5 mL microcentrifugebuis met 70% glycerol. Het plaatsen van de nagelriemen in glycerol zal helpen verwijderen PBST en zorgt voor een duidelijker beeld tijdens de beeldvorming.
- Zet nagelriemen op de microscoopplaat.
- Voeg een paar druppels van 70% glycerol toe aan een microscoopplaat.
- Verwijder met behulp van tangen nagelriemen uit de glycerolbuis en plaats in glycerol op de glijbaan.
- Gebruik onder de ontledende stereomicroscoop tangen om nagelriemen naar boven te oriënteren, zodat het dorsale vat zichtbaar is. Het donkere pigment van de nagelriem zal naar beneden worden gezwenkeld.
- Voeg indien nodig een extra druppel glycerol toe. Dit helpt luchtbellen te voorkomen en zorgt voor een duidelijker beeld.
- Plaats voorzichtig een coverslip over nagelriemen en sluit randen af met nagellak. Laat 10-15 minuten drogen voordat u verdergaat. Beeld de vliegen onmiddellijk of bewaar in een lichtdichte doos bij 4 °C.
- Beeld het dorsale vat voor.
- Gebruik met behulp van een fluorescerende microscoop het structurele interferentiesysteem om optische delen van het dorsale vat te genereren. Een confocale microscoop kan als alternatief worden gebruikt die extra nauwkeurigheid kan bieden. Verkrijg Z-stack beelden van het dorsale vat met behulp van een 20x objectieve en voorkeur imaging software. Voeg een schaalbalk van 10 mm toe en label en sla afbeeldingen correct op als tiff-bestanden(figuur 4)of het gewenste formaat.
OPMERKING: Het aantal verkregen Z-stack afbeeldingen kan variëren tussen ontlesecties en hangt af van hoe goed het dorsale vat is ontleed en van de gewenste stapgrootte tussen afbeeldingen. Hier werd de stapgrootte ingesteld op 0,49 mm. Dat aantal kan variëren van 3 tot 40 beelden per stapel in onze ervaring.
- Gebruik met behulp van een fluorescerende microscoop het structurele interferentiesysteem om optische delen van het dorsale vat te genereren. Een confocale microscoop kan als alternatief worden gebruikt die extra nauwkeurigheid kan bieden. Verkrijg Z-stack beelden van het dorsale vat met behulp van een 20x objectieve en voorkeur imaging software. Voeg een schaalbalk van 10 mm toe en label en sla afbeeldingen correct op als tiff-bestanden(figuur 4)of het gewenste formaat.
7. Afbeeldingen analyseren
- Kwantificeer fluorescerende gebeurtenissen met ImageJ.
- Open afbeeldingen en stapel ze op: Image à Stacks à Images to Stack.
- Tel alleen de ~ 1 mm grote fluorescerende signalen binnen een diameter van 10 mm gecentreerd op een DAPI-positieve kern door te klikken op elke gebeurtenis van ten minste 10 cellen per vlieg, van ten minste 10 vliegen per leeftijd per deeltje type geïnjecteerd: Plugins à Analyze à Cell Counter Notice ( Figuur5A). Het gereedschap Melding van de celteller wijst een andere kleur toe aan elke bijgehouden cel, met een gekleurde stip die overeenkomt met elke fluorescerende gebeurtenis waarop in die cel wordt geklikt.
- Als u de teller- en stapelpositie wilt weergeven die aan elk punt is gekoppeld, drukt u op 'm' of selecteert u Meten onder het tabblad Analyseren of drukt u op 'alt +y'(figuur 5B)om het aantal gebeurtenissen weer te geven dat in elke cel wordt geteld in een resultatentabel.
- Breng de celtellingen over naar een spreadsheet die moet worden gebruikt voor statistische analyse.
- Statistische analyse uitvoeren.
- Analyseer verschillen in fagocytische gebeurtenissen met behulp van vaste effecten ANOVA of mixed-model geneste ANOVA. Gemengde modellen kunnen worden gebruikt om de belangrijkste vaste effecten van leeftijd en genotype en het willekeurige effect van individuen genesteld in elk genotype17te testen.
OPMERKING: Onderzoekers moeten rigoureus zijn in het testen van de veronderstellingen van een statistische procedure die wordt gebruikt om de gegevens te analyseren.
- Analyseer verschillen in fagocytische gebeurtenissen met behulp van vaste effecten ANOVA of mixed-model geneste ANOVA. Gemengde modellen kunnen worden gebruikt om de belangrijkste vaste effecten van leeftijd en genotype en het willekeurige effect van individuen genesteld in elk genotype17te testen.
Representative Results
Ter illustratie van de beschreven injectiemethoden toont figuur 1A de injectieplaats op Drosophila melanogaster, evenals hoe voedselkleurstof een visuele bevestiging mogelijk maakt dat de vlieg is geïnjecteerd(figuur 1B). De toevoeging van voedselkleurstof helpt ook bij de herkenning van een verstopte naald. Injecties kunnen worden uitgevoerd in de buik, maar houd de injectieplaats consistent over experimenten. Dit zal helpen bij het minimaliseren van mogelijke variaties tussen elk experiment.
Om de fluorescerende deeltjes in ingezeten hemocyten langs het rugvat te visualiseren, ontleedden we het dorsale vat en de bijgevoegde buikslijfbeen. Figuur 2A-F schetst de ontledingsmethoden.
Om het leeftijdsspecifieke vermogen van jonge en oude vliegen om fagocytose uit te voeren te beoordelen, worden hemocyten langs het dorsale vat gevisualiseerd met behulp van een fluorescerende microscoop. Om ervoor te zorgen dat alleen cellen langs het dorsale vat worden geteld, kunnen antilichamen of GFP-gelabelde genen voor bepaalde bloedcelmarkers of hartspecifiek collageen, zoals Hemese en Hemolectine, of Pericardin (figuur 3), respectievelijk22,23,24worden gebruikt . Fluorescerend gelabeld E. coli deeltjes zijn 1 mm lang, terwijl hemocyten zijn 10 mm in diameter17. Alleen fluorescerende gebeurtenissen binnen een diameter van 10 mm gecentreerd op een DAPI-positieve kern worden geteld(figuur 4). Om fluorescerende gebeurtenissen te kwantificeren, wordt ImageJ-software gebruikt(figuur 5).
Figuur 1: Injectieplaats en visuele verificatie. (A) Laterale zijde van thorax wordt doorboord met een getrokken capillaire naald. (B)Injecties worden visueel gecontroleerd door het toevoegen van groene kleurstof voor deeltjes aan deeltjesoplossing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Dorsale vaartuigdissectie. (A) Pinnen worden geplaatst in de thorax en achterste buik (zwarte pijlen). (B-C) Twee horizontale insnijdingen (groene pijlen) worden gemaakt aan het achterste uiteinde van de buik(B), en voorste einde(C). (D) Een verticale incisie (groene pijl) wordt gemaakt in het midden van de buik, het aansluiten van de twee horizontale sneden. (E) Optionele pinnen (*) worden gebruikt om de buikholte te openen, waardoor inwendig weefsel wordt blootgesteld. (F) Inwendig weefsel (gewas, darmen, baarmoeder, eierstokken, vetlichamen) wordt verwijderd, waardoor het dorsale vat wordt blootgesteld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Ventrale weergave van een ontleed dorsale vat van een 5 weken oud vrouwtje geïnjecteerd met pH-gevoelige deeltjes, gekleurd met antilichaam gericht tegen Pericardin (A) . Gestippelde witte lijn schetst de zijdelingse kant van het rugvat, met pijl die naar het voorste gebied wijst. (B) Vergrote afbeelding van (A): clusters van hemocyten (blauwe pijl) die actief vernederende bacteriën waren, binnen de eerste aortakamer van het dorsale vat. (C) Vergrote afbeelding van (A) waarin de extracellulaire matrix (ECM) collageen-achtig eiwit, Pericardin (groene pijl), dat het dorsale vat op plaats24houdt . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Ontleed dorsale vat en bijbehorende hemocyten van een vrouwelijke vlieg geïnjecteerd met pH gevoelige deeltjes, of fluor-deeltjes. (A) Het dorsale vat en de bijbehorende hemocyten met verzwolgen pH-gevoelige E. coli-deeltjes (rood), of (E) fluor-geëtiketteerde E. coli-deeltjes (rood), geïsoleerd van een 1 weken oude vlieg, na het herstellen van 60 min. (B,F) Vergroot inzet van (A) en (E) (witte doos), respectievelijk, met twee individuele hemocyten met telbare gebeurtenissen. (C) Het dorsale vat en de bijbehorende hemocyten met verzwolgen pH-gevoelige E. coli-deeltjes(rood), of ( G)fluor-geëtiketteerde E. coli-deeltjes (rood), geïsoleerd van een 5 weken oude vlieg, na het herstellen van 60 min. (D,H) Vergroot inzet van (C) en (G) (witte doos), respectievelijk, met twee individuele hemocyten met telbare gebeurtenissen. Gestippelde witte lijn schetst de zijdelingse kant van het rugvat, met pijl die naar het voorste gebied wijst. Kernen bevlekt met DAPI (blauw). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Het kwantificeren van fagocytische gebeurtenissen binnen een 10 mm hemocyten met behulp van de celteller in ImageJ. (A) Na het openen van afbeelding(en) in ImageJ kan het gereedschap Melding van de celteller worden gebruikt om fagocytische gebeurtenissen per cel bij te houden. (B)Dit gereedschap wijst een andere kleur toe aan elke cel die is geselecteerd om te worden geteld, waarbij elke stip overeenkomt met een fluorescerende gebeurtenis in die cel. Als u op 'alt+y' drukt, wordt een tabel weergegeven met het aantal gebeurtenissen dat per cel wordt geteld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Het hier beschreven protocol is een betrouwbare manier om verschillende aspecten van fagocytose te kwantificeren, onder gecontroleerde experimentele omstandigheden. We merken op dat we deze procedure alleen hebben getest met gramnegatieve bacteriële deeltjes en dat de resultaten kunnen verschillen als grampositieve bacteriële deeltjes worden gebruikt. Inderdaad, het zou interessant zijn om de fagocytische reacties op zowel gram negatieve en gram positieve bacteriën in verschillende experimentele omstandigheden te vergelijken. Het gebruik van een nano-injector zorgt voor nauwkeurige controle over injectievolumes, zodat elke vlieg wordt geïnjecteerd met hetzelfde volume van deeltjes. Een beperking van het protocol komt van inconsistenties in deeltjespreparaten. Deeltjes zullen aggregeren eenmaal bevroren, dus kleine variaties in verdunningsvolumes, of gebrek aan vortexen, kan de deeltjesconcentratie tussen experimenten beïnvloeden. Om mogelijke variaties in deeltjesconcentraties tussen leeftijden te minimaliseren, is het nuttig om 1- en 5-weekse vliegen op dezelfde dag te injecteren, met dezelfde naald- en deeltjesoplossing. Een ander mogelijk nadeel is dat tijdens dissecties het dorsale vat en/of de cuticula gemakkelijk kunnen worden beschadigd als pinnen niet goed worden behandeld. Om te voorkomen dat het dorsale vat wordt verstoord, moet u het aantal pinnen dat per dissectie wordt gebruikt, minimaliseren. Het voordeel van deze dissectiemethode is dat alle fixatie-, was- en kleuringsstappen kunnen worden uitgevoerd in de dissectieplaat. Omdat de nagelriemen zijn vastgepind, voorkomt dit dat de nagelriemen tussen de treden verloren gaan.
In vergelijking met de bestaande methoden18,19,25,26,27,28,29heeft het beschreven protocol zijn voordelen en beperkingen. Door het dorsale vat te ontleden, zijn we in staat om individuele hemocyten op deze locatie te visualiseren en te kwantificeren. Dit maakt het mogelijk om subtiele variaties in fagocytische activiteit tussen experimentele groepen te detecteren. Andere methoden visualiseren fluorescerend gelabelde deeltjes door hemocyten te verzamelen met behulp van een Bleed/Scrape-test19,25,26,27, of via een intacte ventrale cuticula18,19,28,29; individuele hemocyten kunnen echter niet worden beoordeeld wanneer ze door de dorsale nagelriem worden gevisualiseerd. Het voordeel van dit protocol, in vergelijking met de Bleed / Scrape methode is dat onze methode stelt ons in staat om alleen die hemocyten geassocieerd met de dorsale vat te beoordelen, en houdt rekening met circulerende cellen of die langs de lichaamswand, die functioneel verschillend kan zijn. Ontleden van het dorsale vat verwijdert ook de noodzaak om een tweede ronde van injecties met een fluorescentie quencher, zoals Trypan blauw19,26. Dit komt omdat alle deeltjes die niet gebonden zijn aan of overspoeld door een cel zullen worden weggespoeld tijdens wasstappen. Omgekeerd kunnen alternatieve methoden gemakkelijker uit te voeren zijn omdat ze geen dissecties vereisen. Hoewel het ontleden van het dorsale vat gemakkelijk te leren is, voegt deze stap een niveau van complexiteit toe dat mogelijk niet haalbaar is in sommige experimentele ontwerpen.
Hoewel het beschreven gebruik van deze in vivo fagocytosetest is om fagocytische gebeurtenissen tussen verschillende leeftijden te beoordelen en te kwantificeren, is dit protocol zeer aanpasbaar en kan het worden gebruikt om verschillende aspecten van fagocytose tussen genotype, geslacht of weefseltype te analyseren. Omdat fagocytose van centraal belang is voor de meeste meercellige dieren, kan het begrijpen hoe dit proces afneemt met de leeftijd leiden tot betere therapeutische behandelingen voor de vergrijzende bevolking. Deze aanpak biedt op lange termijn potentieel voor het ophelderen van aspecten van leeftijdsgebonden veranderingen in de immuunrespons, met speciale aandacht voor fagocytose.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health R03 AG061484-02 en het UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
- Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
- DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. Immunity and aging: the enemy within. Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).
- Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. Innate immunity and aging. Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).
- Panda, A., et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).
- Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).
- Min, K. -J., Tatar, M. Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472 (2018).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. Drosophila as a genetic model for hematopoiesis. Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Garschall, K., Flatt, T. The interplay between immunity and aging in Drosophila. F1000Research. 7, (2018).
- Brennan, C. A., Anderson, K. V. Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response. Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: a fundamental process in immunity. BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).
- Stuart, L., et al. A systems biology analysis of the Drosophila phagosome. Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).
- Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html (2019).
- Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Goto, A., et al. A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor. Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).
- Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart. Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).
- Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection. Wellcome Open Research. 3, (2018).
- Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Gyoergy, A., et al. Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).
- Bosch, P. S., et al. Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia. BioRxiv. 578864, (2019).
