Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen In-vivo-Test der Phagozytose zur Beurteilung und Quantifizierung der Fähigkeit junger und alter Drosophila melanogaster Hämozyten an Phagozytosebakterien..
Abstract
Phagozytose ist eine wesentliche Funktion der angeborenen Immunantwort. Dieser Prozess wird von phagozytischen Hämozyten durchgeführt, deren primäre Funktion darin besteht, eine Vielzahl von Partikeln zu erkennen und mikrobielle Krankheitserreger zu zerstören. Wenn Organismen altern, beginnt dieser Prozess zu sinken, aber wenig ist über die zugrunde liegenden Mechanismen oder die genetische Grundlage der Immunseneszenz bekannt. Hier wird eine In-vivo-Phagozytose-Assay verwendet, um altersbedingte Veränderungen in verschiedenen Aspekten der Phagozytose, wie Bindung, Verschleierung und Abbau von internalisierten Partikeln, zu bewerten, indem phagozytische Ereignisse in Hämozyten bei erwachsenen Drosophila quantifiziert werden. Drosophila melanogaster ist aus vielen Gründen zu einem idealen Modell geworden, um altersbedingte Veränderungen in der angeborenen Immunfunktion zu untersuchen. Zum einen sind viele genetische Komponenten und Funktionen der angeborenen Immunantwort, einschließlich Phagozytose, evolutionär zwischen Drosophila und Säugetieren konserviert. Aus diesem Grund, Ergebnisse aus der Verwendung dieses Protokolls erhalten sind wahrscheinlich weithin relevant für das Verständnis der altersbedingten Veränderungen in der Immunfunktion in einer Vielzahl von Organismen. Darüber hinaus stellen wir fest, dass diese Methode quantitative Schätzungen der hämozytischen phagozytischen Fähigkeit bietet, die für eine Vielzahl von Forschungsthemen nützlich sein könnte und sich nicht auf Studien über das Altern beschränken muss.
Introduction
Das angeborene Immunsystem, das aus physikalischen und chemischen Infektionsbarrieren sowie zellulären Komponenten besteht, ist evolutionär konserviert über mehrzellige Organismen1,2. Als erste Verteidigungslinie spielt das angeborene Immunsystem eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung eindringender Krankheitserreger bei allen Tieren1,2,3. Die Komponenten der angeborenen Immunantwort umfassen eine breite Palette von Zelltypen, die auf der Grundlage klassifiziert werden, dass sie Spezifität und immunologisches Gedächtnisfehlen 2,3,4. Beim Menschen, Diese Zelltypen gehören phagozytische Monozyten und Makrophagen, Neutrophile, und zytotoxische natürliche Killerzellen4,5. Während ein funktionelles Immunsystem für das Überleben des Wirts unerlässlich ist, ist es klar, dass die Funktion von Immunzellen mit dem Alter abnimmt, ein Phänomen, das als Immunoseneszenz5,6bekannt ist. Die Möglichkeit, altersbedingte Veränderungen der Immunantwort zu bewerten, einschließlich verschiedener Aspekte des Phagozytoseprozesses, könnte unser Verständnis der Immunseneszenz unterstützen. Das Verfahren, das wir hier beschreiben, bietet einen effektiven und wiederholbaren Ansatz zur Bewertung und Quantifizierung phagozytischer Ereignisse durch Hämozyten in Drosophila melanogaster.
Drosophila ist ein ideales Modell, um die Immunantwort aus vielen Gründen zu studieren. Zum einen gibt es eine umfangreiche Reihe genetischer Werkzeuge, die es ermöglichen, die Genexpression auf gewebeabhängige Weise leicht zu manipulieren7. Diese Werkzeuge umfassen eine Sammlung von Mutanten, RNA-Interferenzbeständen, GAL4/UAS-Beständen und dem Drosophila Genetic Reference Panel, das 205 verschiedene Inzuchtlinien enthält, für die die gesamten Genomsequenzen katalogisiert sind8. Der kurze Lebenszyklus von Drosophila und die große Anzahl von Individuen produziert ermöglichen es Forschern, mehrere Personen in einer kontrollierten Umgebung zu testen, in kurzer Zeit. Dies verbessert erheblich die Fähigkeit, subtile Unterschiede in der Immunantwort auf Infektionen bei Genotypen, zwischen Dengeschlechtern oder über das Alter hinweg zu identifizieren. Wichtig ist, dass viele genetische Komponenten und Funktionen der angeborenen Immunantwort, einschließlich Phagozytose, evolutionär zwischen Drosophila und Säugetieren1,2konserviert werden.
In Drosophila wird der Prozess der Phagozytose, der auf eine Infektion folgt, von phagozytischen Hämozyten, sogenannten Plasmatozyten, durchgeführt, die denMakrophagenvon Säugetieren 9 entsprechen. Hämozyten sind wichtig, um eine breite Palette von Partikeln zu erkennen und mikrobielle Krankheitserregerzulöschen 9,10,11,12,13. Diese Zellen drücken eine Vielzahl von Rezeptoren aus, die sich selbst von Nicht-Selbst unterscheiden müssen, und initiieren Signalereignisse, die erforderlich sind, um den phagozytischen Prozess durchzuführen10,11,12,13,14,15., Sobald ein Teilchen gebunden ist, beginnt es durch Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und Remodellierung der Plasmamembran verinnerlicht zu werden, um das Teilchen zu erweitern, und bildet einen phagozytischen Becher11,12,13,14. Während dieses Prozesses weist ein weiterer Satz von Signalen die Zelle an, das Teilchen weiter zu verinnerlichen, indem sie den phagozytischen Becher schließt und ein membrangebundenes Phagosom11,12,,13,14,15bildet. Das Phagosom durchläuft dann einen Reifungsprozess, der mit verschiedenen Proteinen assoziiert und mit Lysosomen verschwoben wird, wodurch ein saures Phagolysom11,12,13,14,15gebildet wird. An dieser Stelle können Partikel effizient abgebaut und eliminiert werden11,12,13,14,15. Drosophila-Studien haben gezeigt, dass ältere Fliegen (4 Wochen alt) haben eine verminderte Fähigkeit, eine Infektion im Vergleich zu jüngeren Fliegen zu löschen (1 Woche alt), wahrscheinlich aufgrund, zumindest teilweise, auf einen Rückgang in einigen Aspekten der Phagozytose16,17.
Das hier beschriebene Verfahren verwendet zwei separate fluoreszierend markierte wärmeabgetötete E. coli-Partikel, von denen eines ein Standardfluorophor und eines mit pH-Empfindlichkeit trägt, um zwei verschiedene Aspekte der Phagozytose zu bewerten: die anfängliche Verschlingtheit von Partikeln und den Abbau von Partikeln im Phagolysosom. In diesem Test ist die Fluor-Partikel-Fluoreszenz beobachtbar, wenn die Teilchen durch Hämozyten gebunden und verschlungen werden, während pH-empfindliche Partikel nur unter den niedrigen pH-Bedingungen des Phagosomfluores fluoreszieren. Fluoreszierende Ereignisse können dann in Hämozyten beobachtet werden, die entlang des Dorsalgefäßes lokalisieren. Wir konzentrieren uns auf Hämozyten, die auf das Dorsalgefäß lokalisiert sind, die ein anatomisches Wahrzeichen darstellen, um Hämozyten zu lokalisieren, von denen bekannt ist, dass sie zur bakteriellen Clearance beitragen, und sie konsequent zu isolieren. Aber auch Hämozyten in anderen Teilen des Körpers und der Hämolymphe sind wichtig für die Clearance. Obwohl wir diese Zellpopulation nicht untersucht haben, könnte unser allgemeines Verfahren auch für phagozytische Assays dieser Zellen anwendbar sein. Ein Vorteil unseres Ansatzes ist, dass wir phagozytische Ereignisse innerhalb einzelner Hämozyten quantifizieren können, was es uns ermöglicht, subtile Variationen in phagozytischen Prozessen zu erkennen. Andere Studien, die fluoreszierende Ereignisse durch die Nagelhaut18,19 visualisieren, berücksichtigen keine Unterschiede in der Anzahl der vorhandenen Hämozyten, was in unserem Fall besonders wichtig ist, da sich die Gesamtzahl der Hämozyten mit17Jahren ändern dürfte.
Protocol
1. Sammeln und altern Drosophila
- Um gleiche F1-Fliegen im Alter von der Phagozytose zu erzeugen, fügen Sie 5-10 jungfräuliche Weibchen und 5 Männchen der entsprechenden Genotypen zu einer Durchstechflasche hinzu, die frische Sfly-Lebensmittel enthält. Wir verwenden eine Maismehl Melasse Agar-basierte Nahrung20, aber die Methode sollte unabhängig von der Art der Ernährung, auf der die Fliegen aufgezogen werden, funktionieren. Für dieses Experiment verwendeten wir Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP fliegt, um Hämozyten genetisch zu kennzeichnen.
HINWEIS: Es können mehr Fliegen verwendet werden, aber einige Linien von D. melanogaster können sich nicht paaren oder gut vermehren, wenn sie überfüllt sind, und Überbelegung kann negative Auswirkungen auf die Larvenentwicklung21 und Phagozytose haben. - Halten Sie Fliegen unter den gewünschten experimentellen Bedingungen. Für dieses Experiment, halten Sie He-GAL4; UAS-GFP fliegt bei 24 °C. Lassen Sie erwachsene Fliegen für eine Woche zu paaren, und dann erwachsene entfernen. F1-Fliegen werden dann nach dem Absetzen für den experimentellen Gebrauch aus diesen Fläschchen gesammelt.
- Sammeln Sie Jungfliegen während der Woche, oder bis die gewünschte Anzahl von Fliegen gesammelt werden. Jungfrauen sind nicht erforderlich; Die Paarung kann jedoch die Immunantwort beeinträchtigen. Wenn F1-Fliegen als Jungfrauen getestet werden sollen, trennen Männchen und Weibchen innerhalb von 8 Stunden nach der Eklat und halten sie in separaten Durchstechflaschen, um eine Paarung zu verhindern. Sammeln Sie genügend Fliegen, um die Beurteilung der Phagozytose bei mindestens 10 Fliegen pro Genotyp/Behandlung/Geschlecht pro Alter zu ermöglichen.
- Wenn die Fliegen auf eine Woche altern, sammeln Sie insgesamt mindestens 50 Fliegen oder 20 Fliegen pro Behandlungsbedingung für jedes Partikel, entweder Fluorpartikel oder pH-empfindliche Partikel, die injiziert werden sollen. Dadurch wird sichergestellt, dass zum Zeitpunkt des Experiments mindestens 10 Fliegen zum Test durchgeführt werden.
- Wenn die Alterung mehr als 3 Wochen beträgt, sammeln Sie mindestens 100-150 Fliegen insgesamt oder 50-75 Fliegen pro Behandlungsbedingung, um sicherzustellen, dass genügend Fliegen zur Verfügung stehen, um Phagozytose zu messen. Wenn das Altern im Labor fliegt, verwenden wir in der Regel Insektenkäfige, die bei 24 °C in 12:12 L:D gehalten werden. und ändern Sie das Essen jeden zweiten Tag. Wenn Fläschchen anstelle von Käfigen verwendet werden, fliegt Die Spitze alle 3-5 Tage in neue Fläschchen, abhängig vom Zustand der Nahrung in der Durchstechflasche. Die Anzahl der benötigten Fliegen hängt davon ab, wie spät im Alter Phagozytose analysiert wird, und die altersspezifischen Überlebensraten dieses Genotyps in einem bestimmten Umweltzustand.
- Wenn junge und ältere Fliegen bewertet werden, planen Sie entsprechend, dass 1 Woche alte und ältere Fliegen am selben Tag injiziert werden. Dadurch werden Schwankungen der Partikelkonzentration zwischen den Experimenten minimiert und sichergestellt, dass die Wirkung des Alters auf die phagozytische Messung nicht mit der Wirkung des Tages, an dem der Test durchgeführt wurde, verwirrt wird.
- Die gesammelten Fliegen bei 24 °C unterbringen, bis sie 5-7 Tage alt sind, oder halten Sie die Fliegen auf das gewünschte Alter.
2. Bereiten Sie fluoreszierend markierte Partikel vor
- Rekonstituieren Sie wärmeabgetötete E. coli-Fluor-Partikel oder pH-empfindliche E. coli-Partikel auf eine Lagerkonzentration von 20 mg/ml bzw. 1 mg/ml. Andere Bakterien stehen zur Verfügung, die für bestimmte Experimente besser geeignet sein können, aber beziehen sich auf die Anweisungen des Herstellers für geeignete Lagerkonzentrationen.
- Für Fluorpartikel 990 l 1x PBS (pH 7,4) oder bevorzugten Puffer und 10 l 2 mM (20%) hinzufügen Natriumazid. Wirbel zu mischen.
HINWEIS: Natriumazid ist ein Konservierungsmittel, das weggelassen werden kann; Partikel, die ohne Natriumazid hergestellt werden, halten jedoch nicht so lange. Fluorpartikel müssen innerhalb von 24 Stunden und pH-empfindliche Partikel innerhalb von 7 Tagen verwendet werden. - Für pH-empfindliche Partikel 1.980 l 1x PBS (pH 7,4) oder bevorzugten Puffer und 20 l von 2 mM (20%) hinzufügen Natriumazid. Wirbel zu mischen.
- Erstellen Sie mehrere Einweg-Aliquots mit 20 L in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren. Fluorpartikel bis zu einem Jahr bei -20 °C und pH-empfindliche Partikel bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern, geschützt vor Licht.
- Für Fluorpartikel 990 l 1x PBS (pH 7,4) oder bevorzugten Puffer und 10 l 2 mM (20%) hinzufügen Natriumazid. Wirbel zu mischen.
- Am Tag der Injektionen Natriumazid vor der Anwendung aus den Partikeln entfernen. Zentrifugieren Sie die Partikel dazu 5 min bei 15.000 x g bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie partikel zweimal, indem Sie in 50 l 1x PBS oder bevorzugten Puffer wieder aufhängen, und Zentrifuge für 5 min bei 15.000 x g.
- Nach der zweiten Wäsche den Überstand entfernen und Partikel in 100 l 1x PBS oder bevorzugtem Puffer wieder aufsetzen. Halten Sie die Lösung in der Röhre und minimieren Sie die Lichteinwirkung während des gesamten Experiments. Sobald das Natriumazid entfernt ist, verwenden Sie Fluorpartikel innerhalb von 24 h und verwenden Sie pH-empfindliche Partikel, die innerhalb von 5-7 Tagen verwendet werden.
HINWEIS: In unseren vorherigen Experimenten fanden wir heraus, dass diese Konzentration von Teilchen eine zählbare Anzahl phagozytischer Ereignisse lieferte und dass die Anzahl der Partikel, die für Phagozytose durch Hämozyten zur Verfügung standen,17nicht einschränkte. Benutzer dieses Protokolls können jedoch die Ergebnisse unter Verwendung anderer Konzentrationen vergleichen, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von Partikeln für die Phagozytose durch Hämozyten unter den Bedingungen ihrer Experimente zur Verfügung steht.- Wenn Natriumazid weggelassen wurde, verdünnen Sie die Partikel 1:5 in demselben Puffer, mit dem die Partikel für Injektionen vorbereitet wurden.
- Fügen Sie den Partikeln einen Tropfen grüne Lebensmittelfarbe hinzu. Dies macht es einfacher, sicherzustellen, dass die Fliegen injiziert wurden.
3. Injizieren Sie die Fliegen
- Bereiten Sie Glasnadeln für Injektionen vor.
- Ziehen Sie Glasnadeln mit einem Pipettenzieher. Stellen Sie die Pipette-Zieherheizung auf 55 °C und den Magneten auf 45. Verwenden Sie nur die mit dem Injektor gelieferten Nadeln, da nicht garantiert ist, dass andere Nadeln mit der gleichen Präzision arbeiten.
- Füllen Sie eine 1 ml sterile Spritze mit Mineralöl und befestigen Sie die 30 Gauge hypodermische (G) Nadel, die mit dem Nano-Injektor geliefert wird.
- Füllen Sie die gezogene Kapillarnadel, indem Sie die 30 G Nadel in das stumpfe Ende der gezogenen Glasnadel einsetzen und mit Mineralöl füllen. Entfernen Sie langsam die 30 G Nadel, um sicherzustellen, dass es keine Luftblasen in der gesamten Nadel gibt, da dies zu ungenauen Injektionsvolumina führen kann. Der Injektor funktioniert nicht richtig, ohne die Nadel zu verfüllen.
- Brechen Sie mit Zangen die Spitze der Nadel ab, um eine Öffnung zu erzeugen, um das Auswerfen der Lösung zu ermöglichen.
- Montieren Sie den Nano-Injektor.
HINWEIS: Es können andere Injektoren verwendet werden. Die unten beschriebene Methode gilt für den Nano-Injektor. Weitere Injektoren finden Sie in der Bedienungsanleitung.- Stellen Sie den Injektor auf das gewünschte Volumen (zwischen 46 nL und 69 nL) ein.
- Entfernen Sie die Spannzange und legen Sie den Dicht-O-Ring, den weißen Abstandser mit dem Einrücken nach oben, um das hintere Ende der Nadel zu erhalten, und den größeren O-Ring auf den Metallkolben in dieser Reihenfolge. Schließen Sie die Spannzange wieder an, ohne sie zu festigen.
- Setzen Sie den Metallkolben in das stumpfe Ende der ölgefüllten Glasnadel ein. Drücken Sie die Nadel vorsichtig nach unten und setzen Sie sie in den größeren O-Ring ein. Spannzange anziehen, bis sie sicher ist.
HINWEIS: Wenn sich der Metallkolben nicht an der Spannzange vorbei erstreckt, halten Sie "EMPTY" so lange, bis der Kolben sichtbar ist. Dadurch wird es einfacher, sicherzustellen, dass der Kolben in die Nadel eingeführt wird. - Halten Sie "EMPTY" so lange, bis der Injektor piept. Dadurch wird der größte Teil des Mineralöls aus der Nadel ausgestoßen, so dass ein kleines Volumen an Öl als Barriere zwischen den beiden Flüssigkeiten wirken und Luftblasen entfernt werden.
- Füllen Sie die Nadel entweder mit Fluorpartikeln oder pH-empfindlichen Partikeln, indem Sie die Spitze der Glasnadel in das Mikrozentrifugenrohr einfügen, das die vorbereiteten Partikel enthält.
- Halten Sie "FILL" so lange, bis der Injektor piept.
- Injektionen
- Übertragen Sie die Fliegen, die in eine leere Durchstechflasche injiziert werden sollen. Immobilisieren Sie die Fliegen, indem Sie die Durchstechflasche in Eis legen. CO2 kann auch verwendet werden, um die Fliegen zu immobilisieren. Beachten Sie jedoch, dass bei der Verwendung von pH-empfindlichen Partikeln erhöhteCO2-Werte alle verwendeten Puffer künstlich säuern und die Hintergrundfluoreszenz erhöhen können.
- Injizieren Sie die Fliegen in die sternopleurale Platte des Thorax (Abbildung 1A). Die Injektion ist erfolgreich, wenn grüner Farbstoff in die Fliege gehen gesehen wird (Abbildung 1B). Wenn die Fliege nicht grün wird, stellen Sie sicher, dass die Nadel nicht verstopft ist.
HINWEIS: Alternativ können Fliegen in den Bauch injiziert werden, aber halten Sie die Injektionsstelle in allen Experimenten konsistent. - Platz injizierte Fliegen in eine neue Lebensmittel-Fläschchen, unter Notierung der Zeit, dass die erste und letzte Fliege injiziert wurde. Um experimentelle Fehler aufgrund der Zeit zu minimieren, die es braucht, um Injektionen abzuschließen, schließen Sie Injektionen rechtzeitig ab. In der Praxis sollte es nicht länger als 10 min dauern, einen Satz Fliegen zu injizieren. Legen Sie die Durchstechflasche auf ihre Seite, bis sich alle Fliegen erholt haben, um zu verhindern, dass die Fliegen in der Nahrung stecken bleiben.
- Lassen Sie Fliegen für 60-90 min erholen, abhängig von den experimentellen Bedingungen. Hier wurde eine 60-min-Erholungszeit verwendet. Beachten Sie, dass dieser Erholungszeitbereich optimal für die Zählung phagozytischer Ereignisse in den experimentellen Bedingungen in der Horn et al. Studie17war. Unter bestimmten Bedingungen kann dies jedoch zu lang sein, um subtile Unterschiede in der Phagozytose zwischen den Behandlungsgruppen zu erkennen. Es kann nützlich sein, Zeitkursexperimente durchzuführen, wie zuvor17 durchgeführt wurde, um die Wiederherstellungszeit zu bestimmen, die maximale Unterschiede zwischen Kontrolle und experimentellen Ergebnissen aufzeigen wird. Welche Erholungszeit auch immer gewählt wird, halten Sie diese konsistent über alle experimentellen Behandlungen.
- Wenn Sie am selben Tag mit Fluorpartikeln und pH-empfindlichen Partikeln injiziert werden, verwenden Sie für jede Lösung eine neue Nadel. Injizieren Sie einzelne Fliegen nicht mit beiden Teilchen, wenn sie beide rot fluoreszieren, da das Ergebnis nicht zwischen den beiden Aspekten der Phagozytose, Partikelbindung/Engulfment vs. Partikelaufnahme in das Phagominus unterscheiden würde.
4. Sezieren des Dorsalgefäßes
- Nachdem sich die Fliegen 60-90 min erholt haben, alle lebenden Fliegen in eine leere Durchstechflasche übertragen und auf Eis immobilisieren.
- Übertragen Sie eine Fliege nach der anderen auf eine Silikonelastomer-Sektionsplatte.
HINWEIS: Bereiten Sie Sezierplatten mindestens 1 Woche vor Gebrauch vor, wenn Sie bei Raumtemperatur aushärten. Dazu bereiten Sie das Elastomer vor und gießen Sie es in eine 33 mm x 10 mm Petrischale, die die Schale etwa zur Hälfte füllt. Tippen Sie vorsichtig auf die Schale auf einer flachen Oberfläche, um Luftblasen zu minimieren. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur, ungestört, für mindestens eine Woche sitzen.- Richten Sie unter einem sezierenden Stereomikroskop die fliegende ventrale Seite nach oben aus.
- Mit Insektenstiften, pin die Fliege auf die Platte durch das Einfügen eines Stiftes durch den Thorax und ein anderer Stift durch das hintere Ende des Bauches, in der Nähe der Genitalien (Abbildung 2A). Es kann nützlich sein, die Stifte vor dem Anheften der Probe zu halbieren, um die Zerlegung nicht zu behindern. Wiederholen Sie dies mit bis zu 10 Fliegen pro Sezierplatte.
HINWEIS: Optional: Entfernen Sie die Flügel und Beine, bevor Sie fliegen auf Platte. Dies wird dazu beitragen, zu verhindern, dass sich eine Blase um die Fliege bildet, wenn Medien hinzugefügt werden. - Sobald alle Fliegen an die Platte gepinnt wurden, fügen Sie genügend Seziermedien hinzu, um die Fliegen (ca. 1 ml) mit einer Transferpipette abzudecken.
- Entfernen Sie den Kopf mit Zangen oder einer Nagelschere.
- Mit Nagelhautschere, machen zwei horizontale Einschnitte: eine direkt über der hinteren Stecknadel im Bauch, und eine andere am vorderen Ende des Bauches, wo der Thorax und Bauch treffen(Abbildung 2B, C). In Abbildung 2wurde der Kopf intakt gelassen, um die Orientierung zu klären.
- Machen Sie einen vertikalen Schnitt, der die beiden horizontalen Schnitte verbindet (die drei Schnitte ähneln dem Buchstaben I). Dadurch wird die Bauchhöhle geöffnet (Abbildung 2D).
- Entfernen Sie mit Zangen die inneren Organe und das Gewebe und vermeiden Sie das Rückengefäß. Ungestört kann man das transparente Rückengefäß oft pulsierend in der Nähe des vorderen Endes des Bauches sehen. Zusätzliche Stifte können verwendet werden, um neu geschnittene Enden der Nagelhaut zu fixieren (Abbildung 2E, F).
- Entfernen Sie den Thorax mit der Nagelschere. Alternativ kann der Thorax entfernt werden, bevor die sezierten Nagelhaut und das Dorsalgefäß auf einem Mikroskopschlitten montiert werden.
- Wiederholen Sie dies mit den verbleibenden Fliegen. Sesekte fliegt rechtzeitig, um mögliche Schwankungen der phagozytischen Rate zu minimieren. Sobald alle Fliegen seziert sind, lassen Sie die Nagelhaut mit dem befestigten Dorsalgefäß an der Platte gepinnt. Der gesamte Schritt 5 wird in der Sezierplatte durchgeführt. Dadurch wird verhindert, dass Nagelhaut zwischen den Stufen beschädigt oder versehentlich entsorgt wird.
5. Fixierung und Färbung
- Sezierte Nagelhaut mit befestigtem Rückengefäß in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixieren.
- Entsorgen Sie die Seziermedien mithilfe einer neuen Einweg-Übertragungspipette für jeden Schritt, und ersetzen Sie sie durch 1 ml 4 % PFA. Während der Fixierung und Färbung, halten Sie die Sezierungen so weit wie möglich vor Licht geschützt.
- Bei Raumtemperatur 15 min mit Schaukeln bei 20 Umdrehungen/min bebrüten. Lassen Sie nicht zu, dass Sezierungen mehr als 20 min fixativ sitzen, da dies beginnen könnte, das Gewebe zu schädigen.
- Cuticles 2x in 1x PBS + 0.1% Tween (PBST) waschen.
- Entfernen Sie fixativ und ersetzen Sie mit 1 ml 1x PBST.
- Waschen Bei Raumtemperatur für 15 min mit Schaukeln.
- Wiederholen Sie 1x.
HINWEIS: Seziertes, festes Gewebe kann bei 4 °C, bis zu 3 Tage lang, lichtgeschützt, nach der ersten Wäsche gelagert werden, indem die Wäsche durch frisches PBST ersetzt wird. Lagern Sie kein festes Gewebe, wenn Antikörper verwendet werden. Antikörper sollten mit frischem Gewebe für beste Ergebnisse verwendet werden.
- Optional: Antikörperfärbung. Antikörper können verwendet werden, um das Dorsalgefäß klar zu visualisieren (Abbildung 3), oder um Hämozytenspezifische Marker zu erkennen. Dadurch können nur Zellen entlang des Rückengefäßes gezählt oder die Membran der Hämozyten markiert werden.
- Entfernen Sie die zweite Wäsche, fügen Sie primären Antikörper bei der entsprechenden Verdünnung hinzu. Über Nacht bei 4 °C mit Schaukeln inkubieren.
- Primären Antikörper entfernen und zweimal mit PBST 15 min mit Schaukeln waschen.
- Fügen Sie fluoreszierenden Sekundärantikörper hinzu. Wir empfehlen einen grünfluoreszierenden Antikörper, damit er die fluoreszierenden Partikel nicht verdeckt. Bei Raumtemperatur 2 h mit Schaukeln bebrüten.
- Sekundären Antikörper entfernen, zweimal für jeweils 15 min mit PBST waschen.
- Stain mit DAPI.
- Die Endwäsche entfernen und durch 1 ml DAPI in PBST (1:1000) verdünnt ersetzen.
- Stain für 20 min mit Schaukeln bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie DAPI, und waschen Sie 2x (wiederholen Sie Schritt 5.2).
- Ersetzen Sie die Endwäsche durch frische 1x PBST.
HINWEIS: Fliegen können bei 4 °C, für bis zu 3 Tage, vor Licht geschützt, nach der ersten Wäsche durch Denerdurchlösung der Wäsche durch frischen PBST gelagert werden.
6. Montage von Nagelhaut auf Mikroskopschlitten und Bildgebung
- Bereiten Sie sezierte Nagelhaut vor.
- Schneiden Sie unter dem sezierenden Stereomikroskop überschüssige Cuticle ab, die die Bildgebung stören könnte.
- Mit Zangen die Nagelhaut mit angeschlossenem Rückengefäß in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 70 % Glycerin übertragen. Das Platzieren der Nagelhaut in Glycerin hilft, PBST zu entfernen und ermöglicht ein klareres Bild während der Bildgebung.
- Nagelhaut auf das Mikroskopschlitten montieren.
- Fügen Sie ein paar Tropfen 70% Glycerin zu einem Mikroskop-Dia hinzu.
- Mit Zangen, entfernen Sie Nagelhaut aus dem Glycerin-Rohr und legen Sie in Glycerin auf der Folie.
- Verwenden Sie unter dem sezierenden Stereomikroskop Zangen, um die ventrale Seite der Nagelhaut nach oben zu richten, um sicherzustellen, dass das Dorsalgefäß sichtbar ist. Das dunklere Pigment der Nagelhaut wird verdeckt sein.
- Fügen Sie bei Bedarf einen zusätzlichen Tropfen Glycerin hinzu. Dies hilft, Luftblasen zu verhindern und ermöglicht ein klareres Bild.
- Legen Sie einen Deckelrutsch vorsichtig über Nagelhaut und versiegeln Sie Kanten mit Fingernagellack. Vor dem Fortfahren 10-15 min trocknen lassen. Die Fliegen sofort abbilden oder in einer lichtdichten Box bei 4 °C aufbewahren.
- Bild das dorsale Schiff.
- Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um optische Abschnitte des Rückengefäßes zu erzeugen. Alternativ kann ein konfokales Mikroskop verwendet werden, das für zusätzliche Genauigkeit sorgen kann. Erhalten Sie Z-Stack-Bilder des dorsalen Gefäßes mit einer 20-fachobjektiven und bevorzugten Bildgebungssoftware. Fügen Sie eine Maßstabsleiste von 10 mm hinzu, und beschriften sie Bilder ordnungsgemäß als Tiff-Dateien (Abbildung 4) oder das gewünschte Format.
HINWEIS: Die Anzahl der erhaltenen Z-Stack-Bilder kann zwischen den Sezieren variieren und hängt davon ab, wie gut das Dorsalgefäß seziert wurde, und von der gewünschten Schrittgröße zwischen den Bildern. Hier wurde die Schrittgröße auf 0,49 mm eingestellt. Diese Zahl kann überall von 3 bis 40 Bilder pro Stapel in unserer Erfahrung reichen.
- Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um optische Abschnitte des Rückengefäßes zu erzeugen. Alternativ kann ein konfokales Mikroskop verwendet werden, das für zusätzliche Genauigkeit sorgen kann. Erhalten Sie Z-Stack-Bilder des dorsalen Gefäßes mit einer 20-fachobjektiven und bevorzugten Bildgebungssoftware. Fügen Sie eine Maßstabsleiste von 10 mm hinzu, und beschriften sie Bilder ordnungsgemäß als Tiff-Dateien (Abbildung 4) oder das gewünschte Format.
7. Bilder analysieren
- Quantifizieren Sie fluoreszierende Ereignisse mit ImageJ.
- Öffnen Sie Bilder und stapeln Sie sie: Bild - Stacks - Bilder zu Stapeln.
- Zählen Sie nur die fluoreszierenden Signale von 1 mm größe innerhalb eines Durchmessers von 10 mm, die auf einem DAPI-positiven Kern zentriert sind, indem Sie auf jedes Ereignis von mindestens 10 Zellen pro Fliege klicken, von mindestens 10 Fliegen pro Alter pro injiziertem Partikeltyp: Plugins - Analyze - Cell Counter Notice ( Abbildung5A). Das Werkzeug zum Zellzähler weist jeder verfolgten Zelle eine andere Farbe zu, mit einem farbigen Punkt, der jedem fluoreszierenden Ereignis entspricht, auf das innerhalb dieser Zelle geklickt wird.
- Um die dem einzelnen Punkt zugeordnete Zähler- und Stapelposition aufzulisten, drücken Sie "m" oder wählen Sie Messen unter der Registerkarte Analysieren aus, oder um die Anzahl der in jeder Zelle gezählten Ereignisse in einer Ergebnistabelle anzuzeigen, drücken Sie "alt +y" (Abbildung 5B).
- Übertragen Sie die Zellenanzahl in eine Kalkulationstabelle, die für die statistische Analyse verwendet werden soll.
- Führen Sie statistische Analysen durch.
- Analysieren Sie Unterschiede in phagozytischen Ereignissen mit ANOVA mit festen Effekten oder mit gemischten Modellverschachtelten ANOVA. Gemischte Modelle können verwendet werden, um die wichtigsten fixen Auswirkungen von Alter und Genotyp und die zufällige Wirkung von Individuen zu testen, die in jedem Genotyp verschachtelt sind17.
HINWEIS: Die Ermittler sollten die Annahmen eines statistischen Verfahrens zur Analyse der Daten streng prüfen.
- Analysieren Sie Unterschiede in phagozytischen Ereignissen mit ANOVA mit festen Effekten oder mit gemischten Modellverschachtelten ANOVA. Gemischte Modelle können verwendet werden, um die wichtigsten fixen Auswirkungen von Alter und Genotyp und die zufällige Wirkung von Individuen zu testen, die in jedem Genotyp verschachtelt sind17.
Representative Results
Zur Veranschaulichung der beschriebenen Injektionsmethoden zeigt Abbildung 1A die Injektionsstelle auf Drosophila melanogaster, sowie wie Lebensmittelfarbstoff eine visuelle Bestätigung ermöglicht, dass die Fliege injiziert wurde (Abbildung 1B). Die Zugabe von Lebensmittelfarbstoffen hilft auch bei der Erkennung einer verstopften Nadel. Injektionen können im Bauch durchgeführt werden, aber halten Sie die Injektionsstelle konsistent über Experimente. Dies wird dazu beitragen, mögliche Variationen zwischen den einzelnen Experimenten zu minimieren.
Um die fluoreszierend markierten Partikel in den ansässigen Hämozyten entlang des Dorsalgefäßes zu visualisieren, sezierten wir das Rückengefäß und befestigten Bauchhaut. Abbildung 2A-F zeigt die Seziermethoden.
Um die altersspezifische Fähigkeit von jungen und gealterten Fliegen zur Phagozytose zu beurteilen, werden Hämozyten entlang des Rückengefäßes mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. Um sicherzustellen, dass nur Zellen entlang des Rückengefäßes gezählt werden, können Antikörper oder GFP-markierte Gene für bestimmte Blutzellmarker oder herzspezifisches Kollagen, wie Hemese und Hemolectin oder Pericardin (Abbildung 3), verwendet werden22,23,24. Fluoreszierend beschriftete E. coli-Partikel sind 1 mm lang, Hämozyten 10 mm im Durchmesser17. Es werden nur die fluoreszierenden Ereignisse mit einem Durchmesser von 10 mm gezählt, die auf einem DAPI-positiven Kern zentriert sind (Abbildung 4). Zur Quantifizierung fluoreszierender Ereignisse wird ImageJ-Software verwendet (Abbildung 5).
Abbildung 1: Injektionsstelle und visuelle Überprüfung. (A) Die Seitenseite des Thorax wird mit einer gezogenen Kapillarnadel durchbohrt. (B) Injektionen werden visuell überprüft, indem der Partikellösung grüner Lebensmittelfarbstoff hinzugefügt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Dorsale Gefäßsektion. (A) Pins werden in den Thorax und den hinteren Bauch (schwarze Pfeile) gelegt. (B-C) Zwei horizontale Einschnitte (grüne Pfeile) werden am hinteren Ende des Bauches (B) und am vorderen Ende (C) gemacht. (D) Ein vertikaler Schnitt (grüner Pfeil) wird in der Mitte des Bauches gemacht, der die beiden horizontalen Schnitte verbindet. (E) Optionale Stifte (*) werden verwendet, um die Bauchhöhle zu öffnen und das innere Gewebe freizulegen. (F) Innengewebe (Pflanze, Darm, Gebärmutter, Eierstöcke, Fettkörper) wird entfernt und setzt das Rückengefäß frei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ventralansicht eines sezierten Dorsalgefäßes eines 5 Wochen alten Weibchens, das mit pH-empfindlichen Partikeln injiziert wurde, mit Antikörpern gegen Pericardin ( A)gefärbt. Gepunktete weiße Linie umreißt die seitliche Seite des Rückengefäßes, wobei der Pfeil auf den vorderen Bereich zeigt. (B) Vergrößertes Bild von (A): Hämozytenhaufen (blauer Pfeil), die aktiv Bakterien abbauen, innerhalb der ersten Aortenkammer des Rückengefäßes. (C) Vergrößertes Bild von (A) umreißt das kollagenartige Protein Pericardin (grüner Pfeil), das das dorsale Gefäß an Platz24hält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Seziertes Rückengefäß und zugehörige Hämozyten einer weiblichen Fliege, die mit pH-empfindlichen Partikeln oder Fluorpartikeln injiziert wird. (A) Das Dorsalgefäß und die zugehörigen Hämozyten mit verschlungenen pH-empfindlich enkoehrenden E. coli-Partikeln (rot) oder (E) fluormarkierten E. coli-Partikeln (rot), isoliert von einer 1-wöchigen Fliege, nach 60 min. (B,F) Vergrößerter Einset von (A) bzw. (E) (weißes Feld), das zwei einzelne Hämozyten zeigt. (C) Das Dorsalgefäß und die zugehörigen Hämozyten mit verschlungenen pH-empfindlich enkoehrenden E. coli-Partikeln(rot) oder ( G ) fluormarkierten E. coli-Partikeln (rot), isoliert von einer 5 Wochen alten Fliege, nach 60 min. (D,H) Vergrößerter Einset von (C) bzw. ( G) (weißes Feld), das zwei einzelne Hämozyten zeigt.G Gepunktete weiße Linie umreißt die seitliche Seite des Rückengefäßes, wobei der Pfeil auf den vorderen Bereich zeigt. Mit DAPI (blau) gebeizte Kerne. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Quantifizierung phagozytischer Ereignisse innerhalb von 10 mm Hämozyten mithilfe des Zellzählers in ImageJ. (A) Nach dem Öffnen von Bildern in ImageJ kann das Werkzeug Zellzählerbenachrichtigung verwendet werden, um phagozytische Ereignisse pro Zelle nachzuverfolgen. (B) Dieses Werkzeug weist jeder Zelle, die ausgewählt wurde, eine andere Farbe zu, wobei jeder Punkt einem fluoreszierenden Ereignis innerhalb dieser Zelleentspricht. Wenn Sie 'alt+y' drücken, wird eine Tabelle mit der Anzahl der pro Zelle gezählten Ereignisse angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll ist eine zuverlässige Möglichkeit, verschiedene Aspekte der Phagozytose unter kontrollierten experimentellen Bedingungen zu quantifizieren. Wir stellen fest, dass wir dieses Verfahren nur mit gramnegativen Bakterienpartikeln getestet haben und die Ergebnisse können sich unterscheiden, wenn grampositive Bakterienpartikel verwendet werden. In der Tat wäre es interessant, die phagozytischen Reaktionen auf gramnegative und grampositive Bakterien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu vergleichen. Der Einsatz eines Nano-Injektors ermöglicht eine präzise Kontrolle der Injektionsvolumina und stellt sicher, dass jede Fliege mit dem gleichen Partikelvolumen injiziert wird. Eine Einschränkung des Protokolls liegt in Inkonsistenzen bei Partikelpräparaten. Partikel aggregieren, sobald sie gefroren sind, so dass kleine Schwankungen der Verdünnungsvolumina oder der Mangel an Wirbeln die Partikelkonzentration zwischen den Experimenten beeinflussen können. Um mögliche Schwankungen der Partikelkonzentrationen zwischen den Alterszufällen zu minimieren, ist es von Vorteil, 1- und 5-wöchige fliegen am selben Tag mit der gleichen Nadel- und Partikellösung zu injizieren. Ein weiterer möglicher Nachteil ist, dass bei Sezierungen das Rückengefäß und/oder die Nagelhaut leicht beschädigt werden können, wenn Die Stifte nicht richtig behandelt werden. Um eine Störung des Dorsalgefäßes zu vermeiden, minimieren Sie die Anzahl der pro Sezieren verwendeten Pins. Der Vorteil dieser Seziermethode ist, dass alle Fixier-, Wasch- und Färbeschritte in der Sezierplatte durchgeführt werden können. Da die Nagelhaut festgezurrt sind, verhindert dies, dass die Nagelhaut zwischen den Stufen verloren geht.
Im Vergleich zu den bestehenden Methoden18,19,25,26,27,28,29hat das beschriebene Protokoll seine Vor- und Nachteile. Durch die Sezieren des Dorsalgefäßes sind wir in der Lage, einzelne Hämozyten an dieser Stelle zu visualisieren und zu quantifizieren. Dies ermöglicht es, subtile Variationen der phagozytischen Aktivität zwischen experimentellen Gruppen zu erkennen. Andere Methoden visualisieren fluoreszierend markierte Partikel durch das Sammeln von Hämozyten mit einem Bleed/Scrape Assay19,25,26,27, oder durch eine intakte ventrale Nagelhaut18,19,28,29; einzelne Hämozyten können jedoch nicht beurteilt werden, wenn sie durch die dorsale Nagelhaut visualisiert werden. Der Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zur Bleed/Scrape-Methode besteht darin, dass unsere Methode es uns ermöglicht, nur die Hämozyten zu bewerten, die mit dem Dorsalgefäß verbunden sind, und dass wir zirkulierende Zellen oder solche entlang der Körperwand berücksichtigen, die funktional unterschiedlich sein können. Die Sezieren des dorsalen Gefäßes beseitigt auch die Notwendigkeit, eine zweite Runde von Injektionen mit einem Fluoreszenz-Quencher, wie Trypan blue19,26. Dies liegt daran, dass alle Partikel, die nicht an eine Zelle gebunden oder von ihr verschlungen werden, während der Waschschritte weggewaschen werden. Umgekehrt können alternative Methoden einfacher durchzuführen sein, da sie keine Sezierungen erfordern. Während die Sezieren des dorsalen Gefäßes leicht zu erlernen ist, fügt dieser Schritt eine Komplexität hinzu, die in einigen experimentellen Designs möglicherweise nicht möglich ist.
Obwohl die beschriebene Verwendung dieses in vivo phagozytose-Assays darin besteht, phagozytische Ereignisse zwischen verschiedenen Altersgruppen zu bewerten und zu quantifizieren, ist dieses Protokoll sehr anpassungsfähig und kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Phagozytose zwischen Genotyp, Geschlecht oder Gewebetyp zu analysieren. Da Phagozytose für die meisten mehrzelligen Tiere von zentraler Bedeutung ist, könnte das Verständnis, wie dieser Prozess mit dem Alter abnimmt, zu besseren therapeutischen Behandlungen für die alternde Bevölkerung führen. Dieser Ansatz bietet langfristiges Potenzial zur Aufklärung von Aspekten altersbedingter Veränderungen der Immunantwort, mit besonderem Fokus auf Phagozytose.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Institutes of Health R061484-02 und des UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
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