Summary
Denne protokollen beskriver en in vivo analyse av fagocytose som brukes til å vurdere og kvantifisere evnen til unge og alderen Drosophila melanogaster hemocytes til fagocytose bakterier.
Abstract
Fagocytose er en viktig funksjon av den medfødte immunresponsen. Denne prosessen utføres av fagocytiske hemocytes hvis primære funksjon er å gjenkjenne et bredt spekter av partikler og ødelegge mikrobielle patogener. Etter hvert som organismene eldes, begynner denne prosessen å avta, men lite er kjent om de underliggende mekanismene eller det genetiske grunnlaget for immundeenscens. Her brukes en injeksjon basert på vivo fagocytoseanalyse til å vurdere aldersrelaterte endringer i ulike aspekter ved fagocytose, som binding, oppslukning og nedbrytning av internaliserte partikler, ved å kvantifisere fagocytiske hendelser i hemocytes hos voksne Drosophila. Drosophila melanogaster har blitt en ideell modell for å undersøke aldersrelaterte endringer i medfødt immunfunksjon av mange grunner. For det første er mange genetiske komponenter og funksjoner av den medfødte immunresponsen, inkludert fagocytose, evolusjonært bevart mellom Drosophila og pattedyr. På grunn av det, resultater fra å bruke denne protokollen er sannsynlig å være allment relevant for å forstå aldersrelaterte endringer i immunforsvaret i en rekke organismer. I tillegg merker vi oss at denne metoden gir kvantitative estimater av hemocyte fagocytisk evne, noe som kan være nyttig for en rekke forskningsemner, og trenger ikke være begrenset til studier av aldring.
Introduction
Det medfødte immunsystemet, som består av fysiske og kjemiske barrierer mot infeksjon samt cellulære komponenter, er evolusjonært bevart på tvers av flercelledeorganismer 1,,2. Som den første forsvarslinjen spiller det medfødte immunsystemet en kritisk rolle i bekjempelse av invaderende patogener i alle dyr1,2,3. Komponentene i den medfødte immunresponsen inkluderer et bredt spekter av celletyper som er klassifisert på grunnlag av at de mangler spesifisitet og immunologisk minne2,,3,4. Hos mennesker inkluderer disse celletypene fagocytosymoncytter og makrofager, nøytrofiler og cytotoksiske naturlige drapsceller4,5. Mens det å ha et funksjonelt immunsystem er viktig for vertsoverlevelse, er det klart at funksjonen til immunceller avtar med alderen, et fenomen kjent som immundeenscens5,6. Å kunne vurdere aldersrelaterte endringer i immunresponsen, inkludert ulike aspekter ved prosessen med fagocytose, kan hjelpe til med vår forståelse av immundeenscens. Prosedyren vi beskriver her gir en effektiv og repeterbar tilnærming til å evaluere og kvantifisere fagocytiske hendelser ved hemocytter i Drosophila melanogaster.
Drosophila er en ideell modell for å studere immunresponsen av mange grunner. For det første er det et omfattende sett med genetiske verktøy tilgjengelig som gjør det mulig å enkelt manipulere genuttrykk på en vevsavhengig måte7. Disse verktøyene inkluderer en samling av mutanter, RNA interferens aksjer, GAL4 / UAS aksjer, og Drosophila Genetic Reference Panel som inneholder 205 forskjellige innavlede linjer som hele genomsekvenser er katalogisert8. Den korte livssyklusen til Drosophila og det store antallet individer som produseres, gjør det mulig for forskere å teste flere individer i et kontrollert miljø, på kort tid. Dette forbedrer i stor grad evnen til å identifisere subtile forskjeller i immunresponser på infeksjon blant genotyper, mellom kjønnene eller på tvers av aldre. Viktigere, mange genetiske komponenter og funksjoner av medfødt immunrespons, inkludert fagocytose, er evolusjonært bevart mellom Drosophila og pattedyr1,2.
I Drosophila utføres prosessen med fagocytose som følger infeksjon av fagocytiske hemocytter kalt plasmacytter, som tilsvarer pattedyrmakrofager9. Hetycytter er avgjørende for å gjenkjenne et bredt spekter av partikler og fjerne mikrobielle patogener9,,10,,11,,12,,13. Disse cellene uttrykker en rekke reseptorer som må skille seg fra ikke-selv, og initiere signalhendelser som trengs for å utføre den fagocytiske prosessen10,11,12,13,14,15. Når en partikkel er bundet, begynner den å bli internalisert ved omorganisering av actin cytoskeleton og ombygging av plasmamembranen for å utvide rundt partikkelen, og danner en fagocytisk kopp11,12,13,14. Under denne prosessen forteller et annet sett med signaler cellen å internalisere partikkelen ytterligere ved å lukke den fagocytiske koppen, danner en membranbundet fagbinding11,12,13,14,15. Den farosom deretter gjennomgår en modningsprosess, forbinder med ulike proteiner og fusjonerer med lysosomer, danner en sur phagolysosome11,12,13,14,15. På dette punktet kan partikler effektivt bli degradert og eliminert11,12,13,14,15. Drosophila studier har vist at eldre fluer (4 uker) har en redusert evne til å fjerne en infeksjon sammenlignet med yngre fluer (1 uke gammel), sannsynligvis skyldes, i hvert fall delvis, til en nedgang i noen aspekter av fagocytose16,17.
Metoden som er beskrevet her benytter to separate fluorescerende merkede varmedrepte E. coli-partikler, en som bærer en standard fluorofore og en som er pH-følsom, for å vurdere to forskjellige aspekter av fagocytose: den første oppslukningen av partikler, og nedbrytning av partikler i fagosofisk. I denne analysen er fluor-partikkelfluorescens observerbar når partiklene er bundet og oppslukt av hemocytter, mens pH-følsomme partikler fluoresce bare i de lave pH-forholdene i phagosome. Fluorescerende hendelser kan deretter observeres i hemocytes som lokaliserer langs dorsalfartøyet. Vi fokuserer på hecytter lokalisert til dorsalfartøyet, som gir et anatomisk landemerke for å lokalisere hemocytes som er kjent for å bidra til bakteriell clearance, og for å konsekvent isolere dem. Imidlertid er hemocytter i andre deler av kroppen og hemolymph også viktig for klaring. Selv om vi ikke har studert denne cellepopulasjonen, kan vår generelle prosedyre også gjelde for fagocytiske analyser av disse cellene. En fordel med vår tilnærming er at vi kan kvantifisere fagocytiske hendelser i individuelle hemocytes, slik at vi kan oppdage subtil variasjon i fagocytiske prosesser. Andre studier som visualiserer fluorescerende hendelser gjennom skjellaget18,19 tar ikke hensyn til forskjeller i antall hemocytes tilstede, noe som er spesielt viktig å vurdere i vårt tilfelle som total hemocyte teller forventes å endres med alder17.
Protocol
1. Samle og alder Drosophila
- For å generere samme alderen F1 fluer for testing av fagocytose, tilsett 5-10 jomfruhunner og 5 menn av de riktige genotypene til et hetteglass som inneholder fersk flymat. Vi bruker en maismelmelasse agarbasert mat20, men metoden skal fungere uavhengig av hvilken type diett fluene er oppdratt på. For dette eksperimentet brukte vi Hemese (Han)-GAL4; UAS-GFP flyr for å merke hemocytes genetisk.
MERK: Flere fluer kan brukes, men noen linjer med D. melanogaster kan ikke parre seg eller reprodusere godt når de er overbefolket, og overbefolkning kan ha negative effekter på larvalutvikling21 og fagocytose. - Opprettholde fluer under de ønskede eksperimentelle forholdene. For dette eksperimentet, opprettholde He-GAL4; UAS-GFP flyr ved 24 °C. La voksne fluer parre seg i en uke, og fjern deretter voksne. F1 fluer vil da bli samlet inn fra disse hetteglassene etter eklosion for eksperimentell bruk.
- Samle jomfrufluer hele uken, eller til ønsket antall fluer samles inn. Jomfruer er ikke nødvendig; Parring kan imidlertid påvirke immunresponsen. Hvis F1 fluer skal testes som jomfruer, skille menn og kvinner innen 8 timer etter eklosion og opprettholde i separate hetteglass for å hindre parring. Samle nok fluer for å tillate vurdering av fagocytose i minst 10 fluer per genotype / behandling / kjønn per alder.
- Hvis du elder fluene til en uke, samle minst 50 fluer totalt, eller 20 fluer per behandling tilstand for hver partikkel, enten fluor-partikler eller pH sensitive partikler, som skal injiseres. Dette vil sikre minst 10 fluer å analysere på tidspunktet for eksperimentet.
- Hvis aldring flyr til mer enn 3 uker, samle minst 100-150 fluer totalt, eller 50-75 fluer per behandling tilstand for å sikre at det er nok fluer tilgjengelig for å måle fagocytose. Når aldring flyr i laboratoriet, bruker vi vanligvis insektbur opprettholdt ved 24 °C i 12:12 L:D forhold, og endre maten annenhver dag. Hvis hetteglass brukes i stedet for bur, flyr spissen inn i nye hetteglass hver 3-5 dager, avhengig av tilstanden til maten i hetteglasset. Antall fluer som trengs vil avhenge av hvor sent i alder fagocytose vil bli analysert, og aldersspesifikke overlevelsesrater av den genotypen i en bestemt miljøtilstand.
- Hvis unge og eldre fluer vil bli vurdert, planlegge tilsvarende slik at 1-ukers gamle og eldre fluer vil bli injisert på samme dag. Dette vil minimere variasjoner i partikkelkonsentrasjon mellom eksperimenter og vil sikre at effekten av alder på den fagocytiske målingen ikke er forvirret med effekten av dagen analysen ble utført.
- Hus de samlede fluene ved 24 °C til de er 5-7 dager gamle, eller opprettholde fluene til ønsket alder.
2. Klargjør fluorescerende merkede partikler
- Rekonstituerer varmedrepte E. coli-fluorpartikler eller pH-sensitive E. coli-partikler til en lagerkonsentrasjon på henholdsvis 20 mg/ml eller 1 mg/ml. Andre bakterier er tilgjengelige for bruk som kan være mer egnet for visse eksperimenter, men se produsentens instruksjoner for passende lagerkonsentrasjoner.
- For fluorpartikler tilsett 990 μL pBS (pH 7,4) eller foretrukket buffer og 10 μL på 2 mM (20 %) natriumazid. Vortex å blande.
MERK: Natriumazimid er et konserveringsmiddel som kan utelates; Partikler tilberedt uten natriumazid varer imidlertid ikke så lenge. Fluor-partikler må brukes innen 24 timer, og pH-sensitive partikler må brukes innen 7 dager. - For pH-følsomme partikler tilsett 1980 μL pBS (pH 7,4) eller foretrukket buffer og 20 μL på 2 mM (20 %) natriumazid. Vortex å blande.
- Lag flere engangsrør på 20 μL aliquoter i 1,5 ml mikrosytribglassrør. Oppbevar fluorpartikler ved -20 °C i opptil et år, og pH-følsomme partikler ved 4 °C i opptil 6 måneder, beskyttet mot lys.
- For fluorpartikler tilsett 990 μL pBS (pH 7,4) eller foretrukket buffer og 10 μL på 2 mM (20 %) natriumazid. Vortex å blande.
- På injeksjonsdagen fjerner du natriumazid fra partiklene før bruk. For å gjøre dette, sentrifuger partiklene i 5 min ved 15.000 x g ved romtemperatur.
- Fjern supernatant- og vaskepartiklene to ganger ved å bruke på nytt i 50 μL pbs eller foretrukket buffer, og sentrifuge i 5 min ved 15 000 x g.
- Etter den andre vasken, fjern de supernatant- og resuspendpartiklene i 100 μL 1x PBS eller foretrukket buffer. Hold løsningen i røret og minimer eksponering for lys gjennom hele eksperimentet. Når natriumaziten er fjernet, bruk fluorpartikler innen 24 timer, og bruk pH-sensitive partikler som brukes innen 5-7 dager.
MERK: I våre tidligere eksperimenter fant vi at denne konsentrasjonen av partikler ga tellbare antall fagocytiske hendelser, og at antall partikler tilgjengelig for fagocytose av hemocytes ikke begrenset17. Brukere av denne protokollen kan imidlertid sammenligne resultater ved hjelp av andre konsentrasjoner for å sikre at det er et tilstrekkelig antall partikler tilgjengelig for fagocytose av hemocytes under betingelsene for sine eksperimenter.- Hvis natriumazid ble utelatt, fortynn partiklene 1:5 i samme buffer partiklene ble tilberedt med, til injeksjoner.
- Legg til en dråpe (~ 10 μL) av grønn matfarging til partiklene. Dette gjør det lettere å sikre at fluene har blitt injisert.
3. Injiser fluene
- Forbered glassnåler til injeksjonsvæsker.
- Trekk glassnåler med pipettetrekker. Sett pipetteavtrekkeren til 55 °C og magneten til 45. Bruk bare nålene som følger med injektoren, da det ikke er garantert at andre nåler vil fungere med samme presisjon.
- Fyll en 1 ml steril sprøyte med mineralolje, og fest 30 gauge hypodermic (G) nålen, som følger med nanoinjektoren.
- Fyll kapillærnålen på bakfyll ved å sette 30 G-nålen inn i den stumpe enden av den trukket glassnålen og fyll med mineralolje. Fjern langsomt 30 G-nålen, og sørg for at det ikke er luftbobler i hele nålen, da dette kan forårsake unøyaktige injeksjonsvolumer. Injektoren vil ikke fungere skikkelig uten å fylle kanylen på forhånd.
- Bruk tang til å bryte av tuppen av nålen for å lage en åpning for å tillate utstøting av oppløsning.
- Monter nanoinjektoren.
MERK: Andre injektorer kan brukes. Metoden som er beskrevet nedenfor gjelder for nanoinjektoren. For andre injektorer, se brukerhåndboken for instruksjoner.- Sett injektoren til ønsket volum (mellom 46 nL og 69 nL).
- Fjern spennhylsen og plasser tetningshylsen O-ringen, den hvite avstandsstykket med innrykk vendt opp for å motta baksiden av nålen, og den større O-ringen på metallstempelet, i den rekkefølgen. Sett spennhylsen igjen uten å stramme den.
- Sett metallstempelet inn i den stumpe enden av den oljefylte glassnålen. Skyv nålen forsiktig ned, sett den inn i den større O-ringen. Stram spennhylsen til den sitter godt fast.
MERK: Hvis metallstempelet ikke strekker seg forbi spennhylsen, trykker du på og holder "EMPTY" til stempelet er synlig. Dette gjør det lettere å sikre at stempelet settes inn i nålen. - Trykk på og hold nede "EMPTY" til injektoren piper. Dette utløser det meste av mineraloljen fra nålen, og etterlater et lite volum olje for å fungere som en barriere mellom de to væskene, samt fjerner luftbobler.
- Fyll nålen med enten fluorpartikler eller pH-følsomme partikler ved å sette spissen av glassnålen inn i mikrosctigrifugerøret som inneholder de tilberedte partiklene.
- Trykk på og hold 'FILL' til injektoren piper.
- Injeksjoner
- Overfør fluene som skal injiseres i et tomt hetteglass. Immobiliser fluene ved å plassere hetteglasset i is. CO2 kan også brukes til å immobilisere fluene. Vær imidlertid oppmerksom på at når du bruker pH-sensitive partikler, kan forhøyede CO2-nivåer kunstig fors sure eventuelle buffere som brukes og kan heve bakgrunnsfluorescensen.
- Injiser fluene i brystplaten på thoraxen (figur 1A). Injeksjonen er vellykket hvis grønt fargestoff er sett går inn i fly (Figur 1B). Hvis flyet ikke blir grønt, må du kontrollere at nålen ikke er tilstoppet.
MERK: Alternativt kan fluer injiseres i magen, men hold injeksjonsstedet konsekvent på tvers av alle eksperimenter. - Plasser injiserte fluer i et nytt mat hetteglass, og bes merke til den tiden at den første og siste fly ble injisert. For å minimere eksperimentelle feil på grunn av hvor lang tid det tar å fullføre injeksjoner, fullføre injeksjoner i tide. Med praksis bør det ta ikke mer enn 10 minutter å injisere ett sett med fluer. Legg hetteglasset på siden til alle fluene har gjenopprettet, for å forhindre at fluene blir sittende fast i maten.
- La fluer komme seg i 60-90 min, avhengig av eksperimentelle forhold. Her ble det brukt en 60-minutters restitusjonstid. Merk at denne restitusjonstiden var optimal for å telle fagocytiske hendelser under de eksperimentelle forholdene i Horn et al. studie17. Men under noen forhold kan dette være for lenge til å oppdage subtile forskjeller i fagocytose mellom behandlingsgrupper. Det kan være nyttig å utføre tidskurseksperimenter som ble gjort tidligere17 for å bestemme gjenopprettingstiden som vil avsløre maksimale forskjeller mellom kontroll og eksperimentelle resultater. Uansett restitusjonstid er valgt, hold dette konsekvent på tvers av alle eksperimentelle behandlinger.
- Hvis injeksjon med fluorpartikler og pH-sensitive partikler på samme dag, bruk en ny nål for hver oppløsning. Ikke injiser individuelle fluer med begge partiklene hvis de begge fluoresce røde, siden resultatet ikke ville skille mellom de to aspektene av fagocytose, partikkelbinding / oppslukning vs. partikkelinkludering i fagocingen.
4. Dissekere dorsalfartøyet
- Etter at fluer har kommet seg i 60-90 min, overfører du alle levende fluer til et tomt hetteglass og immobiliserer på is.
- Overfør en flue om gangen på en silikon elastomer disseksjon plate.
MERK: Klargjør disseksjonsplatene minst 1 uke før bruk, hvis du herder ved romtemperatur. For å gjøre dette, forberede elastomer og hell den i en 33 mm x 10 mm Petri parabolen, fylle parabolen omtrent halvveis. Trykk forsiktig på fatet på en flat overflate for å minimere luftbobler. La platene sitte ved romtemperatur, uforstyrret, i minst en uke.- Under et dissekere stereomikroskop orienterer du flyventesiden opp.
- Ved hjelp av insektpinner fester du flyet på platen ved å sette inn en pin gjennom thoraxen og en annen pin gjennom den mest bakre enden av magen, nær kjønnsorganene (Figur 2A). Det kan være nyttig å kutte pinnene i to før du fester prøven for ikke å hindre disseksjon. Gjenta med opptil 10 fluer per disseksjonsplate.
MERK: Valgfritt: Fjern vingene og bena før du fester fly til plate. Dette vil bidra til å forhindre at en boble dannes rundt fly når medier legges til. - Når alle fluene er festet til platen, legg til nok disseksjonsmedier til å dekke fluene (~ 1 ml) ved hjelp av en overføringspipet.
- Bruk tang eller skjellaget saks, fjern hodet.
- Ved hjelp av cuticle saks, lage to horisontale snitt: en rett over bakre pin i magen, og en annen på den mest fremre enden av magen, hvor thorax og mage møtes (Figur 2B, C). I figur 2ble hodet intakt for å klargjøre orientering.
- Lag et vertikalt snitt, som forbinder de to horisontale snittene (de tre kuttene ligner bokstaven I). Dette vil åpne opp bukhulen (Figur 2D).
- Bruk tang, fjern indre organer og vev, unngå dorsalbeholderen. Hvis det er uforstyrret, kan det gjennomsiktige dorsalfartøyet ofte ses pulserende nær den fremre enden av magen. Ekstra pinner kan brukes til å feste åpne nykuttede ender av skjellaget (Figur 2E, F).
- Bruk skjellaget saks, fjern thorax. Alternativt kan thoraxen fjernes før montering av dissekert neglebånd og dorsalfartøy på et mikroskopsklie.
- Gjenta med gjenværende fluer. dissekere flyr i tide, for å minimere mulige variasjoner i fagocytisk hastighet. Når alle fluer er dissekert, la neglebåndene med det vedlagte dorsalfartøyet festet til platen. Alle trinn 5 vil bli utført i disseksjonsplaten. Dette vil forhindre skade eller ved et uhell kaste neglebånd mellom trinnene.
5. Fiksering og flekker
- Fiks dissekert neglebånd med festet dorsalfartøy i 4 % paraformaldehyd (PFA).
- Bruk en ny engangsoverføringspipet for hvert trinn, kast disseksjonsmediet og erstatt med 1 ml 4 % PFA. Gjennom fiksering og farging, hold disseksjonene beskyttet mot lys så mye som mulig.
- Inkuber ved romtemperatur i 15 min med gynge ved 20 rpm. Ikke la disseksjoner sitte i fikseringsmiddel i mer enn 20 min, da dette kan begynne å skade vevet.
- Vask neglebåndene 2x i 1x PBS + 0,1% Tween (PBST).
- Fjern fikseringsmiddel og erstatt med 1 ml PBST.
- Vask ved romtemperatur i 15 min med gynge.
- Gjenta 1x.
MERK: Dissekert, fast vev kan oppbevares ved 4 °C i opptil 3 dager, beskyttet mot lys, etter første vask ved å erstatte vasken med fersk PBST. Ikke oppbevar fast vev hvis antistoffer vil bli brukt. Antistoffer bør brukes med friskt vev for best resultat.
- Valgfritt: Antistofffarging. Antistoffer kan brukes til å tydelig visualisere dorsalfartøyet tydelig (Figur 3), eller for å oppdage hemocyte spesifikke markører. Dette kan sikre at bare celler langs dorsalbeholderen telles eller markere membranen i hemocytene.
- Fjern den andre vasken, tilsett primært antistoff ved riktig fortynning. Inkuber over natten ved 4 °C, med gynge.
- Fjern primær antistoff, og vask to ganger med PBST i 15 min med gynge.
- Tilsett fluorescerende sekundært antistoff. Vi anbefaler et grønt-fluorescerende antistoff slik at det ikke skjuler fluorescerende partikler. Inkuber ved romtemperatur i 2 timer, med gynge.
- Fjern sekundært antistoff, vask to ganger i 15 min hver med PBST.
- Flekk med DAPI.
- Fjern den endelige vasken og skiftsp med 1 ml DAPI fortynnet i PBST (1:1000).
- Flekk i 20 min med gynge ved romtemperatur.
- Fjern DAPI, og vask 2x (gjenta trinn 5.2).
- Bytt ut sluttvasken med frisk 1x PBST.
MERK: Fluer kan oppbevares ved 4 °C, i opptil 3 dager, beskyttet mot lys, etter første vask ved å erstatte vasken med fersk PBST.
6. Montering av neglebånd på mikroskoplysbilder og bildebehandling
- Forbered dissekert neglebånd.
- Under disseksjon stereomikroskopet, kuttet av overflødig skjellaget som kan forstyrre avbildning.
- Bruk pinsett til å overføre neglebåndene med festet dorsalfartøy til et mikrosygående rør på 1,5 ml mikrocentrifuge som inneholder 70 % glyserol. Plassere neglebåndene i glyserol vil bidra til å fjerne PBST og gir et klarere bilde under bildebehandling.
- Monter neglebåndene på mikroskopet.
- Legg til noen dråper 70% glyserol til et mikroskop lysbilde.
- Bruk pinsett, fjern neglebånd fra glyserolrøret og plasser i glyserol på lysbildet.
- Under disseksjonsteresteromikroskopet bruker du tang til å orientere neglebåndene ventrale side opp, slik at dorsalbeholderen er synlig. Det mørkere pigmentet i skjellaget vil være med forsiden ned.
- Legg til en ekstra dråpe glyserol, om nødvendig. Dette bidrar til å forhindre luftbobler og gir et klarere bilde.
- Plasser forsiktig en coverslip over neglebånd og forsegle kanter med neglelakk. La tørke i 10-15 min før du fortsetter. Bilde fluene umiddelbart eller lagre i en lyssikker boks ved 4 °C.
- Bilde dorsal fartøyet.
- Bruk et fluorescerende mikroskop til å generere optiske deler av dorsalbeholderen. Et konfusisk mikroskop kan alternativt brukes som kan gi ekstra nøyaktighet. Få Z-stabelbilder av dorsal fartøyet ved hjelp av en 20x objektiv og foretrukket bildebehandling programvare. Legg til en 10 mm skalalinje, og merk og lagre bilder som tiff-filer (Figur 4) eller ønsket format.
MERK: Antall Z-stabelbilder som er oppnådd, kan variere mellom disseksjoner og avhenger av hvor godt dorsalfartøyet ble dissekert, og på ønsket trinnstørrelse mellom bildene. Her ble trinnstørrelsen satt til 0,49 mm. Det tallet kan variere alt fra 3 til 40 bilder per stabel i vår erfaring.
- Bruk et fluorescerende mikroskop til å generere optiske deler av dorsalbeholderen. Et konfusisk mikroskop kan alternativt brukes som kan gi ekstra nøyaktighet. Få Z-stabelbilder av dorsal fartøyet ved hjelp av en 20x objektiv og foretrukket bildebehandling programvare. Legg til en 10 mm skalalinje, og merk og lagre bilder som tiff-filer (Figur 4) eller ønsket format.
7. Analyser bilder
- Kvantifiser fluorescerende hendelser ved hjelp av ImageJ.
- Åpne bilder og stable dem: Bilde à Stabler à Bilder å stable.
- Tell bare ~ 1 mm størrelse fluorescerende signaler innenfor en 10 mm diameter sentrert på en DAPI-positiv kjerne ved å klikke på hver hendelse fra minst 10 celler per fly, fra minst 10 fluer per alder per partikkeltype injisert: Plugins à Analyser à Cell Counter Notice ( Figur5A). Verktøyet for celletellermerknad tilordner en annen farge til hver celle som spores, med en farget prikk som tilsvarer hver fluorescerende hendelse som klikkes på i den cellen.
- Hvis du vil vise teller- og stakkposisjonen som er knyttet til hvert punkt, trykker du 'm' eller velger Mål under Analyser-fanen, eller for å vise antall hendelser som telles i hver celle i en resultattabell, trykker du 'alt +y' ( Figur5B).
- Overfør celletellingene til et regneark som skal brukes til statistisk analyse.
- Utfør statistisk analyse.
- Analyser forskjeller i fagocytiske hendelser ved hjelp av enten anova med fast effekt eller blandet modell nestet ANOVA. Blandede modeller kan brukes til å teste de viktigste faste effektene av alder og genotype og den tilfeldige effekten av individer nestet i hver genotype17.
MERK: Etterforskerne bør være strenge i å teste forutsetningene for enhver statistisk prosedyre som brukes til å analysere dataene.
- Analyser forskjeller i fagocytiske hendelser ved hjelp av enten anova med fast effekt eller blandet modell nestet ANOVA. Blandede modeller kan brukes til å teste de viktigste faste effektene av alder og genotype og den tilfeldige effekten av individer nestet i hver genotype17.
Representative Results
For å illustrere de beskrevne injeksjonsmetodene viser figur 1A injeksjonsstedet på Drosophila melanogaster, samt hvordan matfargestoff gir en visuell bekreftelse på at flyet ble injisert (Figur 1B). Tilsetning av matfargestoff hjelper også i anerkjennelse av en tilstoppet nål. Injeksjoner kan utføres i magen, men hold injeksjonsstedet konsekvent på tvers av eksperimenter. Dette vil bidra til å minimere mulige variasjoner mellom hvert eksperiment.
For å visualisere de fluorescerende merkede partiklene i hjemmehørende hemocytes langs dorsalfartøyet, dissekerte vi dorsalfartøyet og festet mageskjorte. Figur 2A-F skisserer disseksjonsmetodene.
For å vurdere den aldersspesifikke evnen til unge og eldre fluer til å utføre fagocytose, visualiseres hemocytter langs dorsalfartøyet ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. For å sikre at bare celler langs dorsalbeholderen telles, kan antistoffer eller GFP-merkede gener for visse blodcellemarkører eller hjertespesifikk kollagen, som Hemese og Hemolectin, eller Pericardin (figur 3), brukes henholdsvis22,23,24. Fluorescerende merket E. coli partikler er 1 mm i lengde, mens hetycytter er 10 mm i diameter17. Bare de fluorescerende hendelsene som ligger innenfor en diameter på 10 mm som er sentrert på en DAPI-positiv kjerne, telles (figur 4). For å kvantifisere fluorescerende hendelser, brukes ImageJ-programvaren (Figur 5).
Figur 1: Injeksjonssted og visuell verifisering. (A) Lateral side av thorax er gjennomboret med en trukket kapillær nål. (B) Injeksjoner verifiseres visuelt ved å tilsette grønt matfargestoff i partikkeloppløsningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Dorsal kardisseksjon. (A)Pins er plassert i thorax og bakre mage (svarte piler). - Jeg harikke noe valg. To horisontale snitt (grønne piler) er laget på den bakre enden av magen (B), og fremre ende (C). (D) Et vertikalt snitt (grønn pil) er gjort ned midt i magen, og forbinder de to horisontale kuttene. (E) Valgfrie pinner (*) brukes til å filet åpne bukhulen, utsette indre vev. (F) Indre vev (avling, tarm, livmor, eggstokkene, fettlegemer) fjernes, utsetter dorsal fartøyet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Ventral visning av et dissekert dorsalfartøy fra en 5 uker gammel hunn injisert med pH følsomme partikler, farget med antistoff rettet mot Pericardin (A). Stiplet hvit linje skisserer den laterale siden av dorsal fartøyet, med pil som peker mot den fremre regionen. (B) Forstørret bilde av (A): klynger av hecytter (blå pil) som var aktivt nedverdigende bakterier, innenfor det første aortakammeret i dorsalfartøyet. (C) Forstørret bilde av (A) som beskriver det ekstracellulære matrisen (ECM) kollagenlignende protein, Pericardin (grønn pil), som holder dorsalbeholderen på plass24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Dissekert dorsalfartøy og tilhørende hecytter fra en hunnflu injisert med pH-følsomme partikler, eller fluorpartikler. (A) Dorsal fartøyet og tilhørende hemocytes med oppslukt pH følsom-merket E. coli partikler (rød), eller ( E )fluor-merket E. coli partikler (rød), isolert fra en 1-ukers gammel fly, etter utvinne for 60 min. (B, F) Forstørret innfelt av (A) og (E) (hvit boks), henholdsvis, viser to individuelle hecycytter med tellbare hendelser. (C) Dorsal fartøyet og tilhørende hemocytter med oppslukt pH følsom-merket E. coli partikler (rød), eller ( G) fluor-merket E. coli partikler (rød), isolert fra en 5-ukers gammel fly, etter utvinne for 60 min. (D, H) Forstørret innfelt av (C) og (G) (hvit boks), henholdsvis, viser to individuelle hemocytter med ansikted. Stiplet hvit linje skisserer den laterale siden av dorsal fartøyet, med pil som peker mot den fremre regionen. Kjerner farget med DAPI (blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kvantifisere fagocytiske hendelser innenfor en 10 mm hemocytes ved hjelp av celletelleren i ImageJ. (A)Etter å ha åpnet bilde(er) i ImageJ, kan verktøyet for celletellermerknad brukes til å holde oversikt over fagocytiske hendelser per celle. (B) Dette verktøyet tilordner en annen farge til hver celle som er valgt for å telles, med hver prikk som tilsvarer en fluorescerende hendelse i den cellen. Hvis du trykker på alt+y, vises en tabell som viser antall hendelser som telles per celle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her er en pålitelig måte å kvantifisere ulike aspekter ved fagocytose, under kontrollerte eksperimentelle forhold. Vi merker oss at vi bare har testet denne prosedyren med gram negative bakterielle partikler, og resultatene kan variere hvis gram positive bakterielle partikler brukes. Faktisk ville det være interessant å sammenligne de fagocytiske svarene med både gram negative og gram positive bakterier i forskjellige eksperimentelle forhold. Bruken av en nanoinjektor gir nøyaktig kontroll over injeksjonsvolumer, slik at hver fly injiseres med samme volum av partikler. En begrensning av protokollen kommer fra uoverensstemmelser i partikkelpreparater. Partikler vil aggregere når de er frosset, så små variasjoner i fortynningsvolumer, eller mangel på virvlende, kan påvirke partikkelkonsentrasjonen mellom eksperimenter. For å minimere mulige variasjoner i partikkelkonsentrasjoner mellom aldre, er det gunstig å injisere 1- og 5-ukers gamle fluer på samme dag, ved hjelp av samme nål og partikkelløsning. En annen potensiell ulempe er at under disseksjoner kan dorsalfartøyet og/eller skjellaget lett bli skadet hvis pinnene ikke håndteres riktig. For å unngå å forstyrre dorsalbeholderen, minimer antall pinner som brukes per disseksjon. Fordelen med denne disseksjonsmetoden er at alle fikserings-, vasketrinn og fargetrinn kan utføres i disseksjonsplaten. Fordi neglebåndene er festet, forhindrer dette at neglebåndene går tapt mellom trinnene.
Sammenlignet med eksisterende metoder18,19,25,26,27,28,29, den beskrevne protokollen har sine fordeler og begrensninger. Ved å dissekere dorsalfartøyet, er vi i stand til å visualisere og kvantifisere individuelle hemocytes på dette stedet. Dette gjør det mulig å oppdage subtile variasjoner i fagocytisk aktivitet mellom eksperimentelle grupper. Andre metoder visualiserer fluorescerende merkede partikler ved å samle hemocytes ved hjelp av en Bleed / Scrape analyse19,25,26,27, eller gjennom en intakt ventral cuticle18,19,28,29; Individuelle hemocytes kan imidlertid ikke vurderes når de visualiseres gjennom dorsal cuticle. Fordelen med denne protokollen, sammenlignet med Bleed / Scrape-metoden er at vår metode tillater oss å vurdere bare de hemocytes knyttet til dorsal fartøyet, og står for sirkulerende celler eller de langs kroppsveggen, som kan være funksjonelt annerledes. Dissecting dorsal fartøyet fjerner også behovet for å inkludere en andre runde med injeksjoner med en fluorescens quencher, som Trypan blå19,26. Dette er fordi eventuelle partikler som ikke er bundet til eller oppslukt av en celle, vil bli vasket bort under vasketrinn. Omvendt kan alternative metoder være lettere å utføre fordi de ikke krever disseksjoner. Selv om dissekering av dorsalfartøyet er lett å lære, legger dette trinnet til et kompleksitetsnivå som kanskje ikke er mulig i noen eksperimentelle design.
Selv om den beskrevne bruken av denne in vivo fagocytoseanalysen er å vurdere og kvantifisere fagocytiske hendelser mellom ulike aldre, er denne protokollen svært tilpasningsdyktig og kan brukes til å analysere ulike aspekter av fagocytose mellom genotype, kjønn eller vevstype. Med fagocytose er av sentral betydning for de fleste flercellede dyr, forstå hvordan denne prosessen avtar med alderen kan føre til bedre terapeutiske behandlinger for den aldrende befolkningen. Denne tilnærmingen gir langsiktig potensial for å belyse aspekter av aldersrelaterte endringer i immunresponsen, med spesielt fokus på fagocytose.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health R03 AG061484-02 og UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
References
- Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
- DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. Immunity and aging: the enemy within. Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).
- Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. Innate immunity and aging. Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).
- Panda, A., et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).
- Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).
- Min, K. -J., Tatar, M. Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472 (2018).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. Drosophila as a genetic model for hematopoiesis. Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).
- Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
- Garschall, K., Flatt, T. The interplay between immunity and aging in Drosophila. F1000Research. 7, (2018).
- Brennan, C. A., Anderson, K. V. Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response. Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: a fundamental process in immunity. BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).
- Stuart, L., et al. A systems biology analysis of the Drosophila phagosome. Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).
- Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).
- Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
- Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).
- Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
- Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html (2019).
- Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Goto, A., et al. A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor. Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).
- Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart. Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).
- Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection. Wellcome Open Research. 3, (2018).
- Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).
- Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Gyoergy, A., et al. Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).
- Bosch, P. S., et al. Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia. BioRxiv. 578864, (2019).
