Summary
Este protocolo descreve um ensaio in vivo da fagocitose utilizado para avaliar e quantificar a capacidade dos hemócitos de melanogaster de Drosophila jovens e envelhecidos para bactérias fagocitose..
Abstract
A fagocitose é uma função essencial da resposta imune inata. Este processo é realizado por hemócitos fagocíticos cuja função primária é reconhecer uma ampla gama de partículas e destruir patógenos microbianos. À medida que os organismos envelhecem, esse processo começa a diminuir, mas pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes ou a base genética da imunosenescência. Aqui, uma injeção baseada em ensaio de fagocitose in vivo é utilizada para avaliar mudanças relacionadas à idade em diferentes aspectos da fagocitose, como ligação, engolamento e degradação de partículas internalizadas, quantificando eventos fagocícitos em hemócitos em Drosophila adulto. Drosophila melanogaster tornou-se um modelo ideal para investigar mudanças relacionadas à idade na função imunológica inata por muitas razões. Por um só, muitos componentes genéticos e funções da resposta imune inata, incluindo a fagocitose, são evolutivamente conservados entre drosophila e mamíferos. Por causa disso, os resultados obtidos com o uso deste protocolo provavelmente serão amplamente relevantes para a compreensão das mudanças relacionadas à idade na função imunológica em uma variedade de organismos. Além disso, observamos que este método fornece estimativas quantitativas da capacidade fagocítica hemocito, que poderia ser útil para uma variedade de tópicos de pesquisa, e não precisa se limitar a estudos de envelhecimento.
Introduction
O sistema imunológico inato, que consiste em barreiras físicas e químicas à infecção, bem como componentes celulares, é conservado evolutivo entre organismos multicelulares1,,2. Como primeira linha de defesa, o sistema imunológico inato desempenha um papel crítico no combate a patógenos invasores em todos os animais1,,2,3. Os componentes da resposta imune inata incluem uma ampla gama de tipos de células que são classificadas com base na falta de especificidade e memória imunológica2,,3,,4. Em humanos, esses tipos de células incluem monócitos fácticos e macrófagos, neutrófilos e células assassinas naturais citotóxicas4,,5. Embora ter um sistema imunológico funcional seja imperativo para a sobrevivência do hospedeiro, é claro que a função das células imunes diminui com a idade, fenômeno conhecido como imunosenescência5,,6. Ser capaz de avaliar mudanças relacionadas à idade na resposta imune, incluindo diferentes aspectos do processo de fagocitose, poderia ajudar na nossa compreensão da imunosenescência. O procedimento que descrevemos aqui fornece uma abordagem eficaz e repetível para avaliar e quantificar eventos faócticos por hemócitos em Drosophila melanogaster.
A drosophila é um modelo ideal para estudar a resposta imune por muitas razões. Por um tempo, há um extenso conjunto de ferramentas genéticas disponíveis que tornam possível manipular facilmente a expressão genética de forma dependente de tecidos7. Essas ferramentas incluem uma coleção de mutantes, estoques de interferência de RNA, estoques GAL4/UAS e o Painel de Referência Genética Drosophila que contém 205 linhas de raça diferentes para as quais todas as sequências de genoma são catalogadas8. O curto ciclo de vida da Drosophila e o grande número de indivíduos produzidos permitem aos pesquisadores testar múltiplos indivíduos em um ambiente controlado, em um curto período de tempo. Isso melhora muito a capacidade de identificar diferenças sutis nas respostas imunes à infecção entre genótipos, entre sexos ou entre idades. É importante ressaltar que muitos componentes genéticos e funções da resposta imune inata, incluindo a fagocitose, são evolutivamente conservados entre drosophila e mamíferos1,2.
Em Drosophila, o processo de fagocitose que se segue à infecção é realizado por hemócitos fagocíticos chamados plasmatócitos, que equivalem aos macrófagosmamíferos 9. Os hemócitos são essenciais para reconhecer uma ampla gama de partículas e limpar patógenos microbianos9,,10,,11,12,13. Essas células expressam uma variedade de receptores que devem diferenciar-se do não-auto, e iniciar eventos de sinalização necessários para realizar o processo fagocítico10,,11,12,,13,,14,15. Uma vez que uma partícula é amarrada, ela começa a ser internalizada pela reorganização do citoesqueleto de actina e remodelação da membrana plasmática para expandir-se em torno da partícula, formando um copo fagocítico11,,12,,13,14. Durante esse processo, outro conjunto de sinais diz à célula para internalizar ainda mais a partícula, fechando o copo fagocítico, formando um fágora ligado à membrana11,,12,13,,14,15. O fágora passa então por um processo de maturação, associando-se com diferentes proteínas e fundindo-se com lisosomos, formando um fagolico ácido11,12,13,14,15. Neste ponto, as partículas podem ser degradadas e eliminadas de forma eficiente11,12,13,14,15. Estudos de drosophila revelaram que moscas mais velhas (4 semanas de idade) têm uma capacidade reduzida de limpar uma infecção em comparação com moscas mais jovens (1 semana de idade), provavelmente devido, pelo menos em parte, a um declínio em alguns aspectos da faagocitose16,17.
O método descrito aqui utiliza duas partículas E. coli com rótulos fluorescentes separados, uma com fluorohore padrão e outra sensível ao pH, para avaliar dois aspectos diferentes da fagocitose: o engolfamento inicial das partículas e a degradação das partículas no fagoliossomo. Neste ensaio, fluorescência fluoro-partícula é observável quando as partículas são amarradas e engolidas por hemócitos, enquanto partículas sensíveis ao pH fluorescem apenas nas baixas condições de pH do fagosome. Eventos fluorescentes podem então ser observados em hemócitos que se localizam ao longo do vaso dorsal. Focamos em hemócitos localizados no vaso dorsal, que fornecem um marco anatômico para localizar hemócitos que são conhecidos por contribuir para o despejo bacteriano, e para isolá-los consistentemente. No entanto, hemócitos em outras partes do corpo e hemoglifos também são importantes para a liberação. Embora não tenhamos estudado essa população celular, nosso procedimento geral pode ser aplicável para ensaios fagocíticos dessas células também. Uma vantagem de nossa abordagem é que podemos quantificar eventos fagocíticos dentro de hemócitos individuais, permitindo detectar variações sutis nos processos fagocíticos. Outros estudos que visualizam eventos fluorescentes através da cutícula18,19 não explicam as diferenças no número de hemócitos presentes, o que é especialmente importante considerar no nosso caso como a contagem total de hemócitos deve mudar com a idadede 17 anos.
Protocol
1. Coletar e envelhecer Drosophila
- Para gerar as mesmas moscas de F1 envelhecidas para testar a fagocitose, adicione 5-10 fêmeas virgens e 5 machos dos genótipos apropriados a um frasco contendo alimentos frescos para moscas. Usamos um alimento à base de melaço de fubá20,mas o método deve funcionar independentemente do tipo de dieta em que as moscas são criadas. Para este experimento usamos Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP voa para rotular hemócitos geneticamente.
NOTA: Mais moscas podem ser usadas, mas algumas linhas de D. melanogaster podem não acasalar ou se reproduzir bem quando superlotadas, e a superlotação pode ter efeitos adversos no desenvolvimento larval21 e fagocitose. - Mantenha moscas sob as condições experimentais desejadas. Para este experimento, manter He-GAL4; UAS-GFP voa a 24 °C. Permita que moscas adultas acasalem por uma semana e, em seguida, remova adultos. As moscas de F1 serão então coletadas destes frascos após o encerramento para uso experimental.
- Coletar moscas virgens ao longo da semana, ou até que o número desejado de moscas seja coletado. Virgens não são necessárias; no entanto, o acasalamento pode impactar a resposta imune. Se as moscas de F1 forem testadas como virgens, separem machos e fêmeas dentro de 8 horas de eclosão e mantenham em frascos separados para evitar o acasalamento. Coletar moscas suficientes para permitir a avaliação da fagocitose em pelo menos 10 moscas por genótipo/tratamento/sexo por idade.
- Se envelhecer as moscas para uma semana, colete pelo menos 50 moscas no total, ou 20 moscas por condição de tratamento para cada partícula, seja fluoro-partículas ou partículas sensíveis ao pH, a serem injetadas. Isso garantirá um mínimo de 10 moscas para avaliar no momento do experimento.
- Se o envelhecimento voa para mais de 3 semanas, colete pelo menos 100-150 moscas no total, ou 50-75 moscas por condição de tratamento para garantir que haja moscas suficientes disponíveis para medir a fagocitose. Quando o envelhecimento voa em laboratório, normalmente usamos gaiolas de insetos mantidas a 24 °C em 12:12 L:D condições, e mudar a comida a cada dois dias. Se os frascos estão sendo usados em vez de gaiolas, a ponta voa em novos frascos a cada 3-5 dias, dependendo da condição do alimento no frasco. O número de moscas necessárias dependerá da idade em que a fagocitose será analisada, e das taxas de sobrevivência específicas da idade desse genótipo em uma determinada condição ambiental.
- Se moscas jovens e idosas serão avaliadas, planeje de acordo para que moscas de 1 semana e moscas envelhecidas sejam injetadas no mesmo dia. Isso minimizará as variações na concentração de partículas entre os experimentos e garantirá que o efeito da idade na medição fagocítica não seja confundido com o efeito do dia em que o ensaio foi realizado.
- Abrigar as moscas coletadas a 24 °C até que tenham de 5 a 7 dias de idade, ou mantenha as moscas à idade desejada.
2. Prepare partículas rotuladas fluorescentes
- Reconstituir partículas E. coli fluoro-partículas ou partículas E. coli sensíveis ao pH a uma concentração de estoque de 20 mg/mL ou 1 mg/mL, respectivamente. Outras bactérias estão disponíveis para uso que podem ser mais adequadas para certos experimentos, mas consulte as instruções do fabricante para concentrações adequadas de estoque.
- Para fluoro-partículas, adicione 990 μL de 1x PBS (pH 7.4) ou buffer preferencial e 10 μL de 2 mM (20%) azida de sódio. Vórtice para misturar.
NOTA: Azida de sódio é um conservante que pode ser omitido; no entanto, partículas preparadas sem azida de sódio não duram tanto tempo. As fluoro-partículas devem ser usadas dentro de 24 horas e partículas sensíveis ao pH devem ser usadas dentro de 7 dias. - Para partículas sensíveis ao pH, adicione 1.980 μL de 1x PBS (pH 7.4) ou tampão preferencial e 20 μL de 2 mM (20%) azida de sódio. Vórtice para misturar.
- Faça várias alíquotas de uso único de 20 μL em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Armazene fluoro-partículas a -20 °C por até um ano, e partículas sensíveis ao pH a 4 °C por até 6 meses, protegidas da luz.
- Para fluoro-partículas, adicione 990 μL de 1x PBS (pH 7.4) ou buffer preferencial e 10 μL de 2 mM (20%) azida de sódio. Vórtice para misturar.
- No dia das injeções, remova o azida de sódio das partículas antes do uso. Para isso, centrifugar as partículas por 5 min a 15.000 x g em temperatura ambiente.
- Remova as partículas supernasais e de lavagem duas vezes por reutilização em 50 μL de 1x PBS ou tampão preferencial, e centrífuga por 5 min a 15.000 x g.
- Após a segunda lavagem, remova as partículas supernascarantes e resuspend em 100 μL de 1x PBS ou tampão preferencial. Mantenha a solução no tubo e minimize a exposição à luz durante todo o experimento. Uma vez removido o azida de sódio, use fluoro-partículas dentro de 24 h, e use partículas sensíveis ao pH usadas dentro de 5-7 dias.
NOTA: Em nossos experimentos anteriores, descobrimos que essa concentração de partículas forneceu números contáveis de eventos fagocíticos e que o número de partículas disponíveis para fagocitose por hemócitos não limitava17. No entanto, os usuários deste protocolo podem querer comparar resultados usando outras concentrações para garantir que haja um número adequado de partículas disponíveis para fagocitose por hemócitos nas condições de seus experimentos.- Se o azida de sódio foi omitida, dilui as partículas 1:5 no mesmo buffer com o qual as partículas foram preparadas para injeções.
- Adicione uma gota (~10 μL) de corante de alimentos verdes às partículas. Isso torna mais fácil garantir que as moscas tenham sido injetadas.
3. Injete as moscas
- Prepare agulhas de vidro para injeções.
- Puxe agulhas de vidro usando um puxador de pipeta. Coloque o aquecedor de tubulação para 55 °C e o solenoide para 45. Use apenas as agulhas fornecidas com o injetor, pois não é garantido que outras agulhas funcionarão com a mesma precisão.
- Encha uma seringa estéril de 1 mL com óleo mineral e conecte a agulha hipodérmica calibre 30 (G), fornecida com o nano-injetor.
- Encha a agulha capilar puxada inserindo a agulha de 30 G na extremidade cega da agulha de vidro puxada e encha com óleo mineral. Remova lentamente a agulha de 30 G, garantindo que não haja bolhas de ar em toda a agulha, pois isso pode causar volumes de injeção imprecisos. O injetor não funcionará corretamente sem encher a agulha.
- Usando fórceps, quebre a ponta da agulha para criar uma abertura para permitir a ejeção da solução.
- Monte o nano-injetor.
NOTA: Outros injetores podem ser usados. O método descrito abaixo se aplica ao nano-injetor. Para outros injetores, consulte o manual do usuário para obter instruções.- Ajuste o injetor ao volume desejado (entre 46 nL e 69 nL).
- Remova o collet e coloque o anel O de vedação, o espaçador branco com o recuo voltado para cima para receber a extremidade traseira da agulha, e o maior o-ring sobre o êmbolo metálico, nessa ordem. Recoloque o collet sem apertá-la.
- Insira o êmbolo metálico na extremidade contundente da agulha de vidro cheia de óleo. Empurre suavemente a agulha para baixo, inserindo-a no anel O maior. Aperte o collet até ficar seguro.
NOTA: Se o êmbolo metálico não passar da collet, pressione e segure 'VAZIO' até que o êmbolo esteja visível. Isso facilita a inserção do êmbolo na agulha. - Pressione e segure 'VAZIO' até que o injetor emite um bipe. Isso ejeta a maior parte do óleo mineral da agulha, deixando um pequeno volume de óleo para atuar como uma barreira entre os dois líquidos, bem como remove bolhas de ar.
- Encha a agulha com fluoro-partículas ou partículas sensíveis ao pH inserindo a ponta da agulha de vidro no tubo de microcentrifuuagem contendo as partículas preparadas.
- Pressione e segure 'FILL' até que o injetor emite um bipe.
- Injeções
- Transfira as moscas que serão injetadas em um frasco vazio. Imobilize as moscas colocando o frasco no gelo. CO2 também pode ser usado para imobilizar as moscas. No entanto, note que, ao usar partículas sensíveis ao pH, níveis elevados de CO2 podem acidificar artificialmente quaisquer buffers que estão sendo usados e podem elevar a fluorescência de fundo.
- Injete as moscas na placa esternopleural do tórax (Figura 1A). A injeção é bem sucedida se o corante verde for visto entrando na mosca(Figura 1B). Se a mosca não ficar verde, certifique-se de que a agulha não está entupida.
NOTA: Alternativamente, moscas podem ser injetadas no abdômen, mas mantenham o local de injeção consistente em todos os experimentos. - Coloque moscas injetadas em um novo frasco de comida, observando a vez que a primeira e última mosca foi injetada. Para minimizar o erro experimental devido à quantidade de tempo necessário para completar as injeções, complete as injeções em tempo hábil. Com a prática, não deve levar mais de 10 minutos para injetar um conjunto de moscas. Coloque o frasco de lado até que todas as moscas se recuperem, para evitar que as moscas fiquem presas na comida.
- Permita que as moscas se recuperem por 60-90 min, dependendo das condições experimentais. Aqui, um tempo de recuperação de 60 minutos foi usado. Observe que este intervalo de tempo de recuperação foi ideal para contar eventos fagocíticos nas condições experimentais no estudo Horn et al.17. No entanto, em algumas condições, isso pode ser muito longo para detectar diferenças sutis na fagocitose entre grupos de tratamento. Pode ser útil realizar experimentos de curso de tempo, como foi feito anteriormente17 para determinar o tempo de recuperação que revelará diferenças máximas entre controle e resultados experimentais. Seja qual for o tempo de recuperação, mantenha isso consistente em todos os tratamentos experimentais.
- Se injetar com fluoro-partículas e partículas sensíveis ao pH no mesmo dia, use uma nova agulha para cada solução. Não injete moscas individuais com ambas as partículas se ambas fluoresce vermelhas, uma vez que o resultado não diferenciaria entre os dois aspectos da faagocytose, ligação/enggolce de partículas versus inclusão de partículas no fagosome.
4. Dissecando o vaso dorsal
- Depois que as moscas se recuperarem por 60-90 minutos, transfira todas as moscas vivas para um frasco vazio e imobilize no gelo.
- Transfira uma mosca de cada vez para uma placa de dissecção de elastômero de silicone.
NOTA: Prepare as placas de dissecção pelo menos 1 semana antes do uso, se curar à temperatura ambiente. Para isso, prepare o elastômero e despeje-o em uma placa de Petri de 33 mm x 10 mm, enchendo a placa na metade do caminho. Bata suavemente o prato em uma superfície plana para minimizar as bolhas de ar. Deixe as placas sentarem em temperatura ambiente, sem ser perturbadas, por pelo menos uma semana.- Sob um microscópio estéreo dissecando, oriente o lado ventral da mosca para cima.
- Usando pinos de inseto, fixar a mosca na placa inserindo um pino através do tórax e outro pino através da extremidade mais posterior do abdômen, perto da genitália(Figura 2A). Pode ser útil cortar os pinos ao meio antes de fixar o espécime para não obstruir a dissecção. Repita com até 10 moscas por placa de dissecção.
NOTA: Opcional: Remova as asas e as pernas antes de fixar a mosca na placa. Isso ajudará a evitar que uma bolha se forme ao redor da mosca quando a mídia for adicionada. - Uma vez que todas as moscas tenham sido presas à placa, adicione mídia de dissecção suficiente para cobrir as moscas (~1 mL) usando uma tubulação de transferência.
- Usando fórceps ou tesouras de cutícula, remova a cabeça.
- Utilizando uma tesoura de cutícula, faça duas incisões horizontais: uma diretamente acima do pino posterior no abdômen, e outra na extremidade mais anterior do abdômen, onde o tórax e o abdômen se encontram(Figura 2B, C). Na Figura 2,a cabeça foi deixada intacta para esclarecer a orientação.
- Faça uma incisão vertical, conectando as duas incisões horizontais (os três cortes se assemelham à letra I). Isso abrirá a cavidade abdominal(Figura 2D).
- Usando fórceps, remova os órgãos internos e o tecido, evitando o vaso dorsal. Se não for perturbado, o vaso dorsal transparente pode ser visto pulsando perto da extremidade anterior do abdômen. Pinos adicionais podem ser usados para fixar extremidades recém-cortadas da cutícula (Figura 2E, F).
- Usando uma tesoura de cutícula, remova o tórax. Alternativamente, o tórax pode ser removido antes de montar as cutículas dissecadas e o vaso dorsal em um slide de microscópio.
- Repita com as moscas restantes. dissecar voa em tempo hábil, para minimizar possíveis variações na taxa fagocítica. Uma vez dissecadas moscas, deixe as cutículas com o vaso dorsal preso à placa. Toda a etapa 5 será realizada na placa de dissecção. Isso evitará danificar ou descartar acidentalmente cutículas entre as etapas.
5. Fixação e coloração
- Fixar cutículas dissecadas com vaso dorsal ligado em 4% de paraformaldeído (PFA).
- Usando uma nova tubulação de transferência descartável para cada etapa, descarte a mídia de dissecção e substitua por 1 mL de 4% de PFA. Durante toda a fixação e coloração, mantenha as dissecções protegidas da luz o máximo possível.
- Incubar em temperatura ambiente por 15 min com balanço a 20 rpm. Não permita que as dissecções fiquem fixas por mais de 20 minutos, pois isso pode começar a danificar o tecido.
- Lave as cutículas 2x em 1x PBS + 0,1% Tween (PBST).
- Remova fixativo e substitua por 1 mL de 1x PBST.
- Lave à temperatura ambiente por 15 minutos com balanço.
- Repita 1x.
NOTA: O tecido dissecado e fixo pode ser armazenado a 4 °C, por até 3 dias, protegido da luz, após a primeira lavagem, substituindo a lavagem por PBST fresco. Não armazene tecido fixo se os anticorpos forem usados. Anticorpos devem ser usados com tecido fresco para melhores resultados.
- Opcional: Mancha de anticorpos. Os anticorpos podem ser usados para visualizar claramente o vaso dorsal claramente(Figura 3), ou para detectar marcadores específicos de hemócito. Isso pode garantir que apenas células ao longo do vaso dorsal sejam contadas ou para marcar a membrana dos hemócitos.
- Remova a segunda lavagem, adicione o anticorpo primário na diluição apropriada. Incubar durante a noite a 4 °C, com balanço.
- Remova o anticorpo primário e lave duas vezes com PBST por 15 minutos com balanço.
- Adicione anticorpo secundário fluorescente. Recomendamos um anticorpo verde-fluorescente para que não obscureça as partículas fluorescentes. Incubar em temperatura ambiente por 2h, com balanço.
- Remova o anticorpo secundário, lave duas vezes por 15 minutos cada com PBST.
- Mancha com DAPI.
- Remova a lavagem final e substitua por 1 mL de DAPI diluído em PBST (1:1000).
- Mancha por 20 minutos com balanço em temperatura ambiente.
- Remova o DAPI e lave 2x (repita o passo 5.2).
- Substitua a lavagem final por pbst 1x fresco.
NOTA: As moscas podem ser armazenadas a 4 °C, por até 3 dias, protegidas da luz, após a primeira lavagem, substituindo a lavagem por PBST fresco.
6. Montagem de cutículas em slides de microscópio e imagens
- Prepare cutículas dissecadas.
- Sob o estereóscópio dissecado, corte o excesso de cutícula que poderia interferir com a imagem.
- Usando fórceps, transfira as cutículas com o vaso dorsal conectado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 70% de glicerol. Colocar as cutículas em glicerol ajudará a remover o PBST e permitirá uma imagem mais clara durante a imagem.
- Monte cutículas no deslizamento do microscópio.
- Adicione algumas gotas de 70% de glicerol a um slide de microscópio.
- Usando fórceps, remova as cutículas do tubo de glicerol e coloque em glicerol no slide.
- Sob o microscópio estéreo dissecando, use fórceps para orientar o lado ventral das cutículas para cima, garantindo que o vaso dorsal seja visível. O pigmento mais escuro da cutícula estará de cara para baixo.
- Adicione uma gota adicional de glicerol, se necessário. Isso ajuda a evitar bolhas de ar e permite uma imagem mais clara.
- Coloque delicadamente uma mancha sobre as cutículas e veda as bordas com polimento das unhas. Deixe secar por 10-15 min antes de prosseguir. Imagem as moscas imediatamente ou armazenar em uma caixa à prova de luz a 4 °C.
- Imagem do vaso dorsal.
- Usando um microscópio fluorescente, use o sistema de interferência estrutural para gerar seções ópticas do vaso dorsal. Um microscópio confocal pode ser usado alternativamente, o que pode fornecer precisão adicional. Obtenha imagens de pilha Z do vaso dorsal usando um software de imagem objetivo e preferencial de 20x. Adicione uma barra de escala de 10 mm e rotule corretamente e salve imagens como arquivos de tiff(Figura 4) ou o formato desejado.
NOTA: O número de imagens de pilha de Z obtidas pode variar entre dissecções e depende de quão bem o vaso dorsal foi dissecado, e do tamanho do passo desejado entre as imagens. Aqui, o tamanho do degrau foi definido para 0,49 mm. Esse número pode variar de 3 a 40 imagens por pilha em nossa experiência.
- Usando um microscópio fluorescente, use o sistema de interferência estrutural para gerar seções ópticas do vaso dorsal. Um microscópio confocal pode ser usado alternativamente, o que pode fornecer precisão adicional. Obtenha imagens de pilha Z do vaso dorsal usando um software de imagem objetivo e preferencial de 20x. Adicione uma barra de escala de 10 mm e rotule corretamente e salve imagens como arquivos de tiff(Figura 4) ou o formato desejado.
7. Analisar imagens
- Quantifique eventos fluorescentes usando ImageJ.
- Abra imagens e empilhe-as: Imagem à Stacks à Images to Stack.
- Conte apenas os sinais fluorescentes de tamanho ~1 mm dentro de um diâmetro de 10 mm centrado em um núcleo DAPI positivo clicando em cada evento a partir de pelo menos 10 células por mosca, de pelo menos 10 moscas por idade per tipo de partícula injetada: Plugins à Analyze à Cell Counter Notice ( Figura5A). A ferramenta de aviso de contador de células atribui uma cor diferente a cada célula rastreada, com um ponto colorido que corresponde a cada evento fluorescente clicado dentro dessa célula.
- Para listar a posição de contador e pilha associada a cada ponto, pressione 'm' ou selecione Medir sob a guia Analisar ou para exibir o número de eventos contados em cada célula em uma tabela de resultados, pressione 'alt +y'(Figura 5B).
- Transferir a contagem celular para uma planilha a ser usada para análise estatística.
- Faça análise estatística.
- Analise diferenças em eventos fagácticos usando ANOVA de efeitos fixos ou ANOVA de modelo misto. Modelos mistos podem ser usados para testar os principais efeitos fixos da idade e do genótipo e o efeito aleatório de indivíduos aninhados dentro de cada genótipo17.
NOTA: Os investigadores devem ser rigorosos em testar as suposições de qualquer procedimento estatístico utilizado para analisar os dados.
- Analise diferenças em eventos fagácticos usando ANOVA de efeitos fixos ou ANOVA de modelo misto. Modelos mistos podem ser usados para testar os principais efeitos fixos da idade e do genótipo e o efeito aleatório de indivíduos aninhados dentro de cada genótipo17.
Representative Results
Para ilustrar os métodos de injeção descritos, a Figura 1A mostra o local de injeção em Drosophila melanogaster, bem como como o corante alimentar permite uma confirmação visual de que a mosca foi injetada(Figura 1B). A adição de corante alimentar também auxilia no reconhecimento de uma agulha entupida. As injeções podem ser realizadas no abdômen, mas mantêm o local de injeção consistente entre os experimentos. Isso ajudará a minimizar possíveis variações entre cada experimento.
Para visualizar as partículas fluorescentes rotuladas dentro de hemócitos residentes ao longo do vaso dorsal, dissecamos o vaso dorsal e anexamos cutícula abdominal. A Figura 2A-F descreve os métodos de dissecção.
Para avaliar a capacidade específica da idade das moscas jovens e idosas para realizar fagocitose, os hemócitos ao longo do vaso dorsal são visualizados usando um microscópio fluorescente. Para garantir que apenas as células ao longo do vaso dorsal sejam contadas, podem ser utilizados anticorpos ou genes marcados por GFP para certos marcadores de células sanguíneas ou colágeno específico do coração, como Hemese e Hemolectina, ou Pericardina(Figura 3),respectivamente, 22,,23,,24. Partículas E. coli fluorescentes são de 1 mm de comprimento, enquanto os hemócitos têm 10 mm de diâmetro17. Apenas são contabilizados aqueles eventos fluorescentes localizados dentro de um diâmetro de 10 mm centrados em um núcleo DAPI positivo(Figura 4). Para quantificar eventos fluorescentes, é utilizado o software ImageJ(Figura 5).
Figura 1: Local de injeção e verificação visual. (A) O lado lateral do tórax é perfurado com uma agulha capilar puxada. (B) As injeções são verificadas visualmente adicionando corante de alimentos verdes à solução de partículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissecção do vaso dorsal. (A) Os pinos são colocados no tórax e abdômen posterior (setas pretas). (B-C) Duas incisões horizontais (setas verdes) são feitas na extremidade posterior do abdômen(B)e na extremidade anterior(C). (D) Uma incisão vertical (arqueiro verde) é feita no meio do abdômen, conectando os dois cortes horizontais. (E) Os pinos opcionais (*) são usados para abrir a cavidade abdominal, expondo o tecido interno. (F) O tecido interno (cultura, intestino, útero, ovários, corpos gordos) é removido, expondo o vaso dorsal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visão ventral de um vaso dorsal dissecado de uma fêmea de 5 semanas injetada com partículas sensíveis ao pH, manchadas com anticorpos direcionados contra Pericardin (A). A linha branca pontilhada descreve o lado lateral do vaso dorsal, com seta apontando para a região anterior. (B) Imagem ampliada de (A): aglomerados de hemócitos (seta azul) que estavam ativamente degradando bactérias, dentro da primeira câmara aórtica do vaso dorsal. (C) Imagem ampliada de (A) delineando a proteína de colágeno extracelular (ECM), pericardina (arqueiro verde), que mantém o vaso dorsal no lugar24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Vaso dorsal dissecado e hemócitos associados de uma mosca fêmea injetado com partículas sensíveis ao pH, ou fluoro-partículas. (A) O vaso dorsal e os hemócitos associados com partículas E. coli com rótulo de pH (vermelho) ou (E) fluoro-rotulados partículas E. coli (vermelho), isolados de uma mosca de uma semana de idade, após a recuperação por 60 minutos.(B,F) Inset ampliado de (A) e (E) (caixa branca), respectivamente, mostrando dois hemocitos individuais com eventos contados. (C) O vaso dorsal e hemócitos associados com partículas E. coli com rótulo de pH (vermelho), ou ( G) fluoro-rotulado partículas E. coli (vermelho), isolados de uma mosca de 5 semanas de idade, após a recuperação por 60 minutos. (D,H) Inset ampliado de (C) e (G) (caixa branca), respectivamente, mostrando dois hemocitos individuais com eventos contados. A linha branca pontilhada descreve o lado lateral do vaso dorsal, com seta apontando para a região anterior. Núcleos manchados com DAPI (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificando eventos fagocícitos dentro de um hemócito de 10 mm usando o contador celular em ImageJ. (A) Após a abertura de imagens no ImageJ, a ferramenta Cell Counter Notice pode ser usada para acompanhar eventos fagocíticos por célula. (B) Esta ferramenta atribuirá uma cor diferente a cada célula selecionada a ser contada, com cada ponto correspondente a um evento fluorescente dentro dessa célula. Pressionar 'alt+y' exibirá uma tabela mostrando o número de eventos contados por célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo descrito aqui é uma maneira confiável de quantificar diferentes aspectos da faagocytose, sob condições experimentais controladas. Notamos que só testamos este procedimento com partículas bacterianas gram negativas e os resultados podem diferir se partículas bacterianas gram positivas forem usadas. De fato, seria interessante comparar as respostas fagocíticas com bactérias gram negativas e gram positivas em diferentes condições experimentais. O uso de um nano-injetor permite um controle preciso sobre os volumes de injeção, garantindo que cada mosca seja injetada com o mesmo volume de partículas. Uma limitação ao protocolo vem de inconsistências nas preparações de partículas. As partículas se agregarão uma vez congeladas, de modo que pequenas variações nos volumes de diluição, ou falta de vórtice, podem afetar a concentração de partículas entre experimentos. Para minimizar possíveis variações nas concentrações de partículas entre as idades, é benéfico injetar moscas de 1 e 5 semanas no mesmo dia, usando a mesma solução de agulha e partículas. Outra desvantagem potencial é que durante as dissecções, o vaso dorsal e/ou cutícula podem ser facilmente danificados se os pinos não forem manuseados corretamente. Para evitar interromper o vaso dorsal, minimize o número de pinos utilizados por dissecção. A vantagem deste método de dissecção é que todas as etapas de fixação, lavagem e coloração podem ser realizadas na placa de dissecção. Como as cutículas estão presas, isso evita que as cutículas se percam entre os passos.
Em comparação com os métodos existentes18,,19,,25,,26,,27,,28,,29, o protocolo descrito tem suas vantagens e limitações. Ao dissecar o vaso dorsal, somos capazes de visualizar e quantificar hemócitos individuais neste local. Isso permite detectar variações sutis na atividade fagocítica entre grupos experimentais. Outros métodos visualizam partículas fluorescentes rotuladas através da coleta de hemócitos usando um ensaio bleed/scrape19,25,26,27, ou através de uma cutícula ventral intacta18,19,28,29; no entanto, hemócitos individuais não podem ser avaliados quando visualizados através da cutícula dorsal. A vantagem deste protocolo, quando comparado ao método Bleed/Scrape é que nosso método nos permite avaliar apenas os hemócitos associados ao vaso dorsal, e explica as células circulantes ou aquelas ao longo da parede do corpo, que podem ser funcionalmente diferentes. Dissecar o vaso dorsal também remove a necessidade de incluir uma segunda rodada de injeções com uma fluorescência quencher, como trypan azul19,26. Isso ocorre porque todas as partículas não vinculadas ou engolidas por uma célula serão lavadas durante as etapas de lavagem. Por outro lado, métodos alternativos podem ser mais fáceis de executar porque não requerem dissecções. Embora dissecar o vaso dorsal seja fácil de aprender, esta etapa adiciona um nível de complexidade que pode não ser viável em alguns projetos experimentais.
Embora o uso descrito deste ensaio de fagocitose in vivo seja para avaliar e quantificar eventos fagocíticos entre diferentes idades, este protocolo é altamente adaptável e pode ser usado para analisar diferentes aspectos da fagocitose entre genótipo, sexo ou tipo de tecido. Com a fagocitose sendo de importância central para a maioria dos animais multicelulares, entender como esse processo diminui com a idade pode levar a melhores tratamentos terapêuticos para a população envelhecida. Essa abordagem oferece potencial de longo prazo para elucidar aspectos das mudanças relacionadas à idade na resposta imune, com foco especial na fagocitose.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde R03 AG061484-02 e do UmBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
| 1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
| 15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
| 16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
| 35x10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
| 6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
| 70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
| Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
| E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
| Glass slides | Premiere | D17026102 | |
| Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
| Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
| Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
| Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
| pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
| Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55? Solenoid: 45 |
| Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |
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