Summary
Мы представляем протокол для обозначения и анализа пирамидальных нейронов, что имеет решающее значение для оценки потенциальных морфологических изменений в нейронах и дендритных позвоночниках, которые могут лежать в основе нейрохимических и поведенческих аномалий.
Abstract
Сообщалось, что размер и форма дендритных шипов связаны с их структурной пластичностью. Для определения морфологической структуры пирамидальных нейронов и дендритных шипов можно использовать метод баллистической маркировки. В настоящем протоколе, пирамидальные нейроны помечены с ДилC18(3) красителя и проанализированы с помощью программного обеспечения реконструкции нейронов для оценки морфологии нейронов и дендритных шипов. Для исследования структуры нейронов выполняются дендритный анализ ветвления и анализ Sholl, позволяющий исследователям делать выводы о дендритной сложности ветвления и сложности нейрональной беседки, соответственно. Оценка дендритных шипов проводится с использованием алгоритма автоматической ассистированной классификации, неотъемлемой частью программного обеспечения реконструкции, который классифицирует шипы на четыре категории (т.е. тонкие, грибные, коренастые, филоподия). Кроме того, для оценки изменений в морфологии дендритного позвоночника выбираются дополнительные три параметра (т.е. длина, диаметр головы и объем). Для проверки потенциала широкого применения метода баллистической маркировки, пирамидальные нейроны из культуры клеток in vitro были успешно помечены. В целом, метод баллистической маркировки уникален и полезен для визуализации нейронов в различных областях мозга у крыс, что в сочетании со сложным программным обеспечением реконструкции позволяет исследователям выяснить возможные механизмы, лежащие в основе нейрокогнитивная дисфункция.
Introduction
В 2000 году Gan et al. описали технику быстрой маркировки для отдельных нейронов и глии в нервной системе, которая сочетала в себе различные липофильные красители, что позволило одновременно маркировать многие клетки мозга разными цветами1,2. Совсем недавно, метод баллистической маркировки был описан Seabold et al.3, которые ввели флуоресцентные красители (Dil) в нейроны ломтиков мозга. Универсальный метод окрашивания, баллистическая маркировка ценится за его способность быть использованы в нескольких видов животных и в широком диапазоне возрастов. Кроме того, он может быть объединен с иммунотированием для выявления субпопуляций клеток мозга3. По сравнению с традиционными методами (например, пропитка серебра Golgi-Cox, микроинъекция)4, баллистическая маркировка дает возможность более четко различать морфологические характеристики, в том числе дендритные шипы, особенность, которая имеет решающее значение для рисования выводов о нейронной сложности и синаптической связи5.
Возбуждение пирамидальных нейронов характеризуется одним, большой атический дендрит, несколько коротких базальных дендритов, и тысячи дендритных шипов6. Пирамидальные нейроны находятся в нескольких областях мозга, связанных с когнитивной обработкой более высокого порядка, включая префронтальную кору (PFC) и гиппокамп. В PFC пирамидальные нейроны наблюдаются в слоях II/III и слой V, при этом каждый из них демонстрирует уникальную морфологию. В частности, пирамидальные нейроны в слое II/III ПФУ имеют более короткий апикальный дендрит и меньше ветвления, чем пирамидальные нейроны в слое V6. В гиппокампе, пирамидальные нейроны расположены в обоих регионах CA1 и CA3, с каждым отображением различных морфологий. В частности, пирамидальные нейроны в регионе CA1 обладают более отличительной актикальный дендрит, с разветвления происходящих дальше от сомы, по отношению к CA3 регионе6.
Дендритные шипы на пирамидальных нейронов в пФУ и гиппокампе являются основным местом возбуждания синапсов7. Морфологические характеристики дендритных шипов, которые классически характеризуются на три основные категории (т.е. тонкие, коренастые илигрибы 8),были связаны с размером возбуждающей синапса9. Тонкие шипы, характеризующиеся длинной, тонкой шеей, маленькой луковичной головой и более мелкими постсинаптическими плотностями, более нестабильны и развивают слабые связи. Тем не менее, грибные шипы, которые имеют большую дендритную голову позвоночника, признаются для формирования более сильных синаптических связей, эффект в результате их большего размера. В резком контрасте, коренастый шипы лишены шеи позвоночника, демонстрируя примерно равные головы и шеи соотношение объема8. В гиппокампе, разветвленные шипы также могут наблюдаться, в котором позвоночник имеет несколько голов, которые возникают из той же дендритной шеи позвоночника10. Таким образом, морфологические изменения дендритных шипов могут отражать функциональность и структурные возможности. Кроме того, исследования показали, что размер и форма дендритных шипов относится к их структурной пластичности, что приводит к мысли, что небольшие шипы участвуют в обучении и внимания, в то время как большие, более стабильные шипы, участвуют в долгосрочных процессах, в том числе памяти11. Кроме того, распределение дендритных шипов вдоль дендрита может быть связано с синаптической связью5,,12.
Таким образом, в настоящем методологическом документе есть три цели: 1) Представить наш протокол для баллистической маркировки, который был использован с успехом (т.е. нейроны удовлетворения критериев отбора и подходит для анализа) 83,3%5,12,13 и через несколько областей мозга (т.е. PFC, ядро accumbens, гиппокамп); 2) Продемонстрировать обобщаемость техники и ее применение к нейронам, выращенным в пробирке; 3) Подробно методология, используемая в нейронной реконструкции программного обеспечения и выводы, которые могут быть сделаны из таких данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы о животных были рассмотрены и утверждены Комитетом по уходу за животными и использованию в Университете южной Каролины (федеральный номер гарантии: D16-00028).
1. Приготовление труб diI/вольфрама из биса
- Растворите 100 мг поливинилпирролидона (PVP) с 10 мл ddH2O. Vortex PVP раствор слегка.
- Заполните трубку раствором PVP (см. Таблицу Материалов)и оставьте его на 20 мин. Затем изгоните решение PVP через другой конец трубки с помощью шприца 10 мл.
- Смешайте 170 мг вольфрамовых бисера с 250 л хлорида метилена. Vortex вольфрамовой бисовой подвески тщательно.
- Смешайте 6 мг липофильных красителей DilC18(3) с 300 л хлорида метилена. Vortex DilC18(3) раствор красителя тщательно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1.3-1.4 в капюшоне дыма. - Пипетка 250 л вольфрамовой суспензии на стеклянную горку. Подождите, пока подвеска высохнет (3 мин).
- Добавьте 300 л раствора красителя DilC18(3) в верхней части слоя подвесной подвески вольфрама. Смешайте раствор красителя DiIC18(3) и подвеску вольфрамового бисера тщательно с кончиком пипетки и дайте смеси высохнуть (3 мин).
- После высыхать, используйте лезвие бритвы, чтобы разделить смесь на две 1,5 мл центрифуговых труб. Заполните трубки водой.
- Соникат на водяной бане (Amp I, 100%) до однородного (5 мин). Убедитесь, что кончик звукового сигнала лежит непосредственно на трубках с подвеской биса.
- Объедините два 1,5 мл гомогенизированной смеси в коническую трубку 15 мл. Снотировать смесь еще 3 мин.
- Нарисуйте вольфрамовую смесь-DilC18(3) в трубку с покрытием PVP с помощью шприца 10 мл. Кормите трубку в подготовительную станцию (см. Таблицу Материалов).
- Поверните в течение 1 мин на подготовительной станции. Тщательно удалите всю воду из трубки с помощью шприца 10 мл.
- Включите азотный газ и отрегулируйте поток азота примерно до 0,5 л в минуту (LPM), поверните трубку на подготовительной станции и высушите азотом в течение 30 мин.
- Снимите трубку с подготовительной станции и нарежьте на 13 мм длины (соответствующие размеру загрузки картриджа) с помощью резака для труб. Держите 13 мм длины в сцинтилляции флаконы в темноте.
2. Подготовка секций мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые мужчины F344/N крысы были пара размещены в контролируемой среде под 12/12 свет: темный цикл с объявлением libitum доступ к пище и воде. Все животные были ухаживали за использованием руководящих принципов, установленных Национальными институтами здравоохранения в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных.
- Глубоко обезвреживать крыс с помощью 5% севофлуран.
- Приступайте к следующему шагу, когда крысы не реагируют на вредные раздражители и рефлексы отсутствуют.
- Защищайте крысу в положении на спине внутри химического дыма капот.
- Сделайте разрез через кожу вдоль грудной средней линии. Отделить диафрагму и открыть грудь ножницами. Вставьте 20 G и 25 мм иглы в левый желудочек.
- Сразу же вырежьте правое предсердие ножницами. Perfuse 50 мл 100 мМ PBS с 5 мл/мин скорости потока. Perfuse 100 мл 4% параформальдегида буферизированы в 100 мМ PBS.
- Удалить весь мозг крысы сразу после перфузии.
- Postfix весь мозг в течение 10 мин с 4% параформальдегида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не postfix в 4% параформальдегида в течение более 30 мин, потому что это повлияет на маркировку. - Вырезать 500 мкм толщиной корональных секций с помощью матрицы мозга крысы (см. Таблица материалов). Сделать первый разрез и держать лезвие на месте. Сделайте второй разрез с помощью второго лезвия и вертикально удалите первое лезвие, удерживая ткань на поверхности лезвия.
- Поместите ломтики мозга в 24 хорошо пластины с 1 мл 100 мМ PBS в каждой скважине. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все срезы не будут разрезаны.
3. Баллистическая маркировка и визуализация секций мозга
- Удалите PBS из каждого целевого хорошо.
- Загрузите картридж с куском diI/вольфрама бисора трубки и поместите его в аппликатор.
- Положите кусок фильтровальной бумаги между двумя экранами сетки. Подключите аппликатор к гелиевому шлангу. Отрегулируйте давление выхода гелия до 90 фунтов на квадратный дюйм (пси).
- Поместите аппликатор вертикально вручную по центру целевого колодца на расстоянии 1,5 см между образцом и экраном сетки. Пожар DiI / Вольфрама бисера труб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте удалить все PBS из целевых скважин перед съемкой. - Загрузите картридж со следующей трубой из биса DiI/Вольфрама. Непрерывно огонь DiI / Вольфрам абус из труб на оставшиеся ломтики.
- Заполните 24 хорошо пластины с 100 мМ PBS. Вымойте 500 л свежего 100 мМ PBS 3x. Не позволяйте ломтикам перевернуться во время мытья с PBS.
- Добавьте 500 л свежего 100 мМ PBS и держите ломтики при 4 градусах По цельсию в темноте в течение 3 ч.
- Перенесите ломтики мозга на стеклянные слайды с помощью тонкой кисти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три секции мозга могут быть перенесены на каждый стеклянный слайд. - Сразу же добавить 1 мл антифадеймонтаж среды на каждом разделе. Поместите 22 мм х 50 мм coverslip над секциями мозга. Высушите стекло в темноте в течение 2 дней.
- Включите систему конфокального микроскопа и переключитесь на цель на 60 евро.
- Установите систему конфокального микроскопа, чтобы иметь увеличение 60 "(A/1.4, масло) и интервал в 0,15 мкм (пинхол размер 30 мкм, задний проект радиус отверстия 167 нм). Используйте длину волны 543 нм для получения изображений нейронов, представляющих интерес.
- Получение изображений стекол для целевого типа нейронов на основе границ области мозга и морфологических характеристик нейронов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приобрести по крайней мере три изображения от каждого животного.
4. Использование методологии с клеточной культурой
- Изолировать первичные корковые нейроны от F344/N крыс в послеродовой день один с использованием ранее сообщалось методологии14.
- Культура первичных корковых нейронов в 35 мм стеклянной нижней тарелке в течение одной недели. Измените половину среды культуры со свежим истоем роста нейронов на третий день после изоляции. Вымойте стеклянную нижнюю тарелку 2x с 1 мл 100 мМ PBS.
- Исправить с 4% параформальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите шаги 3.2-3.6 для баллистической маркировки клеток.
- Вымойте 1 мл 100 мМ PBS 3x. Добавьте 500 кл свежего 100 мМ PBS и держите его при 4 градусах по Цельсию в темноте в течение 3 ч.
- Добавьте 200 л антифадейского монтажа.
- Получите изображения стека для каждого целевого нейрона, используя параметры в шаге 3.10.
5. Анализ нейронов и дендритная оценка позвоночника
- Слепые нейроны, использующие кодовые номера для предотвращения предубеждений экспериментаторов.
- Установить критерии отбора нейронов на основе области мозга интерес.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии отбора для нейронов включают непрерывное дендритное окрашивание, низкий фон, отсутствие красителей внутри клеток, минимальное распространение красителя DiI в внеклеточное пространство, правильная морфология пирамидальных нейронов(рисунок 1). - Открытое программное обеспечение реконструкции нейронов (см. прилагаемый видео 1).
- Загрузите файл изображения, нажав на изображение«File Folder»в верхнем левом углу.
- Нажмите"Сома"и пометьте сому нейронов на изображении.
- Нажмите "Tree" и выберите "Управляемый пользователем".
- Проследите все дендритные ветви интереса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для пирамидальных нейронов, которые характеризуются одним акическим дендритом и несколькими базилярными дендритами, прослеживается только апикальный дендрит. Убедитесь, что все соединительные ветви прикреплены друг к другу. - Нажмите "Позвоночник".
- Определите параметры обнаружения и нажмитекнопку "Обнаружить все".
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мозговых срезов, последовательные параметры, используемые в регионах мозга: 2.0 (Внешний диапазон), 0,3 (минимальная высота), 100% (Чувствительность детектора), и 10 (Минимальный граф). Для клеточной культуры необходимо увеличить чувствительность детектора и уменьшить минимальный отсчет. - Классифицировать шипы, выбрав "Классифицировать все".
ПРИМЕЧАНИЕ: Дендритические шипы классифицируются с помощью алгоритма, неотъемлемого программного обеспечения реконструкциинейронов 15. - Сохранить отслеживание, выбрав изображение диска в верхнем левом углу.
- Выполняйте нейрональные и дендритные морфологические анализы позвоночника.
- Открытая нейрональная реконструкция количественного анализа программного обеспечения (см. прилагаемый видео 2).
- Загрузите изображение, нажав "Файл" и "Открытый файл данных".
- Нажмите "Анализ" и "Анализ структуры",чтобы проанализировать морфологию нейронов и дендритную морфологию позвоночника.
- Для морфологии нейронов нажмите «Tree Totals»и выберите коробку для«Dendrite Totals».
- Для дендритной морфологии позвоночника нажмите кнопку «Spines», а затем выберите коробку для «Spine Details».
- Сохранить выход в виде текстового (.txt) файла, нажав правой кнопкой выхода таблицы и выбрав "Сохранить файл".
- Нажмите "Анализ" и "Анализ Шолля".
- Установите стартовый радиус до 10 мкм, а радиус приращения до 10 мкм.
- Нажмите на поле "Dendrites" и нажмите "Дисплей".
- Сохранить выход в виде текстового (.txt) файла, нажав правой кнопкой таблицы вывода и выбрав "Сохранить файл".
6. Анализ данных
- Проанализируйте данные морфологии нейронов (т.е. дендритной сложности ветвления).
- Добавьте количество дендритов в каждой ветви порядка и разделить на общее количество дендритов. Умножьте на 100, чтобы вычислить относительные частоты для количества дендритов в каждом заказе филиала.
- Проанализируйте данные анализа Sholl для изучения сложности нейрональной беседки и дендритной связи позвоночника.
- Рассчитайте среднее и стандартное погрешность среднего значения для количества пересечений в каждом радиусе.
- Сумма количество шипов зависит от типа позвоночника (т.е. тонкий, коренастый, гриб) в каждом радиусе и разделить на общее количество шипов для этого типа позвоночника. Умножьте на 100, чтобы вычислить относительные частоты для количества шипов в каждом радиусе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2A, типичные пирамидальные нейроны в гиппокампе области в крысиных секций мозга были определены по технологии баллистической маркировки, характеризуется одним большим акическим дендритом и несколькими меньшими базальными дендритами вокруг сомы. На рисунке 2B показан нейрон в программном обеспечении количественного анализа нейронов реконструкции после того, как была обнаружена сома, были обнаружены дендритные ветви и обнаружены шипы. Впоследствии данные были проанализированы с помощью нейрональной реконструкции количественного анализа программного обеспечения, которое дало возможность оценить дендритной сложности ветвления(рисунок 2C) и нейрональной беседки сложности(рисунок 2D).
На рисунке 2Смы использовали метод заказа центробежных ветвей, собранный из вывода "Три тотализа", для подсчета количества сегментов, пройденных вдоль каждого дендрита и назначенного заказа филиала. Относительная частота сегментов в каждом заказе филиала была исследована для отраслевых заказов 1-15. Когда между группами наблюдались изменения в распределении дендритных ветвей, можно было бы сделать вывод об изменениях в дендритной ветвящейся сложности. Кроме того, анализ Sholl был проведен в качестве дополнительной меры сложности нейрональной беседки, в результате чего количество дендритных пересечений, происходящих каждые 10 мкм от сомы была количественно в каждом разделе образца (Рисунок 2D). Когда сдвиги в количестве дендритных пересечений наблюдались между группами, изменения в нейрональной беседке сложности можно было бы сделать вывод.
Морфологические изменения в дендритных позвоночниках можно оценить с использованием длины (мкм), диаметра головы (мкм) и объема (мкм3),как видно на рисунке 3A-B. Кроме того, шипы были классифицированы с использованием автоматической системы классификации в программном обеспечении реконструкции нейронов. Относительная частота количества шипов между каждым радиусом была исследована на тонкие, грибные и коренастые шипы. Учитывая наше понимание того, какие типы позвоночника образуют более сильные синаптические связи (т.е. грибы по отношению к коренастый) и нейромедиатор афферентов, сдвиги в распределении шипов вдоль нейрона может указывать на синаптической связи.
Кроме того, мы проверили полезность метода баллистической маркировки на первичном пирамидальном нейроне в клеточной культуре. Во-первых, мы культивировали первичные гиппокампа нейронов в послеродовой D1 (день 1) на пластине клеточной культуры покрыты поли-L-лизин в течение 2 недель или примерно до 70% выпуклости. Затем образцы были зафиксированы с 4% PFA в течение 15 мин и промывают 2x с PBS. Начиная с ступени 3.1 настоящего протокола, мы баллистически помечены и изображения первичных пирамидальных нейронов из гиппокампа. Данные показали стабилизированную маркировку и определили пирамидальные нейроны на основе треугольниковой формы сомы и большого апического дендрита(рисунок 4A). Использование нейронов реконструкции программного обеспечения для исследования дендритных шипов первичных пирамидальных нейронов, выращенных в клеточной культуре предлагает возможности, аналогичные тем, в мозге крысы. Пример ы результатов иллюстрируются для распределения тонких дендритных шипов(рисунок 4B) и дендритной длины позвоночника измеряется в мкм(рисунок 4C). Однако примечательно, что первичные пирамидальные нейроны, выращенные в клеточной культуре, имели менее дендритное ветвление, исключая оценку, по крайней мере в этом примере, дендритной ветвления сложности и сложности нейрональной беседки.
Рисунок 1: Критерии отбора, используемые для пирамидальных нейронов в медиальной префронтальной коре, помеченной с использованием технологии баллистической маркировки. (A) Представитель конфокального изображения (60x) хорошо обозначенных пирамидальных нейронов из медиальной префронтальной коры. Один пирамидальный нейрон с явным сомой и апеканским дендриатом включал в себя непрерывное, яркое дендритное окрашивание с низким фоном. (B-C) Представитель конфокального изображения (60x) пирамидального нейрона из медиальной префронтальной коры со световым окрашиванием на более дистальные ветви (B) и высокий фон(C). (D) Представитель конфокального изображения (60x) помечены нейрон из медиальной префронтальной коры (на основе координат Брегма), который имеет недостатки морфологических характеристик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Маркировка пирамидальных нейронов в гиппокампе (HIP) с использованием технологии баллистической маркировки и нейроанатомических оценок. (A) Три репрезентативных конфокальных изображения (60x) пирамидальных нейронов помечены баллистических вольфрамовых бусин. (B) Оценка морфологии нейронов: дендритный анализ порядка ветви и анализ Sholl. Прослеживается изображение дендритного позвоночника, в котором морфология позвоночника была также идентифицирована с помощью дендритного программного обеспечения для анализа позвоночника. (C)Анализ ынаики ветви использованный для того чтобы рассмотреть относительную частоту dendritic ветвей на по-разному заказах ветви. (D) Количество дендритных пересечений каждые 10 мкм от сомы были оценены с помощью анализа Sholl как мера сложности нейрональной арбо. Данные описываются как относительные частоты всего набора данных (C) или подходят с 95% доверительных интервалов(D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Оценка морфологии дендритного позвоночника. (A-B) Распределение дендритных шипов иллюстрируется как функция типа позвоночника (т.е. тонкий, коренастый, гриб). В качестве оценки дендритной морфологии позвоночника были также проанализированы дополнительные параметры дендритного позвоночника (т.е. длина, объем, диаметр головы). Данные иллюстрируются как относительные частоты всего набора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Маркировка первичного коркового нейрона in vitro с использованием технологии баллистической маркировки. (A) Представитель конфокальные изображения (60x) первичных корковых нейронов помечены баллистических вольфрамовых бусин в пробирке. Примеры результатов, аналогичных тем, которые получены от баллистической маркировки в ломтиках мозга показаны для распределения тонких дендритных шипов (B) и длины (C). Данные иллюстрируются как относительные частоты всего набора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Процедуры отслеживания нейронов и дендритного обнаружения позвоночника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Видео 2: Процедуры сбора и вывода данных для количественного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы описываем разностороннюю технику маркировки нейронов как из мозга крыс, так и из тех, которые выращивают в пробирке. Кроме того, мы сообщаем о методологии использования программного обеспечения реконструкции нейронов и программного обеспечения количественного анализа нейронной реконструкции для оценки морфологии нейронов и дендритных шипов. Оценка нейрональной морфологии и дендритных шипов дает возможность определить изменения в дендритной сложности ветвления, сложности нейрональной арбойности, дендритной морфологии позвоночника и синаптической связи.
При проведении протокола исследователям следует обратить особое внимание на несколько шагов. Во-первых, после фиксации в 4% PFA слишком долго повредит целостность липофильной мембраны и привести к краситель утечки за пределами клеток. Во-вторых, по сравнению со специфичностью баллистической маркировки в мозге ломтиками, которая нацелена только на нейроны, маркировка первичных корковых нейронов in vitro вводит неспецифическую маркировку глии, поскольку баллистическая маркировка в мозговых ломтиках не специфична для типа нейрона (т.е. пирамидального нейрона, среднего колючего нейрона, гранулированной клетки). Таким образом, координаты Брегма, морфологические оценки или конкретные маркеры клеток должны сочетаться с методом баллистической маркировки. В-третьих, толщина ломтиков мозга может быть между 200-500 мкм; для достижения наилучших результатов он должен быть оптимизирован. В-четвертых, эффективность маркировки и проникновения красителей связана со многими факторами, такими как давление гелия, время инкубации после применения баллистики, бисер DiI/Вольфрам, расстояние между экраном сетки и поверхностью мозговых ломтиков и т.д. Протокол должен быть оптимизирован для каждого исследования. В-пятых, больших скоплений или скоплений баллистических красителей покрытием вольфрамовых бусин во время подготовки следует избегать, потому что сгустки не позволит отдельных нейронов, которые будут отличаться. Мы также определили, что diI диффундии по отдельным нейронам более полно, чем DiO в этой баллистической методологии.
Тем не менее, по сравнению с традиционными методами маркировки4, метод баллистической маркировки делает высокое разрешение конфокальной визуализации возможно, что позволяет для оценки нейрональных и дендритных морфологии позвоночника. Кроме того, программное обеспечение для реконструкции нейронов использует алгоритм автоматической ассистированной классификации дендритных шипов (т.е. тонких, грибных, коренастых), измерения заказа филиала, классический анализ Sholl и измерения морфологических особенностей дендритных шипов, таких как длина (мкм), диаметр головы (мкм) и объем (мкм3). Количественная оценка нескольких нейронных параметров дает возможность лучше понять механизмы, лежащие в основе нейрокогнитивной дисфункции.
В целом, метод баллистической маркировки позволяет визуализировать нейронные структуры в различных областях мозга крысы и в клеточной культуре, что важно для выяснения возможных механизмов, лежащих в основе нейрокогнитивной дисфункции. В настоящем исследовании мы представляем метод маркировки пирамидальных нейронов методом баллистической маркировки. Кроме того, в сочетании с программным обеспечением реконструкции нейронов, мы продемонстрировали способность изучать нейрональные и дендритные морфологии позвоночника в гиппокампе пирамидальных нейронов. Групповые различия в нейрональной и/или дендритной морфологии позвоночника дают возможность понять механизмы, лежащие в основе нейрокогнитивной дисфункции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов не имеет конфликта интересов, чтобы объявить.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет грантов NIH HD043680, MH106392, DA013137 и NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
