Bioengineering

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990

Géraud Heckler¹, Christelle Aigueperse¹, Liza Hettal¹, Quentin Thuillier¹, Fabrice de Chaumont², Stéphane Dallongeville², Isabelle Behm-Ansmant¹

¹Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, ²Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

Wir präsentieren einen frei verfügbaren Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in bestimmten Zellkompartimenten in Fluoreszenzmikroskopiebildern. Dieser benutzerfreundliche Workflow wurde auf der Open-Source-Software Icy entwickelt und verwendet auch ImageJ-Funktionalitäten. Die Pipeline ist ohne Kenntnisse in der Bildanalyse erschwinglich.

Abstract

Das letzte Jahrzehnt war durch Durchbrüche in Fluoreszenzmikroskopie-Techniken gekennzeichnet, die durch die Verbesserung der räumlichen Auflösung, aber auch in Live-Zell-Bildgebung und Hochdurchsatzmikroskopie-Techniken veranschaulicht wurden. Dies führte zu einer stetigen Zunahme der Menge und Komplexität der Mikroskopiedaten für ein einzelnes Experiment. Da die manuelle Analyse von Mikroskopiedaten sehr zeitaufwändig, subjektiv und quantitative Analysen verbietet, wird die Automatisierung der Biobildanalyse nahezu unvermeidbar. Wir haben einen Informatik-Workflow namens Substructure Analyzer entwickelt, um die Signalanalyse in Biobildern aus der fluoreszierenden Mikroskopie vollständig zu automatisieren. Dieser Workflow wird auf der benutzerfreundlichen Open-Source-Plattform Icy entwickelt und durch Funktionalitäten von ImageJ ergänzt. Es umfasst die Vorverarbeitung von Bildern zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses, die individuelle Segmentierung von Zellen (Erkennung von Zellgrenzen) und die Erkennung/Quantifizierung von Zellkörpern, die in bestimmten Zellkompartimen angereichert sind. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, Benutzern komplexe Bio-Imaging-Funktionalitäten ohne Bildanalyse-Expertise über eine benutzerfreundliche Oberfläche vorzuschlagen. Darüber hinaus ist es hochmodular und an mehrere Themen angepasst, von der Charakterisierung der kern-zytoplasmatischen Translokation bis hin zur vergleichenden Analyse verschiedener Zellkörper in verschiedenen zellulären Substrukturen. Die Funktionalität dieses Workflows wird durch die Untersuchung der Cajal (gewickelt) Körper unter oxidativen Stressbedingungen (OS) veranschaulicht. Daten aus der Fluoreszenzmikroskopie zeigen, dass ihre Integrität in menschlichen Zellen wenige Stunden nach der Induktion des Betriebssystems beeinträchtigt wird. Dieser Effekt ist durch eine Abnahme der Coilin-Kernbildung in charakteristische Cajal-Körper gekennzeichnet, verbunden mit einer nukleoplasmatischen Umverteilung von Coilin in eine erhöhte Anzahl kleinerer Brennpunkte. Die zentrale Rolle von Coilin beim Austausch zwischen CB-Komponenten und dem umgebenden Nukleoplasma legt nahe, dass OS-induzierte Umverteilung von Coilin die Zusammensetzung und Die Funktionalität von Cajal Bodies beeinflussen könnte.

Introduction

Die Lichtmikroskopie und insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie sind robuste und vielseitige Techniken, die in den biologischen Wissenschaften häufig eingesetzt werden. Sie geben Zugang zur präzisen Lokalisierung verschiedener Biomoleküle wie Proteine oder RNA durch ihre spezifische fluoreszierende Kennzeichnung. Das letzte Jahrzehnt war geprägt von rasanten Fortschritten in der Mikroskopie und Bildgebungstechnologien, wie der Nobelpreis für Chemie 2014 zeigt, der Eric Betzig, Stefan W. Hell und William E. Moerner für die Entwicklung der superaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie (SRFM)¹vergibt. SFRM umgeht die Beugungsgrenze der traditionellen optischen Mikroskopie, um sie in die Nanodimension zu bringen. Die Verbesserung von Techniken wie Live-Imaging oder Screening-Ansätzen mit hohem Durchsatz erhöht auch die Menge und Komplexität der daten, die für jedes Experiment behandelt werden sollen. Meistens sind Forscher mit hohen heterogenen Zellpopulationen konfrontiert und wollen Phänotypen auf einzelliger Ebene analysieren.

Zunächst wurden Analysen wie die Brennweite mit dem Auge durchgeführt, was von einigen Forschern bevorzugt wird, da es eine vollständige visuelle Kontrolle über den Zählprozess bietet. Die manuelle Analyse solcher Daten ist jedoch zu zeitaufwändig, führt zu Einer Variabilität zwischen den Beobachtern und bietet keinen Zugriff auf komplexere Merkmale, so dass computergestützte Ansätze weit verbreitet und nahezu unvermeidbar werden². Bioimage-Informatik-Methoden erhöhen die Effizienz der Datenanalyse erheblich und sind frei von der unvermeidbaren Bedienersubjektivität und potenziellen Verzerrung der manuellen Zählanalyse. Die gestiegene Nachfrage in diesem Bereich und die Verbesserung der Computerleistung führten zur Entwicklung einer vielzahl von Bildanalyseplattformen. Einige von ihnen sind frei verfügbar und ermöglichen den Zugriff auf verschiedene Tools, um Analysen mit PCs durchzuführen. Eine Klassifizierung von Open-Access-Tools wurde vor kurzem³ eingeführt und präsentiert Icy⁴ als leistungsstarke Software, die Benutzerfreundlichkeit und Funktionalität kombiniert. Darüber hinaus hat Eis den Vorteil, mit ImageJ zu kommunizieren.

Für Anwender ohne Bildanalyse-Expertise besteht das Haupthindernis darin, das passende Werkzeug entsprechend den problematischen und korrekt abgestimmten Parametern auszuwählen, die oft nicht gut verstanden werden. Darüber hinaus sind die Rüstzeiten oft lang. Icy schlägt eine benutzerfreundliche Point-and-Click-Schnittstelle namens "Protokolle" vor, um den Workflow zu entwickeln, indem einige Plugins kombiniert werden, die in einer erschöpfenden Sammlung gefunden wurden⁴. Der flexible modulare Aufbau und die Point-and-Click-Schnittstelle machen die Einrichtung einer Analyse für Nicht-Programmierer möglich. Hier stellen wir einen Workflow namens Substructure Analyzervor, der in der Icy-Schnittstelle entwickelt wurde und dessen Funktion darin besteht, fluoreszierende Signale in bestimmten zellulären Kompartimenten zu analysieren und verschiedene Merkmale wie Helligkeit, Brennziffer, Brennpunktegröße und räumliche Verteilung zu messen. Dieser Workflow befasst sich mit mehreren Fragen wie der Quantifizierung der Signaltranslokation, der Analyse transfizierter Zellen, die einen fluoreszierenden Reporter exdrücken, oder der Analyse von Brennpunkten aus verschiedenen zellulären Unterstrukturen in einzelnen Zellen. Es ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Bilder, und Ausgabeergebnisse werden in ein von Registerkarten getrenntes Arbeitsblatt exportiert, das in häufig verwendeten Tabellenkalkulationsprogrammen geöffnet werden kann.

Die Substructure Analyzer-Pipeline ist in Abbildung 1dargestellt. Erstens werden alle Bilder, die in einem angegebenen Ordner enthalten sind, vorverarbeitet, um ihr Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Dieser Schritt erhöht die Effizienz der folgenden Schritte und verringert die Laufzeit. Dann werden die Regionen des Interesses (ROIs), die den Bildbereichen entsprechen, in denen das Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden soll, identifiziert und segmentiert. Schließlich wird das Fluoreszenzsignal analysiert, und die Ergebnisse werden in ein durch Tabstopps getrenntes Arbeitsblatt exportiert.

Die Objektsegmentierung (Erkennung von Grenzen) ist der anspruchsvollste Schritt in der Bildanalyse, und ihre Effizienz bestimmt die Genauigkeit der resultierenden Zellmessungen. Die ersten Objekte, die in einem Bild identifiziert werden (primäre Objekte genannt) sind oft Kerne aus DNA-befleckten Bildern (DAPI- oder Hoechst-Färbung), obwohl primäre Objekte auch ganze Zellen, Perlen, Flecken, Tumoren oder was auch immer gefärbte Objekte sein können. In den meisten biologischen Bildern berühren sich Zellen oder Kerne oder überlappen sich, wodurch die einfachen und schnellen Algorithmen versagen. Bis heute kann kein universeller Algorithmus eine perfekte Segmentierung aller Objekte durchführen, vor allem, weil ihre Eigenschaften (Größe, Form oder Textur) die Effizienz der Segmentierung⁵modulieren. Die Segmentierungstools, die üblicherweise mit Mikroskopiesoftware vertrieben werden (z. B. die MetaMorph Imaging Software von Molecular Devices⁶oder die NIS-Elements Advances Research Software von Nikon⁷), basieren im Allgemeinen auf Standardtechniken wie Korrelationsabgleich, Schwellenwertierung oder morphologischen Operationen. Obwohl diese übergeneralisierten Methoden in grundlegenden Systemen effizient sind, stellen sie schnell Einschränkungen dar, wenn sie in anspruchsvolleren und spezifischeren Kontexten eingesetzt werden. Tatsächlich ist die Segmentierung sehr empfindlich gegenüber experimentellen Parametern wie Zelltyp, Zelldichte oder Biomarkern und erfordert häufig eine wiederholte Anpassung für einen großen Datensatz. Der Substructure Analyzer-Workflow integriert sowohl einfache als auch anspruchsvollere Algorithmen, um verschiedene Alternativen vorzuschlagen, die an die Bildkomplexität und die Benutzeranforderungen angepasst sind. Sie schlägt insbesondere den markerbasierten Wasserscheidealgorithmus⁸ für stark gruppierte Objekte vor. Die Effizienz dieser Segmentierungsmethode hängt von der Auswahl der einzelnen Marker für jedes Objekt ab. Diese Marker werden die meiste Zeit manuell ausgewählt, um korrekte Parameter für die vollständige Segmentierung zu erhalten, was sehr zeitaufwändig ist, wenn Benutzer mit einer hohen Anzahl von Objekten konfrontiert sind. Substructure Analyzer schlägt eine automatische Erkennung dieser Marker vor und bietet so einen hocheffizienten Segmentierungsprozess. Die Segmentierung ist meistens der einschränkende Schritt der Bildanalyse und kann die Verarbeitungszeit je nach Auflösung des Bildes, der Anzahl der Objekte pro Bild und der Ebene des Clusterings von Objekten erheblich ändern. Typische Pipelines benötigen auf einem Standarddesktopcomputer einige Sekunden bis 5 Minuten pro Bild. Die Analyse komplexerer Bilder kann einen leistungsfähigeren Computer und einige Grundlegendes in der Bildanalyse erfordern.

Die Flexibilität und Funktionalität dieses Workflows wird anhand verschiedener Beispiele in den repräsentativen Ergebnissen veranschaulicht. Die Vorteile dieses Workflows werden vor allem durch die Untersuchung nuklearer Unterstrukturen unter oxidativen Stressbedingungen (OS) deutlich. OS entspricht einem Ungleichgewicht der Redoxhomöostase zugunsten von Oxidationsmitteln und ist mit hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verbunden. Da ROS als Signalmoleküle fungieren, wirken sich Veränderungen in ihrer Konzentration und subzellulären Lokalisation positiv oder negativ auf eine Vielzahl von Signalwegen und Netzwerken aus, die physiologische Funktionen regulieren, einschließlich Signaltransduktion, Reparaturmechanismen, Genexpression, Zelltod und Proliferation⁹^,¹⁰. OS ist somit direkt an verschiedenen Pathologien (neurodegenerative und herzkarvaskuläre Erkrankungen, Krebs, Diabetes, etc.), aber auch zelluläreAlterung beteiligt. Daher stellt die Entschlüsselung der Folgen von OS für die Organisation und Funktion der menschlichen Zelle einen entscheidenden Schritt im Verständnis der Rolle von OS beim Beginn und der Entwicklung menschlicher Pathologien dar. Es wurde festgestellt, dass OS die Genexpression reguliert, indem es die Transkription durch mehrere Transkriptionsfaktoren moduliert (p53, Nrf2, FOXO3A)¹¹, aber auch durch die Beeinflussung mehrerer ko- und posttranskriptionaler Prozesse wie alternatives Spleißen (AS) von Pre-RNAs¹²^,¹³^,¹⁴. Das alternative Spleißen von primären Kodierungs- und Nicht-Codierungs-Transkripten ist ein wesentlicher Mechanismus, der die Kodierungskapazität der Genome durch die Produktion von Transkript-Isoformen erhöht. AS wird von einem riesigen Ribonukleoprotein-Komplex namens Spliceoom durchgeführt, der fast 300 Proteine und 5 U-reiche kleine nukleare RNAs (UsnRNAs)¹⁵enthält. Spliceosome Montage und AS werden in den Zellen streng kontrolliert und einige Schritte der spliceosome Reifung treten in membranlosen Kernräumen namens Cajal Bodies. Diese kerntechnischen Unterstrukturen zeichnen sich durch die Dynamik ihrer Struktur und ihre Zusammensetzung aus, die hauptsächlich durch multivalente Wechselwirkungen ihrer RNA- und Proteinkomponenten mit dem Coilin-Protein erfolgen. Die Analyse von Tausenden von Zellen mit dem Substructure Analyzer-Workflow ermöglichte die Charakterisierung nie beschriebener Os-Effekte auf Cajal Bodies. Tatsächlich deuten die erhaltenen Daten darauf hin, dass OS die Keimbildung von Cajal Bodies modifiziert und eine nukleoplasmatische Umverteilung des Coilin-Proteins in zahlreiche kleinere Kernbrennpunkte induzieren. Eine solche Änderung der Struktur von Cajal Bodies könnte die Reifung des Spliceooms beeinflussen und an der AS-Modulation durch OS teilnehmen.

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Protocol

HINWEIS: Benutzerfreundliche Tutorials sind auf der Website von Icy http://icy.bioimageanalysis.orgverfügbar.

1. Herunterladen von Eis und dem Substructure Analyzer-Protokoll

Laden Sie Icy von der Icy-Website (http://icy.bioimageanalysis.org/download) herunter und laden Sie das Substructure Analyzer-Protokoll herunter: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
HINWEIS: Wenn Sie ein 64-Bit-Betriebssystem verwenden, sollten Sie die 64-Bit-Version von Java verwenden. Diese Version ermöglicht die Erhöhung des Speichers, der Icy zugewiesen ist(Einstellungen | Allgemeines | Max. Speicher).

2. Öffnen des Protokolls

Öffnen Sie Eis und klicken Sie im Menü "Menüleiste" auf Extras.
Klicken Sie auf Protokolle, um die Protokoll-Editor-Schnittstelle zu öffnen.
Klicken Sie auf Laden und öffnen Sie den Protokoll-Substructure Analyzer. Das Laden des Protokolls kann einige Sekunden dauern. Stellen Sie sicher, dass das Öffnen des Protokolls abgeschlossen ist, bevor Sie es verwenden.
HINWEIS: Der Workflow besteht aus 13 allgemeinen Blöcken, die in Abbildung 2adargestellt sind. Jeder Block funktioniert als Pipeline, die aus mehreren Feldern besteht, die bestimmte Teilaufgaben ausführen.

3. Interaktion mit dem Workflow auf Eis

HINWEIS: Jeder Block oder jedes Feld ist nummeriert und hat einen bestimmten Rang innerhalb des Workflows (Abbildung 2b). Durch Anklicken dieser Nummer wird die nächstgelegene Position zum ersten dem ausgewählten Block/Feld zugewiesen, dann wird die Position der anderen Blöcke/Boxen neu organisiert. Beachten Sie bei der Vorbereitung des Workflows die richtige Reihenfolge der Blöcke. Beispielsweise benötigt der Spot Detector-Block vordefinierte ROIs, sodass Segmentierungsblöcke vor Spot Detector-Blöcken ausgeführt werden müssen. Ändern Sie die Position der Felder nicht. Verwenden Sie "." nicht im Namen des Bildes.

Durch Klicken auf das symbol "obere linke Ecke" wird der Block reduziert, erweitert, vergrößert, verengt oder entfernt (Abbildung 2b).
Jede Pipeline des Workflows zeichnet sich durch ein Netz von Boxen aus, die über deren Ein- und Ausgabe verbunden sind (Abbildung 2b). Um eine Verbindung herzustellen, klicken Sie auf Ausgabe und halten Sie, bis der Cursor eine Eingabe erreicht. Verbindungen können entfernt werden, indem Sie auf das Ausgabe-Tag klicken.

4. Zusammenführen der Kanäle eines Bildes

Verwenden Sie den Block Merge Channels, um zusammengeführte Bilder zu generieren. Benennen Sie die Dateien bei Bedarf so um, dass Sequenzen, die zusammengeführt werden sollen, das Präfix des gleichen Namens haben, gefolgt von einem separaten Trennzeichen. Sequenzen einzelner Kanäle aus einem Bild A werden beispielsweise benannt: ImageA_red, ImageA_blue.
HINWEIS: Verwenden Sie für das Trennzeichen keine Zeichen, die bereits im Namen des Bildes vorhanden sind.
Erstellen Sie im gleichen Ordner einen neuen Ordner pro Kanal, der zusammengeführt werden soll. Um beispielsweise rote, grüne und blaue Kanäle zusammenzuführen, erstellen Sie 3 Ordner, und speichern Sie die entsprechenden Sequenzen in diesen Ordnern.
Verwenden Sie nur den Block Merge Channels, entfernen Sie die anderen Blöcke, und speichern Sie das Protokoll als Merge Channels.
1. Greifen Sie auf die Felder zu, um Parameter festzulegen. Füllen Sie für jeden Kanal die Felder Kanalnummer X (Felder 1, 5 oder 9), Ordnerkanalnummer X (Felder 2, 6 oder 10), Trennkanalnummer X (Felder 3, 7 oder 11) und Colormap-Kanal nb X (Felder 4, 8 und 12).
  HINWEIS: Diese Felder sind horizontal durch vier gruppiert, jede Zeile entspricht demselben Kanal. In jeder Zeile ist auch ein Display (Felder 23, 24 oder 25) verfügbar, um die Reihenfolge des entsprechenden Kanals direkt zu visualisieren.
  1. Wählen Sie im Feld Kanalnummer Xaus, welchen Kanal extrahiert werden soll (in klassischen RGB-Bildern, 0=Rot, 1=Grün, 2=Blau). Der Benutzer greift schnell auf die verschiedenen Kanäle eines Bildes im Inspector-Fenster von Eis, in der Registerkarte Sequenz. Schreiben Sie den Wert des kleinsten Kanals in der oberen Zeile und den höchsten in der unteren Zeile.
  2. Schreiben Sie in das Feld Ordnerkanalnummer Xden Namen des Ordners, der Bilder von Kanal X enthält.
  3. Schreiben Sie in das Feld Trennkanalnummer Xdas Trennzeichen, das für den Namen des Bildes verwendet wird (im vorherigen Beispiel: "_red", "_green" und "_blue").
  4. Geben Sie im Feld Colormap-Kanal nb Xmit einer Zahl an, welches Colormap-Modell verwendet werden soll, um den entsprechenden Kanal in Icy zu visualisieren. Die verfügbaren Farbkarten sind auf der Registerkarte Sequenz des Inspektorfensters sichtbar.
  5. Schreiben Sie in das Feld Format der zusammengeführten Bilder (Feld 28) die Erweiterung, um zusammengeführte Bilder zu speichern: .tif, .gif, .jpg, .bmp oder .png.
    HINWEIS: Um nur 2 Kanäle zusammenzuführen, füllen Sie nicht die vier Felder, die dem dritten Kanal entsprechen.
2. Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Blocks Kanäle zusammenführen auf den Link direkt rechts von Folder. Doppelklicken Sie im dialogoffenen Dialogfeld auf den Ordner mit Sequenzen des ersten Kanals, der im Feld Ordnerkanal Nummer 1 (Feld 2) definiert wurde. Klicken Sie dann auf Öffnen.
3. Führen Sie das Protokoll aus, indem Sie auf den schwarzen Pfeil in der oberen linken Ecke des Merge Channels-Blocks klicken (weitere Details finden Sie in Teil 7). Zusammengeführte Bilder werden in einem Mergeordner im selben Verzeichnis wie die Ordner der einzelnen Kanäle gespeichert.

5. Segmentierung der Interessengebiete

HINWEIS: Substructure Analyzer integriert sowohl einfache als auch anspruchsvollere Algorithmen, um verschiedene Alternativen vorzuschlagen, die an die Bildkomplexität und die Benutzeranforderungen angepasst sind.

Wählen Sie den angepassten Block aus.
1. Wenn sich Objekte nicht berühren oder der Benutzer gruppierte Objekte nicht einzeln unterscheiden muss, verwenden Sie den Block Segmentierung A: Nicht gruppierte Objekte.
2. Wenn sich Objekte nicht berühren, aber einige nahe sind, verwenden Sie den Block Segmentierung B: Schlecht gruppierte Objekte.
3. Verwenden Sie für Objekte mit einer hohen Clusterebene und einer konvexen Form den Block Segmentierung C: Gruppierte Objekte mit konvexen Formen.
4. Wenn Objekte eine hohe Clusterebene aufweisen und unregelmäßige Formen aufweisen, verwenden Sie den Block Segmentierung D: Gruppierte Objekte mit unregelmäßigen Formen.
5. Verwenden Sie den Block Segmentierung E: Clustered Cytoplasma, um berührende Zytoplasmen einzeln unter Verwendung segmentierter Kerne als Marker zu segmentieren. Dieser Block muss unbedingt segmentierte Kerne verarbeiten.
  ANMERKUNG: Blöcke, die unabhängig für den primären Objektsegmentierungsprozess angepasst sind, sodass mehrere Blöcke in derselben Ausführung verwendet werden können, um ihre Effizienz für eine bestimmte Unterstruktur zu vergleichen oder verschiedene Arten von Unterstrukturen zu segmentieren. Wenn die Clusterebene innerhalb desselben Satzes von Bildern heterogen ist, verarbeiten Sie kleine und stark gruppierte Objekte separat in den angepassten Blöcken.
Verknüpfen Sie die Ausgabe0 (Datei) des Blocks Ordner auswählen mit der Ordnereingabe des gewählten Segmentierungsblocks.
Legen Sie die Parameter des gewählten Segmentierungsblocks fest.
1. Segmentierung A: Nicht gruppierte Objekte und Segmentierung C: Gruppierte Objekte mit konvexen Formen
  1. Legen Sie im Box-Kanal-Signal (Box 1) den Kanal der Objekte auf Segment fest.
  2. Optional erhöhen Sie in Kasten Gaußsche Filter (Box 2) die X- und Y-Sigma-Werte, wenn das Signal in Objekten heterogen ist. Der Gaußsche Filter glättet Texturen, um gleichmäßigere Regionen zu erhalten und erhöht die Geschwindigkeit und Effizienz der Kernsegmentierung. Je kleiner die Objekte, desto niedriger ist der Sigma-Wert. Vermeiden Sie hohe Sigma-Werte. Legen Sie die Standardwerte auf 0 fest.
  3. Legen Sie in Feld HK-Means (Feld 3) den Parameter Intensitätsklassen und die ungefähren minimalen und maximalen Größen (in Pixel) der zu erkennenden Objekte fest.
    HINWEIS: Für Intensitätsklassen klassifiziert ein Wert von 2 Pixel in 2 Klassen: Hintergrund und Vordergrund. Es wird somit angepasst, wenn der Kontrast zwischen den Objekten und dem Hintergrund hoch ist. Wenn Vordergrundobjekte unterschiedliche Intensitäten haben oder der Kontrast zum Hintergrund gering ist, erhöhen Sie die Anzahl der Klassen. Die Standardeinstellung ist 2. Die Objektgröße kann schnell ausgewertet werden, indem ein ROI manuell um das Objekt von Interesse gezeichnet wird. Die Größe des ROI (Interior in Pixel) wird direkt auf dem Bild angezeigt, wenn er mit dem Cursor zeigt, oder kann im ROI-Statistikfenster aufgerufen werden (öffnen Sie ihn über die Suchleiste). Optimale Parameter erfassen jedes Vordergrundobjekt in einem einzigen ROI. Sie können manuell in Icy (Erkennung und Nachverfolgung | HK-Mittel).
  4. Optimieren Sie im Feld Aktive Konturen (Feld 4) die Erkennung von Objektgrenzen. Umfangreiche Dokumentation für dieses Plugin ist online verfügbar: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Korrekte Parameter können auch manuell in Icy(Erkennung und Nachverfolgung | Aktive Konturen).
  5. Während des Vorgangs wird automatisch ein Ordner erstellt, um Bilder segmentierter Objekte zu speichern. Benennen Sie diesen Ordner im Feld Text (Feld 6) (z. B. Segmentierte Kerne). Um das Format zum Speichern von Bildern segmentierter Objekte (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG) festzulegen, füllen Sie das Feldformat von Bildern segmentierter Objekteaus. Der Ordner wird in dem Ordner erstellt, der zusammengeführte Bilder enthält.
  6. Führen Sie den Workflow aus (Details finden Sie in Teil 7).
2. Segmentierung B: Schlecht gruppierte Objekte
  1. Führen Sie die gleichen Schritte wie in 5.3.1 aus, um Parameter von Boxen Kanalsignal, HK-Means, Active Contours, Extension zum Speichern segmentierter Objekte und Text festzulegen (Boxen sind nicht die gleichen wie in Schritt 5.3.1).
  2. Legen Sie im Feld Anruf IJ Plugin (Feld 4) den Rolling-Parameter fest, um die Hintergrundsubtraktion zu steuern. Legen Sie diesen Parameter auf mindestens die Größe des größten Objekts fest, das nicht Teil des Hintergrunds ist. Das Verringern dieses Werts erhöht die Hintergrundentfernung, kann aber auch den Verlust des Vordergrundsignals verursachen.
  3. Verbessern Sie im Feld Adaptivehistogrammentzerrung (Feld 6) die Kontraste zwischen den Vordergrundobjekten und dem Hintergrund. Durch das Erhöhen der Neigung werden mehr kontrastreiche Sequenzen angezeigt.
  4. Führen Sie den Workflow aus (Details finden Sie in Teil 7).
3. Segmentierung D: Gruppierte Objekte mit unregelmäßigen Formen
  ANMERKUNG: Für jedes Bild gelten drei verschiedene Segmentierungsmethoden:HK-means Clusteringkombiniert mit derActive Contours-Methodeangewendet wird. Dann wird dieklassischer Wasserscheidealgorithmus(mit der euklidischen Entfernungskarte) wird auf zuvor falsch segmentierte Objekte angewendet. Schließlich wird einMarker-basierter Wassereinzugsgebietsalgorithmusverwendet wird. Nur HK-Mittel und markerbasierte Wassereinzugsgebietsmethoden müssen von der Nutzer eingreifen. Für beide Methoden können für alle Bilder (vollautomatische Version) die gleichen Parameter angewendet oder für jedes Bild geändert werden (halbautomatische Version). Wenn der Benutzer in diesen Segmentierungsmethoden nicht geschult ist, wird die halbautomatische Verarbeitung dringend empfohlen. Bei der Bearbeitung dieses Blocks ist ein manuelles Eingreifen erforderlich. Wenn eine Segmentierungsmethode abgeschlossen ist, muss der Benutzer falsch segmentierte Objekte vor dem Beginn der nächsten Segmentierungsmethode manuell entfernen. Erfolgreich segmentierte Objekte werden gespeichert und im nächsten Schritt nicht berücksichtigt. Dieser Block muss mit dem Block verbunden werdenClustered/Heterogene Shapes primäre Objekte Segmentierung DialogFeldkorrekt zu funktionieren.
  1. Laden Sie die ImageJ-Kollektion MorphoLibJ auf https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases herunter. Die MorphoLibJ 1.4.0 Version wird in diesem Protokoll verwendet. Platzieren Sie die Datei MorphoLibJ_-1.4.0.jar im Ordner eis/ij/plugins. Weitere Informationen zum Inhalt dieser Sammlung finden Sie auf https://imagej.net/MorphoLibJ.
  2. Führen Sie die gleichen Schritte wie in Schritt 5.3.1 aus, um Parameter von Boxen Kanalsignal, Gaußsche Filter, Aktive Konturen, Erweiterung, um segmentierte Objekte und Textzu speichern . Die Boxensindsind sind nicht die gleichen wie in Schritt 5.3.1.
  3. Legen Sie die Parameter des Feldes Adaptiver Histogrammausgleich fest (siehe Schritt 5.3.2.3).
  4. Um Den Hintergrund subtrahierenzu aktivieren, schreiben Sie ja in Apply Subtrahierhintergrund? (Feld 5). Andernfalls, schreiben Sie Nein. Wenn das Plugin aktiviert ist, setzen Sie den Rolling-Parameter (siehe Schritt 5.3.2), im Feld Hintergrund subtrahieren (Feld 7).
  5. Automatisierung von HK-Mitteln: Um die gleichen Parameter für alle Bilder anzuwenden (vollautomatische Verarbeitung), legen Sie den Nb der Klassen (Feld 11), die Mindestgröße (Feld 12) und die maximale Größe (Feld13) fest (siehe Schritt 5.3.1). Diese Parameter müssen so eingestellt werden, dass ein Maximum an Vordergrundpixeln ausgewählt und die Individualisierung von Vordergrundobjekten optimiert wird. Für die halbautomatische Verarbeitungsversion ist kein Eingriff erforderlich.
  6. Automatisierung von Markerextraktionen: Erweitern Sie für die vollautomatische Version die Box Interne Markerextraktion (Box 27) und legen Sie den Wert des Parameters "dynamisch" in Zeile 13 des Skripts fest. Für die halbautomatische Verarbeitungsversion ist kein Eingriff erforderlich.
    HINWEIS: Marker werden extrahiert, indem eine Extended-Minima-Transformation auf ein Eingabebild angewendet wird, das durch einen "dynamischen" Parameter gesteuert wird. Im markerbasierten Wassereinzugsgebietsalgorithmus wird das Überfluten von diesen Markern simuliert, um die Objektsegmentierung durchzuführen. Für die erfolgreiche Segmentierung von Vordergrundobjekten sollte ein einzelner Marker pro Vordergrundobjekt extrahiert werden. Die Einstellung des Parameters "dynamisch" für eine optimale Markerextraktion hängt meist von der Auflösung von Bildern ab. Wenn Sie also mit diesem Parameter nicht vertraut sind, verwenden Sie die halbautomatische Version.
  7. Führen Sie den Workflow aus (Details finden Sie in Teil 7).
  8. Zu Beginn der Verarbeitung öffnen sich die Dialogfelder HK-means Parameter und Marker-basierte Wasserscheide sukzessive. Um die gleichen Parameter für alle Bilder anzuwenden (vollautomatische Version), klicken Sie auf JA. Andernfalls klicken Sie auf NEIN. Es öffnet sich ein Informationsfeld mit der Bitte: "Bestimmen Sie optimale ROIs mit HK-Means Plugin und Close Image". Klicken Sie auf OK und wenden Sie das HK-Means Plugin(Erkennung und Tracking| HK-Mittel) auf dem Bild, das sich automatisch öffnet. Wählen Sie die Option ROIs exportieren im MODULfeld HK-Means aus. Wenden Sie die besten Parameter an, um ROIs mit maximal einem Vordergrundpixel zu verwenden und die Individualisierung von Vordergrundobjekten zu optimieren. Wenn optimale ROIs gefunden werden, schließen Sie das Bild direkt.
  9. Am Ende der ersten Segmentierungsmethode öffnet sich ein Informationsfeld und fordert "Unerwünschte ROIs entfernen und Bild schließen". Diese ROIs entsprechen den Rändern der segmentierten Objekte. Wählen Sie OK aus, und entfernen Sie ROIs von falsch segmentierten Objekten im Bild, das automatisch geöffnet wird. Ein ROI kann leicht entfernt werden, indem Sie den Cursor auf den Rand setzen und die Schaltfläche "Löschen" der Tastatur verwenden. Schließen Sie das Bild. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren nach Abschluss des zweiten Segmentierungsschritts.
  10. Wenn in diesem Stadium die YES-Schaltfläche für die vollständige Automatisierung des markerbasierten Wassereinzugsgebietsalgorithmus ausgewählt wurde, werden die zuvor festgelegten Parameter auf alle Bilder angewendet.
  11. Wenn die Schaltfläche NO ausgewählt wurde, wird ein Informationsfeld geöffnet, in dem Sie aufgefordert werden, "interne Markierungen zu bestimmen und anzupassen". Klicken Sie auf OK und gehen Sie innerhalb der ImageJ-Schnittstelle von Icy zu Plugins | MorphoLibJ | Minima und Maxima| Erweiterte Min & Max. Wählen Sie im Betrieb Extended Minimaaus.
  12. Wählen Sie Vorschau aus, um das Ergebnis der Transformation auf dem automatisch geöffneten Bild vorab zu visualisieren. Verschieben Sie die Dynamik, bis optimale Marker beobachtet werden. Marker sind Pixelgruppen mit einem Wert von 255 (nicht unbedingt weiße Pixel). Optimale Parameter führen zu einem Marker pro Objekt. Konzentrieren Sie sich auf die verbleibenden Objekte, die mit den beiden vorherigen Segmentierungsmethoden nicht gut segmentiert wurden.
  13. Verbessern Sie ggf. die Marker, indem Sie zusätzliche morphologische Operationen wie "Öffnen" oder "Schließen"(Plugins | MorphoLibJ | Morphologische Filter). Wenn Sie das endgültige Bild der Marker erhalten, halten Sie es offen und schließen Sie alle anderen Bilder, die mit dem Bild enden, das ursprünglich als Eingabe für den Extended Minima-Vorgang verwendet wurde. Klicken Sie auf Nein, wenn ein ImageJ-Feld darum bittet, Änderungen an diesem Bild zu speichern.
  14. Bestimmen Sie im Feld Nb von Bildern mit Informationsbox (Feld 14), wie viele Bilder mit Informationsfeldern angezeigt werden sollen.
4. Segmentierung E: Clustered Cytoplasma
  HINWEIS: Dieser Block verwendet zuvor segmentierte Kerne als einzelne Marker, um die Zytoplasmasegmentierung zu initiieren. Stellen Sie sicher, dass der Block der Kernsegmentierung verarbeitet wurde, bevor Sie ihn verwenden.
  1. Legen Sie in der Box Kanalzytoplasma (Box 1) den Kanal des zytoplasmatischen Signals ein.
  2. Schreiben Sie in das Feld Extension segmentierte Kerne (Feld 2), das Format verwendet, um Bilder von segmentierten Kernen zu speichern (tif, jpg, bmp, png). Das Standardformat ist tif.
  3. Schreiben Sie in das Feld Text (Feld3) den Namen des Ordners, der segmentierte Kerne enthält.
  4. Legen Sie im Feld Format der Bilder segmentierter Zytoplasmen (Feld 4) das Format fest, das zum Speichern segmentierter Objekte (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG) verwendet werden soll.
  5. Während des Prozesses wird automatisch ein Ordner erstellt, um Bilder von segmentierten Zytoplasmen zu speichern. Benennen Sie diesen Ordner im Feld Text (Feld 5) (z. B. segmentierte Zytoplasmen). Der Ordner wird in dem Ordner erstellt, der zusammengeführte Bilder enthält.
  6. Führen Sie die gleichen Schritte wie in Schritt 5.3.1 aus, um Parameter von Boxen Gaußsche Filter und Aktive Konturen (Vorsicht, Box Ränge sind nicht die gleichen wie in Schritt 5.3.1).
  7. Führen Sie den Workflow aus (Details finden Sie in Teil 7).

6. Fluoreszierende Signalerkennung und -analyse

Wählen Sie den angepassten Block aus.
1. Im Block Fluoreszenzanalyse A: 1 Kanalführen Sie die Erkennung und Analyse von Brennpunkten in einem Kanal innerhalb eines Segmentobjekts durch: Detektion von Coilin-Brennpunkten (roter Kanal) innerhalb des Kerns.
2. Im Block Fluoreszenzanalyse B: 2 Kanäle im selben Fachführen Sie die Erkennung und Analyse von Brennpunkten in zwei Kanälen innerhalb eines Segmentobjekttyps durch: Erkennung von Coilin (roter Kanal) und 53BP1 (grüner Kanal) im Kern.
3. Im Block Fluoreszenzanalyse C: 2 Kanäle in zwei Kompartimentenführen Die Detektion und Analyse von Brennpunkten in einem oder zwei Kanälen, insbesondere innerhalb der Kerne und des entsprechenden Zytoplasmas, durch: Detektion von Coilin-Brennpunkten (roter Kanal) sowohl innerhalb des Kerns als auch des entsprechenden Zytoplasmas oder Nachweis von Coilin-Brennpunkten (roter Kanal) innerhalb des Kerns und G3BP-Foci (grüner Kanal) innerhalb des entsprechenden Zytoplasmas.
4. Im Block Fluoreszenzanalyse D: Globale Translokationberechnen Sie den Prozentsatz des Signals von einem Kanal in zwei Zellkompartimen (a und b). Exportieren Sie beispielsweise in einem Zytoplasma/Kerntranslokationstest berechnete Prozentsätze nuklearer und zytoplasmatischer Signale für jedes Bild in der endgültigen Tabelle "Ergebnisse". Die Formel zur Berechnung des Kernsignalprozentsatzes ist unten dargestellt. Dieser Block kann für jedes subzelluläre Fach verwendet werden:
5. Im Block Fluoreszenzanalyse E: Individuelle Zelltranslokationberechnen Sie den Prozentsatz des Signals aus einem Kanal in zwei Zellkompartimenten für jede Zelle. Dieser Block ist speziell für den Kern-/Zytoplasma-Translokationstest auf einzelliger Ebene optimiert.
  HINWEIS: Da der Block Fluoreszenzanalyse E: Individuelle Zelltranslokation Analysen auf einzelzeller Ebene durchführt, ist eine effiziente Segmentierung von Kern und Zytoplasma erforderlich.
Verknüpfen Sie die Ausgabe0 (Datei) des Blocks Ordner auswählen (Block 1) mit der Ordnereingabe (weiße Pfeile in schwarzen Kreisen) des gewählten Blocks.
Legen Sie die Parameter des gewählten Blocks fest.
1. Fluoreszenzanalyse A: 1 Kanal, Fluoreszenzanalyse B: 2 Kanäle im selben Fach und Fluoreszenzanalyse C: 2 Kanäle in zwei Fächern
  1. Schreiben Sie im Feld Ordnerbilder ROIden Namen des Ordners, der Bilder von segmentierten Objekten enthält, denen ein umgekehrter Schrägstrich vorangestellt ist. (Zum Beispiel: "Segmentierte Kerne").
  2. Schreiben Sie im Feld Format der Bilder segmentierter Objekte (Feld 2) das Format, das zum Speichern von Bildern segmentierter Objekte (tif, jpg, bmp, png) verwendet wird. Das Standardformat ist tif.
  3. In das Feld "Grenzen töten? ,schreiben Sie Ja, um Rahmenobjekte zu entfernen. Andernfalls schreiben Sie Nr. Die Installation der MorphoLibJ-Sammlung von ImageJ ist erforderlich, um diese Funktion zu verwenden (siehe Schritt 5.3.3).
  4. In der box(es) Kanalspots Signal,stellen Sie den Kanal, wo Flecken erkannt werden müssen. In klassischen RGB-Bildern, 0=Rot, 1=Grün und 2=Blau.
  5. In die Felder Name des lokalisierten Molekülsschreiben Sie den Namen des Moleküls, das sich in die Flecken lokalisiert. Die Anzahl der einzugebenden Felder hängt von der Anzahl der Moleküle ab.
  6. Legen Sie im box(es) Wavelet Spot Detector BlockSpot-Erkennungsparameter für jeden Kanal fest. Legen Sie die Skala(n) (bezogen auf die Spotgröße) und die Empfindlichkeit der Erkennung fest (eine kleinere Empfindlichkeit verringert die Anzahl der erkannten Flecken, wobei der Standardwert 100 und der Mindestwert 0 beträgt). Die ausführliche Dokumentation dieses Plugins ist online verfügbar: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Parameter können auch manuell in Icy definiert werden(Erkennung und Nachverfolgung | Spotdetektor).
  7. Optional filtern Sie im Feld ROI nach Größefiltern die segmentierten Objekte, bei denen Flecken erkannt werden, indem Sie ein Intervall der Größe (in Pixel) festlegen. Dieser Schritt ist besonders nützlich, um unter- oder übersegmentierte Objekte zu entfernen. Informationen zur manuellen Schätzung der Größe von Objekten finden Sie in Schritt 5.3.1. Die Standardparameter enthalten nicht die Filterung von ROIs nach Größe. Der Block 2 Kanäle in zwei Fächern enthält zwei Boxen: Filterkerne nach Größe (Box 19) und Filterzytoplasma nach Größe (Box 46).
  8. Optional filtern Sie im Feld Spots nach Größefiltern die erkannten Flecken nach ihrer Größe (in Pixel), um unerwünschte Artefakte zu entfernen. Um die Spotgröße manuell zu schätzen, klicken Sie auf Erkennung und Tracking und öffnen Sie das Spot-Detektor-Plugin. Wählen Sie unter Ausgabeoptionen Die Option Exportieren in ROIaus. Achten Sie darauf, dass Standardparameter keine Filterung von Flecken nach Größe enthalten und gefilterte Flecken bei der Analyse nicht berücksichtigt werden. Die Anzahl der einzugebenden Felder hängt von der Anzahl der Kanäle ab.
  9. Optional wird in der Box Filterspotsein zusätzlicher Filter (Kontrast, Homogenität, Umfang, Rundheit) auf die erkannten Stellen angewendet. Achten Sie darauf, dass Standardparameter keine Punktfilterung enthalten und gefilterte Flecken bei der Analyse nicht berücksichtigt werden. Die Anzahl der einzugebenden Felder hängt von der Anzahl der Kanäle ab.
  10. Optional legen Sie in den Feldern Spot-Größenschwelleeinen Schwellenwert für den Bereich (in Pixel) der analysierten Punkte fest. Die Anzahl der gezählten Punkte unterhalb und oberhalb dieses Schwellenwerts wird in der endgültigen Ergebnistabelle exportiert. Die Anzahl der zu informierenden Felder hängt von der Anzahl der Kanäle ab.
  11. Führen Sie den Workflow aus (Details finden Sie in Teil 7). Daten werden in einer Ergebnistabelle exportiert, die in dem Ordner mit zusammengeführten Bildern gespeichert ist.
2. Fluoreszenzanalyse D: Globale Translokation und Fluoreszenzanalyse E: Individuelle Zelltranslokation:
  1. Schreiben Sie in die Felder Ordnerbilder (Felder 1 und 2) den Namen des Ordners, der Bilder von segmentierten Objekten enthält. Im Block Fluoreszenzanalyse D: Global Translocationwerden die beiden ROI-Typen als ROI a und ROI b identifiziert. Für den Block Fluoreszenzanalyse E: Individuelle Zelltranslokation, in Ordnerbildern segmentierte Kerne und Ordnerbilder segmentierte Zytoplasmen-Boxen, schreiben Sie den Namen des Ordners, der segmentierte Kerne bzw. Zytoplasmen enthält.
  2. Geben Sie im Kasten Kanalsignal (Box 3) den Kanal des Signals ein.
  3. Schreiben Sie im Feld Format der Bilder segmentierter Objekte (Feld 4) das Format, das zum Speichern von Bildern segmentierter Objekte (tif, jpg, bmp, png) verwendet wird. Das Standardformat ist tif. Die Option "Rahmen töten" ist auch zum Entfernen von Rahmenobjekten verfügbar (siehe Schritt 6.3.1).
  4. Optional filtern Sie in Boxen den ROInach Größe , filtern Sie die segmentierten Objekte, indem Sie ein Intervall der Größe (in Pixel) festlegen. Dieser Schritt kann nützlich sein, um unter- oder übersegmentierte Objekte zu entfernen. Informationen zur manuellen Schätzung der Objektgröße finden Sie unter Schritt 5.3.1. Es gibt zwei Felder, die eingegeben werden müssen, eines pro Kanal. Standardparameter enthalten keine ROI-Filterung nach Größe.
  5. Führen Sie den Workflow aus (Details finden Sie in Teil 7). Exportieren von Daten in einer Kalkulationstabelle Ergebnisse, die in dem Ordner mit zusammengeführten Bildern gespeichert sind.

7. Führen Sie das Protokoll aus

Um einen Block in einer Ausführung zu verarbeiten, entfernen Sie die Verbindung zwischen dem ausgewählten Block und dem Block Ordner auswählen. Platzieren Sie den gewünschten Block auf dem^1. Rang. Klicken Sie in der oberen linken Ecke des gewünschten Blocks auf den Link direkt rechts vom Ordner. Doppelklicken Sie im Dialogfeld Öffnen auf den Ordner mit den zusammengeführten Bildern. Klicken Sie dann auf Öffnen. Klicken Sie auf Ausführen, um den Workflow zu starten. Die Verarbeitung kann durch Klicken auf die Stopp-Taste gestoppt werden.
Um verschiedene Blöcke in einem Durchlauf zu verarbeiten, behalten Sie Verbindungen ausgewählter Blöcke mit dem Block Ordner auswählen (Block 1). Stellen Sie sicher, dass ihr Rang die gute Verarbeitung des Workflows ermöglicht. Wenn z. B. ein bestimmter Block segmentierte Objekte verarbeiten muss, stellen Sie sicher, dass der Segmentierungsblock zuvor verarbeitet wird. Entfernen Sie vor dem Ausführen des Workflows nicht verwendete Blöcke, und speichern Sie das neue Protokoll unter einem anderen Namen.
Klicken Sie auf Ausführen, um den Workflow zu starten. Wenn das geöffnete Dialogfeld angezeigt wird, doppelklicken Sie auf den Ordner, der die zusammengeführten Bilder enthält. Klicken Sie dann auf Öffnen. Der Workflow wird automatisch ausgeführt. Beenden Sie ggf. die Verarbeitung, indem Sie auf die Schaltfläche Stopp klicken.
Überprüfen Sie am Ende der Verarbeitung, ob die Nachricht Der ausgeführte Workflow erfolgreich in der unteren rechten Ecke angezeigt wurde und dass alle Blöcke mit einem grünen Vorzeichen gekennzeichnet sind ( Abbildung2b). Ist dies nicht der Fall, geben der Block und das Innere des Fehlerzeichens das zu korrigierende Element an (Abbildung 2b).
HINWEIS: Nachdem der Workflow erfolgreich ausgeführt wurde, kann eine neue Ausführung nicht direkt gestartet werden, und um den Workflow erneut zu verarbeiten, sollte mindestens ein Block mit dem Zeichen "bereit zu verarbeiten" gekennzeichnet werden. Um den Status eines Blocks zu ändern, löschen und erstellen Sie entweder eine Verknüpfung zwischen zwei Feldern innerhalb dieses Blocks, oder schließen Und öffnen Sie das Protokoll einfach. Wenn während der Verarbeitung ein Fehler auftritt, kann eine neue Ausführung direkt gestartet werden. Während einer neuen Ausführung werden alle Blöcke der Pipeline verarbeitet, auch wenn einige von ihnen mit dem grünen Vorzeichen gekennzeichnet sind.

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Representative Results

Alle beschriebenen Analysen wurden auf einem Standard-Laptop (64-Bit- Quad-Core-Prozessor bei 2,80 GHz mit 16 GB Ram-Speicher (Random-Access Memory) durchgeführt, der mit der 64-Bit-Version von Java arbeitet. Der Arbeitsspeicher mit zufälligem Zugriff ist ein wichtiger Parameter, der je nach Menge und Auflösung der zu analysierenden Bilder zu berücksichtigen ist. Die Verwendung der 32-Bit-Version von Java beschränkt den Speicher auf ca. 1300 MB, was für big Data-Analysen ungeeignet sein könnte, während die 64-Bit-Version es ermöglicht, den Icy zugewiesenen Speicher zu erhöhen. Abbildung 3 zeigt die Zeit, die für die Segmentierung für verschiedene Bildtypen und auflösungen benötigt wird. Er bestätigt, dass die hohe Auflösung die Zeit der primären Objektsegmentierung erheblich erhöht.

Die in den nächsten Absätzen dargestellten Daten zeigen, dass der Substruktur Analyzer-Workflow verwendet werden kann, um die meisten der in der Zell- und Molekularbiologie auftretenden problematischen Probleme zu lösen (Zellzählung, Brennpunktzählung und -analyse, Translokationsanalyse).

Die Messung des genauen Anteils der in einem bestimmten Fach konzentrierten Moleküle in zahlreichen Zellen oder die Änderung der Lokalisierung über subzelluläre Domänen hinweg kann eine sehr umständliche und fehleranfällige Aufgabe sein, insbesondere wenn sie manuell durchgeführt wird. Abbildung 4 zeigt die Fähigkeit des Workflows, die gut beschriebene kerntechnische Translokation des Transkriptionsfaktors NF-B als Reaktion auf die TNF-Stimulation schnell und präzise zu quantifizieren. Die für die Analyse verwendeten Bilder wurden von Ilya Ravkin (http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm) gnädig zusammengestellt und sind in der Broad Bioimage Benchmark Collection¹⁶öffentlich zugänglich. Dieses Set enthält Bilder von MCF7- und A549-Zelllinien, die mit zunehmenden Konzentrationen von TNF behandelt werden. Die Analyse wurde an mehr als 40.000 Zellen und 96 Bildern (48 Bilder für jeden Kanal) aus der MCF7-Zelllinie (Abbildung 4a) durchgeführt. Die gesamte Analyse (vom Import von Bildern bis zur Datenspeicherung) dauerte 26 Minuten. Jedes Bild entspricht einer bestimmten TNF-Konzentration. Die kern-zytoplasmatischen Anteile von NF-B waren für ein bestimmtes Bild in allen Zellen homogen. Aus diesem Grund wurden für jedes Bild die Werte aller nuklearen oder zytoplasmatischen Pixel summiert, um die nuklearen und zytoplasmatischen Anteile von NF-B zu berechnen, und eine Individualisierung berührender Kerne/Zytoplasmen während ihrer Segmentierung war nicht erforderlich. DAPI-Bilder wurden im Segmentierung C verarbeitet: Gruppierte Objekte mit konvexen Formen blockten zu Segmentkernen und der grüne Kanal wurde verwendet, um die Zytoplasmen mit dem Segmentierung E: Clustered Zytoplasmablock abzuleiten (Abbildung 4b). Der Fluoreszenzanalyse D: Global Translocation Block wurde verwendet, um die Summe der nuklearen und zytoplasmatischen Pixelwerte zu exportieren. Die erhaltenen Daten werden in einer Dosis-Wirkungs-Kurve dargestellt (Abbildung 4c) und veranschaulichen den Anstieg des NF-B-Kernanteils nach Stimulation mit zunehmenden TNF-Konzentrationen.

Der Workflow analysiert nicht nur das globale Intensitätssignal in verschiedenen subzellulären Kompartimenten, sondern kann auch verwendet werden, um Brennpunkte zu erkennen und spezifische Informationen über ihre Funktionen zu extrahieren. Abbildung 5a zeigt den Nachweis von P-Körpern in einzelnen Zellen durch Lokalisierung des Enhancers von mRNA-Deapping 4 (EDC4)-Protein. Der Segmentierungsblock A: Nicht gruppierte Objekte wurde verwendet, um Kerne zu segmentieren, die einen niedrigen Clustering-Wert darstellen, den Segmentierung E: Clustered Cytoplasma Block zur Abgrenzung der Zytoplasmen und die Fluoreszenzanalyse C: 2 Kanäle in zwei Kompartimenten, um EDC4-Foci zu erkennen. Segmentierte Objekte werden identifiziert (segmentierte nuclei_0, segmentierte cytoplasms_0) und mehrere Informationen werden in das entsprechende Arbeitsblatt (Segmentierte Kerninformationen und segmentierte Zytoplasmeninformationen) wie die mittlere EDC4-Intensität oder die Anzahl/Größe der erkannten Körper in jedem ROI gesammelt(Abbildung 5b). Vor der Analyse können erkannte Körper vorläufig nach ihrem Bereich gefiltert werden, was nützlich sein kann, um Objekte unterhalb der Auflösungsleistung des Mikroskops auszuschließen. Um die Größe der konservierten Objekte zu schätzen, kann ein zusätzlicher Flächenschwellenwert eingeführt werden. Bereiche aller erkannten Körper werden in dedizierten Arbeitsblättern gemeldet (Segmentierte nuclei_Distribution-Foci-Größe, Segmentierte cytoplasms_Distribution-Foci-Größe). In diesem Beispiel markieren wir die Analyse von zwei Zellen (segmentierte nuclei_0 and_1 und segmentierte cytoplasm_0 and_1), in denen zytoplasmatische EDC4-Brennpunkte nachgewiesen werden. Beachten Sie, dass, obwohl das Signal des EDC4-Proteins sowohl im Kern- als auch im Zytoplasmabereich nachgewiesen wird, nur die zytoplasmatischen Brennpunkte P-Körpern entsprechen. Das Kernsignal resultiert höchstwahrscheinlich aus der Kreuzreaktivität des Antikörpers, der zur Durchführung von Immunfluoreszenzexperimenten verwendet wird. Die Größe in Pixeln der einzelnen Brennpunkte wird angegeben.

Da dann die Wirkung von oxidativem Stress (OS) auf Cajal Bodies noch unbekannt war, nutzten wir die Vielseitigkeit des Workflows, um ihn während der Zeitkinetik zu untersuchen (2 bis 20 Stunden nach OS-Induktion mit 500 'M H₂O₂) (Abbildung 6). Cajal Körper sind dynamische Strukturen nucleating und lösen sich innerhalb des Nukleoplasmas unter der Kontrolle von spezifischen Parametern wie der Transkriptionsrate oder Zellzyklusprogression. Cajal Bodies wurden visualisiert, indem ihre Hauptstruktur- und Funktionskomponente, das Coilin-Protein, lokalisiert wurde. Informationen über die Anzahl und Größe der Cajal-Körper wurden gesammelt, indem 2300 einzelne Zellen aus hochauflösenden Bildern (3840X3072) untersucht wurden, die 3 Kanäle enthielten: DAPI (blau), 53BP1 (grün) und Coilin (rot) (Abbildung 6a). Die vollständige Verarbeitung dauerte weniger als 1 h. Da Kerne eine konvexe Form darstellten und einige von ihnen gruppiert wurden, wurde der Block Segmentierung C: Gruppierte Objekte mit konvexen Formen ausgewählt, um die Segmentierung durchzuführen. Da OS bekannt ist, DNA-Doppelstrangbrüche (DDSBs) zu induzieren, wurde das p53-bindende Protein 1 (53BP1), bekannt als ein wesentlicher Effektor von DNA-Schäden Signalwegen, als Marker verwendet, um zwischen gestressten und nicht beanspruchten Zellen zu unterscheiden. In Ermangelung von DNA-Schäden ist 53BP1 im Nukleoplasma homogen verteilt, während es sich nach DNA-Schäden auf DDSBs konzentriert, die in der Mikroskopie leicht unterscheidbare Brennpunkte bilden. Die Anzahl und die Größe von 53BP1 und Coilin Kernbrenne in jeder Zelle wurden mit dem Block Fluoreszenzanalyse B: 2 Kanäle im selben Fachanalysiert. Erstens half die Analyse von 53BP1-Daten, für jeden Zeitpunkt der Kinetik den besten Schwellenwert für die Klassifizierung von Zellen nach ihrem Stressstatus zu bestimmen. Unter der gesamten Kinetik induziert OS eine signifikante Zunahme der 53BP1-Foci-Zahl mit einer 11-fachen Erhöhung bei 2, 4 und 8 h nach der Induktion von OS (Abbildung S1). Dieser Effekt ist bei 6 h (6,5-fach) aufgrund eines höheren Anfangsniveaus von DSB in nicht beanspruchten Zellen weniger ausgeprägt. Auch nach 20 h bleibt ein anhaltender Anstieg (fast 6-fach). Diese Daten spiegeln die Wirksamkeit der Behandlung wider, um das Betriebssystem zu induzieren und 53BP1 als effizienten Spannungsmarker für frühe und späte Beobachtungen in der Mikroskopie zu etablieren. Auf der anderen Seite wurde ein kleiner Anteil von Gestresstzellen mit einem niedrigen DDSB-Spiegel zu jedem Zeitpunkt der Kinetik beobachtet, was darauf hindeutet, dass Zellen nicht homogen beansprucht werden, was die Bedeutung der Verwendung eines Spannungsmarkers in Stressexperimenten aussetzt. Auf der Grundlage der ROC-Analyse wurde ein Gesamtschwellenwert von 17 53BP1-Brennpunkten ausgewählt, um zwischen gestressten und unbelasteten Zellen in der gesamten Kinetik zu unterscheiden (Abbildung S1).

Dann wurden Anzahl und Größe der Kernbrennpunkte von Coilin entsprechend dem Spannungsstatus der Zelle analysiert. Eine signifikante Zunahme der Anzahl der Brennpunkte wurde 2, 4 und 6 h nach Deronduktion beobachtet (Abbildung 6b). Der nachhaltigste Effekt wird bei 2 h beobachtet, wobei die Anzahl der Zellen mit mehr als 10 Brennpunkten von 0% in den unbelasteten Zellen auf 75% in den gestressten Zellen ansteigt. Darüber hinaus hatten mehr als 25 % der gestressten Zellen zu diesem Zeitpunkt mehr als 20 Coilin-Brennpunkte. Dieser Effekt nimmt schrittweise bis 8 h ab. Bei 20 h wird ein kleiner Anstieg des ersten und des dritten Quartils beobachtet, aber die Daten zeigen auch, dass 84% bzw. 80% der Zellen weniger als 8 Brennpunkte in nicht gestressten und gestressten Zellen aufweisen. Diese Daten zeigen, dass OS hat auch späte Auswirkungen auf Parameter, die die Keimbildung von Cajal Bodies steuern, die sich von frühen Auswirkungen unterscheiden könnte. Interessanterweise ergab eine sorgfältige Analyse der Merkmale der Spulenkernfoien, dass die beobachtete Zunahme der Anzahl der Coilin-Brennpunkte mit einer Abnahme ihrer Größe zusammenfliegt (Abbildung 6c). Zum Beispiel, 2 h nach OS-Induktion, erhöht sich der Anteil der Coilin-Brennpunkte mit einer Fläche von weniger als 0,2^m2 von 26% auf 64%. Dieser Effekt nimmt bis 8 h ab, aber im Gegensatz zur Anzahl der Cajal-Körper wird bei 20 h keine signifikante Veränderung beobachtet. Dies könnte darauf widerschlagen, dass die frühe und späte nukleoplasmatische Umverteilung von Cajal Bodies unterschiedliche Ereignisse sind.

Insgesamt deuten diese Daten stark darauf hin, dass OS die Keimkraft von Cajal Bodies verändert und eine nukleoplasmatische Umverteilung in zahlreiche kleinere Kernbrennpunkte induzieren. Da die Keimbildung von Cajal Bodies durch ihre Protein- und RNA-Komponenten angetrieben wird, deutet dies darauf hin, dass der OS-Effekt die Zusammensetzung von Cajal Bodies verändern könnte. Innerhalb von Cajal Bodies interagiert das Coilin-Protein mit verschiedenen Proteinpartnern wie Komponenten des SMN-Komplexes und Sm-Proteinen. Diese Wechselwirkungen betrafen oft Phosphodomains von Coilin, und man kann sich vorstellen, dass eine Änderung der Struktur von Cajal Bodies mit Veränderungen des Phosphorylierungsstatus von Coilin verbunden sein könnte. Darüber hinaus haben neuere Arbeiten gezeigt, dass Cajal-Körper nicht zufällig innerhalb des Zellkerns lokalisiert sind und die Genexpression durch proximale Assoziation mit bestimmten Gen-Loci¹⁷beeinflussen können. Angesichts all dieser Fakten wäre es nicht verwunderlich, wenn eine Auswirkung auf die Funktionalität der Cajal-Körper Veränderungen in ihrer Struktur mit sich führen würde. Aus diesen Ergebnissen können wir auch fragen, ob die Umgestaltung solcher Cajal Bodies eine passive Folge von OS ist oder an der Reaktion teilnimmt, indem wir beispielsweise mit bestimmten Gen-Loci interagieren.

Um zu testen, ob eine Änderung der Pulsenexpression ihre Lokalisierung verändern und die Keimbildung von Cajal Bodies verändern könnte, haben wir ein exogenes GFP-Coilin-Fusionsprotein überexprimiert. Kerne wurden nicht gruppiert, daher wurde die Segmentierung mit dem Block Segmentierung A: Nicht gruppierte Objektedurchgeführt. Um dann die Anzahl und Größe der Spulenfoien (rotes Signal, Kanal 1) nach dem Niveau des GFP-Spulens (grünes Signal, Kanal 2) Überexpression genau zu quantifizieren, wurde der Block Fluoreszenzanalyse B: 2 Kanäle im selben Fach verwendet. Der Gfksionsgehalt spiegelte sich in der mittleren Intensität des GFP-Signals im einzelnen Kern wider (Abbildung 7a). In Zellen mit mittlerer oder hoher GFP-Spulenüberexpression (GFP-Intensität über 10) erhöht sich die Anzahl der Cajal-Körper pro Kern signifikant, wobei einige Kerne bis zu 21 Brennpunkte aufweisen(Abbildung 7b). Wir bemerkten auch, dass die Helligkeit (mittlere Intensität) von Cajal Bodies erheblich parallel zum Überausdrucksniveau zunimmt, was zu einer Intensitätssättigung führt. Solche gesättigten Regionen könnten somit das Vorhandensein kleinerer und schwächerer Brennpunkte verschleiern. In Zellen, die ein mittleres oder hohes GFP-Pulin überexzättigen, nimmt auch die Größe von Cajal Bodies deutlich zu, wobei die Medianwerte von 1 bis 2 m² ansteigen(Abbildung 7c). Darüber hinaus stellen mehr als 25 % der Zellen mit einem hohen GFP-Pulin-Expressionsniveau Brennpunkte mit einer Fläche von mehr als 2,5^m2dar, während sie in nicht transfizierten Zellen nie 0,8 m² überschreiten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die GfP-Coilin-Überexpression zu einer signifikanten Zunahme sowohl der Anzahl als auch der Größe von Cajal-Körpern führt. Da OS die Anzahl der Cajal-Körper erhöht, aber ihre Größe reduziert, könnten diese Daten widerspiegeln, dass OS-Effekt auf die Struktur von Cajal Bodies höchstwahrscheinlich durch eine Änderung ihrer Zusammensetzung und nicht durch einen Effekt auf die zelluläre Menge von Coilin induziert wird.

Abbildung 1: Die Substruktur Analyzer-Pipeline
Der Workflow wird in Icy, einer offenen Community-Plattform für Bioimage-Informatik, entwickelt und führt die automatische Analyse mehrerer Fluoreszenzmikroskopiebilder durch. Erstens werden Mehrkanalbilder automatisch innerhalb des Protokolls geladen und vorverarbeitet, um bei Bedarf das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und bildgebende Artefakte zu entfernen. Anschließend isoliert die Bildsegmentierung Interessenbereiche (ROIs) vom Hintergrund. Je nach Clusterebene und Art der Objekte stehen verschiedene Segmentierungsmethoden zur Verfügung. Segmentierte Objekte werden mit einem bestimmten Deskriptor (z. B. Image name_Nucleus_1) in einem bestimmten Ordner gespeichert und können für die nachfolgende Analyse verwendet/wiederverwendet werden. Fluoreszierende Signale wie Flecken werden dann innerhalb der ROIs analysiert und mehrere Features (Position, Größe, Form, Intensität, Textur, Spotnummer und Größe) werden in eine automatisch erstellte Kalkulationstabelle exportiert. Alle gemessenen Features, wie die Anzahl der erkannten Punkte, werden dem Deskriptor des entsprechenden ROI gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Grafische Benutzeroberfläche des Eisigen Workflows
(a) Der Workflow besteht aus 13 allgemeinen Blöcken, die nach ihrer allgemeinen Funktion gruppiert werden können: Ordner auswählen (Block 1) ermöglichen den Zugriff auf Bilder; Merge-Kanäle (Block 2) wird verwendet, um verschiedene Kanäle von Bildern zusammenzuführen. Die Blöcke 3 bis 8 sind der Objektsegmentierung gewidmet, wobei jeder für einen bestimmten Kontext angepasst wird: Segmentierung A: Nicht gruppierte Objekte, Segmentierung B: Schlecht gruppierte Objekte, Segmentierung C: Gruppierte Objekte mit konvexen Formen, Segmentierung D: Gruppierte Objekte mit unregelmäßigen Formen (Block 7, arbeitet in Verbindung mit Block 6), Segmentierung E: Clustered Zytoplasmen. Die Blöcke 9 bis 11 werden verwendet, um Brennpunkte innerhalb subzellulärer Kompartimente zu zählen/analysieren: Fluoreszenzanalyse A: 1 Kanal, Fluoreszenzanalyse B: 2 Kanäle im selben Fach und Fluoreszenzanalyse C: 2 Kanäle in zwei Kompartimenten. Die Blöcke 12 und 13 sind für die Analyse von Translokationsereignissen geeignet: Fluoreszenzanalyse D: Globale Translokation und Fluoreszenzanalyse E: Individuelle Zelltranslokation. (b) Globale Darstellung einer Blockarchitektur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zeitbedarf für die Segmentierung in Abhängigkeit von Bildauflösung und Objektclusterebene
(a) Grafische Darstellung der Zeit, die für die Segmentierung je nach Bildauflösung und Clustering-Ebene benötigt wird. Es wurden zwei verschiedene Segmentierungsblöcke getestet: Segmentierung A (für nicht gruppierte Objekte) und Segmentierung D (für gruppierte Objekte mit unregelmäßigen Formen). Die Verarbeitungszeit (in Sekunden pro Bild) wird als Funktion der Bildauflösung (Anzahl der Pixel) dargestellt. (b) Beispiel für Bilder, die entweder mit Segmentierung A oder Segmentierung D-Block analysiert wurden. DAPI-Färbung und segmentierte Kerne sind indiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Workflow-Analyse eines NF-B-Atomtranslokationstests als Reaktion auf tNF-Stimulation
(a) Beispiel für Bilder menschlicher MCF7-Zellen (menschliche Brustadenokarzinom-Zelllinie), die mit TNF aus dem BBBC014-Bildsatz (Broad Bioimage Benchmark Collection)¹²behandelt wurden. Die Lokalisierung des Transkriptionsfaktors NF-B wurde in Zellen untersucht, die mit 12 zunehmenden Konzentrationen von TNF (von 0 bis 10^-7g/ml) behandelt wurden. Für jede Konzentration wurden 4 Replikationen durchgeführt. DAPI-Bilder (blauer Kanal) wurden im Segmentierung C verarbeitet: Gruppierte Objekte mit konvexen Formen blockieren zu Segmentkernen, und dann wurde NF-B-Färbung mit FITC (grüner Kanal) verwendet, um die Zytoplasmen mit dem Segmentierung E: Clustered Zytoplasmablock abzuleiten. Der Fluoreszenzanalyse D: Global Translocation Block wurde verwendet, um die Summe der nuklearen und zytoplasmatischen Pixelwerte zu exportieren. (b) Segmentierte Kerne (grau) und Zytoplasmen (weiß) werden verwendet, um die Gesamtintensität des NF-B-Fluoreszenzsignals in jedem Fach zu bestimmen. (c) Die dosis-Wirkungs-Kurve, die aus der Datenanalyse gewonnen wird, veranschaulicht den Anstieg des Kernanteils der NF-B bei steigender TNF-Konzentration. Die Bilder haben ein 8-Bit-BMP-Format, und die Bildgröße beträgt 1360 x 1024 Pixel. Für jede Konzentration wird die Standardabweichung zwischen den 4 Replikationen berechnet und als Fehlerbalken dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Quantifizierung von EDC4-Brennpunkten (P-Körper) innerhalb des Zytoplasmas in einzelnen Zellen
(a) Co-Färbung mit DAPI (blauer Kanal) und Phalloidin (roter Kanal) ermöglicht die Segmentierung und Identifizierung von Zellkernen bzw. F-Actin. Das EDC4-Protein (grüner Kanal) wird als Marker für den Nachweis von P-Körpern verwendet, von der bekannt ist, dass sie ausschließlich zytoplasmatisch ist. Maßstabsleiste, 10 m . (b) Foci werden gezählt, und mehrere Features (hier ihre Fläche in Pixeln) werden in die Tabelle Ergebnisse exportiert, die in mehreren Blättern strukturiert ist. Zwei Blätter sind der Analyse von Kernen und zwei der Analyse von Zytoplasmen gewidmet. Jede Rohe bettet die Informationen eines bestimmten ROI ein. In Nucleus/Cytoplasma Information sheets werden die Eigenschaften segmentierter Objekte exportiert (ROI-ID, Größe und mittlere Intensität), gefolgt von der Anzahl der erkannten Brennpunkte innerhalb jedes ROI. Bei Bedarf kann ein Größenschwellenwert (in diesem Beispiel 100 Pixel) hinzugefügt werden, und die Anzahl der Brennpunkte unterhalb und oberhalb dieses Schwellenwerts wird in den beiden letzten Spalten gemeldet. In Nucleus/Cytoplasm_Distribution von Brennweiteblättern wird die Fläche (in Pixel) aller erkannten Brennpunkte im Rohformat des entsprechenden ROI gemeldet. In diesem Beispiel markieren wir die Analyse von zwei Zellen (Segmentierte cytoplasm_0 and_1), in denen zytoplasmatische EDC4-Brennpunkte nachgewiesen wurden. Die Größe in Pixeln der einzelnen Brennpunkte wird ebenfalls angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Kinetik von Coilin und 53BP1 nukleoplasmatische Verteilung nach oxidativem Stress
Die Analyse der Anzahl und Größe der Brennpunkte basierte auf mehr als 110 Einzelzellen für jeden Zeitpunkt aus 3 unabhängigen Kinetiken. (a) Immunfluoreszenznachweis von Coilin und 53BP1 Brennpunkten in HeLa S3-Zellen während der Gesamten der Behandlungskinetik mit 500 'M H₂O₂. 53BP1 konzentriert sich auf DNA Double-Strand Break-Standorte und wird verwendet, um die Wirksamkeit der Behandlung an jeder Zelle zu bewerten. Coilin ist in Cajal Bodies angereichert. Die Zellen wurden 2, 4, 6, 8 und 20 h nach oxidativer Stressinduktion fixiert und mit Anti-Coilin-Antikörpern (roter Kanal) und Anti-53BP1 -Antikörpern (grüner Kanal) kogefärbt. Skala bar, 10 m (b) Die Anzahl der Spulen kerntechnischen Brennpunkte nach oxidativem Stress. Die Ergebnisse werden als Boxplots angezeigt, wobei die mittlere Markierung der Median, die unteren und oberen Ränder des Feldes die^25. und^75. Perzentile sind. In Zellen, die mit_H2_O2behandelt werden, wird eine signifikante Erhöhung der Anzahl der Spulen-Brennpunkte nachgewiesen und ist nach 2 und 4 h Behandlung maximal. Wilcoxon - Mann Whitney Testanalyse zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen unbehandelten und H₂O₂ behandelten Zellen (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). (c) Der Anteil der Zellen in funktionärer Spulen-Brennweite (2^). Die meisten Brennpunkte haben eine kleinere Fläche bei 2 h und 4 h Zeitpunkten im Vergleich zur Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Untersuchung der Keimbildung von Cajal Bodies in Zellen, die ein GFP-Coilin-Fusionsprotein überexzessen
(a) HeLa S3-Zellen wurden vorübergehend in biologischen Triplicaten mit 500 ng eines Plasmids transfiziert, das ein GFP-Coilin-Fusionsprotein nach einem Standardverfahren nach den Empfehlungen des Herstellers exzessither ausdrückte. Nach 48 h wurden die Zellen fixiert und mit einem Antikörper gegen Coilin gefärbt. DAPI (blauer Kanal) erlaubt das Segmentieren von Kernen. Für diese Analysen wurden mehr als 100 Zellen analysiert. Das GFP-Signal reflektiert die lokalisierung des ektopischen Coilin-GFP-Proteins (grüner Kanal), während das Coilinsignal (roter Kanal) sowohl der endogeneals als auch der exogenen Proteinlokalisierung entspricht. Für jeden Kern spiegelt die mittlere Intensität des GFP-Signals den Grad der Coilin-Expression wider. Nach diesem Parameter wurden die Merkmale von Coilin-Brennpunkten mit dem Block Fluoreszenzanalyse B: 2 Kanäle im selben Fachanalysiert. Skala bar, 10 m . (b) Verhältnis zwischen der Anzahl der Coilin-Brennpunkte und der mittleren GFP-Intensität pro Kern. Die Ergebnisse werden als Boxplots angezeigt, wobei die mittlere Markierung der Median ist, der untere und obere Rand des Feldes die^25. und^75. Perzentile sind. Wilcoxon - Mann Whitney Testanalyse zeigt eine signifikante Zunahme der Anzahl der Brennpunkte für eine GFP-Intensität >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). (c) Verhältnis zwischen der Spulenfläche und der mittleren GFP-Intensität pro Kern. Die Ergebnisse werden als Boxplots angezeigt, wobei die mittlere Markierung der Median ist, der untere und obere Rand des Feldes die^25. und^75. Perzentile sind. Wilcoxon - Mann Whitney Testanalyse zeigt eine signifikante Zunahme der Fläche der Coilin-Brennpunkte für eine GFP-Intensität >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung S1: Kinetik der 53BP1 nukleoplasmatischen Verteilung nach oxidativem Stress
(a) Quantifizierung von 53BP1 Kernbrennpunkten in unbehandelten oder H₂_O2 behandelten Zellen nach unterschiedlichen Inkubationszeiten. Die Ergebnisse werden als Boxplots angezeigt, wobei die mittlere Markierung der Median ist, der untere und obere Rand des Feldes die^25. und^75. Perzentile sind. Wilcoxon - Mann Whitney Testanalyse zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen unbehandelten und H₂O₂ behandelten Zellen (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). (b) Für jeden Zeitpunkt der Kinetik wurde eine ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) ermittelt, um den besten Schwellenwert für die Unterscheidung zwischen gestressten und nicht beanspruchten Zellen zu bestimmen. Die Parameter jedes Tests werden in der Tabelle gemeldet (Empfindlichkeit, Spezifität, TP: wahr positiv, TN: true negativ, FP: falsch positiv, FN: falsch negativ). Aus diesen Daten wurde eine globale Schwelle von 17 53BP1 brennpunkten bestimmt, um gestresste von nicht beanspruchten Zellen durch die Kinetik zu diskriminieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Für die Analyse von Fluoreszenzzellbildern stehen immer mehr freie Software-Tools zur Verfügung. Benutzer müssen die geeignete Software entsprechend der Komplexität ihres Problems, ihrem Wissen in der Bildverarbeitung und der Zeit, die sie in ihrer Analyse verbringen möchten, richtig auswählen. Icy, CellProfiler oder ImageJ/Fiji sind leistungsstarke Tools, die sowohl Benutzerfreundlichkeit als auch Funktionalität kombinieren³. Icy ist ein eigenständiges Tool, das eine klare grafische Benutzeroberfläche (GUI) und insbesondere seine "Protokolle" Point-and-Click-Schnittstelle präsentiert, durch die Workflows einfach entworfen oder manipuliert werden können⁴. Die Funktionalität dieser Software wird durch die Unterstützung und Verwendung von ImageJ-Plug-Ins verbessert, und eine Menge Dokumentation ist dank seiner großen Community von Benutzern verfügbar. Wir haben diese starke Kombination aus Usability und Funktionalität der Eissoftware verwendet, um den Substructure Analyzer Workflow zu entwickeln. Sein Hauptziel ist es, eine automatisierte Lösung vorzuschlagen, um eine vollständige Analyse des Zellfluoreszenzsignals aus mehreren Bildern durchzuführen. Die Analyse umfasst Bildvorverarbeitung, Objektsegmentierung und fluoreszierende Signalanalyse.

Mehrere Protokolle werden dankbar auf der Icy Website geteilt und schlagen vor, eisige Funktionalitäten zu verwenden, um fluoreszierende Signale wie zelluläre Brennpunkte zu erkennen und zu analysieren. Einige dieser Protokolle verarbeiten jedoch nur ein Abbild pro Ausführung, exportieren die Ergebnisse nicht in eine bestimmte Datei oder analysieren einen einzelnen Kanal. Andere enthalten keine vorläufige Segmentierung, um Interessenbereiche (ROIs) zu bestimmen oder einfache Algorithmen wie "HK-Means" vorzuschlagen, die nicht für die Segmentierung stark gruppierter Objekte geeignet sind. Substructure Analyzer automatisiert alle Schritte der Bildanalyse von der Bildvorverarbeitung über die Segmentierung von Objekten bis hin zur Erkennung/Analyse von Fluoreszenzsignalen. Das Protokoll schlägt auch einfache oder komplexere Methoden für die Objektsegmentierung und den Export der Daten (Namen der segmentierten Objekte, Brennpunkteanalyse) in optimierten, an das Problem angepassten Ausgängen vor. CellProfiler bietet auch leistungsstarke Pipelines aus Modulen an, die die Funktionalitäten¹⁸^,¹⁹kapseln. Die verfügbaren Rohrleitungen sind gut an spezifische Probleme angepasst. Eisige Workflows sind ein Netzwerk aus verschiedenen Boxen, von denen jeder eine bestimmte Aufgabe ausführt. Über die "Protocols"-Schnittstelle sind Boxen, die das Netzwerk verfassen, intuitiv und leicht zu manipulieren. Substructure Analyzer ist an verschiedene Kontexte angepasst, wie das einfache Zusammenführen von Kanälen, die Quantifizierung der Fluoreszenzsignalverteilung zwischen zwei subzellulären Kompartimenten, die Analyse von Brennpunkten in einem oder mehreren Kanälen aus einem oder zwei Zellkompartimenten in einzelnen Zellen. Mehrere Displays ermöglichen die Visualisierung der Zwischenergebnisse während jeder Ausführung, um die Verarbeitung zu steuern. Darüber hinaus stellt Icy Symbolleisten vor, die die Methoden nach Themen gruppieren und von denen aus im Workflow gefundene Funktionen separat bearbeitet werden können, um bestimmte Parameter für einige Bilder manuell zu testen, bevor sie für einen gesamten Bildsatz verwendet werden.

Wie im Bereich der Bioimage-Analyse ist der wichtigste Schritt dieses Protokolls die Objektsegmentierung. Das Protokoll schlägt die Segmentierung von primären Objekten vor, die die meiste Zeit zellkerne sind, und enthält auch einen weiteren Block, der Aufgabe darin besteht, einen zweiten Objekttyp innerhalb der Zelle zu segmentieren. Die Kernsegmentierung kann schwierig sein, wenn die Objekte stark gruppiert sind, sodass sie sich berühren oder überlappen. Je nach Form der Objekte und der Ebene des Clusterings sind im Protokoll verschiedene Alternativen für die Segmentierung von primären Objekten enthalten, auch wenn bisher kein universeller Algorithmuserfolg bei der vollständigen Segmentierung stark gruppierter Objekte vorliegt. Der Segmentierungsprozess wird hauptsächlich durch die Bestimmung korrekter Parameter begrenzt, die einen Teil der Objekte erfolgreich segmentieren könnten, aber zu einer Unter- oder Übersegmentierung eines anderen Teils führen. Der Benutzer müsste verschiedene Durchläufe mit unterschiedlichen Parametern ausführen, um eine endgültige korrekte Segmentierung zu erhalten, insbesondere für gruppierte Objekte, die heterogene und nicht konvexe Formen darstellen.

Dieses Protokoll wird hauptsächlich durch den Segmentierungsschritt eingeschränkt, der sehr zeitaufwändig sein kann und für die komplexesten Fälle eine leistungsstarke Computerkonfiguration benötigt. Genauer gesagt, je zahlreicher oder komplexer die Bilder sind (gruppierte Objekte zu segmentieren, eine hohe Anzahl von Pixeln in den Bildern), desto mehr Zufällig-Zugriff-Speicher (RAM) wird der Benutzer benötigen. Global, für jedes Problem, muss der Benutzer das Protokoll auf einer 64-Bit-Java-Runtime-Umgebung (frei verfügbar auf Java-Website) und ein 64-Bit-Betriebssystem (OS) verwenden, um den verfügbaren Speicher von Icy verwendet zu erhöhen (Speicher ist auf 1300 MB für 32 Bit JRE beschränkt). Aufgrund des Skripts funktioniert das Protokoll auf einem Mac-Computer nicht ordnungsgemäß. Darüber hinaus steigt die Anzahl der Parameter mit der Komplexität des Problems und erfordert mehr Kenntnisse in der Bildanalyse. Was die Funktionskriterien betrifft, so wurde dieses Protokoll noch nicht für die Analyse von gestapelten Bildern (Zeitstapel, Z-Stacks) angepasst, auch wenn Eis effizient Analysen dieser Art von Daten durchführt.

Zukünftige Aktualisierungen werden insbesondere durchgeführt, um die Segmentierung komplexer Clusterobjekte zu verbessern. Zusätzliche Blöcke werden entwickelt, um die Segmentierung an gruppierte zelluläre Strukturen mit unregelmäßigen, nicht konvexen Formen anzupassen. Wir passen den Workflow auch für die Analyse von Zeit und Z-Stacks (für Live-Bildgebung und 3D-Daten) an.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

G.H. wurde durch ein Graduiertenstipendium des Ministére Délégué é la Recherche et aux Technologies unterstützt. L.H. wurde durch ein Graduiertenstipendium des Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL) unterstützt, während Q.T. durch ein öffentliches Stipendium unterstützt wurde, das von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) im Rahmen des zweiten Programms "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (Referenz: ANR-15-RHU4570004) überwacht wurde. Diese Arbeit wurde von CNRS und der Université de Lorraine (UMR 7365) finanziert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells

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References

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Bioengineering

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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