Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, 2Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

אנו מציגים זרימת עבודה זמינה בחופשיות שנבנתה לחיפוש מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתאי תא ספציפיים בתמונות מיקרוסקופית הקרינה. זרימת עבודה ידידותית למשתמש זו מיועדת לתוכנה הפתוחה בקוד הפתוח אייסי ומשתמשת גם בפונקציות ImageJ. הצינור הוא במחיר סביר ללא ידע בניתוח תמונה.

Abstract

העשור האחרון התאפיין בפריצות דרך בטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מומחשות באמצעות שיפור ברזולוציה מרחבית, אלא גם בהדמיית תא חי וטכניקות מיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. זה הוביל לעלייה מתמדת בכמות ובמורכבות של נתוני המיקרוסקופיה לניסוי בודד. מכיוון ניתוח ידני של נתונים מיקרוסקופ הוא זמן רב מאוד, סובייקטיבי, ואוסר ניתוחים כמותיים, אוטומציה של ניתוח bioimage הופך כמעט בלתי נמנע. בנינו זרימת עבודה של אינפורמטיקה שנקראת מנתח מבנה משנה כדי להפוך באופן מלא ניתוח אותות לאוטומטי בתמונות bioimages מיקרוסקופ פלורסנט. זרימת עבודה זו מפותחת בפלטפורמת הקוד הפתוח של המשתמש ומסתיימת בפונקציונליות של ImageJ. היא כוללת את העיבוד מראש של תמונות כדי לשפר את האות ליחס הרעש, פילוח בודדים של תאים (זיהוי של גבולות התא) ואת זיהוי/קוונפיקציה של גופי תא מועשר בתאי תאים ספציפיים. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא להציע פונקציונליות ביו-הדמיה מורכבת למשתמשים ללא התמחות בניתוח תמונה באמצעות ממשק ידידותי למשתמש. יתר על כן, הוא מודולרי מאוד ומותאם למספר סוגיות מתוך אפיון טרנסלוקציה גרעינית/cytoplasmic לניתוח השוואתי של גופי תאים שונים במבנים סלולריים שונים. הפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחש דרך המחקר של הגופים Cajal (מפותל) תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. נתונים ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראים כי היושרה שלהם בתאים אנושיים מושפע כמה שעות לאחר אינדוקציה של מערכת ההפעלה. אפקט זה מאופיין על ידי ירידה של לאסוף את הנוקלאוציה לתוך הגופים Cajal אופייני, הקשורים עם הפצה מחודש של הצמדה של האוסף לתוך מספר גדל של foci קטן. התפקיד המרכזי של הרכב בבורסה בין רכיבי CB לבין הנואופלזמה מרמז כי מערכת ההפעלה הנגרמת מהפצה מראש של האוסף עלולה להשפיע על הקומפוזיציה ועל הפונקציונליות של Cajal הגופים.

Introduction

מיקרוסקופ אור, במיוחד יותר, מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית חזקים ומגוונים בשימוש נפוץ במדעי הביולוגיה. הם נותנים גישה ללוקליזציה מדויקת של biomolecules שונים כמו חלבונים או RNA באמצעות תיוג פלורסנט ספציפי שלהם. העשור האחרון התאפיין בהתקדמות מהירה בטכנולוגיות המיקרוסקופיה והדמיה כפי שמעידים על ידי פרס נובל לכימיה ב-2014 בשנת, הענקת אריק באזיג, סטפן ויליאם א. מוינר לפיתוח מיקרוסקופ הקרינה הסופר-מפוענח (SRFM)1. SFRM עוקף את המגבלה העקיפה של מיקרוסקופ אופטי מסורתי כדי להביא אותו לתוך הננו-ממד. שיפור בטכניקות כגון הדמיה חיה או גישות לסינון תפוקה גבוהה גם מגביר את הכמות ואת מורכבות הנתונים לטיפול בכל ניסוי. רוב הזמן, החוקרים מתמודדים עם אוכלוסיות הטרוגנית גבוהה של תאים ורוצה לנתח פנוטיפים ברמה תא יחיד.

בתחילה, ניתוחים כגון ספירת וקדי בוצעו על ידי עין, אשר מועדף על ידי כמה חוקרים שכן הוא מספק שליטה ויזואלית מלאה על תהליך הספירה. עם זאת, ניתוח ידני של נתונים כאלה ארוך מדי, מוביל לשונות בין משקיפים, ואינו מספק גישה לתכונות מורכבות יותר כך שגישות באמצעות מחשב הופכות לשימוש נרחב וכמעט בלתי נמנע2. שיטות האינפורמטיקה של bioimage מגדילות באופן משמעותי את היעילות של ניתוח נתונים וחופשיות מהמסובייקטיביות הבלתי נמנעים ומהתטיות הפוטנציאליות של ניתוח הספירה הידנית. הביקוש המוגבר בתחום זה ושיפור כוח המחשב הובילו לפיתוח מספר רב של פלטפורמות ניתוח תמונה. חלקם זמינים באופן חופשי ומעניקים גישה לכלים שונים לביצוע ניתוח עם מחשבים אישיים. סיווג של כלי גישה פתוחה הוקמה לאחרונה3 ו מציג אייסי4 כמו תוכנה רבת עוצמה המשלבת שימושיות ופונקציונליות. יתר על כן, הקרח יש את היתרון של תקשורת עם ImageJ.

עבור משתמשים ללא מומחיות ניתוח תמונה, המכשולים העיקריים הם לבחור את הכלי המתאים בהתאם לפרמטרים בעייתיים כראוי המנגינה כי הם לעתים קרובות לא מובנים היטב. יתר על כן, זמני ההתקנה הם לעתים קרובות ארוך. אייסי מציע ממשק ידידותי למשתמש נקודה-and-לחץ בשם "פרוטוקולים" כדי לפתח זרימת עבודה על ידי שילוב כמה התוספים שנמצאו בתוך אוסף ממצה4. עיצוב מודולרי גמיש וממשק נקודת-ולחיצה להפוך את הגדרת ניתוח ריאלי עבור שאינם מתכנתים. כאן אנו מציגים זרימת עבודה בשם מנתח מבנה משנה, שפותחה בממשק של קרח, שתפקידו לנתח אותות פלורסנט בתאים סלולריים ספציפיים למדוד תכונות שונות כמו בהירות, מספר וקדי, גודל וקדי, והפצה מרחבית. זרימת עבודה זו מטפלת במספר בעיות כגון כימות הטרנסלוקציה של האות, ניתוח של תאים מזוהמים המבטא כתב פלורסנט, או ניתוח של וקדי ממבני משנה סלולריים שונים בתאים בודדים. הוא מאפשר את העיבוד הסימולטני של תמונות מרובות, ותוצאות הפלט מיוצאות לגליון עבודה המופרד בטאבים שניתן לפתוח בתוכניות גיליון אלקטרוני נפוצות.

צינור מנתח מבנה משנה מוצג באיור 1. ראשית, כל התמונות הכלולות בתיקיה שצוינה מעובדות מראש כדי לשפר את האות שלהם ליחס הרעש. שלב זה מגדיל את היעילות של השלבים הבאים ומקטין את זמן הריצה. לאחר מכן, אזורי הריבית (ROIs), המתאימים לאזורי התמונה שבהם יש לזהות את אות הפלורסנט, מזוהים ומחולקים. לבסוף, אות הפלורסנט מנותח והתוצאות מיוצאות לגליון עבודה מופרד באמצעות טאבים.

פילוח של אובייקט (זיהוי גבולות) הוא הצעד המאתגר ביותר בניתוח תמונה, והיעילות שלה קובעת את הדיוק של מדידות התא המתקבלות. האובייקטים הראשונים המזוהים בתמונה (המכונים אובייקטים ראשוניים) הם לעתים קרובות גרעינים מדימויים מוכתמים DNA (DAPI או כתמים), אם כי אובייקטים ראשוניים יכולים להיות גם תאים שלמים, חרוזים, ספאקלס, גידולים, או כל חפץ מוכתם. ברוב התמונות, התאים או הגרעינים הביולוגיים נוגעים זה בזה או חופפים הגורמים לאלגוריתמים פשוטים ומהירים להיכשל. עד היום, אין אלגוריתם אוניברסלי יכול לבצע פילוח מושלם של כל האובייקטים, בעיקר בגלל המאפיינים שלהם (גודל, צורה, או מרקם) לווסת את היעילות של פילוח5. כלי הפילוח המופצים בדרך כלל עם תוכנות מיקרוסקופית (כגון תוכנת הדמיה של המכונות המולקולריות על-ידי מכשירים מולקולריים6, או התוכנה המתקדמת בתחום המחקר של ניקון7) מבוססות בדרך כלל על טכניקות סטנדרטיות כגון התאמת מתאם, סף או פעולות מורפולוגיות. למרות היעילות במערכות בסיסיות, שיטות מוגדרות מאוד אלה מציגות במהירות מגבלות כאשר נעשה בהן שימוש בהקשרים מאתגרים ומדויקים יותר. ואכן, פילוח הוא רגיש מאוד לפרמטרים ניסיוניים כגון סוג תא, צפיפות תאים או סמנים, ולעתים קרובות דורש התאמה חוזרת עבור ערכת נתונים גדולה. זרימת העבודה של מנתח מבנה המשנה משלבת אלגוריתמים פשוטים ומתוחכמים יותר כדי להציע חלופות שונות המותאמות למורכבות התמונה ולצורכי המשתמש. זה בעיקר מציע את האלגוריתם מבוסס סימן הפרשת הצבע8 עבור אובייקטים באשכולות מאוד. היעילות של שיטת פילוח זו מסתמכת על הבחירה של סמנים בודדים בכל אובייקט. סמנים אלה נבחרים באופן ידני ברוב הזמן כדי לקבל פרמטרים נכונים עבור פילוח מלא, המהווה זמן רב מאוד כאשר משתמשים מתמודדים עם מספר גבוה של אובייקטים. מנתח מבנה משנה מציע זיהוי אוטומטי של סמנים אלה, מתן תהליך רב מאוד יעיל פילוח. פילוח הוא, ברוב הזמן, את השלב המגביל של ניתוח תמונה והוא יכול לשנות במידה ניכרת את זמן העיבוד בהתאם לרזולוציה של התמונה, מספר האובייקטים לכל תמונה, והרמה של קיבוץ של אובייקטים. קווי צינורות טיפוסיים דורשים מספר שניות עד 5 דקות לכל תמונה במחשב שולחני רגיל. ניתוח של תמונות מורכבות יותר יכול לדרוש מחשב חזק יותר וכמה ידע בסיסי בניתוח תמונה.

הגמישות והפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחשות עם דוגמאות שונות בתוצאות הנציגים. היתרונות של זרימת עבודה זו מוצגים בעיקר באמצעות המחקר של מבני משנה גרעינית תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. מערכת ההפעלה מקבילה חוסר איזון של הומאוסטזיס החמצון לטובת חמצון והוא קשור עם רמות גבוהות של מינים חמצן תגובתי (ROS). מאז רוס לפעול כמו מולקולות איתות, שינויים בריכוז שלהם לוקליזציה subcellular להשפיע באופן חיובי או שלילי מספר עצום של מסלולים ורשתות המסדירים פונקציות פיזיולוגיות, כולל התמרה אותות, מנגנוני תיקון, ביטוי גנים, מוות תאים, והתפשטות9,10. מערכת ההפעלה היא אפוא מעורב ישירות בפתווגיות שונות (נוירוניווניות ומחלות לב וכלי דם, סרטן, סוכרת, וכו '), אלא גם הזדקנות תאית. לכן, פענוח ההשלכות של מערכת ההפעלה על הארגון של התא האנושי ותפקוד מהווה צעד מכריע בהבנת התפקידים של מערכת ההפעלה בתחילת ופיתוח של הפתווגיות האדם. הוא הוקם כי מערכת ההפעלה מווסת ביטוי גנים על ידי שעתוק מודולים דרך מספר גורמים שעתוק (p53, Nrf2, FOXO3A)11, אבל גם על ידי השפעה על הרגולציה של מספר תהליכים שיתוף ושלאחר ההמרה כגון שחבור חלופיים (as) של טרום rnas12,13,14. שחבור אלטרנטיבי של קידוד ראשוני התעתיקים שאינם קידוד הוא מנגנון חיוני המגביר את קיבולת הקידוד של הגנום על ידי הפקת תעתיק. כפי שהוא מבוצע על ידי מורכב מסובך גדול הנקרא מתחת לפני הזמן, המכיל כמעט 300 חלבונים ו 5 U-עשיר גרעיני קטן RNAs (UsnRNAs)15. הרכבה ספצאומין וכמו הם נשלט באופן הדוק בתאים וכמה צעדים של התבגרות מלבין מתרחשים בתוך תאים גרעיניים פחות ממברנה בשם Cajal גופים. מבני המשנה הגרעיניים הללו מאופיינים באופי הדינמי של המבנה שלהם ובקומפוזיציה שלהם, אשר מתנהלים בעיקר על ידי אינטראקציות רב-הדדיות של רכיבי ה-RNA והחלבון שלהם עם האוסף החלבונים. ניתוח של אלפי תאים עם זרימת העבודה של מנתח מבנה משנה מותר לאפיון של השפעות מעולם לא תיאר של מערכת ההפעלה על Cajal גופים. אכן, השיג נתונים מראים כי מערכת ההפעלה משנה את התגרלות של Cajal הגופים, גרימת הפצה משנה של היווצרות החלבון לתוך foci גרעיני קטן. שינוי כזה של מבנה של הגופים Cajal עלול להשפיע על ההבשלה של הספצאוחלק ולהשתתף אפנון כמו מערכת ההפעלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הדרכות ידידותיות למשתמש זמינות באתר האינטרנט של אייסי http://icy.bioimageanalysis.org.

1. הורד אייסי ואת פרוטוקול מנתח מבנה משנה

  1. הורד אייסי מהאתר קרח (http://icy.bioimageanalysis.org/download) ולהוריד את מבנה המשנה פרוטוקול מנתח : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
    הערה: אם אתה משתמש בערכת הפעלה של 64 סיביות, הקפד להשתמש בגירסת 64 הסיביות של Java. גרסה זו מאפשרת להגדיל את הזיכרון המוקצה קרח (העדפות | כללי | זיכרון מרבי).

2. פתיחת הפרוטוקול

  1. פתח אייסי ולחץ על כלים בתפריט רצועת הכלים .
  2. לחץ על הפרוטוקולים כדי לפתוח את ממשק עורך הפרוטוקולים .
  3. לחץ על טען ופתח את מנתח מבנה משנההפרוטוקול. טעינת פרוטוקול יכולה. להימשך מספר שניות ודא שפתיחת הפרוטוקול הושלמה לפני השימוש בו.
    הערה: זרימת העבודה מורכבת מ -13 בלוקים כלליים המוצגים באיור 2a. כל בלוק פועל כצינור המורכב ממספר תיבות ביצוע תת פעילויות ספציפיות.

3. אינטראקציה עם זרימת העבודה על אייסי

הערה: כל בלוק או תיבה ממוספרים ומכיל דירוג מסוים בתוך זרימת העבודה (איור 2b). על-ידי לחיצה על מספר זה, המיקום הקרוב ביותר האפשרי לראשון מוקצה לבלוק/תיבת שנבחרו ואז את המיקום של בלוקים אחרים/תיבות מאורגן מחדש. כבד את הסדר הנכון של הבלוקים בעת הכנת זרימת העבודה. לדוגמה, גלאי ספוט לחסום צריך ROIs מוגדר מראש כך בלוקים פילוח יש להפעיל לפני בלוקים גלאי ספוט. אל תשנה את מיקום התיבות. אין להשתמש ב-"." בשם התמונה.

  1. על-ידי לחיצה על סמל הפינה השמאלית העליונה, התמוטטות, הרחבה, הגדלה, צרה או הסרת הבלוק (איור 2b).
  2. כל צינור של זרימת העבודה מאופיין ברשת של תיבות המחוברות דרך הקלט והפלט שלהם (איור 2b). כדי ליצור חיבור, לחץ על הפלט ותחזק עד שהסמן יגיע לקלט. ניתן להסיר חיבורים על-ידי לחיצה על תג הפלט .

4. מיזוג ערוצי תמונה

  1. השתמש בבלוק מיזוג ערוצים כדי ליצור תמונות ממוזגות. במקרה הצורך, שנה את שם הקבצים כך שרצפים שימוזגו יהיו בעלי הקידומת של אותו שם ואחריו מפריד נפרד. לדוגמה, רצפים של ערוצים בודדים מתמונה A נקראים בשם: ImageA_red, ImageA_blue.
    הערה: עבור המפריד, אל תשתמש בתווים שכבר קיימים בשם התמונה.
  2. באותה תיקיה, צור תיקיה חדשה אחת לכל ערוץ למיזוג. לדוגמה, כדי למזג ערוצים אדומים, ירוקים וכחולים, צור 3 תיקיות ואחסן את הרצפים המתאימים בתיקיות אלה.
  3. השתמש רק בערוצי המיזוגשל הבלוק, הסר את הבלוקים האחרים ושמור את הפרוטוקול כערוצי מיזוג.
    1. גש לתיבות כדי להגדיר פרמטרים. עבור כל ערוץ, למלא את הארגזים מספר ערוץ x (תיבות 1, 5 או 9), מספר ערוץ התיקייה x (תיבות 2, 6 או 10), ערוץ המפריד x (תיבות 3, 7 או 11) ו- מפת colormap nb x (תיבות 4, 8 ו-12) בהתאמה.
      הערה: תיבות אלה מקובצות אופקית לפי ארבעה, כל שורה התואמת לאותו ערוץ. בכל שורה, תצוגה זמינה גם (תיבות 23, 24, או 25) כדי להמחיש באופן ישיר את הרצף של הערוץ המתאים.
      1. בתיבה מספר ערוץ X, לבחור איזה ערוץ לחלץ (בתמונות RGB קלאסית, 0 = אדום, 1 = ירוק, 2 = כחול). המשתמש ניגש במהירות לערוצים השונים של תמונה בתוך חלון המפקח של אייסי, בכרטיסיה רצף . כתוב את ערך הערוץ הקטן ביותר בשורה העליונה ואת הגבוהה ביותר בשורה התחתונה.
      2. בתיבה מספר ערוץ x, כתוב \ שם התיקייה המכילה תמונות של ערוץ X.
      3. בערוץ המפרידשל התיבה X, כתוב את המפריד המשמש עבור שם התמונה (בדוגמה הקודמת: "_red", "_green" ו-"_blue").
      4. בתיבה מיפוי צבעים ערוץ Nb X, ציין עם מספר שבו מודל מיפוי צבעים להשתמש כדי להמחיש את הערוץ המתאים בקרח. מפות הצבעים הזמינות גלויות בכרטיסיית הרצף של חלון המפקח .
      5. בתבנית התיבה של תמונות ממוזגות (תיבת 28), כתוב את ההרחבה כדי לשמור תמונות ממוזגות:. tif,. gif,. jpg,. bmp או. png.
        הערה: כדי למזג 2 ערוצים בלבד, אל תמלא את ארבע התיבות המתאימות לערוץ השלישי.
    2. בפינה השמאלית העליונה של בלוק מיזוג ערוצים , לחץ על הקישור ישירות לימין התיקיה. בתיבת הדו פתיחה שמופיעה, לחץ פעמיים על התיקיה המכילה רצפים של הערוץ הראשון שהוגדר בערוץ תיקיית התיבה מספר 1 (תיבת 2). לאחר מכן, לחץ על פתח.
    3. הפעל את הפרוטוקול על-ידי לחיצה על החץ השחור בפינה השמאלית העליונה של בלוק מיזוג ערוצים (ראה חלק 7 לפרטים נוספים). תמונות ממוזגות נשמרות בתיקיית מיזוג באותה ספריה כמו התיקיות של ערוצים בודדים.

5. פילוח אזורי העניין

הערה: מנתח מבנה משנה משלב אלגוריתמים פשוטים ומתוחכמים יותר כדי להציע חלופות שונות המותאמות למורכבות התמונה וצרכי המשתמש.

  1. בחר את הבלוק המותאם.
    1. אם אובייקטים אינם נוגעים זה בזה, או שהמשתמש אינו צריך להבדיל בין אובייקטים באשכולות בנפרד, השתמש בבלוק פילוח A: אובייקטים שאינם מקובצים באשכולות.
    2. כאשר אובייקטים אינם נוגעים זה בזה, אך חלק מהם קרובים, השתמש באפשרות הבלוק פילוח B: אובייקטים לא מקובצים באשכולות.
    3. עבור אובייקטים עם רמת אשכול גבוהה וצורה קמורה, השתמש באפשרות הבלוק פילוח C: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות קמורה.
    4. אם האובייקטים מציגים רמת אשכול גבוהה ובעלי צורות לא סדירות, השתמש בפלח הבלוק D: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות לא סדירות.
    5. השתמש בבלוק פילוח E: באשכולות ציטופלסמה לפלח לגעת cytoplasms בנפרד באמצעות גרעיני מקוטע כמו סמנים. כדי לעבד את החסימה צריך לעכל גרעינים מקוטע.
      הערה: בלוקים המותאמים לתהליך פילוח של אובייקט ראשי באופן עצמאי כך שניתן להשתמש במספר בלוקים באותה הפעלה כדי להשוות את היעילות שלהם למבנה משנה מסוים או לפלח סוגים שונים של מבני משנה. אם רמת האשכולות היא הטרוגנית בתוך אותה קבוצה של תמונות, לאחר מכן לעבד אובייקטים קטנים ומקובצים באשכולות בנפרד בבלוקים המותאמים.
  2. קשר את output0 (קובץ) של הבלוק בחר תיקיה לקלט התיקיה של בלוק הפילוח שנבחר.
  3. הגדר פרמטרים של בלוק הפילוח שנבחר.
    1. פילוח A: אובייקטים שאינם מקובצים באשכולות ופילוח C: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות קמורה
      1. בתיבה אות ערוץ (תיבת 1), הגדר את הערוץ של האובייקטים לפלח.
      2. כאפשרות, במסנן גאוס של התיבה (תיבה 2), הגדל את ערכי ה-X ו-Y סיגמא אם האות בתוך אובייקטים הוא הטרוגנית. המסנן ' גאוס ' מחליק מרקמים כדי להשיג אזורים אחידים יותר ומגביר את המהירות והיעילות של פילוח של גרעינים. ככל שהאובייקטים קטנים יותר, כך ערך הסיגמא נמוך יותר. הימנע מערכי סיגמא גבוהה. הגדר ערכי ברירת מחדל ל-0.
      3. ב -HK-אמצעי (תיבת 3), הגדר את הפרמטר מחלקות אינטנסיביות ואת הגדלים המינימלי והמקסימלי המשוער (בפיקסלים) של אובייקטים להתגלות.
        הערה: עבור מחלקות אינטנסיביות, ערך של 2 מסווג פיקסלים ב-2 מחלקות: רקע וקידמה. הוא מותאם אפוא כאשר הניגוד בין האובייקטים והרקע הוא גבוה. אם לאובייקטי קידמה יש עוצמות שונות או אם הניגודיות עם הרקע נמוכה, הגדילו את מספר המחלקות. הגדרת ברירת המחדל היא 2. גודל האובייקט ניתן להעריך במהירות על-ידי ציור ROI באופן ידני סביב אובייקט הריבית. גודל ההחזר (הפנים בפיקסלים) מופיע ישירות על התמונה בעת הצבעה עם הסמן או שניתן לגשת אליו בחלון הסטטיסטיקה של ROI (לפתוח אותו מסרגל החיפוש). פרמטרים אופטימליים מזהים כל אובייקט בקידמה ב-ROI יחיד. הם יכולים להיות מוגדרים באופן ידני ב אייסי (איתור ומעקב | HK-אמצעים).
      4. בתיבה מתארי פעיל (תיבת 4), מטב את הזיהוי של גבולות האובייקט. תיעוד ממצה עבור תוסף זה זמין באינטרנט: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. ניתן גם להגדיר את הפרמטרים הנכונים ב-אייסי (איתור ומעקב | מתארי פעיל).
      5. במהלך התהליך, תיקיה נוצרת באופן אוטומטי כדי לשמור תמונות של אובייקטים מקוטע. בתיבה טקסט (תיבת 6), שם תיקיה זו (ex: גרעינים מקוטע). כדי להגדיר את הפורמט עבור שמירת תמונות של אובייקטים מקוטע (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), למלא את תבנית התיבה של תמונות של אובייקטים מקוטע. התיקיה נוצרת בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות.
      6. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7).
    2. פילוח ב': אובייקטים המקובצים באשכולות
      1. בצע את אותם שלבים כמו ב 5.3.1 כדי להגדיר את הפרמטרים של הסדרה שידור הערוץ, HK-אמצעים, מתארי פעיל, הרחבה כדי לשמור אובייקטים מקוטע וטקסט (שורות תיבות אינן זהות כמו בשלב 5.3.1).
      2. בתיבה CALL IJ plugin (תיבת 4), הגדר את הפרמטר מתגלגל כדי לשלוט בחיסור הרקע. הגדר פרמטר זה כ-לפחות בגודל האובייקט הגדול ביותר שאינו חלק מהרקע. הפחתת ערך זה מגבירה את הסרת הרקע, אך יכולה גם לגרום לאובדן של אות קידמה.
      3. בתיבה הפחתת היסטוגרמה אדפטיבית (תיבת 6), שיפור הניגודים בין אובייקטי הקידמה לבין הרקע. הגדלת השיפוע נותן יותר רצפים בניגוד.
      4. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7).
    3. פילוח D: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות לא סדירות
      הערה: שלוש שיטות שונות של פילוח חלים על כל תמונה: ראשית,HK-פירושו אשכוליחד עם השיטת המתאר הפעילמוחל. לאחר מכן, האלגוריתם פרשת השבעת(שימוש במפת המרחק Euclidian) מוחל על עצמים שאינם מחולקים קודם לכן. לבסוף,אלגוריתם פרשת שתים מבוסס-סמןמשמש. רק HK-אמצעים ומבוססי סמן שיטות פרשת הדרכים צריך התערבות המשתמש. עבור שתי השיטות, ניתן להחיל את אותם הפרמטרים עבור כל התמונות (הגירסה האוטומטית המלאה) או לשנות עבור כל תמונה (גירסה למחצה אוטומטית). אם המשתמש אינו מאומן בשיטות פילוח אלה, העיבוד האוטומטי למחצה מומלץ מאוד. במהלך העיבוד של בלוק זה, נדרשת התערבות ידנית. כשמסתיים שיטת פילוח, על המשתמש להסיר באופן ידני אובייקטים לא מקוטעת לפני תחילת שיטת הפילוח הבאה. אובייקטים מקוטעת בהצלחה נשמרים ולא נחשבים בשלבים הבאים. הבלוק הזה צריך להיות מקושר עם הבלוקבאשכולות/הטרוגנית צורות אובייקטים ראשוניים פילוח תיבת הדולפעול כראוי.
      1. הורד את אוסף ה-ImageJ ב- https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. הגירסה ה1.4.0 מורורליג'י משמשת בפרוטוקול זה. מקם את הקובץ MorphoLibJ_-1.4.0. jar בתיקיה קרח/ij/תוספים. מידע נוסף אודות התוכן של אוסף זה זמין ב -https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. בצע את אותם שלבים כמו בשלב 5.3.1 כדי להגדיר פרמטרים של שידור בתיבות הערוץ, מסנן גאוס, מתארי פעיל, הרחבה כדי לשמור אובייקטים מקוטע וטקסט. שורות תיבות אינן זהות לאלה שבשלב 5.3.1.
      3. קבעו פרמטרים לקיזוז ההיסטוגרמה של התיבה (ראו step 5.3.2.3).
      4. כדי להפעיל את הפחת רקע, כתוב כן בהחלת הפחתה ברקע? (תיבת 5). . אחרת, תכתוב לא אם התוסף מופעל, הגדר את הפרמטר המתגלגל (ראה step 5.3.2), בתיבה הפחת רקע (תיבת 7).
      5. אוטומציה של HK-אמצעים: כדי להחיל את אותם הפרמטרים עבור כל התמונות (עיבוד אוטומטי מלא), הגדר את ה- Nb של מחלקות (תיבת 11), את הגודל המינימלי (תיבת 12) ואת הגודל המירבי (box13) (ראה שלב 5.3.1). יש להגדיר פרמטרים אלה כדי לבחור מקסימום פיקסלים בחזית ולמטב את האינדיבידואליזציה של אובייקטי הקידמה. עבור גירסת העיבוד האוטומטית למחצה, אין צורך בהתערבות.
      6. אוטומציה של שאיבת הסמן: לגרסה האוטומטית לחלוטין, להרחיב את התיבה מיצוי סמנים פנימיים (תיבת 27) ולהגדיר את הערך של הפרמטר "דינמי" בשורה 13 של הסקריפט. עבור גירסת העיבוד האוטומטית למחצה, אין צורך בהתערבות.
        הערה: סמנים מחולצים על-ידי החלת המרה מורחבת-minima בתמונת קלט הנשלטת באמצעות פרמטר "דינאמי". באלגוריתם פרשת הסיביות המבוסס על סמן, ההצפה מסמנים אלה מדומה לביצוע פילוח של אובייקטים. לצורך פילוח מוצלח של אובייקטי קידמה, יש לחלץ סמן אחד לכל אובייקט בקידמה. ההגדרה של הפרמטר "dynamic" להפקת סמנים אופטימלית תלויה בעיקר ברזולוציה של תמונות. לכן, אם אינך מכיר פרמטר זה, השתמש בגירסה האוטומטית למחצה.
      7. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7).
      8. בתחילת העיבוד, תיבות דו-שיח HK-אמצעים הפרמטרים מבוססי סמן פרשת הדרכים פתוח ברציפות. כדי להחיל את אותם הפרמטרים עבור כל התמונות (הגירסה האוטומטית לחלוטין), לחץ על כן. אחרת, לחץ על לא. תיבת מידע נפתחת, לבקש "לקבוע ROIs אופטימלית עם ה-HK-משמעותו תוסף ותמונת סגירה". לחץ על אישור ובאופן ידני להחיל את HK-אמצעי Plugin (איתור ומעקב| HK-פירושו) בתמונה, שנפתחת באופן אוטומטי. בחרו באפשרות ' ייצוא ROIs ' בתיבת התוסף ' הכוונה ל-HK '. החל את הפרמטרים הטובים ביותר שיש ל-ROIs המכיל מקסימום פיקסלים בקידמה וכלה במיטוב האינדיבידואליזציה של אובייקטי הקידמה. כאשר נמצא ROIs אופטימלי, לסגור ישירות את התמונה.
      9. בסוף שיטת הפילוח הראשון, תיבת מידע נפתחת ומבקשת "להסיר ROIs לא רצויות ותמונה קרובה". ROIs אלה מקבילים לגבולות של האובייקטים מקוטע. בחר ב'אישור ' והסר את rois של אובייקטים שאינם מקוטע בתמונה, הנפתחים באופן אוטומטי. ניתן להסיר ROI בקלות על-ידי הצבת הסמן על הגבול שלו ושימוש בלחצן "Delete" של המקלדת. סגור את התמונה. חזור על אותו ההליך לאחר השלמת שלב הפילוח השני.
      10. בשלב זה, אם לחצן YES נבחר עבור האוטומציה המלאה של האלגוריתם המבוסס על סמן הפרשת הצבע, הפרמטרים שהוגדרו קודם לכן יוחלו על כל התמונות.
      11. אם הלחצן לא נבחר, ייפתח תיבת מידע ותבקש "לקבוע ולהתאים סמנים פנימיים". לחץ על אישור ובתוך הממשק imagej של אייסי, עבור תוספים | מורורליג'יי | Minima ו מקסימה| מינימום המורחבת &Amp; מקס. בפעולה, בחר ב- Minima מורחבת.
      12. בחרו ' תצוגה מקדימה ' כדי להמחיש מראש בתמונה שנפתחה אוטומטית כתוצאה מהשינוי. הזז את הדינמיקה עד לסימון הסמנים האופטימליים. סמנים הם קבוצות של פיקסלים עם ערך של 255 (לא בהכרח פיקסלים לבנים). פרמטרים אופטימליים מובילים לסמן אחד לכל אובייקט. התמקד באובייקטים שנותרו שלא מחולקים היטב עם שתי השיטות הקודמות של פילוח.
      13. במידת הצורך, שיפור הסמנים על-ידי החלת פעולות מורפולוגיות נוספות כמו "פתיחה" או "סגירה" (תוספים | מורורליג'יי | מסננים מורפולוגיים). בעת קבלת התמונה הסופית של סמנים, להשאיר אותו פתוח ולסגור את כל התמונות האחרות המסתיימים בתמונה במקור משמש כקלט עבור הפעולה מורחבת המורחבת . לחץ על לא אם התיבה imagej מבקשת לשמור שינויים בתמונה.
      14. בתיבה Nb של תמונות עם תיבת מידע (תיבת 14), קבע כמה תמונות עם תיבות מידע אמורות להופיע.
    4. פילוח ה: ציטופלסמה באשכולות
      הערה: בלוק זה משתמש בגרעין מקוטע בעבר כסמנים בודדים כדי ליזום פילוח ציטופלסמה. ודא שגוש הגרעין של פילוח עובד לפני השימוש בו.
      1. בתיבה ציטופלסמה ערוץ (קופסה 1), הגדר את הערוץ של האות cytoplasmic.
      2. בהרחבה התיבה גרעינים מקוטע (תיבת 2), לכתוב את הפורמט המשמש לשמירת תמונות של גרעיני מקוטע (טיף, jpeg, bmp, png). תבנית ברירת המחדל היא tif.
      3. בתיבה טקסט (box3), כתוב את \Tolename של התיקייה המכילה גרעינים מקוטע.
      4. בתבנית תיבת תמונות של cytoplasms מקוטע (תיבת 4), להגדיר את הפורמט לשימוש עבור שמירת אובייקטים מקוטע תמונות (Tiff, Gif, JPEG, BMP, PNG).
      5. במהלך התהליך, תיקיה נוצרת באופן אוטומטי כדי לשמור תמונות של cytoplasms מקוטע. בתיבה טקסט (קופסה 5), שם תיקיה זו (ex: cytoplasms). התיקיה נוצרת בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות.
      6. בצע את אותם שלבים כמו בשלב 5.3.1 כדי להגדיר פרמטרים של מסנן גאוסיאני ומתארי פעיל (להיזהר, דרגות התיבה אינם זהים לאלה בשלב 5.3.1).
      7. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7).

6. זיהוי וניתוח אותות פלורסנט

  1. בחר את הבלוק המותאם.
    1. ב ניתוח הפלואורסצנטית לחסום A: 1 ערוץ, לבצע זיהוי וניתוח של וקדי בערוץ אחד בתוך סוג אחד של אובייקט מקוטע: זיהוי של האוסף וקדי (ערוץ אדום) בתוך הגרעין.
    2. ב בלוק הפלואורסצנטית ניתוח B: 2 ערוצים באותו תא, לבצע זיהוי וניתוח של וקדי בשני ערוצים בתוך סוג אחד של אובייקט מקוטע: זיהוי של האוסף (אדום הערוץ) ו 53bp1 (ערוץ ירוק) וקדי בתוך הגרעין.
    3. ב בלוק הזריחה ניתוח C: 2 ערוצים בשני תאים, לבצע זיהוי וניתוח של וקדי בערוץ אחד או שניים, במיוחד בתוך הגרעינים ואת ציטופלסמה המקביל שלהם: זיהוי של האוסף וקדי (ערוץ אדום) הן בתוך הגרעין ואת הציטופלסמה המקביל שלה או זיהוי של לאסוף וקדי (ערוץ אדום) בתוך הגרעין ו G3BP וקדי (ירוק ערוץ)
    4. ב בלוק הפלואורסצנטית ניתוח D: טרנסלוקציה גלובלית, לחשב את אחוז האות מערוץ אחד בשני תאים סלולריים (a ו-b). לדוגמה, בתוך שיטת הטרנספלסמה/גרעין לאחר הייצוא, לייצא אחוזים מחושבים של אותות גרעיניים ו cytoplasmic עבור כל תמונה בגיליון הסופי "תוצאות". הנוסחה המשמשת לחישוב אחוז האות הגרעיני מוצגת להלן. ניתן להשתמש בבלוק זה עבור כל תא תת-תאי משנה:
      Equation 1
    5. ב לחסום את הזריחה בניתוח E: כדורית תא בודד, לחשב את אחוז האות מערוץ אחד בשני תאים סלולריים עבור כל תא. בלוק זה מותאם במיוחד לגבי הגרעין/הציטופלסמה שיטת ברמה בודדת תא.
      הערה: מכיוון שחסימת הזריחה החוסמת E: טרנסלוקציה תא בודדת מבצעת ניתוח ברמה של תא בודד, פילוח יעיל של הגרעין והציטופלסמה נדרש.
  2. קשר את output0 (קובץ) של הבלוק בחר תיקייה (לחסום 1) לקלט התיקייה (חיצים לבנים בעיגולים שחורים) של הבלוק הנבחר.
  3. הגדר את הפרמטרים של הבלוק הנבחר.
    1. ניתוח פלואורסצנטית A: 1 ערוץ, ניתוח פלואורסצנטית B: 2 ערוצים באותו תא ו ניתוח פלואורסצנטית C: 2 ערוצים בשני תאים
      1. בתיבה תיקיית התמונות ROI, כתוב את שם התיקיה המכילה תמונות של אובייקטים מקוטע שקדמו לו לוכסן אחורי. (לדוגמה: הגרעין המקוכן).
      2. בתבנית תיבת תמונות של אובייקטים מקוטע (תיבת 2), לכתוב את הפורמט המשמש לשמירת תמונות של אובייקטים מקוטע (טיף, jpeg, bmp, png). תבנית ברירת המחדל היא tif.
      3. ? בתיבה הרוג גבולות, כתוב כן כדי להסיר אובייקטי גבול. . אחרת, תכתוב לא ההתקנה של אוסף מורפוליבג של ImageJ נדרש להשתמש בפונקציה זו (ראה שלב 5.3.3).
      4. בתיבה (es) ערוץ כתמים, הגדר את הערוץ שבו יש לזהות את הכתמים. בתמונות RGB קלאסיות, 0 = אדום, 1 = ירוק, ו-2 = כחול.
      5. בתיבות שם של מולקולה שהותאמה לשפות אחרות, כתוב את שם המולקולה המותאמת לנקודות. מספר השדות שיש להזין תלוי במספר המולקולות.
      6. בתיבה (es) אדוה לחסום גלאי ספוט, הגדר פרמטרים של זיהוי ספוט עבור כל ערוץ. הגדר את קנה המידה (המוזכר בגודל ספוט) ורגישות הזיהוי (רגישות קטנה יותר מקטינה את מספר הנקודות שזוהו, ערך ברירת המחדל הוא 100 והערך המזערי הוא 0). תיעוד ממצה של תוסף זה זמין באינטרנט: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. פרמטרים ניתן גם להגדיר באופן ידני ב אייסי (איתור ומעקב | גלאי ספוט).
      7. כאפשרות, ב -מסנן התיבה ROI לפי גודל, לסנן את האובייקטים מקוטע שבו מזוהים כתמים על ידי הגדרת מרווח גודל (בפיקסלים). שלב זה שימושי במיוחד להסרת אובייקטים שמתחת או מקוטע. כדי להעריך באופן ידני את גודל האובייקטים, ראה שלב 5.3.1. פרמטרי ברירת המחדל אינם כוללים את הסינון של ROIs לפי גודל. הבלוק 2 ערוצים בשני תאים מכיל שתי תיבות: מסנן גרעינים לפי גודל (תיבת 19) ומסנן ציטופלסמה לפי גודל (box 46).
      8. באופן אופציונלי, בתיבה מסנן כתמים לפי גודל, לסנן את הנקודות שזוהו על פי גודלם (בפיקסלים) כדי להסיר פריטים לא רצויים. כדי להעריך באופן ידני את גודל הספוט, לחץ על איתור ומעקב ופתח את תוסף גלאי הספוט . באפשרויות פלט , בחרו ' ייצוא ל-ROI'. היזהר שפרמטרי ברירת המחדל אינם כוללים סינון של נקודות לפי גודל, ושמקומות מסוננים אינם נלקחים בחשבון עבור הניתוח. מספר השדות שיש להזין תלוי במספר הערוצים.
      9. באופן אופציונלי, בנקודות הסינוןשל התיבה, החל מסנן נוסף (ניגודיות, הומוגניות, היקף, המעוגלות) בנקודות שזוהו. היזהר שפרמטרי ברירת המחדל אינם כוללים סינון ספוט וכתמים מסוננים אינם נלקחים בחשבון עבור הניתוח. מספר השדות שיש להזין תלוי במספר הערוצים.
      10. לחלופין, בתיבות הסף של גודל ספוט, הגדר סף עבור האזור (בפיקסלים) של נקודות שנותחו. מספר הנקודות הנספרות מתחת וממעל לסף זה מיוצא בגיליון האלקטרוני של התוצאות הסופיות. מספר התיבות שיש ליידע תלוי במספר הערוצים.
      11. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7). נתונים מיוצאים בגיליון אלקטרוני של תוצאות שנשמר בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות.
    2. ניתוח קרינה פלואורסצנטית D: טרנסלוקציה הכללית וניתוח פלואורסצנטית E: כולל טרנסלוקציה תא בודדים:
      1. בתיבות תמונות של תיקיות (תיבות 1 ו-2), כתוב את \Tolname של התיקיה המכילה תמונות של אובייקטים מקוטע. ב בלוק הפלואורסצנטית ניתוח D: טרנסלוקציה גלובלית, שני סוגים של ROI מזוהים כמו ROI a ו-roi b. עבור בלוק הפלואורסצנטית ניתוח E: כולל טרנסלוקציה תא בודדים, תמונות התיקייה גרעינים מקוטע ותמונות תיקיה תיבות cytoplasms מקוטע , לכתוב את השם של התיקייה המכילה גרעינים מקוטע cytoplasms, בהתאמה.
      2. באות ערוץ התיבה (תיבת 3), הזן את ערוץ האות.
      3. בתבנית תיבת תמונות של אובייקטים מקוטע (תיבת 4), לכתוב את הפורמט המשמש לשמירת תמונות של אובייקטים מקוטע (טיף, jpeg, bmp, png). תבנית ברירת המחדל היא tif. האפשרות ' הרוג גבולות ' זמינה גם להסרת אובייקטי גבול (ראה step 6.3.1).
      4. לחלופין, בתיבות מסנן ROI לפי גודל, לסנן את האובייקטים מקוטע על ידי הגדרת מרווח של גודל (בפיקסלים). שלב זה עשוי להיות שימושי להסרת אובייקטים שמתחת או מקוטע. כדי להעריך באופן ידני את גודל האובייקט, ראה שלב 5.3.1. יש שני שדות להזנה, אחד בכל ערוץ. פרמטרי ברירת המחדל אינם כוללים את הסינון ROI לפי גודל.
      5. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7). ייצוא נתונים בתוצאות גיליון אלקטרוני שנשמרו בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות.

7. הפעל את הפרוטוקול

  1. כדי לעבד בלוק אחד בהפעלה, הסר את החיבור בין הבלוק שנבחר לבין הבלוק בחר תיקיה. הציבו את הרחוב המבוקשבדרגה 1 . בפינה השמאלית העליונה של בלוק המבוקש, לחץ על הקישור ישירות לימין של התיקיה. בתיבת הדו פתיחה שמופיעה, לחץ פעמיים על התיקיה המכילה את התמונות הממוזגות. לאחר מכן, לחץ על פתח. לחץ על הפעלה כדי להפעיל את זרימת העבודה. ניתן לעצור את העיבוד על ידי לחיצה על לחצן עצור .
  2. כדי לעבד בלוקים שונים בריצה, לשמור על החיבורים של בלוקים נבחרים עם בלוק לבחור תיקייה (לחסום 1). ודא שהדירוג שלהם מאפשר עיבוד טוב של זרימת העבודה. לדוגמה, אם בלוק מסוים זקוק לאובייקטים מחולקים לעיבוד, ודא שתהליך החסימה של הפילוח מקודם. לפני הפעלת זרימת העבודה, הסר בלוקים שאינם בשימוש ושמור את הפרוטוקול החדש בשם אחר.
  3. לחץ על הפעלה כדי להפעיל את זרימת העבודה. כאשר תיבת הדו פתוחה מופיעה, לחץ פעמיים על התיקיה המכילה את התמונות הממוזגות. לאחר מכן, לחץ על פתח. זרימת העבודה תופעל באופן אוטומטי. במקרה הצורך, להפסיק את העיבוד על ידי לחיצה על לחצן עצור .
  4. בסוף העיבוד, בדוק שההודעה שבוצעה בוצעה בהצלחה הופיעה בפינה הימנית התחתונה ושכל הבלוקים מסומנים בדגל ירוק (איור 2b). אם לא, הבלוק והתיבה הפנימית המציגים את סימן השגיאה מציינים את האלמנט לתיקון (איור 2b).
    הערה: לאחר שזרימת העבודה בוצעה בהצלחה, לא ניתן להפעיל הפעלה חדשה באופן ישיר ולעבד שוב את זרימת העבודה, לפחות בלוק אחד מסומן בסימן "מוכן לעיבוד". כדי לשנות את מצב הבלוק, מחק וצור מחדש קישור בין שתי תיבות בתוך בלוק זה או פשוט סגור ופתח מחדש את הפרוטוקול. אם מתרחשת שגיאה במהלך העיבוד, ניתן להפעיל הפעלה חדשה ישירות. במהלך הפעלה חדשה, כל גושי הצינור מעובדים, גם אם חלק מהם מסומנים עם השלט הירוק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל הניתוחים שתוארו בוצעו על מחשב נייד רגיל (64 סיביות, ארבע ליבות מעבד ב 2.80 GHz עם 16 GB זיכרון גישה אקראית (RAM)) עבודה עם גירסת 64-bit של Java. זיכרון גישה אקראית הוא פרמטר חשוב שיש לשקול, בהתאם לכמות ולרזולוציה של תמונות לצורך ניתוח. באמצעות גירסת 32-bit של Java מגבילה את הזיכרון כ 1300 MB, אשר יכול להיות בלתי מתאים לניתוח נתונים גדולים, בעוד גרסת 64-bit מאפשר הגדלת הזיכרון המוקצה קרח. איור 3 מדווח על הזמן הדרוש לפילוח עבור סוגים שונים של תמונות ורזולוציות שונות. הוא מאשר כי ברזולוציה גבוהה מגדיל באופן משמעותי את הזמן של פילוח האובייקט העיקרי.

הנתונים המוצגים בפסקאות הבאות מדגימים שניתן להשתמש בזרימת העבודה של מנתח מבנה המשנה כדי לפתור את רוב הבעיות הנפוצות הנתקלות בביולוגיה תאית ומולקולרית (ספירת תאים, ספירת וניתוח של המשך, ניתוח טרנסלוקציה).

מדידה בתאים רבים של החלק המדויק של מולקולות מרוכז בתוך תא נתון או שינוי של לוקליזציה על פני תחומים תת-סלולריים יכולה להיות משימה מסורבלת מאוד ונוטה לשגיאות, במיוחד כאשר הוא מבוצע באופן ידני. איור 4 ממחיש את היכולת של זרימת העבודה במהירות ובדיוק לכמת את הטרנסלוקציה גרעינית מתוארת היטב של שעתוק גורם NFκB בתגובה לגירוי TNFα. תמונות ששימשו לניתוח נאספו באדיבות איליה ראוקין (http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm) וזמינות לציבור באוסף16של בחינת ביצועים רחבים. ערכה זו מכילה תמונות של קווי תא MCF7 ו-A549 שטופלו בריכוזים הגדלים של TNFα. הניתוח בוצע על יותר מ 40,000 תאים ו 96 תמונות (48 תמונות עבור כל ערוץ) מקו התא MCF7 (איור 4a). הניתוח כולו (מתוך ייבוא תמונות לחיסכון בנתונים) לקח 26 דקות. כל תמונה מקבילה לריכוז מסוים של TNFα. הפרופורציות הגרעיניות/cytoplasmic של NFκB היו הומוגניות בכל התאים עבור תמונה נתונה. מסיבה זו, עבור כל תמונה, את הערכים של כל הפיקסלים הגרעיניים או cytoplasmic היו מסוכם לחשב את הפרופורציות גרעינית ו cytoplasmic של NFκB, והאינדיבידואליזציה של גרעיני מגע/cytoplasmic במהלך הפילוח שלהם לא היה נדרש. תמונות DAPI עובדו בפילוח C: אובייקטים מקובצים באשכולות עם צורות קמורה בלוק לגרעין הפלח והערוץ הירוק שימש לתיחום ה cytoplasms עם פילוח E: בלוק ציטופלסמה באשכולות (איור 4b). ניתוח הקרינה הפלואורסצנטית D: טרנסלוקציה גלובלית בלוק שימש לייצא את הסכום של ערכי פיקסלים גרעיניים ו cytoplasmic. הנתונים המתקבלים מיוצגים בעקומה מינון-תגובה (איור 4c) ולהמחיש את הגידול של NFκB הגרעין לאחר גירוי עם הגדלת ריכוזים של TNFα.

זרימת העבודה לא רק מנתח את האות עוצמת העוצמה הגלובלית בתאי sub-סלולריים שונים, אבל יכול לשמש גם כדי לזהות וקדי ולחלץ מידע ספציפי על התכונות שלהם. איור 5a ממחיש את הזיהוי של P-גופים בתאים בודדים על ידי לוקליזציה של משפר mrna 4 (EDC4) חלבון. פילוח A: בלוק אובייקטים שאינם מקובצים באשכולות שימש לפלח גרעינים הנוכחים ברמה נמוכה של קיבוץ באשכולות, פילוח E: בלוק ציטופלסמה באשכולות כדי להתוות את cytoplasms ואת ניתוח פלואורסצנטית C: 2 ערוצים בשני תאים כדי לזהות EDC4 foci. אובייקטים מקוטע מזוהים (מקוטע nuclei_0, מקוטע cytoplasms_0), ומידע מרובה נאסף בגליון העבודה המתאים (מידע על הגרעין מקוטע ומידע cytoplasms מקוטע) כמו בעוצמה EDC4 או מספר/גודל של גופים שזוהו בכל ROI (איור 5b). לפני שנותחו, הגופים שזוהו יכולים להיות preliminarily מסוננים על פי האזור שלהם, אשר יכול להיות שימושי כדי להוציא את האובייקטים מתחת לעוצמת הרזולוציה של המיקרוסקופ. כדי להעריך את גודל האובייקטים ששומרו, ניתן להציג סף אזור נוסף. האזורים של כל הגופים שזוהו מדווחים בגליונות עבודה ייעודיים (מקוטע nuclei_Distribution גודל וקדי, מקוטע cytoplasms_Distribution גודל וקדי). בדוגמה זו, אנו להדגיש את הניתוח של שני תאים (מקוטע nuclei_0 and_1 ו מקוטע cytoplasm_0 and_1), שם cytoplasmic EDC4 וקדי מזוהים. שים לב כי גם אם האות של חלבון EDC4 מזוהה הן בתאי הגרעין cytoplasmic, רק fotoplasmic מתאים P-גופים. האות הגרעיני נובע ככל הנראה מן החתך החוצה של הנוגדן המשמש כדי לבצע ניסויים אימונוoforסנס. הגודל בפיקסלים של כל אחד מהfoci נתון.

אז, כמו ההשפעה של לחץ חמצוני (OS) על הגופים Cajal עדיין לא ידוע, ניצלנו את צדדיות של זרימת העבודה כדי ללמוד אותו בזמן קינטיקה (2 כדי 20 שעות לאחר מערכת ההפעלה אינדוקציה עם 500 μM H2O2) (איור 6). Cajal גופים הם מבנים דינמיים נוקלאוטינג והמסת בתוך הנואופלזמה תחת שליטה של פרמטרים ספציפיים כמו שיעור תמלול או התקדמות מחזור התא. הגופים של קאג'אל היו מגואלים על ידי לוקליזציה של המרכיב המבני והתפקודי העיקרי שלהם, האוסף חלבון. מידע על המספר ואת גודל הגופים Cajal נאספו על ידי לימוד 2300 תאים בודדים מתמונות ברזולוציה גבוהה (3840X3072) המכיל 3 ערוצים: DAPI (כחול), 53BP1 (ירוק) ו האוספים (אדום) (איור 6a). עיבוד מלא לקח פחות מ 1 h. מכיוון שגרעינים הציגו צורה קמורה וחלק מהם התקבצו, פילוח הבלוק C: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות קמורה נבחרו לבצע את הפילוח. כמו מערכת ההפעלה ידוע לגרום DNA כפול הגדיל מעברי (DDSBs), חלבון p53-מחייב 1 (53BP1), ידוע להיות מאפקטור חיוני של נזק אותות DNA מסלולים, שימש סמן להפלות בין תאים לחוצים וללא הדגיש. אכן, בהעדר נזקי DNA, 53bp1 הוא הרבה מופץ בתוך הנואופלזמה, ואילו בעקבות נזקי DNA, זה מתרכז ddsbs, אשר טופס בקלות להבדיל וקדי במיקרוסקופיה. המספר והגודל של שני 53bp1 ו לאסוף ב-וקדי גרעינית בכל תא נותחו באמצעות ניתוח הפלואורסצנטית בלוק B: 2 ערוצים באותו תא. ראשית, ניתוח של 53 BP1 נתונים עזר לקבוע עבור כל נקודת זמן של קינטיקה את הסף הטוב ביותר לסווג תאים לפי מצב הלחץ שלהם. בין הקינטיקה כולה, מערכת ההפעלה משרה עלייה משמעותית של מספר וקדי 53 bp1 עם עלייה של 11 מקפלים ב 2, 4, ו 8 h לאחר אינדוקציה של מערכת ההפעלה (איור S1). אפקט זה מבוטא פחות 6 h (6.5-קיפול) בגלל רמה ראשונית גבוהה יותר של DSB בתאים שאינם לחוצים. גם לאחר 20 שעות, הגידול המתמשכת נשאר (כמעט 6-קיפול). נתונים אלה משקפים את היעילות של הטיפול כדי לזרז את מערכת ההפעלה ולהקים 53BP1 כמו מתח מדגיש יעיל-סמן מוקדם ומאוחר במיקרוסקופיה. מצד שני, חלק קטן של תאים לחוצים עם רמה נמוכה של DDSBs נצפתה בכל נקודה של הקינטיקה, מציע כי התאים אינם הדגיש באופן הומוגנטי, לאכוף את החשיבות של שימוש בסמן לחץ בניסויים בלחץ. בהתבסס על הניתוח ROC, סף כללי של 17 53bp1 וקדי נבחר להפלות בין תאים לחוצים ובלתי לחוצים ברחבי הקינטיקה (איור S1).

אז המספר והגודל של הריסוס הגרעיניים נותחו בהתאם למצב הסטרס של התא. עלייה משמעותית במספר וקדי נצפתה 2, 4, ו 6 h לאחר אינדוקציה לחץ (איור 6b). ההשפעה המתמשכת ביותר היא נצפתה ב 2 h, מספר התאים שיש יותר מ 10 וקדי הגדלת מ 0% התאים הדגיש כדי 75% בתאים הדגיש. יתר על כן, יותר מ -25% של תאים הדגיש של נקודת זמן זו היו יותר מ 20 לאסוף foci. השפעה זו יורדת בהדרגה עד 8 h. ב -20 h, עלייה קטנה של הרבינות הראשונה והרבעוני השלישי נצפתה, אבל הנתונים גם מראים כי 84% ו 80% התאים מופיעים פחות מ 8 וקדי בתאים לא לחוצים והדגיש, בהתאמה. נתונים אלה מראים כי מערכת ההפעלה יש גם השפעות מאוחרות על הפרמטרים השולטים על התגררות של הגופים Cajal, אשר עשויים להיות שונים מהשפעות מוקדמות. מעניין, ניתוח קפדני של התכונות של האוסף וקדי גרעיניים חשף כי העלייה הנצפים של מספר האוסף של מקורביו וקדי עם ירידה בגודלם (איור 6c). למשל, 2 h לאחר אינדוקציה מערכת ההפעלה, החלק של לאסוף וקדי עם אזור מתחת 0.2 יקרומטר2 עולה מ 26% כדי 64%. השפעה זו פוחתת עד 8 שעות, אבל, בניגוד מספר של הגופים Cajal, לא שינוי משמעותי הוא נצפתה 20 h. זה עשוי לשקף כי ההפצה המוקדמת מוקדם ומאוחרת של Cajal גופים הם אירועים שונים.

באופן כלשהו נתונים אלה מצביעים בחריפות כי מערכת ההפעלה משנה את עוצמת הנוקלאוציה של Cajal הגופים, ומספק הפצה משנה של נואופלסמטי לתוך מספר רב של מסמכים גרעיניים קטנים. מאז התגררות של הגופים Cajal מונע על ידי החלבון שלהם רכיבי RNA, זה מרמז כי אפקט מערכת ההפעלה עשוי לשנות את הרכב של Cajal גופים. ב Cajal גופים, האוסף החלבון מקיים אינטראקציה עם מספר שותפים חלבון שונים כגון רכיבים של מורכבות SMN ו-Sm חלבונים. האינטראקציות הללו מעורבות לעתים קרובות זרחן של הבניין, ואפשר לדמיין כי שינוי של מבנה של הגופים Cajal יכול להיות מקושר לשינויים במצב זרחון של לאסוף. יתר על כן, העבודות האחרונות הראו כי הגופים Cajal אינם מותאמים באופן אקראי בתוך הגרעין, והוא יכול להשפיע על ביטוי הגנים דרך ההתאגדות הקרוב עם משטח הגן הספציפי17. בהינתן כל העובדות האלה, זה לא יהיה מפתיע אם השפעה על הפונקציונליות של גוף Cajal היה ללוות שינויים במבנה שלהם. מתוך תוצאות אלה, אנחנו יכולים גם לשאול אם שיפוץ כזה של גופים Cajal היא תוצאה פסיבית של מערכת ההפעלה או משתתפת בתגובה על ידי אינטראקציה עם הבית הגן הספציפי, למשל.

כדי לבדוק אם שינוי בתוך הביטוי יכול לשנות את הלוקליזציה שלו ולשנות את התגררות של הגופים הקאחאל, אנו מבטאים יותר מדי את הגדוגני בחלבון היתוך. גרעינים לא בוצעו באשכולות, ולכן בוצע פילוח עם הבלוק פילוח A: אובייקטים שאינם מקובצים באשכולות. אז, בדיוק לכמת את מספר וגודל של האוסף וקדי (האות האדום, ערוץ 1) לפי רמת gfp-לאסוף (האות הירוק, ערוץ 2) ביטוי יתר, בלוק הזריחה ניתוח B: 2 ערוצים באותו תא שימש. רמת GFP-האוסף השתקף על ידי העוצמה הממוצע של אות GFP בגרעין הפרט (איור 7a). בתאים עם רמה בינונית או גבוהה של gfp-ביטוי overexpression (עוצמה gfp גבוה יותר 10), מספר הגופים cajal לגרעין מגדיל באופן משמעותי עם כמה גרעינים מציג עד 21 וקדי (איור 7b). שמנו לב גם כי הבהירות (עוצמה מתכוון) של הגופים Cajal עולה באופן משמעותי במקביל עם רמת הביטוי overexpression מובילה לאינטנסיביות הרוויה. אזורים רוויים כאלה עלולים להסוות את נוכחותו של הקטן והפורה יותר. בתאים ביטוי מופרז ברמה בינונית או גבוהה של gfp-לאסוף, בגודל של הגופים cajal גם מגדיל באופן משמעותי, את הערכים החציוני עולה מ 1 עד 2 יקרומטר2 (איור 7c). יתר על כן, יותר מ -25% של תאים עם gfp גבוהה ברמת הביטוי הנוכחי וקדי עם שטח גדול יותר מאשר 2.5 יקרומטר2, ואילו זה מעולם לא עולה על 0.8 יקרומטר2 בתאים שאינם מעבר לטרנסג. לסיכום, GFP-ביטוי overexpression מוביל לעלייה משמעותית הן מספר וגודל של הגופים Cajal. מאז מערכת ההפעלה מגדילה את מספר הגופים Cajal אבל מפחית את גודלם, נתונים אלה עשויים לשקף את ההשפעה של מערכת ההפעלה על המבנה של Cajal הגופים הוא כנראה המושרה על ידי שינוי של הרכב שלהם ולא על ידי השפעה על כמות הסלולר של האוסף.

Figure 1
איור 1: צינור המשנה של מנתח המבנה
זרימת העבודה מפותחת בקרח, פלטפורמה קהילתית פתוחה לאינפורמטיקה ביודמית, ומבצעת ניתוח אוטומטי של תמונות מיקרוסקופית הקרינה הפלואורסצנטית. ראשית, תמונות מרובות ערוצים נטענים באופן אוטומטי בתוך הפרוטוקול ומעובדים מראש כדי לשפר, במידת הצורך, את האות ליחס הרעש וכלה להסרת חפצי הדמיה. לאחר מכן, פילוח תמונה מבודד אזורים מעניינים (ROIs) מהרקע. מספר שיטות של פילוח זמינות בהתאם לרמת הקיבוץ והאופי של אובייקטי הריבית. אובייקטים מקוטע נשמרים עם מתאר ספציפי (לדוגמה, Image name_Nucleus_1) בתיקיה מסוימת וניתן להשתמש בו/להשתמש בו מחדש לצורך ניתוח עוקב. אותות פלורסנט כמו כתמים מנותח לאחר מכן בתוך ROIs ותכונות מרובות (מיקום, גודל, צורה, עוצמה, מרקם, מספר ספוט, גודל) מיוצאים לתוך גיליון אלקטרוני שנוצר באופן אוטומטי. כל התכונות שנמדדו, כמו מספר הנקודות שזוהו, מדווחות למתאר של התשואה המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ממשק גרפי של זרימת העבודה אייסי
(א) זרימת העבודה מורכבת מ -13 בלוקים כלליים, אשר ניתן לקבץ לפי הפונקציה הכללית שלהם: בחר תיקייה (לחסום 1) לאפשר גישה לתמונות; מיזוג ערוצים (לחסום 2) משמש למיזוג ערוצים שונים של תמונות. בלוקים 3 עד 8 מוקדשים לפילוח אובייקטים, שכל אחד מהם מותאם להקשר מסוים: פילוח a: אובייקטים שאינם מקובצים באשכולות, פילוח B: אובייקטים לא מקובצים באשכולות, פילוח C: אובייקטים באשכולות עם צורות קמורה, פילוח D: אובייקטים באשכולות עם צורות לא סדירות (בלוק 7, עובד בשיתוף עם חסימה 6), פילוח E: מקובצים בלוקים 9 כדי 11 משמשים לספור/לנתח וקדי בתוך התאים subcellular: ניתוח פלואורסצנטית A: 1 ערוץ, בדיקות פלואורסצנטית B: 2 ערוצים באותו תא ו הזריחה ניתוח C: 2 ערוצים בשני תאים. בלוקים 12 ו-13 מותאמים לניתוח של טרנסלוקציה: ניתוח פלואורסצנטית D: טרנסלוקציה הכללית וניתוח פלואורסצנטית: תא יחיד טרנסלוקציה. (ב) הצגה גלובלית של ארכיטקטורת בלוקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הזמן הדרוש לפילוח כפונקציה של רזולוציית תמונה ורמת האשכול של האובייקט
(א) איור גרפי של הזמן הדרוש לביצוע פילוח בהתאם לרזולוציית התמונה ולרמת הקיבוץ. שני גושי פילוח שונים נבדקו: פילוח A (עבור אובייקטים שאינם מקובצים באשכולות) ופילוח D (עבור אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות לא סדירות). זמן העיבוד (בשניות לכל תמונה) מותווים כפונקציה של רזולוציית תמונה (מספר הפיקסלים). (ב) דוגמה לתמונות שנותחו באמצעות פילוח A או פילוח D בלוק. כתמים וגרעינים מקוטע של DAPI מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח זרימת העבודה של שיטת טרנסלוקציה גרעינית NFκB בתגובה לגירוי של TNFα
(a) דוגמה של תמונות של תאים MCF7 האדם (שדהאדםאדנוקרצינומה קו התא) טיפל עם TNFα מתוך ערכת התמונה BBBC014 (אוסף בחינת ביצועים רחב bioimage)12. לוקליזציה של שעתוק גורם NFκB כבר נחקרו בתאים שטופלו 12 ריכוזים הגוברת של TNFα (מ 0 אל 10-7g/mL). עבור כל ריכוז, 4 משכפל נעשו. תמונות DAPI (ערוץ כחול) עובדו בפילוח C: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות קמורה בלוק כדי גרעיני פלח, ולאחר מכן NFκB מכתים עם fitc (ירוק ערוץ) שימש כדי להתוות את cytoplasms עם פילוח E: לחסום ציטופלסמה באשכולות . ניתוח הקרינה הפלואורסצנטית D: טרנסלוקציה גלובלית בלוק שימש לייצא את הסכום של ערכי פיקסלים גרעיניים ו cytoplasmic. (ב) גרעיני מקוטע (אפור) ו cytoplasms (לבן) משמשים כדי לקבוע את העוצמה הכוללת של האות פלורסנט NFκB בכל תא. (ג) עקומת המינון-תגובה שהתקבל מניתוח נתונים ממחישה את העלייה של NFκB הגרעין הפרופורציה TNFα עליות ריכוז. תמונות הן בתבנית BMP של 8 סיביות, וגודל התמונה הוא 1360 x 1024 פיקסלים. עבור כל ריכוז, סטיית התקן בין 4 המשכפלת מחושבת ומאוירת כקווי שגיאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: קוונפיקציה של EDC4 וקדי (P-הגופים) בתוך הציטופלסמה בתאים בודדים
(a) מכתים שיתוף עם dapi (ערוץ כחול) ו Phalloidin (ערוץ אדום) מאפשר פילוח וזיהוי של גרעיני תאים ו-F-actin, בהתאמה. חלבון EDC4 (ערוץ ירוק) משמש סמן לזיהוי של P-גופים ידוע בלעדית cytoplasmic. סרגל בקנה מידה, 10 μm. (ב) foci נספרים, וכמה תכונות (כאן האזור שלהם בפיקסלים) מיוצאים לגיליון האלקטרוני תוצאות מובנה במספר גיליונות. שני סדינים מוקדשים לניתוח גרעינים ושניים לניתוח של cytoplasms. כל raw מטמיע את המידע של ROI ספציפי. בתוך הגרעין/הציטופלסמה גיליונות, המאפיינים של אובייקטים מקוטע מיוצאים (מזהה ROI, גודל, ועוצמה ממוצע), ואחריו את מספר וקדי שזוהו בתוך כל ROI. במקרה הצורך, ניתן להוסיף לסף גודל (100 פיקסלים בדוגמה זו), ומספר הוקדי שמתחת וממעל לסף זה מדווח בשתי העמודות האחרונות. בגרעין/Cytoplasm_Distribution של גיליונות גודל וקדי , האזור (בפיקסלים) של כל וקדי שאותרו מדווח raw של המקביל ROI. בדוגמה זו, אנו להדגיש את הניתוח של שני תאים (מקוטע cytoplasm_0 and_1), שם cytoplasmic EDC4 וקדי זוהו. הגודל בפיקסלים של כל אחד מהfoci ניתן אף הוא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: קינטיקה של לאסוף ו-53BP1 התפלגות לאחר לחץ חמצוני
ניתוח מספר וגודל של וקדי היה מבוסס על יותר מ 110 תאים בודדים עבור כל נקודת זמן מ 3 הקינטיקה עצמאית. (א) immunofluorescence זיהוי של האוסף ו 53bp1 וקדי בתאי הלה S3 במהלך הטיפול קינטיקה עם 500 μm H2O2. 53BP1 מתרכז באתרי הפריצה של DNA דאבל סטרנד ומשמש כדי להעריך את היעילות של הטיפול בכל תא. האוסף מועשר בקג'אל. תאים היו קבועים 2, 4, 6, 8, ו 20 h לאחר האינדוקציה לחץ חמצוני ומוכתם שיתוף עם anti-הצווארון (אדום הערוץ) ו anti-53BP1 (ערוץ ירוק) נוגדנים. סרגל בקנה מידה, 10 μm. (ב) מספר האוסף של וקדי גרעינית לאחר לחץ חמצוני. התוצאות מוצגות כחלקות תיבות, כאשר הסימן המרכזי הוא החציון, הקצוות התחתונים והעליונים של התיבה הםה -25 ו -75th אחוזונים. בתאים שטופלו H2O2, עלייה משמעותית במספר האוסף וקדי מזוהה והוא מקסימלי לאחר 2 ו 4 H של הטיפול. וילקוסון-מאן ויטני ניתוח מבחן מדגים הבדל משמעותי בין מטופל ו-H2O2 תאים מטופלים (*, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). (ג) הפרופורציה של תאים בפונקציה של האוסף באזור וקדי (μm2). רוב וקדי יש אזור קטן יותר ב 2 h ו 4 h נקודות זמן לעומת הפקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: מחקר התגררות של הגופים הקאחאל בתאים מבטאים ביתר ביטוי בחלבון היתוך
(a) התאים של הלה S3 היו בעבר מזוהמים בטריליטים ביולוגיים עם 500 ng של פלפמיד ביטוי gfp לאסוף חלבון היתוך באמצעות הליך סטנדרטי בעקבות המלצות היצרן. לאחר 48 h, תאים היו קבועים מוכתם עם נוגדן נגד לאסוף. DAPI (ערוץ כחול) מאפשר לפלח גרעינים. עבור ניתוחים אלה, יותר מ 100 תאים נותחו. האות GFP משקף את הלוקליזציה של חלבון-GFP (ערוץ ירוק) לוקליזציה, בעוד האוסף האות (ערוץ אדום) מתאים הן אנדוגני והלוקליזציה של חלבון אקסוגני. עבור כל גרעין, העוצמה הממוצע של אות ה-GFP משקפת את רמת הביטוי האוסף. לפי פרמטר זה, התכונות של האוסף וקדי נותחו באמצעות בלוק הפלואורסצנטית ניתוח B: 2 ערוצים באותו תא. סרגל בקנה מידה, 10 μm. (ב) קשר בין מספר האוסף וקדי ומתכוון gfp בעוצמה לכל גרעין. התוצאות מוצגות כחלקות תיבות, כאשר הסימן המרכזי הוא החציון, הקצה התחתון והעליון של התיבה הםה -25 ו -75th אחוזונים. וילקוסון-מאן ויטני ניתוח מבחן מדגים עלייה משמעותית של מספר וקדי עבור עוצמה gfp > 10 (*, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). (ג) הקשר בין האזור של לאסוף וקדי ומתכוון gfp בעוצמה לכל גרעין. התוצאות מוצגות כחלקות תיבות, כאשר הסימן המרכזי הוא החציון, הקצה התחתון והעליון של התיבה הםה -25 ו -75th אחוזונים. וילקוסון-מאן ויטני ניתוח מבחן מדגים עלייה משמעותית של האזור לאסוף וקדי עבור עוצמה gfp > 10 (*, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור S1: קינטיקה של 53 BP1 התפלגות לאחר לחץ חמצוני
(א) כימות של 53 BP1 הגרעין הגרעיני ב מטופל או H2O2 הטיפול בתאים אחרי הדגירה שונים פעמים. התוצאות מוצגות כחלקות תיבות, כאשר הסימן המרכזי הוא החציון, הקצה התחתון והעליון של התיבה הםה -25 ו -75th אחוזונים. וילקוסון-מאן ויטני ניתוח מבחן מדגים הבדל משמעותי בין מטופל ו-H2O2 תאים מטופלים (*, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). (ב) עבור כל נקודת זמן של הקינטיקה, הוקמה העקומה ROC (מאפיין הפעלה מקלט) כדי לקבוע את הסף הטוב ביותר להפלות בין תאים לחוצים ובלתי לחוצים. הפרמטרים של כל בדיקה מדווחים בטבלה (רגישות, ספציפיות, TP: אמת חיובי, TN: שלילי אמיתי, FP: חיובי false, FN: שלילי שווא). מתוך נתונים אלה, סף גלובלי של 17 53bp1 וקדי היה נחוש להפלות הדגיש מתאים לא להדגיש דרך הקינטיקה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר גדל והולך של כלי תוכנה חופשית זמינים לניתוח של תמונות תאים פלואורסצנטית. משתמשים חייבים לבחור בצורה נכונה את התוכנה הנאותה בהתאם למורכבות הבעייתי שלהם, לידע שלהם בעיבוד התמונה, ולזמן שהם רוצים להשקיע בניתוח שלהם. אייסי, CellProfiler, או ImageJ/פיג'י הם כלים רבי-עוצמה המשלבים הן שימושיות והן פונקציונליות3. קרח הוא כלי עצמאי המציג ממשק משתמש גרפי ברור (GUI), ובעיקר שלה "הפרוטוקולים" הנקודה ולחץ ממשק דרכו ניתן זרימות עבודה יכול להיות מעוצב בקלות או מניפולציות4. הפונקציונליות של תוכנה זו משופרת על ידי תמיכה וניצול של התוספים ImageJ, והרבה תיעוד זמין תודות לקהילה הגדולה של משתמשים. השתמשנו זה שילוב חזק של שימושיות ופונקציונליות של התוכנה קרח כדי לפתח את זרימת העבודה מנתח מבנה משנה . המטרה העיקרית שלה היא להציע פתרון אוטומטי כדי לבצע ניתוח מלא של אות פלורסנט של התא מתמונות מרובות. הניתוח כולל עיבוד מקדים של תמונה, פילוח אובייקט וניתוח אותות פלורסנט.

פרוטוקולים מספר משותפים בהכרת תודה על האתר קרח ולהציע להשתמש בפונקציות קרח כדי לזהות ולנתח אותות פלורסנט כמו foci סלולרי. עם זאת, חלק מפרוטוקולים אלה מעבדים רק תמונה אחת בכל הפעלה, לא מייצאים את התוצאות בקובץ מסוים או מנתחים ערוץ יחיד. אחרים אינם מכילים פילוח ראשוני כדי לקבוע אזורי עניין (ROIs) או להציע אלגוריתמים פשוטים כמו "HK-אמצעים" שאינם מתאימים לפילוח של אובייקטים באשכולות מאוד. מנתח מבנה משנה ממכן את כל השלבים של ניתוח תמונה מראש עיבוד התמונה כדי פילוח של אובייקטים זיהוי/ניתוח של אותות פלורסנט. הפרוטוקול מציע גם שיטות פשוטות או מורכבות יותר עבור פילוח אובייקט וייצוא של הנתונים (שמות של אובייקטים מקוטע, ניתוח וקדי) ממומש תפוקות ממוטבת המותאמים בעייתי. Cellprofiler מציע גם צינורות חזקים המורכב של מודולים כי כלומר פונקציונליות18,19. קווי הצנרת הזמינים מותאמים היטב לבעיות ספציפיות. זרימות עבודה של קרח הן רשת של תיבות שונות, שכל אחת מהן מבצעת משימה מסוימת. באמצעות ממשק "פרוטוקולים", תיבות ההלחנה של הרשת הן אינטואיטיבי וקל לתמרן. מנתח מבנה משנה מותאם מספר ההקשרים כמו מיזוג פשוט של ערוצים, הקוונפיקציה של אותות פלורסנט התפלגות בין שני תאים substructure, ניתוח של וקדי באחד או כמה ערוצים מתאים סלולריים אחד או שניים בתאים בודדים. מספר צגים מאפשרים להמחיש את תוצאות הביניים במהלך כל הפעלה כדי לשלוט בעיבוד. יתר על כן, קרח מציג בארים סמל כי הקבוצה שיטות לפי נושא וממנו פונקציות שנמצאו בזרימת העבודה ניתן מניפולציות בנפרד כדי לבדוק באופן ידני פרמטרים ספציפיים על תמונות מסוימות לפני השימוש בהם על ערכת תמונה שלמה.

כמו בשדה ניתוח הביותמונה, השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא פילוח האובייקטים. הפרוטוקול מציע את הפילוח של אובייקטים ראשיים, שהם רוב הגרעינים של תאי הזמן, ומכיל גם בלוק נוסף שהפעילות היא לפלח סוג שני של אובייקטים בתוך התא. פילוח גרעינים יכול להיות קשה כאשר האובייקטים הם באשכולות מאוד, כך שהם נוגעים או חופפים יחד. חלופות שונות לפילוח של אובייקטים ראשוניים כלולים בפרוטוקול, בהתאם לצורת האובייקטים ולרמת הקיבוץ האשכולות גם אם לא הצלחת באלגוריתם אוניברסלי בפילוח מלא של אובייקטים באשכולות מאוד. תהליך הפילוח מוגבל בעיקר על-ידי קביעת הפרמטרים הנכונים שיכולים לפלח חלק מהאובייקטים, אך להוביל לחלק אחר מפלח האובייקטים. המשתמש יצטרך לבצע רצפים שונים עם פרמטרים שונים כדי לקבל מפלח נכון סופי, במיוחד עבור אובייקטים באשכולות המציגים צורות הטרוגנית ולא קמורה.

פרוטוקול זה מוגבל ברובו על-ידי שלב הפילוח, שעשוי לגזול זמן רב ולדרוש תצורת מחשב רבת-עוצמה עבור המקרים המורכבים ביותר. באופן ספציפי יותר, ככל שהתמונות הן רבות יותר או מורכבות יותר (אובייקטים המקובצים באשכולות לפלח, מספר גבוה של פיקסלים בתמונות), יהיה צורך בזיכרון הגישה האקראית (RAM) שהמשתמש ידרוש. באופן גלובלי, עבור כל בעייתי, המשתמש יצטרך להפעיל את הפרוטוקול על 64 סיביות Java Runtime סביבה (זמין באופן חופשי באתר האינטרנט של Java) וכלה להשתמש במערכת ההפעלה 64 bits (OS) כדי להגדיל את הזיכרון הזמין בשימוש על ידי אייסי (זיכרון מוגבל 1300 MB עבור 32 חתיכות JRE). בגלל הסקריפט, הפרוטוקול אינו פועל כראוי במחשב Mac. יתרה מזאת, מספר הפרמטרים גדל עם המורכבות של הבעיה וידרוש ידע רב יותר בניתוח תמונות. בנוגע לקריטריוני הפונקציונליות, פרוטוקול זה עדיין לא הותאם לניתוח של תמונות מוערמות (ערימות זמן, z-ערימות) גם אם אייסי מבצע ניתוח באופן יעיל בסוג זה של נתונים.

עדכונים עתידיים יובנו במיוחד כדי לשפר את הפילוח של אובייקטים מורכבים מקובצים באשכולות. בלוקים נוספים יתפתחו כדי להתאים את פילוח למבנים סלולריים באשכולות עם צורות לא סדיר לא קמורה. אנו גם להתאים את זרימת העבודה לניתוח זמן ו-z-ערימות (עבור הדמיה חיה ונתונים תלת-ממדיים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

G.H. היתה נתמכת על-ידי מלגת מוסמכים מבית המיניצ ' א-לה-שרצ'ה וטכנולוגיות עזר. L.H. היה נתמך על ידי מלגת בוגר מכון דה Cancérologie דה לוריין (כיל), בעוד שקט היה נתמך על ידי מענק ציבורי תנוהלנה על ידי סוכנות המחקר הלאומי הצרפתית (ANR) כחלק השני "הבדיקה של התוכנית" להילחם-HF (התייחסות: ANR-15-RHU4570004). עבודה זו ממומנת על ידי CNRS ואוניברסיטת דה לוריין (UMR 7365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free Thermo Fisher Scientific 28908 to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific A-11008 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-21425 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A34055 fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA) euromedex 04-100-812-E
DMEM Sigma-Aldrich D5796-500ml cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040-5ML mounting medium
Human: HeLa S3 cells IGBMC, Strasbourg, France cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) Sigma-Aldrich H1009-100ml used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent Thermo Fisher Scientific 11668-019 transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin abcam ab11822 Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope Nikon epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062 transfection medium
PBS pH 7.4 (10x) gibco 70011-036 to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1 Thermo Fisher Scientific PA1-16565 53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4 Sigma-Aldrich SAB4200114 EDC4-specific antibody
Triton X-100 Roth 6683 to permeabilize the cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
  2. Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
  3. Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  4. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  5. Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
  6. Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
  7. Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018).
  8. Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014).
  9. Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
  10. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  11. D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
  12. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
  13. Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
  14. Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
  15. Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
  16. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  17. Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
  18. Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
  19. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
  20. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).

Tags

Bioהנדסאים סוגיה 161 מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית אנליזה ביולוגית פילוח של תאים ספירת Foci גופים סלולריים מתח חמצוני אוטומציה טרנסלוקציה מנתח מבנה משנה קרח תמונה J
מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, … More

Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, L., Thuillier, Q., de Chaumont, F., Dallongeville, S., Behm-Ansmant, I. Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images. J. Vis. Exp. (161), e60990, doi:10.3791/60990 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter