Summary
우리는 형광 현미경 이미지의 특정 세포 구획에서 세포 체의 신속한 탐사와 정확한 분석을 위해 구축 된 자유롭게 사용할 수있는 워크플로우를 제시합니다. 이 사용자 친화적인 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어 Icy에서 설계되었으며 ImageJ 기능을 사용합니다. 파이프라인은 이미지 분석에 대한 지식없이 저렴합니다.
Abstract
지난 10년 동안 공간 해상도 개선뿐만 아니라 살아있는 세포 이미징 및 고처리량 현미경 기술에서도 도시된 형광 현미경 기술의 돌파구가 특징입니다. 이로 인해 단일 실험에 대한 현미경 데이터의 양과 복잡성이 지속적으로 증가했습니다. 현미경 데이터의 수동 분석은 매우 시간이 많이 걸리고 주관적이며 정량적 분석을 금지하기 때문에 생체 이미지 분석의 자동화는 거의 피할 수 없게되고 있습니다. 우리는 형광 현미경 검사법에서 생체 이미지에서 신호 분석을 완전히 자동화하기 위해 하위 구조 분석기라는 정보학 워크플로우를 구축했습니다. 이 워크플로우는 사용자 친화적인 오픈 소스 플랫폼 Icy에서 개발되었으며 ImageJ의 기능으로 완료됩니다. 그것은 소음 비에 신호, 세포의 개별 세분화 (세포 경계의 검출) 및 특정 세포 구획에서 농축 된 세포 체의 검출 /정량화를 개선하기 위해 이미지의 사전 처리를 포함한다. 이 워크플로우의 주요 장점은 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 이미지 분석 전문 지식 없이 사용자에게 복잡한 바이오 이미징 기능을 제안하는 것입니다. 더욱이, 그것은 매우 모듈식이며 핵 /세포 분석 전대의 특성화에서 다른 세포 하위 구조에서 다른 세포 체의 비교 분석에 이르기까지 여러 문제에 적응한다. 이 워크플로우의 기능은 산화 스트레스(OS) 조건 하에서 Cajal(코일) 바디의 연구를 통해 설명됩니다. 형광 현미경 검사법의 데이터는 인간 세포에 있는 그들의 무결성이 OS의 유도 후에 몇 시간 영향을 받았다는 것을 보여줍니다. 이러한 효과는 코일린의 핵재분배와 연관된 코일린 핵형성의 감소를 특성형 카잘 체체로 감소시켜 더 작은 포시 수로 재분배하는 것을 특징으로 한다. CB 성분과 주변 뉴클레오플라즘 사이의 교환에서 코일린의 중심 역할은 코일린의 OS 유도 재분배가 Cajal Body의 조성 및 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
Introduction
가벼운 현미경 검사법과 특히 형광 현미경 검사는 생물 과학에서 일반적으로 사용되는 견고하고 다재다능한 기술입니다. 그(것)들은 그들의 특정 형광 표시를 통해 단백질 또는 RNA 같이 각종 생체 분자의 정확한 현지화에 접근을 줍니다. 지난 10년 동안 에릭 베치그, 스테판 W. 지옥, 윌리엄 E. 모너가 슈퍼 해결형 형광 현미경 검사법(SRFM)1의개발을 수여한 2014년 노벨 화학상에서 입증된 바와 같이 현미경 및 이미징 기술의 급속한 발전이 특징지어졌습니다. SFRM은 나노 크기로 가져오기 위해 기존의 광학 현미경 검사법의 회절 한계를 우회합니다. 라이브 이미징 또는 높은 처리량 스크리닝 접근법과 같은 기술의 개선은 또한 각 실험에 대해 치료할 데이터의 양과 복잡성을 증가시킵니다. 대부분의 경우 연구자들은 세포의 이질적인 집단에 직면하고 단일 세포 수준에서 표현형을 분석하고자 합니다.
처음에, foci 계산과 같은 분석은 계산 프로세스를 완전히 시각적인 통제를 제공하기 때문에 몇몇 연구원에 의해 선호되는 눈에 의해 수행되었습니다. 그러나 이러한 데이터의 수동 분석은 너무 오래 걸리고 관찰자 간의 가변성을 유발하며 컴퓨터 지원 접근 방식이 널리 사용되고 거의 피할 수 없는2가되도록 보다 복잡한 기능에 대한 액세스를 제공하지 않습니다. 생체 이미지 정보학 방법은 데이터 분석의 효율성을 크게 향상시키고 수동 계수 분석의 피할 수 없는 작업자 주관성과 잠재적 편향이 없습니다. 이 분야의 수요 증가와 컴퓨터 전력의 개선으로 인해 많은 수의 이미지 분석 플랫폼이 개발되었습니다. 그들 중 일부는 자유롭게 사용할 수 있으며 개인용 컴퓨터로 분석을 수행하기 위해 다양한 도구에 액세스 할 수 있습니다. 오픈 액세스 도구의 분류는 최근 설립되었습니다3 유용성과 기능을 결합하는 강력한 소프트웨어로 얼음4를 제시한다. 또한, 얼음은 ImageJ와 통신의 장점이있다.
이미지 분석 전문 지식이 없는 사용자의 경우 주요 장애물은 문제가 있는 매개 변수에 따라 적절한 도구를 선택하고 잘 이해하지 못하는 매개 변수를 올바르게 조정하는 것입니다. 또한 설정 시간은 종종 깁니다. Icy는 "프로토콜"이라는 사용자 친화적인 포인트 앤 클릭 인터페이스를 제안하여 전체 컬렉션4내에서 발견되는 일부 플러그인을 결합하여 워크플로우를 개발할 수 있습니다. 유연한 모듈식 설계와 포인트 앤 클릭 인터페이스를 통해 프로그래머가 아닌 사람들에게 가능한 분석을 설정할 수 있습니다. 여기서 우리는 특정 셀룰러 구획에서 형광 신호를 분석하고 밝기, foci 수, foci 크기 및 공간 분포와 같은 다양한 기능을 측정하는 Icy의 인터페이스에서 개발 된 하위 구조 분석기라는워크플로우를 제공합니다. 이 워크플로우는 신호 전좌의 정량화, 형광 기자를 발현하는 전감염된 세포의 분석, 또는 개별 세포에서 다른 세포 하위 구조에서 의 초점 분석과 같은 몇 가지 문제를 해결합니다. 여러 이미지를 동시에 처리할 수 있으며, 출력 결과를 일반적으로 사용되는 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있는 탭 구분워크시트로 내보낼 수 있습니다.
하위 구조 분석기 파이프라인은 그림 1에표시됩니다. 첫째, 지정된 폴더에 포함된 모든 이미지는 신호 대 노이즈 비율을 개선하기 위해 미리 처리됩니다. 이 단계는 다음 단계의 효율성을 높이고 실행 시간을 줄입니다. 그런 다음 형광 신호를 감지해야 하는 이미지 영역에 대응하는 관심 영역(ROI)이 식별되고 세분화됩니다. 마지막으로 형광 신호를 분석하고 결과는 탭 구분 워크시트로 내보냅니다.
물체 세분화(경계 감지)는 이미지 분석에서 가장 까다로운 단계이며, 그 효율성은 결과 셀 측정의 정확도를 결정합니다. 이미지(1차 개체라고 함)에서 확인된 첫 번째 개체는 DNA 염색 된 이미지 (DAPI 또는 Hoechst 염색)에서 종종 핵이지만 기본 개체는 전체 세포, 구슬, 반점, 종양 또는 얼룩이있는 물체일 수 있습니다. 대부분의 생물학적 이미지에서 세포 또는 핵은 서로 접촉하거나 중첩되어 간단하고 빠른 알고리즘이 실패합니다. 현재까지, 어떤 범용 알고리즘도 모든 객체의 완벽한 세분화를 수행할 수 없으며, 대부분 특성(크기, 모양 또는 텍스처)이 분할5의효율성을 조절하기 때문입니다. 현미경 소프트웨어(예: 분자 장치에 의한 변형 이미징 소프트웨어6또는 Nikon7의NIS-Elements Advances 연구 소프트웨어)와 함께 일반적으로 배포되는 세분화 도구는 일반적으로 상관 관계 일치, 임계값 또는 형태학적 작업과 같은 표준 기술을 기반으로 합니다. 기본 시스템에서는 효율적이지만 이러한 보다 일반화된 메서드는 보다 까다롭고 특정한 컨텍스트에서 사용할 때 한계를 빠르게 제시합니다. 실제로, 세분화는 세포 유형, 세포 밀도 또는 바이오마커와 같은 실험 파라미터에 매우 민감하며, 종종 큰 데이터 세트에 대한 반복적인 조정이 필요하다. 하위 구조 분석기 워크플로는 간단하고 정교한 알고리즘을 통합하여 이미지 복잡성및 사용자 요구에 맞게 다양한 대안을 제안합니다. 특히 고클러스터된 개체에 대한 마커 기반 유역 알고리즘8을 제안합니다. 이 세분화 방법의 효율성은 각 개체의 개별 마커 선택에 의존합니다. 이러한 마커는 사용자가 많은 수의 객체에 직면할 때 매우 많은 시간이 소요되는 전체 세분화에 대한 올바른 매개 변수를 얻기 위해 대부분의 시간을 수동으로 선택합니다. 하위 구조 분석기는 이러한 마커를 자동으로 감지하여 매우 효율적인 세분화 프로세스를 제공합니다. 세분화는, 대부분의 경우 이미지 분석의 제한 단계이며 이미지의 해상도, 이미지당 개체 수 및 개체 의 클러스터링 수준에 따라 처리 시간을 상당히 수정할 수 있습니다. 일반적인 파이프라인은 표준 데스크톱 컴퓨터에서 이미지당 몇 초에서 5분이 필요합니다. 더 복잡한 이미지를 분석하려면 보다 강력한 컴퓨터와 이미지 분석에 대한 몇 가지 기본 지식이 필요할 수 있습니다.
이 워크플로의 유연성과 기능은 대표 결과의 다양한 예제와 함께 설명되어 있습니다. 이 워크플로우의 장점은 특히 산화 스트레스 (OS) 조건하에서 핵 하위 구조의 연구를 통해 표시됩니다. OS는 산화제에 찬성하는 레독스 항상성의 불균형에 대응하고 반응성 산소 종 (ROS)의 높은 수준과 연관된다. ROS는 신호 분자로서 작용하기 때문에, 그들의 농도 및 세포 세포 소소화의 변화는 신호 변환, 수리 메커니즘, 유전자 발현, 세포 사멸 및 증식9,,10을포함하여 생리적 기능을 조절하는 수많은 경로 및 네트워크에 긍정적 또는 부정적으로 영향을 미친다. 따라서 OS는 다양한 병리학 (신경 퇴행성 및 심혈관 질환, 암, 당뇨병 등)뿐만 아니라 세포 노화에도 직접 관여합니다. 따라서 인간 세포의 조직과 기능에 대한 OS의 결과를 해독하는 것은 인간 병리학의 발병 및 개발에서 OS의 역할을 이해하는 데 중요한 단계입니다. OS는 여러 전사 인자(p53, Nrf2, FOXO3A)11을통해 전사를 조절함으로써 유전자 발현을 조절하는 것으로 확립되었지만, 또한 전RNA12,,13,14의대체 접합(AS)과 같은 여러 공동 및 전사 후 과정의조절에영향을 미치는 것으로 확립되었다. 1차 코딩 및 비코딩 전사체의 대체 접합은 전사동형태를 생성하여 게놈의 인코딩 능력을 증가시키는 필수적인 메커니즘이다. AS는 거의 300 단백질과 5 U-풍부한 작은 핵 RNA (UsnRNAs)15를포함하는 spliceosome에게 불린 거대한 ribonucleoprotein 복합체에 의해 수행됩니다. Spliceosome 조립 및 AS는 세포에서 단단히 통제되고 화려한 성숙의 몇몇 단계는 Cajal 바디라는 막없는 핵 구획 내에서 생깁니다. 이러한 핵 하위 구조는 주로 코일린 단백질을 가진 RNA 및 단백질 성분의 다원적 상호 작용에 의해 수행되는 구조와 그 조성물의 동적 특성을 특징으로 합니다. 하위 구조 분석기 워크플로우를 가진 수천 개의 셀을 분석하여 OS가 Cajal Body에 미치는 영향을 설명하지 않은 특성화를 허용했습니다. 실제로, 얻은 데이터는 OS가 카잘 바디의 핵을 수정하고, 수많은 작은 핵 포시로 코일린 단백질의 핵 소플라즈마 재분배를 유도한다는 것을 건의합니다. Cajal 바디의 구조의 이러한 변화는 화려한의 성숙에 영향을 미치고 OS에 의한 AS 변조에 참여할 수 있습니다.
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Protocol
참고 : 사용자 친화적 인 튜토리얼은 http://icy.bioimageanalysis.orgIcy의 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다.
1. 얼음 과 하위 구조 분석기 프로토콜을 다운로드
- 얼음 웹 사이트에서 얼음을 다운로드(http://icy.bioimageanalysis.org/download) 하위 구조 분석기 프로토콜을 다운로드 : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
참고: 64비트 OS를 사용하는 경우 64비트 버전의 Java를 사용해야 합니다. 이 버전은 얼음에 할당 된 메모리를 증가 할 수있습니다 (환경 설정 | 일반 | 최대 메모리).
2. 프로토콜 열기
- 얼음을 열고 리본 메뉴의 도구를 클릭합니다.
- 프로토콜을 클릭하여 프로토콜 편집기 인터페이스를 엽니다.
- 로드를 클릭하고 프로토콜 하위 구조 분석기를 엽니다. 프로토콜 로드는 몇 초 정도 걸릴 수 있습니다. 프로토콜을 사용하기 전에 프로토콜의 열기가 완료되었는지 확인합니다.
참고: 워크플로는 그림 2a에제시된 13개의 일반 블록으로 구성됩니다. 각 블록은 특정 하위 작업을 수행하는 여러 상자로 구성된 파이프라인으로 작동합니다.
3. 얼음에 워크플로우와 상호 작용
참고: 각 블록 또는 상자에 번호가 매겨지며워크플로(그림 2b)내에서 특정 랭크가 있습니다. 이 번호를 클릭하면 첫 번째 에 가장 가까운 위치가 선택한 블록/상자에 할당된 다음 다른 블록/상자의 위치가 다시 구성됩니다. 워크플로를 준비할 때 블록의 올바른 순서를 존중합니다. 예를 들어 스팟 검출기 블록은 스팟 검출기 블록 전에 세분화 블록을 실행해야 하므로 미리 정의된 ROI가 필요합니다. 상자의 위치를 수정하지 마십시오. 이미지 이름에 ""를 사용하지 마십시오.
- 왼쪽 상단 모서리 아이콘을 클릭하여블록(그림 2b)을축소, 확장, 확대, 확대 또는 제거합니다.
- 워크플로의 각 파이프라인은 입력 및출력(그림 2b)을통해 연결된 상자 네트워크를 특징으로 합니다. 연결을 만들려면 출력을 클릭하고 커서가 입력에 도달할 때까지 유지 관리합니다. 출력 태그를 클릭하여 연결을 제거할 수 있습니다.
4. 이미지 채널 병합
- 블록 병합 채널을 사용하여 병합된 이미지를 생성합니다. 필요한 경우 병합할 시퀀스가 동일한 이름의 접두사를 갖도록 파일이름을 변경한 다음 고유한 분리기입니다. 예를 들어 이미지 A의 개별 채널 시퀀스의 이름이 ImageA_red ImageA_blue.
참고: 분리기의 경우 이미지 이름에 이미 있는 문자를 사용하지 마십시오. - 동일한 폴더에서 병합할 채널당 새 폴더 를 만듭니다. 예를 들어 빨간색, 녹색 및 파란색 채널을 병합하고 3개의 폴더를 만들고 해당 시퀀스를 이러한 폴더에 저장합니다.
- 블록 병합 채널만사용하고, 다른 블록을 제거하고, 프로토콜을 병합 채널로 저장합니다.
- 상자에 액세스하여 매개 변수를 설정합니다. 각 채널에 대해 상자 채널 번호 X(상자 1, 5 또는 9), 폴더 채널 번호 X(상자 2, 6 또는 10), 분리기 채널 번호 X(상자 3, 7 또는 11) 및 Colormap 채널 nb X(상자 4, 8 및 12)를 각각 채웁니다.
참고: 이 상자는 동일한 채널에 해당하는 각 줄의 4개줄로 가로로 그룹화됩니다. 각 선에서 디스플레이(상자 23, 24 또는 25)도 사용하여 해당 채널의 시퀀스를 직접 시각화할 수 있습니다.- 상자 채널 번호 X에서추출할 채널을 선택합니다(클래식 RGB 이미지, 0=빨간색, 1=녹색, 2=파란색). 사용자는 시퀀스 탭에서 Icy의 검사기 창 내에서 이미지의 다른 채널에 빠르게 액세스합니다.
- 상자 폴더 채널 번호 X에서채널 X의 이미지가 포함된 폴더의 \Name을 작성합니다.
- 상자 분리기 채널 번호 X에서이미지 이름에 사용되는 분리기(이전 예: "_red", "_green" 및 "_blue")를 작성합니다.
- 상자 Colormap 채널 nb X에서Icy에서 해당 채널을 시각화하는 데 사용할 컬러맵 모델을 숫자로 나타냅니다. 사용 가능한 색상 맵은 검사기 창의 시퀀스 탭에 표시됩니다.
- 병합된 이미지의 상자 형식(상자 28)에서 병합된 이미지를 저장하기 위해 확장을 작성합니다.
참고: 2개의 채널만 병합하려면 세 번째 채널에 해당하는 네 개의 상자를 채우지 마십시오.
- 병합 채널 블록의 왼쪽 위 모서리에서 폴더오른쪽에 있는 링크를 직접 클릭합니다. 표시되는 열린 대화 상자에서 상자 폴더 채널 번호 1(상자 2)에 정의된 첫 번째 채널의 시퀀스가 포함된 폴더를 두 번 클릭합니다. 그런 다음 열기를 클릭합니다.
- 병합 채널 블록의 왼쪽 위 모서리에 있는 검은 색 화살표를 클릭하여 프로토콜을 실행합니다(자세한 내용은 7부 참조). 병합된 이미지는 개별 채널의 폴더와 동일한 디렉토리의 병합 폴더에 저장됩니다.
- 상자에 액세스하여 매개 변수를 설정합니다. 각 채널에 대해 상자 채널 번호 X(상자 1, 5 또는 9), 폴더 채널 번호 X(상자 2, 6 또는 10), 분리기 채널 번호 X(상자 3, 7 또는 11) 및 Colormap 채널 nb X(상자 4, 8 및 12)를 각각 채웁니다.
5. 관심 영역의 세분화
참고: 하위 구조 분석기는 단순하고 정교한 알고리즘을 통합하여 이미지 복잡성 및 사용자 요구에 맞게 다양한 대안을 제안합니다.
- 적응된 블록을 선택합니다.
- 개체가 서로 만지지 않거나 사용자가 클러스터된 개체를 개별적으로 구분할 필요가 없는 경우 블록 세분화 A: 클러스터된 개체가 아닌 객체를사용합니다.
- 개체가 서로 만지지 않지만 그 중 일부가 가까이있는 경우 블록 세분화 B: 클러스터된 개체를사용합니다.
- 클러스터링 레벨과 볼록 모양이 높은 객체의 경우 볼록 모양이 있는 클러스터된 객체인 블록 세분화 C: 클러스터된 객체를사용합니다.
- 개체가 높은 클러스터링 레벨을 표시하고 불규칙한 셰이프가 있는 경우 블록 세분화 D: 불규칙한 셰이프가 있는 클러스터된 객체를사용합니다.
- 블록 세분화 E를 사용하십시오: 클러스터된 세포질은 분할된 핵을 마커로 사용하여 개별적으로 접촉하는 세포질을 분할합니다. 이 블록은 반드시 공정하기 위해 분할 된 핵이 필요합니다.
참고: 기본 개체 세분화 프로세스에 맞게 조정된 블록은 동일한 실행에서 여러 블록을 사용하여 특정 하위 구조에 대한 효율성을 비교하거나 다양한 유형의 하위 구조를 분할하는 데 사용할 수 있습니다. 클러스터링 수준이 동일한 이미지 집합 내에서 이질적인 경우 적응된 블록에서 작고 고도로 클러스터된 개체를 별도로 처리합니다.
- 블록 선택 폴더의 출력0(파일)을 선택한 분할 블록의 폴더 입력에 연결합니다.
- 선택한 분할 블록의 매개 변수를 설정합니다.
- 분할 A: 클러스터되지 않은 개체 및 분할 C: 볼록 모양이 있는 클러스터된 개체
- 상자 채널 신호(상자 1)에서 오브젝트의 채널을 세그먼트로 설정합니다.
- 옵션으로, 상자 가우시안 필터 (상자 2)에서, 객체 내부의 신호가 이질적 인 경우 X와 Y 시그마 값을 증가. 가우시안 필터는 질감을 부드럽게 하여 더 균일한 영역을 확보하고 핵 분단의 속도와 효율성을 높입니다. 개체가 작을수록 시그마 값이 낮습니다. 높은 시그마 값을 피하십시오. 기본 값을 0으로 설정합니다.
- 상자 HK-Means(상자 3)에서 강도 클래스 매개 변수와 감지할 개체의 최소 및 최대 크기(픽셀)를 설정합니다.
참고: 강도 클래스의 경우 2값은 배경 과 전경의 2개 클래스에서 픽셀을 분류합니다. 따라서 개체와 배경 사이의 대비가 높을 때 조정됩니다. 전경 오브젝트의 강도가 다르거나 배경과의 대비가 낮은 경우 클래스 수를 늘립니다. 기본 설정은 2입니다. 개체 크기를 관심 있는 개체 주위에 수동으로 ROI를 그리면 개체 크기를 신속하게 평가할 수 있습니다. 커서로 가리키는 경우 ROI 크기(픽셀내 내부)가 이미지에 직접 나타나거나 ROI 통계 창에서 액세스할 수 있습니다(검색 표시줄에서 열림). 최적의 매개 변수는 단일 ROI에서 각 전경 오브젝트를감지합니다. 그들은 수동으로 얼음(탐지 및 추적 | HK-Means). - 상자에서 활성 윤곽(상자 4)에서 개체 테두리 의 검색을 최적화합니다. 이 플러그인에 대 한 철저한 설명서 온라인 사용할 수 있습니다.: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. 올바른 매개 변수는 Icy(탐지 및 추적]에서 수동으로 정의할 수도 있습니다. 활성 윤곽).
- 이 과정에서 세그먼트된 개체의 이미지를 저장하기 위해 폴더가 자동으로 만들어집니다. 상자 텍스트(상자 6)에서 이 폴더의 이름을 지정합니다(예: 분할된 핵). 분할된 개체(Tiff, GIF, Jpeg, BMP, PNG)의 이미지를 저장하는 형식을 설정하려면 분할된 개체의 이미지의상자 형식을 채웁니다. 폴더는 병합된 이미지가 포함된 폴더에 만들어집니다.
- 워크플로를 실행합니다(자세한 내용은 7부 참조).
- 분할 B: 클러스터가 제대로 클러스터된 개체
- 상자 채널 신호, HK-Means, 활성 윤곽선,분할 된 개체 및 텍스트를 저장하는 확장의 매개 변수를 설정하려면 5.3.1에서와 동일한 단계를 따르십시오 (상자 순위는 5.3.1 단계와 동일하지 않습니다).
- 상자 에서 IJ 플러그인 (상자 4)를 호출, 배경 뺄셈을 제어하기 위해 롤링 매개 변수를 설정합니다. 이 매개 변수를 배경의 일부가 아닌 가장 큰 개체의 크기로 설정합니다. 이 값을 줄이면 배경 제거가 증가하지만 전경 신호의 손실을 유발할 수도 있습니다.
- 상자 적응 히스토그램 균등화(상자 6)에서 전경 오브젝트와 배경 사이의 대비를 개선합니다. 경사를 늘리면 더 대조적인 시퀀스가 됩니다.
- 워크플로를 실행합니다(자세한 내용은 7부 참조).
- 분할 D: 불규칙한 모양이 있는 클러스터된 개체
참고: 각 이미지에 세 가지 세분화 방법이 적용됩니다.HK-수단 클러스터링액티브 컨투어 방법적용됩니다. 그런 다음,고전 분수령 알고리즘(유클리디아 거리 맵사용)은 이전에 잘못 분할된 개체에 적용됩니다. 마지막으로,마커 기반 분수령 알고리즘사용됩니다. HK-means 및 마커 기반 유역 방법만 사용자 개입이 필요합니다. 두 방법 모두 모든 이미지(완전 자동화된 버전)에 동일한 매개 변수를 적용하거나 각 이미지(반자동 버전)에 대해 변경할 수 있습니다. 사용자가 이러한 세분화 방법에 대해 교육을 받지 않은 경우 반자동 처리를 권장합니다. 이 블록을 처리하는 동안 수동 개입이 필요합니다. 세분화 메서드가 완료되면 사용자는 다음 분할 메서드가 시작되기 전에 잘못 분할된 개체를 수동으로 제거해야 합니다. 성공적으로 분할된 개체는 저장되며 다음 단계에서 고려되지 않습니다. 이 블록은 블록과 연결되어야 합니다.클러스터/이기종 모양 기본 개체 분할 대화 상자제대로 작동합니다.- https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases이미지J 컬렉션 MorphoLibJ를 다운로드합니다. MorphoLibJ 1.4.0 버전은 이 프로토콜에 사용됩니다. 폴더 얼음 / ij / 플러그인에 파일 MorphoLibJ_-1.4.0.jar을 놓습니다. 이 컬렉션의 내용에 대한 자세한 내용은 https://imagej.net/MorphoLibJ 확인할 수 있습니다.
- 5.3.1 단계와 동일한 단계를 수행하여 상자 채널 신호, 가우시안 필터, 액티브 컨투어,확장의 매개 변수를 설정하여 분할된 개체 및 텍스트를저장합니다. 상자 순위는 5.3.1 단계와 동일하지 않습니다.
- 상자 적응 히스토그램 균등화의 매개 변수를 설정합니다(5.3.2.3 단계 참조).
- 빼기 배경을활성화하려면, 선택 서적 배경 적용에 예 쓰기? (상자 5). 다른, 아니오를 작성합니다. 플러그인이 활성화되면 롤링 매개 변수(단계 5.3.2 참조)를 상자에 배경 매개 변수(상자 7)를 뺍니다.
- HK 수단의 자동화: 모든 이미지(완전 자동화처리)에 동일한 매개변수를 적용하려면 클래스 의 Nb(상자 11), 최소 크기(상자 12), 최대 크기(box13)를 설정합니다(단계 5.3.1 참조). Minimum size 이러한 매개 변수는 최대 전경 픽셀을 선택하고 전경 객체의 개별화를 최적화하도록 설정해야 합니다. 반자동 처리 버전의 경우 개입이 필요하지 않습니다.
- 마커 추출의 자동화: 완전 자동화된 버전의 경우 내부 마커 추출(box 27)을 확장하고 스크립트의 13줄에서 "동적" 매개 변수값을 설정합니다. 반자동 처리 버전의 경우 개입이 필요하지 않습니다.
참고: 마커는 "동적" 매개 변수에 의해 제어되는 입력 이미지에 확장 된 미니마 변환을 적용하여 추출됩니다. 마커 기반 분수령 알고리즘에서 이러한 마커의 플러드는 개체 세분화를 수행하기 위해 시뮬레이션됩니다. 전경 오브젝트의 성공적인 세분화를 위해 전경 오브젝트당 하나의 마커를 추출해야 합니다. 최적의 마커 추출을 위한 "동적" 매개 변수의 설정은 주로 이미지의 해상도에 따라 달라집니다. 따라서 이 매개 변수에 익숙하지 않은 경우 반자동 버전을 사용합니다. - 워크플로를 실행합니다(자세한 내용은 7부 참조).
- 처리 초기에 대화 상자는 HK-means 매개 변수와 마커 기반 유역이 연속적으로 열립니다. 모든 이미지(완전 자동화된 버전)에 동일한 매개 변수를 적용하려면 YES를 클릭합니다. 그렇지 않으면 아니오를 클릭합니다. 정보 상자가 열리며 "HK-Means 플러그인으로 최적의 ROI를 결정하고 이미지를 닫아야 합니다." 확인을 클릭하고 수동으로 HK-수단 플러그인을 적용(탐지 및 추적| 홍콩-수단) 자동으로 열리는 이미지에서. HK-Means 플러그인 상자에서 내보내기 ROI 옵션을 선택합니다. 최대 전경 픽셀을 포함하는 ROI를 적용하고 전경 객체의 개별화를 최적화합니다. 최적의 ROI가 발견되면 이미지를 직접 닫습니다.
- 첫 번째 세분화 메서드가 끝나면 정보 상자가 열리고 "원치 않는 ROI 제거 및 이미지 닫기"를 요청합니다. 이러한 ROI는 분할된 개체의 테두리에 해당합니다. 확인을 선택하고 이미지에서 잘못 분할된 개체의 ROI를 제거하여 자동으로 열립니다. ROI는 커서를 테두리에 배치하고 키보드의 "삭제" 버튼을 사용하여 쉽게 제거할 수 있습니다. 이미지를 닫습니다. 두 번째 세분화 단계가 완료된 후 동일한 절차를 반복합니다.
- 이 단계에서 마커 기반 분수령 알고리즘의 전체 자동화를 위해 YES 버튼을 선택한 경우 이전에 설정된 매개 변수가 모든 이미지에 적용됩니다.
- NO 버튼을 선택하면 정보 상자가 열리며 "내부 마커를 결정하고 조정"하라는 요청이 표시됩니다. 확인을 클릭하고 얼음의 ImageJ 인터페이스 내에서, 플러그인으로 이동 | 모포리브제이 | 미니마와 맥시마| 확장 된 Min & 최대. 작업 중 확장 된 미니마를 선택합니다.
- 미리 보기를 선택하여 자동으로 열린 이미지에서 변환 결과를 미리 시각화합니다. 최적의 마커가 관찰될 때까지 동적을 이동합니다. 마커는 값이 255(반드시 흰색 픽셀은 아님)의 픽셀 그룹입니다. 최적의 매개 변수는 개체당 하나의 마커로 연결됩니다. 이전 두 분할 메서드로 잘 분할되지 않은 나머지 개체에 초점을 맞춥니다.
- 필요한 경우 "열기" 또는 "닫기"와 같은 추가 형태학적 작업을 적용하여마커를 개선합니다(플러그인 | 모포리브제이 | 형태학적 필터). 마커의 최종 이미지를 얻을 때, 그것을 열고 처음에 확장 미니마 작업에 대한 입력으로 사용되는 이미지로 끝나는 다른 모든 이미지를 닫습니다. ImageJ 상자가 이 이미지의 변경 내용을 저장하도록 요청하는 경우 아니오를 클릭합니다.
- 정보 상자(상자 14)가 있는 이미지의 상자 Nb에서 정보 상자가 있는 이미지 수를 결정합니다.
- 세분화 E: 클러스터된 세포질
참고: 이 블록은 세포질 분할을 시작하기 위해 이전에 분할된 핵을 개별 마커로 사용합니다. 핵 분할의 블록은 그것을 사용하기 전에 처리되었는지 확인하십시오.- 상자 채널 세포질 (상자 1)에서, 세포질 신호의 채널을 설정합니다.
- 상자 확장 분할 핵 (상자 2)에서, 분할 된 핵의 이미지를 저장하는 데 사용되는 형식을 작성 (tif, jpeg, bmp, png). 기본 형식은 tif입니다.
- 상자 텍스트(box3)에 분할된 핵을 포함하는 폴더의 \Name을 작성합니다. Text
- 세분화된 세포질(상자 4)의 이미지 상자 형식에서 분할된 개체 이미지(Tiff, GIF, Jpeg, BMP, PNG)를 저장하는 데 사용할 형식을 설정합니다.
- 이 과정에서 세그먼트된 세포질의 이미지를 저장하기 위해 폴더가 자동으로 만들어집니다. 상자 텍스트(상자 5)에서 이 폴더의 이름을 지정합니다(예: 분할된 사이토플라솜). 폴더는 병합된 이미지가 포함된 폴더에 만들어집니다.
- 5.3.1 단계와 동일한 단계를 수행하여 상자 가우시안 필터 및 활성 윤곽의 매개 변수를 설정합니다(주의해야, 상자 랭크는 5.3.1 단계와 동일하지 않음).
- 워크플로를 실행합니다(자세한 내용은 7부 참조).
- 분할 A: 클러스터되지 않은 개체 및 분할 C: 볼록 모양이 있는 클러스터된 개체
6. 형광 신호 감지 및 분석
- 적응된 블록을 선택합니다.
- 블록 형광 분석 A: 1 채널에서,하나의 유형의 분할 된 개체 내부의 한 채널에서 초점의 검출 및 분석을 수행 : 핵 내에서 코일린 포시 (적색 채널)의 검출.
- 블록 형광 분석 B: 2 채널은 동일한 구획에서,하나의 유형의 분할 된 개체 내부의 두 채널에서 포시의 검출 및 분석을 수행합니다 : 핵 내코일린 (빨간 채널) 및 53BP1 (녹색 채널) 초점의 검출.
- 블록 형광 분석 C: 2 개의 구획에서 2 채널,하나 또는 두 개의 채널에서 초점의 검출 및 분석을 수행, 특히 핵 과 해당 세포질 내부: 코일린 포시 (적색 채널)의 검출 모두 핵 과 그 해당 세포질 내의 검출 (적색 채널) 핵 및 G3BP 내의 코일린 포시 (적색 채널)
- 블록 형광 분석 D: 글로벌 전좌에서두 셀룰러 구획(a 및 b)에서 한 채널의 신호 비율을 계산합니다. 예를 들어, 세포질/핵 전좌 분석에서 최종 "결과" 스프레드시트에서 각 이미지에 대해 계산된 백분율의 핵 및 세포질 신호를 내보냅니다. 핵 신호 백분율을 계산하는 데 사용되는 공식은 다음과 같습니다. 이 블록은 모든 셀룰러 구획에 사용할 수 있습니다.
- 블록 형광 분석 E: 개별 세포 전좌에서각 셀룰러 구획에 하나의 채널에서 신호의 백분율을 계산합니다. 이 블록은 단일 세포 수준에서 핵/세포질 전좌 분석에 특별히 최적화되어 있습니다.
참고: 블록 형광 분석 E: 개별 세포 전좌는 단일 세포 수준에서 분석을 수행하기 때문에 핵과 세포질의 효율적인 세분화가 필요합니다.
- 블록 선택 폴더(블록 1)의 출력0(파일)을 선택한 블록의 폴더 입력(검은색 원의 흰색 화살표)에 연결합니다.
- 선택한 블록의 매개 변수를 설정합니다.
- 형광 분석 A: 1 채널, 형광 분석 B: 동일한 구획 및 형광 분석 C의 2 채널: 2 개의 구획에 2 개의 채널
- 상자 폴더 이미지 ROI에서백슬래시 앞에 분할된 개체의 이미지가 포함된 폴더의 이름을 작성합니다. (예를 들어: \분할된 핵).
- 분할된 개체의 이미지 형식(상자 2)에서 분할된 개체의 이미지를 저장하는 데 사용되는 형식을 작성합니다(tif, jpeg, bmp, png). 기본 형식은 tif입니다.
- 상자에서 국경을 죽여? Yes 그렇지 않으면 아니오를 작성합니다. ImageJ의 MorphoLibJ 컬렉션의 설치는이 기능을 사용 하 여 필요 (단계 참조 5.3.3).
- 상자(es) 채널 스팟 신호에서반점을 감지해야 하는 채널을 설정합니다. 클래식 RGB 이미지에서 0=빨간색, 1=녹색 및 2=파란색입니다.
- 상자에 국화 된 분자의 이름,반점에 국소화 분자의 이름을 작성합니다. 입력할 필드 수는 분자 수에 따라 다릅니다.
- 상자(es) 웨이블렛 스팟 검출기 블록에서각 채널에 대한 스팟 감지 매개 변수를 설정합니다. 배율(들)을 설정하고(스팟 크기라고 함) 및 검출의 감도(감도가 작을수록 감지된 스팟 의 수가 감소하고 기본 값이 100이고 최소 값이 0이 됨). 이 플러그인의 철저한 문서는 온라인으로 사용할 수 있습니다 : http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. 매개 변수는 얼음(탐지 및 추적 |에서 수동으로 정의 할 수 있습니다. 스팟 검출기).
- 옵션으로 상자에서 크기별로 ROI를 필터링하여크기 간격(픽셀)을 설정하여 반점이 감지되는 세그먼트 객체를 필터링합니다. 이 단계는 세분화된 아래 또는 과도하게 분할된 개체를 제거하는 데 특히 유용합니다. 개체 크기를 수동으로 추정하려면 5.3.1 단계를 참조하십시오. 기본 매개 변수에는 크기별로 ROI 필터링이 포함되지 않습니다. 두 구획의 블록 2 채널에는 크기별로 핵 필터(상자 19) 및 크기별 필터 세포질(상자 46)의 두 개의 상자가 포함되어 있습니다.
- 선택적으로 상자에서 크기별로 반점을 필터링하여크기(픽셀)에 따라 감지된 반점을 필터링하여 원치 않는 아티팩트를 제거합니다. 스팟 크기를 수동으로 추정하려면 감지 및 추적을 클릭하고 스팟 감지기 플러그인을 엽니다. 출력 옵션에서 ROI로 내보내기를 선택합니다. 기본 매개 변수에는 크기별로 스팟 필터링이 포함되지 않으며 필터링된 반점이 분석을 고려하지 않도록 주의해야 합니다. 입력할 필드 수는 채널 수에 따라 다릅니다.
- 선택적으로, 상자 필터 반점에,감지 된 반점에 추가 필터 (대조, 균일성, 둘레, 둥근)를 적용합니다. 기본 매개 변수에는 스팟 필터링이 포함되지 않으며 필터링된 스팟이 분석을 고려하지 않도록 주의해야 합니다. 입력할 필드 수는 채널 수에 따라 다릅니다.
- 선택적으로, 상자 스팟 크기 임계값에서분석된 반점의 영역(픽셀)에 대한 임계값을 설정합니다. 이 임계값 이하의 계산된 스팟 수는 최종 결과 스프레드시트에서 내보냅니다. 정보에 입각할 상자 수는 채널 수에 따라 다릅니다.
- 워크플로를 실행합니다(자세한 내용은 7부 참조). 데이터는 병합된 이미지가 포함된 폴더에 저장된 결과 스프레드시트에 내보내지 않습니다.
- 형광 분석 D: 글로벌 전좌 및 형광 분석 E: 개별 세포 전좌:
- 상자 폴더 이미지(상자 1 및 2)에 분할된 개체의 이미지가 포함된 폴더의 \Name을 작성합니다. 블록 형광 분석 D: 글로벌 전좌에서두 가지 유형의 ROI는 ROI a 및 ROI b로 식별됩니다. 블록 형광 분석 E: 개별 세포 전좌,폴더 이미지 분할 핵 및 폴더 이미지 분할 세포질 상자를, 분할 된 핵과 세포질을 포함하는 폴더의 이름을 각각 작성합니다.
- 상자 채널 신호(상자 3)에서 신호의 채널을 입력합니다.
- 분할된 개체의 이미지 형식(상자 4)에서 분할된 개체의 이미지를 저장하는 데 사용되는 형식을 작성합니다(tif, jpeg, bmp, png). 기본 형식은 tif입니다. 테두리 개체를 제거할 수 있는 데 보더 테두리 제거 옵션도 있습니다(6.3.1 단계 참조).
- 선택적으로, 상자에서 크기별로 ROI를 필터링하고,크기 간격(픽셀)을 설정하여 분할된 객체를 필터링합니다. 이 단계는 세분화된 아래 또는 과도하게 분할된 개체를 제거하는 데 유용할 수 있습니다. 개체 크기를 수동으로 추정하려면 5.3.1 단계를 참조하십시오. 입력할 필드가 두 개 있습니다. 기본 매개 변수에는 크기별 ROI 필터링이 포함되지 않습니다.
- 워크플로를 실행합니다(자세한 내용은 7부 참조). 병합된 이미지가 포함된 폴더에 저장된 스프레드시트 결과에서 데이터를 내보냅니다.
- 형광 분석 A: 1 채널, 형광 분석 B: 동일한 구획 및 형광 분석 C의 2 채널: 2 개의 구획에 2 개의 채널
7. 프로토콜 실행
- 실행에서 한 블록을 처리하려면 선택한 블록과 블록 선택 폴더 사이의 연결을 제거합니다. 원하는 블록을 1등급에 놓습니다. 원하는 블록의 왼쪽 위 모서리에서 폴더오른쪽에 있는 링크를 직접 클릭합니다. 표시되는 열린 대화 상자에서 병합된 이미지가 포함된 폴더를 두 번 클릭합니다. 그런 다음 열기를 클릭합니다. 실행 실행을 클릭하여 워크플로를 시작합니다. 중지 버튼을 클릭하여 처리를 중지할 수 있습니다.
- 실행에서 다른 블록을 처리하려면 선택한 블록의 연결을 블록 선택 폴더(블록 1)로 유지합니다. 해당 순위에서 워크플로를 잘 처리할 수 있는지 확인합니다. 예를 들어 특정 블록에서 처리하려면 분할된 개체가 필요한 경우 세분화 블록이 이전에 처리해야 합니다. 워크플로를 실행하기 전에 사용하지 않은 블록을 제거하고 새 프로토콜을 다른 이름으로 저장합니다.
- 실행 실행을 클릭하여 워크플로를 시작합니다. 열린 대화 상자가 나타나면 병합된 이미지가 포함된 폴더를 두 번 클릭합니다. 그런 다음 열기를 클릭합니다. 워크플로가 자동으로 실행됩니다. 필요한 경우 중지 버튼을 클릭하여 처리를 중지합니다.
- 처리가 끝나면 실행된 워크플로가 오른쪽 아래 모서리에 성공적으로 나타나고 모든 블록에 녹색기호(그림 2b)로플래그가 지정된지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 오류 기호를 표시하는 블록 과 내부 상자는 올바른 요소를나타냅니다(그림 2b).
참고: 워크플로를 성공적으로 실행한 후에는 새 실행을 직접 시작할 수 없으며 워크플로를 다시 처리하려면 "처리할 준비가 됨"이라는 기호로 하나 이상의 블록에 플래그를 지정해야 합니다. 블록의 상태를 변경하려면 이 블록 내부의 두 상자 사이의 링크를 삭제하고 다시 만들거나 프로토콜을 닫고 다시 엽니다. 처리 중에 오류가 발생하면 새 실행을 직접 시작할 수 있습니다. 새 실행 중에 파이프라인의 모든 블록이 처리됩니다.
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Representative Results
설명된 모든 분석은 64비트 버전의 Java와 함께 작동하는 표준 랩톱(2.80GHz의 쿼드 코어 프로세서)에서 수행되었습니다. 랜덤 액세스 메모리는 분석할 이미지의 양과 해상도에 따라 고려해야 할 중요한 매개 변수입니다. 자바의 32 비트 버전을 사용 하 여 약 1300 MB에 메모리를 제한, 빅 데이터 분석에 적합 할 수 있는 반면, 반면 64 비트 버전 아이시에 할당 된 메모리를 증가 수 있습니다. 그림 3은 다양한 유형의 이미지와 다른 해상도에 대한 세분화에 필요한 시간을 보고합니다. 고해상도가 기본 개체 세분화 시간을 크게 증가시킨다는 것을 확인합니다.
다음 단락에 제시된 데이터는 하위 구조 분석기 워크플로우가 세포 및 분자 생물학에서 발생하는 일반적인 문제의 대부분을 해결하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다 (세포 계산, 포시 계수 및 분석, 전좌 분석).
주어진 구획 내에 집중된 분자의 정확한 비율 또는 세포 외 도메인에 걸쳐 국소화의 변화의 수많은 세포에서 측정은 특히 수동으로 수행 될 때 매우 번거롭고 오류가 발생하기 쉬운 작업일 수 있습니다. 도 4는 TNFα 자극에 대응하여 전사 계수 NFθB의 잘 설명된 핵 전좌를 신속하고 정확하게 정량화하는 워크플로우의 능력을 보여 준다. 분석에 사용되는 이미지는 Ilya Ravkin(http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm)에의해 정중하게 컴파일되었으며 브로드 바이오 이미지 벤치 마크 컬렉션16에서공개적으로 사용할 수 있습니다. 이 세트에는 TNFα의 농도가 증가함에 따라 처리된 MCF7 및 A549 세포주 이미지가 포함되어 있습니다. 분석은 MCF7 세포주(도4a)로부터40,000개 이상의 세포와 96개의 영상(각 채널에 대한 48개의 이미지)에서 수행되었다. 전체 분석(이미지 가져오기에서 데이터 저장까지)은 26분이 걸렸습니다. 각 이미지는 특정 TNFα 농도에 해당합니다. NFθB의 핵/세포질 비율은 주어진 이미지에 대한 모든 세포에 걸쳐 균일했다. 이러한 이유로, 각 이미지에 대해, 모든 핵 또는 세포질 픽셀의 값을 합산하여 NFθB의 핵 및 세포질 비율을 계산하고, 세분화 하는 동안 핵/세포질을 만지는 개별화는 필요하지 않았다. DAPI 이미지는 분할 C에서 처리되었다: 핵을 분할하는 볼록 모양 블록이 있는 클러스터된 물체와 녹색 채널은 세분화 E: 클러스터된 세포질 블록(도4b)으로세포질을 묘사하는 데 사용되었다. 형광 분석 D: 글로벌 전좌 블록은 핵 및 세포질 픽셀 값의 합을 수출하는 데 사용되었습니다. 얻어진 데이터는 용량 반응 곡선(도4c)으로나타내며 TNFα의 농도가 증가함에 따라 자극 후 NFθB 핵 비율의 증가를 예시한다.
워크플로는 다양한 셀룰러 구획에서 전역 강도 신호를 분석할 뿐만 아니라 foci를 감지하고 해당 기능에 대한 특정 정보를 추출하는 데 사용할 수도 있습니다. 도 5a는 mRNA 데칭 4(EDC4) 단백질의 증강을 국소화함으로써 개별 세포에서 P-바디의 검출을 도시한다. 분할 A: 비클러스터된 물체 블록은 낮은 수준의 클러스터링을 제시하는 핵을 분할하는 데 사용되었으며, 분할 E: 클러스터된 세포질 블록은 세포질과 형광 분석 C: EDC4 포시를 검출하기 위해 두 개의 구획에서 2개의 채널을 묘사하도록 하여 서식성 분석 C를 묘사했습니다. 분할된 개체는 식별(분할된 nuclei_0, 분할된 cytoplasms_0), 및 EDC4와 같은 해당 워크시트(분할된 핵 정보 및 분할된 세포질 정보)로 수집되는 다중 정보는 각 ROI(그림5b)에서검출된 신체의 강도 또는 수/크기이다. 분석되기 전에, 검출된 바디는 그들의 지역에 따라 예비적으로 여과될 수 있고, 현미경의 해상도 힘 의 밑에 객체를 제외하는 것이 유용할 수 있습니다. 보존된 개체의 크기를 추정하기 위해 추가 영역 임계값을 도입할 수 있습니다. 검출된 모든 바디의 영역은 전용 워크시트(분할된 nuclei_Distribution 초점 크기, 분할된 cytoplasms_Distribution cytoplasms_Distribution 초점 크기)로 보고됩니다. 이 예에서는 세포질 EDC4 포시가 검출되는 두 세포(분할된 nuclei_0 and_1 및 분할된 cytoplasm_0 and_1)의 분석을 강조합니다. EDC4 단백질의 신호가 핵 및 세포질 구획 모두에서 검출되더라도 세포질 포시만 P-바디에 해당합니다. 핵 신호는 면역 형광 실험을 수행하는 데 사용되는 항체의 상호 반응성으로부터 가장 가능성이 발생합니다. 각 초점의 픽셀 크기가 주어집니다.
이어서, 카잘바디에 대한 산화스트레스(OS)의 효과는 아직 알려지지 않았지만, 워크플로우의 다재다능함을 활용해 시간 운동(500 μMH2 O2)으로OS 유도2후 2~20시간 동안 연구하였다(그림6). 카잘 바디는 전사 속도 또는 세포 주기 진행과 같은 특정 파라미터의 통제 하에 핵중내의 핵및 용해를 형성하고 용해하는 동적 구조이다. 카잘 바디는 그들의 주요 구조 및 기능적인 분대, 코일린 단백질을 현지화하여 시각화되었습니다. Cajal 바디의 수 및 크기에 대한 정보는 3개의 채널을 포함하는 고해상도 심상 (3840X3072)에서 2300개의 개별 세포를 연구하여 수집하였다: DAPI(블루), 53BP1(녹색) 및 코일린(빨간색)(그림 6a). 전체 처리는 1시간 미만이 걸렸습니다. 핵이 볼록 모양을 제시하고 그 중 일부는 클러스터되었기 때문에 블록 세분화 C: 볼록 모양이 있는 클러스터된 물체가 분할을 수행하도록 선택되었다. OS는 DNA 이중 가닥 브레이크(DDSBs)를 유도하는 것으로 알려져 있으며, DNA 손상 신호 경로의 필수적인 이펙터로 알려진 p53 결합 단백질 1(53BP1)은 스트레스와 비스트레스 세포를 구별하기 위한 마커로 사용되었다. 실제로, DNA 손상이 없는 경우, 53BP1은 핵종양 내에 균질하게 분포되는 반면 DNA 손상에 따라, 그것은 현미경 검사법에서 쉽게 구별할 수 있는 포시를 형성하는 DDSBs에 집중합니다. 각 셀에서 53BP1 및 코일린 핵 포시의 수와 크기는 블록 형광 분석 B: 2 채널을 동일한 구획에사용하여 분석되었다. 첫째, 53BP1 데이터의 분석은 운동학의 각 시간 점에 대해 그들의 응력 상태에 따라 세포를 분류하는 가장 좋은 임계값을 결정하는 데 도움이 되었습니다. 전체 운동 중, OS는OS(도 S1)의유도 후 2, 4, 8h에서 11배 증가하여 53BP1 포시 수의 현저한 증가를 유도한다. 이 효과는 스트레스가 없는 세포에서 DSB의 초기 수준이 높기 때문에 6h(6.5배)에서 덜 두드러집니다. 20 시간 후에도 지속적인 증가가 남아 있습니다 (거의 6 배). 이러한 데이터는 OS를 유도하고 53BP1을 현미경 검사법의 초기 및 후기 관찰 모두에 대한 효율적인 스트레스 마커로서 확립하는 치료의 효율성을 반영한다. 한편, 낮은 수준의 DDSB를 가진 스트레스 세포의 작은 비율은 운동학의 매 시점에서 관찰되었으며, 세포가 균일하게 스트레스를 받지 않는다는 것을 시사하여 스트레스 실험에서 스트레스 마커를 사용하는 것의 중요성을 적용했다. ROC 분석에 기초하여, 17 53BP1 초점의 전체 임계값은 운동학(FigureS1)을통해 응력 및 스트레스되지 않은 세포를 구별하기 위해 선택되었다.
그런 다음 코일린의 핵 포시의 수와 크기를 세포의 응력 상태에 따라 분석했다. 스트레스 유도 후 2, 4, 6h의 포시의 수가 현저한증가(도 6b). 가장 지속적인 효과는 2h에서 관찰되며, 스트레스가 없는 세포에서 0%에서 75%로 증가하는 10개 이상의 포시를 갖는 세포의 수가 관찰된다. 더욱이, 그 시점의 응력 세포의 25% 이상은 20코일린 포시를 가지고 있었습니다. 이 효과는 8시간까지 점진적으로 감소합니다. 20h에서, 첫번째와 제 3 사분위수의 작은 증가가 관찰됩니다, 그러나 데이터는 또한 세포의 84% 및 80%가 비 응고 및 응력 세포에서 8 foci 미만을 제시하는 것을 보여줍니다, 각각. 이러한 데이터는 OS가 또한 초기 효력과 다를 수 있는 Cajal 바디의 핵을 통제하는 매개변수에 늦은 효력이 있다는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도, 코일린 핵 포시의 특징을 주의 깊게 분석한 결과 코일린 포치의 수가 증가하여 크기가 감소하는 것으로나타났다(도 6c). 예를 들어, OS 유도 후 2시간 후, 0.2 μm2 이하면적의 코일린 포시의 비율은 26%에서 64%로 증가합니다. 이 효과는 8시간까지 감소하지만, 카잘 바디의 수와 달리 20h에서 큰 변화는 관찰되지 않습니다. 이것은 Cajal 바디의 초기 및 후반 핵연재가 다른 사건이다는 것을 반영할 지도 모릅니다.
이 모든 데이터는 OS가 카잘 바디의 핵형성 힘을 변화시키고, 수많은 작은 핵 포시로 핵소플라즈마 재분배를 유도한다는 것을 강력하게 건의합니다. Cajal 바디의 핵은 그들의 단백질 및 RNA 분대에 의해 구동되기 때문에, 이것은 OS 효력이 Cajal 바디의 조성을 바꿀 수 있다는 것을 건의합니다. 카잘 바디 내, 코일린 단백질은 SMN 복합체 및 Sm 단백질의 분대와 같은 몇몇 다른 단백질 파트너와 상호 작용합니다. 이러한 상호 작용은 종종 코일린의 인광 도메인을 포함, 하나는 카잘 몸의 구조의 수정코일린의 인산화 상태의 변화에 연결 될 수 있다고 상상할 수 있습니다. 더욱이, 최근 연구는 카잘 바디가 핵 내에서 무작위로 국소화되지 않으며, 특정 유전자 loci 17과의 근위 관계를 통해 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다는 것을입증했다. 이러한 모든 사실을 감안할 때, Cajal 신체의 기능에 미치는 영향이 구조의 변화에 수반한다면 놀라운 일이 아닙니다. 이러한 결과로부터, 우리는 또한 이러한 Cajal 바디의 리모델링이 OS의 수동적인 결과인지 또는 특정 유전자 loci와 상호 작용하여 반응에 참여하는지 물어볼 수 있습니다, 예를 들면.
코일린 발현의 변화가 국소화를 바꾸고 카잘 바디의 핵을 바꿀 수 있는지 시험하기 위하여, 우리는 외인성 GFP-코일린 융합 단백질을 과발하게 표현했습니다. 핵은 클러스터되지 않았기 때문에 블록 세분화 A: 비 클러스터된 객체로 세분화가 수행되었다. 이어서, GFP-코일린(녹색 신호, 채널 2) 과발현의 수준에 따라 코일린 포치(적색 신호, 채널 1)의 수와 크기를 정확하게 정량화하기 위해, 블록 형광 분석 B: 2 채널이 동일한 구획에서 사용되었다. GFP-코일린의 수준은 개별 핵에서 GFP 신호의 평균 강도에 의해 반영되었다(도7a). GFP-코일린 과발현(GFP 강도 10보다 높은 GFP 강도)의 중간 또는 높은 수준을 가진 세포에서 핵당 카잘 체의 수는 최대 21초점(도7b)까지표시되는 일부 핵을 통해 크게 증가한다. 우리는 또한 카잘 바디의 밝기 (평균 강렬)가 강도 채도로 이끌어 내는 과발현 수준과 병행하여 상당히 증가하는 것을 주의했습니다. 따라서 이러한 포화 영역은 더 작고 희미한 초점의 존재를 가리을 수 있습니다. 배지 또는 높은 수준의 GFP-코일린을 과발현하는 세포에서, 카잘 바디의 크기도 크게 증가하며, 중앙값은 1에서 2 μm2(도 7c)로상승한다. 더욱이, GFP-코일린 발현 수준이 높은 세포의 25% 이상이 2.5 μm2보다큰 영역을 가진 포시를 제시하지만, 비트랜스감염 된 세포에서 0.8 μm2를 초과하지 는 않는다. 결론적으로, GFP-코일린 과발현은 카잘 바디의 수와 크기 모두에서 현저하게 증가합니다. OS는 Cajal Body의 수를 증가하지만 크기를 줄이기 때문에 이러한 데이터는 Cajal Body의 구조에 대한 OS 효과가 코일린의 셀룰러 양에 미치는 영향이 아니라 구성의 변화에 의해 가장 유도된다는 것을 반영할 수 있습니다.
그림 1: 하위 구조 분석기 파이프라인
워크플로우는 생체 이미지 정보학을 위한 개방형 커뮤니티 플랫폼인 Icy에서 개발되었으며 여러 형광 현미경 이미지에 대한 자동 분석을 수행합니다. 첫째, 다중 채널 이미지는 프로토콜 내에서 자동으로 로드되고 필요한 경우 신호 대 노이즈 비율을 개선하고 이미징 아티팩트를 제거하기 위해 미리 처리됩니다. 그런 다음 이미지 세분화는 관심 영역(ROI)을 배경에서 격리합니다. 클러스터링 수준과 관심 있는 개체의 특성에 따라 여러 분할 방법을 사용할 수 있습니다. 분할된 개체는 특정 폴더에 특정 설명자(예: 이미지 name_Nucleus_1)로 저장되며 후속 분석에 사용/다시 사용할 수 있습니다. 그런 다음 반점과 같은 형광 신호가 ROI 내에서 분석되고 여러 피쳐(위치, 크기, 모양, 강도, 텍스처, 현물 번호 및 크기)를 자동으로 생성된 스프레드시트로 내보냅니다. 검출된 반점 수와 같은 모든 측정된 피쳐는 해당 ROI의 설명자에게 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 얼음 워크플로우의 그래픽 인터페이스
(a)워크플로는 13개의 일반 블록으로 구성되며, 이는 일반적인 기능에 따라 그룹화될 수 있습니다: 폴더 선택(블록 1)은 이미지에 대한 액세스를 허용합니다. 병합 채널(블록 2)은 다양한 이미지 채널을 병합하는 데 사용됩니다. 블록 3 ~8은 객체 세분화에 전념하며, 각 객체는 특정 컨텍스트에 맞게 조정됩니다: 분할 A: 클러스터된 객체, 분할 B: 클러스터된 객체, 분할 C: 볼록 모양이 있는 클러스터된 객체, 분할 D: 불규칙한 모양이 있는 클러스터된 객체(블록 7, 블록 6과 관련하여 작동), 분할 E: 클러스터된 사이토플라스. 블록 9 에서 11은 세포 전구 내에서 포시를 계산 / 분석하는 데 사용됩니다 : 형광 분석 A : 1 채널, 형광 분석 B : 동일한 구획 및 형광 분석 C : 2 개의 구획에서 2 개의 채널. 블록 12 및 13은 전좌 이벤트의 분석에 적응됩니다: 형광 분석 D: 글로벌 전좌 및 형광 분석 E: 개별 세포 전좌. (b)블록 아키텍처의 글로벌 프레젠테이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미지 해상도 및 개체 클러스터링 레벨의 함수로서 세분화에 필요한 시간
(a)이미지 해상도 및 클러스터링 수준에 따라 세분화를 수행하는 데 필요한 시간의 그래픽 그림입니다. 두 개의 서로 다른 분할 블록이 테스트되었습니다: 분할 A(클러스터되지 않은 객체의 경우) 및 분할 D(불규칙한 모양이 있는 클러스터된 객체의 경우). Segmentation D 처리 시간(이미지당 초)은 이미지 해상도(픽셀 수)의 함수로 플롯됩니다. (b) 세분화 A 또는 세분화 D 블록으로 분석된 이미지의 예. DAPI 염색 및 분할된 핵이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: TNFα 자극에 대한 응답으로 NFθB 핵 전좌 분석
(a)BBBC014 이미지 세트(Broad Bioimage 벤치마크 컬렉션)로부터 TNFα로 처리된 인간 MCF7 세포(인간 유방 아데노시노종 세포주)의 이미지의 예(Broad Bioimage 벤치마크 컬렉션)12. 전사 인자 NFθB의 국소화는 TNFα의 12 증가 농도(0 에서 10-7g/mL)로 처리된 세포에서 연구되고 있다. 각 농도에 대해, 4 복제가 수행되었다. DAPI 이미지(blue channel)는 세분화 C에서 처리하였다: 핵을 분할하기 위해 볼록 모양 블록이 있는 클러스터된 물체, 그리고 FITC(녹색 채널)로 염색한 NFθB 염색을 세분화 E: 클러스터된 세포질 블록으로 구분하는 데 사용되었다. 형광 분석 D: 글로벌 전좌 블록은 핵 및 세포질 픽셀 값의 합을 수출하는 데 사용되었습니다. (b)분할된 핵(grey) 및 세포질(white)은 각 구획에서 NFθB 형광 신호의 총 강도를 결정하는 데 사용된다. (c)데이터 분석에서 얻은 용량 반응 곡선은 TNFα 농도가 증가함에 따라 NFθB 핵 비율의 증가를 보여줍니다. 이미지는 8비트 BMP 형식으로 되어 있으며 이미지 크기는 1360 x 1024 픽셀입니다. 각 농도에 대해 4 복제 사이의 표준 편차가 계산되고 오류 막대로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 개별 세포에서 세포질 내EDC4 초점(P-바디)의 정량화
(a)DAPI(블루 채널) 및 판로이드(적색 채널)와 공동 염색하면 세포 핵과 F-액틴의 분할 및 식별을 각각 허용한다. EDC4 단백질(green channel)은 독점적으로 세포질로 알려진 P-체체의 검출을 위한 마커로서 사용된다. 스케일 바, 10 μm.(b)Foci는 계산되며 여러 피쳐(여기에 픽셀로 해당 영역)가 여러 시트로 구성된 결과 스프레드시트로 내보내됩니다. 2장은 핵 의 분석에 전념하고 2 개의 세포질 분석에 전념한다. 각 원시에는 특정 ROI의 정보가 포함됩니다. Nucleus/Cytoplasm 정보 시트에서는 분할된 개체의 특성(ROI ID, 크기 및 평균 강도)을 내보내고 각 ROI 내에서 검출된 포시 수가 있습니다. 필요한 경우 크기 임계값(이 예제의 100픽셀)을 추가할 수 있으며 이 임계값 이하의 foci 수를 두 개의 마지막 열에 보고합니다. 핵/Cytoplasm_Distribution 포시 크기 시트에서, 검출된 모든 초점의 영역(픽셀)은 해당 ROI의 원시에서 보고된다. 이 예에서는 세포질 EDC4 포시가 검출된 두 세포(분할된 cytoplasm_0 and_1)의 분석을 강조합니다. 각 초점의 픽셀 크기도 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 산화 스트레스 후 코일린 및 53BP1 핵오프라증 분포의 역학
포시의 수와 크기를 분석한 것은 3개의 독립적인 운동학으로부터 매 시간마다 110개 이상의 개별 세포를 기반으로 하였다. (a)500 μM H 2 O2를가진 치료 운동전반에 걸쳐 HeLa S3 세포에서 코일린2및 53BP1 초점의 면역 형광 검출. 53BP1은 DNA 이중 스트랜드 브레이크 부위에 집중하며 각 세포에 대한 치료의 효율성을 평가하는 데 사용됩니다. 코일린은 카잘 바디에 풍부합니다. 세포는 산화 스트레스 유도 후 2, 4, 6, 8 및 20h를 고정하고 항 코일린 (빨간 채널) 및 항 -53BP1 (녹색 채널) 항체와 공동 염색하였다. 스케일 바, 10 μm.(b)산화 응력 후 코일린 핵 포시의 개수. 결과는 중앙 마크가 중앙표가 중앙값인 상자 플롯으로 표시되며, 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리는25번째 및75번째 백분위수입니다. H2 O2로치료된 세포에서 코일린 포시의 수가 현저히 증가하여 2 및 4 h의 치료 후 최대화된다.2 Wilcoxon - Mann Whitney 테스트 분석은 치료되지 않은 세포와 H2O2 처리 셀(*, p&0.05; **, p&0.01; ***, p&0.001)의 상당한 차이를 보여줍니다. (c)코일린 포시 영역(μm2)의기능에서 세포의 비율. 대부분의 포시는 컨트롤에 비해 2h 및 4 시간 지점에서 더 작은 영역을 가지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: GFP-코일린 융합 단백질을 과발현하는 세포에서 카잘 바디의 핵형성 연구
(a)HeLa S3 세포는 제조업체의 권고에 따른 표준 절차를 사용하여 GFP-코일린 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 500ng를 가진 생물학적 삼중생물에서 과도하게 변형되었다. 48 h 후, 세포는 코일린에 대한 항체로 고정되고 염색되었다. DAPI(블루 채널)는 핵을 분할할 수 있도록 허용합니다. 이러한 분석을 위해, 100개 이상의 세포가 분석되었다. GFP 신호는 이토피 코일린-GFP 단백질(녹색 채널) 국소화를 반영하는 반면, 코일린 신호(red channel)는 내인성 및 외인성 단백질 국소화모두에 해당한다. 각 핵에 대해, GFP 신호의 평균 강도는 코일린 발현의 수준을 반영한다. 이 매개 변수에 따르면, 코일린 포시의 특징은 블록 형광 분석 B: 2 채널을 동일한 구획에사용하여 분석되었다. 스케일 바, 10 μm.(b)코일린 포시의 수와 핵당 GFP 강도 사이의 관계. 결과는 중앙 마크가 중앙값이 중앙값인 상자 플롯으로 표시되며, 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리는25번째 및75번째 백분위수입니다. 윌콕슨 - Mann Whitney 테스트 분석은 GFP 강도 >10 (*, p&0.05; **, p&01; ***, p&0.001)에 대한 초점 의 수를 크게 증가시보여줍니다. (c)코일린 포시의 영역과 핵당 GFP 강도 의 관계. 결과는 중앙 마크가 중앙값이 중앙값인 상자 플롯으로 표시되며, 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리는25번째 및75번째 백분위수입니다. 윌콕슨 - Mann Whitney 테스트 분석은 GFP 강도 >10 (*, p&0.05; **, p&01; ***, p&001)에 대한 코일린 포시 영역의 현저한 증가를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 S1: 산화 스트레스 후 53BP1 핵오프라증 분포의 역학
(a)상이한 배양 시간 후 처리되지 않은 또는 H2O2 처리 된 세포에서 53BP1 핵 포시의 정량화. 결과는 중앙 마크가 중앙값이 중앙값인 상자 플롯으로 표시되며, 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리는25번째 및75번째 백분위수입니다. Wilcoxon - Mann Whitney 테스트 분석은 치료되지 않은 세포와 H2O2 처리 셀(*, p&0.05; **, p&0.01; ***, p&0.001)의 상당한 차이를 보여줍니다. (b)운동학의 각 시간지점에 대해, ROC(수신기 작동 특성) 곡선은 응력 및 스트레스가 없는 세포를 구별하는 최상의 임계값을 결정하기 위해 확립되었다. 각 테스트의 매개 변수는 표에 보고됩니다 (민감도, 특이성, TP: 참 긍정, TN: 참 음수, FP: 거짓 긍정, FN: 거짓 부정). 이러한 데이터에서, 17 53BP1 foci의 글로벌 임계값은 운동학을 통해 비 응력 세포에서 응고를 차별하기로 결정했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
형광 세포 이미지의 분석에 사용할 수있는 무료 소프트웨어 도구의 증가가 사용할 수 있습니다. 사용자는 문제가 있는 복잡성, 이미지 처리에 대한 지식 및 분석에 지출하려는 시간에 따라 적절한 소프트웨어를 올바르게 선택해야 합니다. 얼음, 셀 프로파일러, 또는 ImageJ / 피지는 유용성과 기능 모두를 결합하는 강력한도구입니다 3. Icy는 명확한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 제공하는 독립 실행형 도구이며, 특히 워크플로를 쉽게 설계하거나 조작할 수 있는 "프로토콜" 포인트 및 클릭 인터페이스를4. 이 소프트웨어의 기능은 ImageJ 플러그인을 지원하고 활용함으로써 강화되며, 많은 문서가 많은 사용자 커뮤니티 덕분에 사용할 수 있습니다. 우리는 하위 구조 분석기 워크플로우를 개발하기 위해 Icy 소프트웨어의 유용성과 기능의 강력한 조합을 사용했다. 주요 목적은 여러 이미지에서 세포 형광 신호의 전체 분석을 수행하기 위해 자동화 된 솔루션을 제안하는 것입니다. 이 분석은 이미지 전처리, 물체 세분화 및 형광 신호 분석을 포함합니다.
여러 프로토콜은 Icy 웹 사이트에서 감사하게 공유되며 세포 foci와 같은 형광 신호를 감지하고 분석하기 위해 얼음 기능을 사용할 것을 제안합니다. 그러나 이러한 프로토콜 중 일부는 실행당 하나의 이미지만 처리하거나 결과를 특정 파일로 내보내거나 단일 채널을 분석하지 않습니다. 다른 사람들은 관심 영역(ROI)을 결정하기 위한 예비 세분화를 포함하지 않거나 고도로 클러스터된 개체의 세분화에 적합하지 않은 "HK-means"와 같은 간단한 알고리즘을 제안하지 않습니다. 하위 구조 분석기는 이미지 사전 처리에서 개체의 세분화 및 형광 신호의 검출/분석에 이르기까지 이미지 분석의 모든 단계를 자동화합니다. 또한 이 프로토콜은 개체 세분화 및 데이터의 내보내기를 위한 간단하거나 복잡한 방법(분할된 개체의 이름, foci Analysis)이 문제가 있는 최적화된 출력으로 실현되는 것을 제안합니다. CellProfiler는 또한 기능을 캡슐화하는 모듈로 구성된 강력한파이프라인을 제안합니다(18,,19). 사용 가능한 파이프라인은 특정 문제에 잘 적응됩니다. Icy 워크플로우는 서로 다른 상자의 네트워크이며 각 워크플로는 특정 작업을 수행합니다. "프로토콜" 인터페이스를 통해 네트워크를 구성하는 상자는 직관적이고 조작하기 쉽습니다. 하위 구조 분석기는 채널의 단순한 병합, 두 개의 세포 이하 구획 사이의 형광 신호 분포의 정량화, 개별 세포에서 하나 또는 두 개의 셀룰러 구획에서 하나 또는 여러 채널에서 초점의 분석과 같은 여러 컨텍스트에 적응된다. 여러 디스플레이를 사용하면 각 실행 중에 중간 결과를 시각화하여 처리를 제어할 수 있습니다. 또한 Icy는 전체 이미지 집합에서 메서드를 사용하기 전에 일부 이미지에서 특정 매개 변수를 수동으로 테스트하기 위해 워크플로에서 메서드를 그룹화하는 아이콘 막대를 제공합니다.
생체 이미지 분석 필드와 마찬가지로 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 개체 세분화입니다. 프로토콜은 대부분의 시간 세포 핵인 기본 개체의 분할을 제안하며, 또한 세포 내의 두 번째 유형의 객체를 분할하는 또 다른 블록을 포함합니다. 핵 분할은 물체가 서로 만지거나 겹쳐서 고도로 클러스터될 때 어려울 수 있습니다. 기본 개체의 분할에 대한 다른 대안은 고도로 클러스터된 개체의 전체 세분화에서 범용 알고리즘의 성공이 없는 경우에도 개체의 모양과 클러스터링 수준에 따라 프로토콜에 포함되어 있습니다. 세분화 프로세스는 주로 객체의 일부를 성공적으로 분할할 수 있지만 다른 부품의 세분화 또는 과다 분할로 이어질 수 있는 올바른 매개 변수의 결정에 의해 제한됩니다. 사용자는 최종 올바른 세분화를 얻기 위해 서로 다른 매개 변수로 다른 실행을 수행해야 하며, 특히 이질적이고 볼록이 아닌 모양을 표시하는 클러스터된 개체의 경우
이 프로토콜은 대부분 세분화 단계에 의해 제한되며, 이는 시간이 많이 소요될 수 있으며 가장 복잡한 경우에 강력한 컴퓨터 구성이 필요할 수 있습니다. 보다 구체적으로, 이미지가 더 많거나 복잡할수록(클러스터된 객체가 세그먼트로, 이미지의 픽셀 수가 많음), 사용자가 필요로 하는 더 많은 랜덤 액세스 메모리(RAM)가 필요합니다. 전 세계적으로 문제가 있는 경우 사용자는 64비트 Java 런타임 환경(Java 웹 사이트에서 자유롭게 사용할 수 있음)에서 프로토콜을 실행하고 64비트 운영 체제(OS)를 사용하여 Icy에서 사용하는 사용 가능한 메모리를 늘려야 합니다(메모리는 32비트 JRE에 대해 1300MB로 제한됩니다). 스크립트 때문에 Mac 컴퓨터에서 프로토콜이 올바르게 작동하지 않습니다. 또한 문제의 복잡성에 따라 매개 변수 수가 증가하고 이미지 분석에 대한 더 많은 지식이 필요합니다. 기능 기준에 관해서는, 이 프로토콜은 Icy가 이러한 유형의 데이터에 대한 분석을 효율적으로 수행하더라도 누적된 이미지(시간 스택, z-스택)의 분석에 아직 적용되지 않았습니다.
복잡한 클러스터된 개체의 세분화를 개선하기 위해 향후 업데이트가 특히 실현됩니다. 불규칙한 비볼록 형상을 가진 클러스터된 세포 구조에 세분화를 조정하기 위해 추가 블록이 개발될 것이다. 또한 시간 및 z 스택 분석(라이브 이미징 및 3D 데이터)에 대한 워크플로우를 조정합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
G.H.는 미니슈르 델레구에 아 라 레쉐 에 오 테크놀로지스의 대학원 펠로우십에 의해 지원되었다. L.H.는 인스티투트 드 칸세로로지 드 로렌(ICL)의 대학원 펠로우십의 지원을 받았고, Q.T.는 프랑스 국립연구청(ANR)이 감독하는 공공 보조금으로 지원받았고, 두 번째 "인베스트먼트 다베니르" 프로그램 파이트-HF(참조: ANR-15-RHU40)의 일환으로 지원되었다. 이 작품은 CNRS와 유니버시테 드 로렌 (UMR 7365)에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
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