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Bioengineering

Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, 2Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

Presentamos un flujo de trabajo de libre disposición construido para la exploración rápida y el análisis preciso de cuerpos celulares en compartimentos celulares específicos en imágenes de microscopía de fluorescencia. Este flujo de trabajo fácil de usar está diseñado en el software de código abierto Icy y también utiliza funcionalidades ImageJ. La canalización es asequible sin conocimientos en el análisis de imágenes.

Abstract

La última década se ha caracterizado por avances en las técnicas de microscopía de fluorescencia ilustradas por la mejora de la resolución espacial, pero también en las técnicas de imagen de células vivas y microscopía de alto rendimiento. Esto condujo a un aumento constante en la cantidad y complejidad de los datos de la microscopía para un solo experimento. Debido a que el análisis manual de los datos de la microscopía consume mucho tiempo, es subjetivo y prohíbe los análisis cuantitativos, la automatización del análisis de bioimagen se está volviendo casi inevitable. Construimos un flujo de trabajo informático llamado Substructure Analyzer para automatizar completamente el análisis de señales en bioimagens a partir de microscopía fluorescente. Este flujo de trabajo se desarrolla en la plataforma de código abierto fácil de usar Icy y se completa con las funcionalidades de ImageJ. Incluye el preprocesamiento de imágenes para mejorar la relación señal-ruido, la segmentación individual de celdas (detección de límites celulares) y la detección/cuantificación de cuerpos celulares enriquecidos en compartimentos celulares específicos. La principal ventaja de este flujo de trabajo es proponer complejas funcionalidades de bioimagen a los usuarios sin experiencia en análisis de imágenes a través de una interfaz fácil de usar. Además, es altamente modular y se adapta a varias cuestiones desde la caracterización de la translocación nuclear/citoplasmático hasta el análisis comparativo de diferentes cuerpos celulares en diferentes subefilas celulares. La funcionalidad de este flujo de trabajo se ilustra a través del estudio de los cuerpos Deles (bobinados) en condiciones de estrés oxidativo (OS). Los datos de la microscopía de fluorescencia muestran que su integridad en las células humanas se ve afectada unas horas después de la inducción del sistema operativo. Este efecto se caracteriza por una disminución de la nucleación de bobina en cuerpos típicos de Cajal, asociado con una redistribución nucleoplasmica de bobina en un mayor número de focos más pequeños. El papel central de la bobina en el intercambio entre los componentes CB y el nucleoplasmo circundante sugiere que la redistribución inducida por el sistema operativo de bobinado podría afectar la composición y la funcionalidad de Los cuerpos de Cajal.

Introduction

La microscopía ligera y, más particularmente, la microscopía de fluorescencia son técnicas robustas y versátiles comúnmente utilizadas en las ciencias biológicas. Dan acceso a la localización precisa de varias biomoléculas como proteínas o ARN a través de su etiquetado fluorescente específico. La última década se ha caracterizado por rápidos avances en las tecnologías de microscopía e imagen, como lo demuestra el Premio Nobel de Química 2014 que otorga a Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia superconsuelta (SRFM)1. SFRM evita el límite de difracción de la microscopía óptica tradicional para incorporarlo a la nanodimensión. La mejora de técnicas como la imagen en vivo o los enfoques de detección de alto rendimiento también aumenta la cantidad y la complejidad de los datos que se deben tratar para cada experimento. La mayoría de las veces, los investigadores se enfrentan a altas poblaciones heterogéneas de células y quieren analizar fenotipos a nivel de una sola célula.

Inicialmente, análisis como el conteo de focos fueron realizados a simple vista, lo que es preferido por algunos investigadores ya que proporciona un control visual completo sobre el proceso de conteo. Sin embargo, el análisis manual de estos datos consume demasiado tiempo, conduce a la variabilidad entre los observadores y no da acceso a características más complejas para que los enfoques asistidos por ordenador se estén volviendo ampliamente utilizados y casi inevitables2. Los métodos informáticos bioimagen aumentan sustancialmente la eficiencia del análisis de datos y están libres de la subjetividad inevitable del operador y el sesgo potencial del análisis de recuento manual. El aumento de la demanda en este campo y la mejora de la potencia informática llevaron al desarrollo de un gran número de plataformas de análisis de imágenes. Algunos de ellos están disponibles de forma gratuita y dan acceso a varias herramientas para realizar análisis con ordenadores personales. Recientemente se ha establecido una clasificación de herramientas de acceso abierto3 y presenta Icy4 como un potente software que combina facilidad de uso y funcionalidad. Además, Icy tiene la ventaja de comunicarse con ImageJ.

Para los usuarios sin experiencia en análisis de imágenes, los principales obstáculos son elegir la herramienta adecuada de acuerdo con los parámetros problemáticos y de ajuste correcto que a menudo no se entienden bien. Además, los tiempos de configuración suelen ser largos. Icy propone una interfaz fácil de usar de apuntar y hacer clic llamada "Protocolos" para desarrollar el flujo de trabajo mediante la combinación de algunos plugins que se encuentran dentro de una colección exhaustiva4. El diseño modular flexible y la interfaz de apuntar y hacer clic hacen que la configuración de un análisis sea factible para los no programadores. Aquí presentamos un flujo de trabajo llamado Substructure Analyzer,desarrollado en la interfaz de Icy, cuya función es analizar señales fluorescentes en compartimentos celulares específicos y medir diferentes características como brillo, número de focos, tamaño de los focos y distribución espacial. Este flujo de trabajo aborda varios problemas como la cuantificación de la translocación de la señal, el análisis de células trans infectadas que expresan a un reportero fluorescente o el análisis de focos de diferentes subestructuras celulares en células individuales. Permite el procesamiento simultáneo de varias imágenes, y los resultados de salida se exportan a una hoja de trabajo delimitada por tabulaciones que se puede abrir en programas de hoja de cálculo de uso común.

La canalización Analizador de subestructuras se presenta en la Figura 1. En primer lugar, todas las imágenes contenidas en una carpeta especificada se procesan previamente para mejorar su relación señal/ruido. Este paso aumenta la eficiencia de los pasos siguientes y disminuye el tiempo de ejecución. A continuación, se identifican y segmentan las Regiones de Interés (ROI), correspondientes a las áreas de imagen donde se debe detectar la señal fluorescente. Por último, se analiza la señal fluorescente y los resultados se exportan a una hoja de cálculo delimitada por tabulaciones.

La segmentación de objetos (detección de límites) es el paso más difícil en el análisis de imágenes, y su eficiencia determina la precisión de las mediciones de celda resultantes. Los primeros objetos identificados en una imagen (llamados objetos primarios) son a menudo núcleos de imágenes manchadas de ADN (tinción DAPI o Hoechst), aunque los objetos primarios también pueden ser células enteras, cuentas, motas, tumores o cualquier objeto manchado. En la mayoría de las imágenes biológicas, las células o núcleos se tocan entre sí o se superponen haciendo que los algoritmos simples y rápidos fallen. Hasta la fecha, ningún algoritmo universal puede realizar una segmentación perfecta de todos los objetos, principalmente porque sus características (tamaño, forma o textura) modulan la eficiencia de la segmentación5. Las herramientas de segmentación comúnmente distribuidas con software de microscopía (como MetaMorph Imaging Software de Molecular Devices6o el software NIS-Elements Advances Research de Nikon7)se basan generalmente en técnicas estándar como la coincidencia de correlaciones, umbrales u operaciones morfológicas. Aunque son eficientes en los sistemas básicos, estos métodos sobregeneracionalizados presentan rápidamente limitaciones cuando se utilizan en contextos más desafiantes y específicos. De hecho, la segmentación es muy sensible a parámetros experimentales como el tipo de celda, la densidad de celdas o los biomarcadores, y con frecuencia requiere un ajuste repetido para un conjunto de datos grande. El flujo de trabajo de Substructure Analyzer integra algoritmos simples y más sofisticados para proponer diferentes alternativas adaptadas a la complejidad de la imagen y a las necesidades del usuario. En particular, propone el algoritmo de cuenca hidrográfica basada en marcadores8 para objetos altamente agrupados. La eficiencia de este método de segmentación se basa en la selección de marcadores individuales en cada objeto. Estos marcadores se eligen manualmente la mayor parte del tiempo para obtener los parámetros correctos para la segmentación completa, lo que consume mucho tiempo cuando los usuarios se enfrentan a un gran número de objetos. Substructure Analyzer propone una detección automática de estos marcadores, proporcionando un proceso de segmentación altamente eficiente. La segmentación es, la mayor parte del tiempo, el paso limitante del análisis de imágenes y puede modificar considerablemente el tiempo de procesamiento en función de la resolución de la imagen, el número de objetos por imagen y el nivel de agrupación en clústeres de objetos. Las canalizaciones típicas requieren de unos segundos a 5 minutos por imagen en un equipo de escritorio estándar. El análisis de imágenes más complejas puede requerir un ordenador más potente y algunos conocimientos básicos en el análisis de imágenes.

La flexibilidad y la funcionalidad de este flujo de trabajo se ilustran con varios ejemplos en los resultados representativos. Las ventajas de este flujo de trabajo se muestran notablemente a través del estudio de subestructuras nucleares en condiciones de estrés oxidativo (OS). El sistema operativo corresponde a un desequilibrio de la homeostasis redox en favor de los oxidantes y se asocia con altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Dado que ROS actúa como moléculas de señalización, los cambios en su concentración y localización subcelular afectan positiva o negativamente a una miríada de vías y redes que regulan las funciones fisiológicas, incluyendo la transducción de señales, los mecanismos de reparación, la expresión génica, la muerte celular y la proliferación9,,10. Por lo tanto, el sistema operativo participa directamente en diversas patologías (enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, cánceres, diabetes, etc.), pero también en el envejecimiento celular. Por lo tanto, descifrar las consecuencias del sistema operativo en la organización y función de la célula humana constituye un paso crucial en la comprensión de las funciones del sistema operativo en la aparición y desarrollo de patologías humanas. Se ha establecido que el sistema operativo regula la expresión génica mediante la modulación de la transcripción a través de varios factores de transcripción (p53, Nrf2, FOXO3A)11,pero también afectando a la regulación de varios procesos co- y post-transcripción como el empalme alternativo (AS) de pre-RNAs12,,13,14. El empalme alternativo de transcripciones de codificación primaria y no codificación es un mecanismo esencial que aumenta la capacidad de codificación de los genomas mediante la producción de isoformas de transcripción. As es realizado por un enorme complejo de ribonucleoproteína llamado spliceosoma, que contiene casi 300 proteínas y 5 PEQUEÑOS ARN nucleares (UsnRNAs) ricos en U15. El ensamblaje de empalmes y AS están estrechamente controlados en las células y algunos pasos de la maduración del empalme ocurren dentro de compartimentos nucleares sin membrana llamados Cuerpos Cajales. Estas subestructuras nucleares se caracterizan por la naturaleza dinámica de su estructura y su composición, que se llevan a cabo principalmente por interacciones multivalentes de sus componentes de ARN y proteína con la proteína coilin. El análisis de miles de celdas con el flujo de trabajo de Substructure Analyzer permitió caracterizar los efectos nunca descritos del sistema operativo en Los cuerpos de Cajal. De hecho, los datos obtenidos sugieren que el sistema operativo modifica la nucleación de los cuerpos de Cajal, induciendo una redistribución nucleoplasmica de la proteína de bobina en numerosos focos nucleares más pequeños. Tal cambio de la estructura de los Cuerpos de Cajales podría afectar a la maduración del empalme y participar en la modulación AS por el sistema operativo.

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Protocol

NOTA: Tutoriales fáciles de usar están disponibles en el sitio web de Icy http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Descargue Icy y el protocolo Substructure Analyzer

  1. Descargue Icy desde el sitio web de Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/download) y descargue el protocolo Substructure Analyzer: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
    NOTA: Si utiliza un sistema operativo de 64 bits, asegúrese de utilizar la versión de 64 bits de Java. Esta versión permite aumentar la memoria asignada a Icy (Preferencias ? General ? Memoria máxima).

2. Apertura del protocolo

  1. Abra Icy y haga clic en Herramientas en el menú de la cinta de opciones.
  2. Haga clic en Protocolos para abrir la interfaz del Editor de protocolos.
  3. Haga clic en Cargar y abra el protocolo Substructure Analyzer. La carga del protocolo puede tardar unos segundos. Asegúrese de que la apertura del protocolo se ha completado antes de usarlo.
    NOTA: El flujo de trabajo se compone de 13 bloques generales presentados en la Figura 2a. Cada bloque funciona como una canalización compuesta por varios cuadros que realizan subtareas específicas.

3. Interactuar con el flujo de trabajo en Icy

NOTA: Cada bloque o cuadro está numerado y tiene un rango específico dentro del flujo de trabajo (Figura 2b). Al hacer clic en este número, la posición más cercana posible a la primera se asigna al bloque/cuadro seleccionado y, a continuación, se reorganiza la posición de los otros bloques/cajas. Respete el orden correcto de los bloques al preparar el flujo de trabajo. Por ejemplo, el bloque Detector de spot necesita ROI predefinidos para que los bloques de segmentación tengan que ejecutarse antes de los bloques de Detector de spot. No modifique la posición de los cuadros. No utilice "." en el nombre de la imagen.

  1. Haciendo clic en el icono de la esquina superior izquierda, contraiga, expanda, amplíe, acote o elimine el bloque (Figura 2b).
  2. Cada canalización del flujo de trabajo se caracteriza por una red de cajas conectadas a través de su entrada y salida(Figura 2b). Para crear una conexión, haga clic en Salida y mantenga hasta que el cursor alcance una entrada. Las conexiones se pueden eliminar haciendo clic en la etiqueta Salida.

4. Combinación de los canales de una imagen

  1. Utilice el bloque Canales de combinación para generar imágenes combinadas. Si es necesario, cambie el nombre de los archivos para que las secuencias que se van a combinar tengan el mismo prefijo de nombre seguido de un separador distinto. Por ejemplo, las secuencias de canales individuales de una imagen A se denominan: ImageA_red ImageA_blue.
    NOTA: Para el separador, no utilice caracteres ya presentes en el nombre de la imagen.
  2. En la misma carpeta, cree una nueva carpeta por canal para combinar. Por ejemplo, para combinar canales rojos, verdes y azules, cree 3 carpetas y almacene las secuencias correspondientes en estas carpetas.
  3. Utilice solamente el bloque Fusionar canales, elimine los otros bloques y guarde el protocolo como Canales de fusión.
    1. Acceda a las casillas para establecer parámetros. Para cada canal, rellene las casillas Número de canal X (cuadros 1, 5 o 9), Número de canal de carpeta X (cuadros 2, 6 o 10), Número de canal separador X (cuadros 3, 7 o 11) y Canal de mapa de color nb X (cuadros 4, 8 y 12) respectivamente.
      NOTA: Estos cuadros se agrupan horizontalmente por cuatro, cada línea correspondiente al mismo canal. En cada línea, también está disponible una pantalla (cuadros 23, 24 o 25) para visualizar directamente la secuencia del canal correspondiente.
      1. En el cuadro Número de canal X, elija qué canal extraer (en imágenes RGB clásicas, 0,rojo, 1, verde, 2, azul). El usuario accede rápidamente a los diferentes canales de una imagen dentro de la ventana Inspector de Icy, en la pestaña Secuencia.
      2. En el cuadro Número de canal de carpeta X, escriba el nombre de la carpeta que contiene imágenes del canal X.
      3. En el cuadro Separador número de canal X, escriba el separador utilizado para el nombre de la imagen (en el ejemplo anterior: "_red", "_green" y "_blue").
      4. En el cuadro Canal de mapa de colores nb X, indique con un número qué modelo de mapa de colores utilizar para visualizar el canal correspondiente en Icy. Los mapas de colores disponibles están visibles en la pestaña Secuencia de la ventana Inspector.
      5. En el cuadro Formato de imágenes combinadas (cuadro 28), escriba la extensión para guardar imágenes combinadas: .tif, .gif, .jpg, .bmp o .png.
        NOTA: Para fusionar solo 2 canales, no llene los cuatro cuadros correspondientes al tercer canal.
    2. En la esquina superior izquierda del bloque Combinar canales, haga clic en el vínculo directamente a la derecha de Carpeta. En el cuadro de diálogo Abrir que aparece, haga doble clic en la carpeta que contiene secuencias del primer canal que se ha definido en el cuadro Canal de carpeta número 1 (cuadro 2). A continuación, haga clic en Abrir.
    3. Ejecute el protocolo haciendo clic en la flecha negra en la esquina superior izquierda del bloque Canales de fusión (consulte la parte 7 para obtener más detalles). Las imágenes combinadas se guardan en una carpeta Combinar en el mismo directorio que las carpetas de canales individuales.

5. Segmentación de las regiones de interés

NOTA: Substructure Analyzer integra algoritmos simples y más sofisticados para proponer diferentes alternativas adaptadas a la complejidad de la imagen y a las necesidades del usuario.

  1. Seleccione el bloque adaptado.
    1. Si los objetos no se tocan entre sí o el usuario no necesita diferenciar los objetos agrupados individualmente, utilice el bloque Segmentación A: Objetos no agrupados.
    2. Cuando los objetos no se toquen entre sí, pero algunos de ellos están cerca, utilice el bloque Segmentación B: Objetos mal agrupados.
    3. Para objetos con un nivel de agrupación en clústeres alto y una forma convexa, utilice el bloque Segmentación C: Objetos agrupados con formas convexas.
    4. Si los objetos presentan un nivel de agrupación en clústeres alto y tienen formas irregulares, utilice el bloque Segmentación D: Objetos agrupados con formas irregulares.
    5. Utilice el bloque Segmentación E: citoplasma agrupado para segmentar los citoplasmas que tocan individualmente utilizando núcleos segmentados como marcadores. Este bloque necesita imperativamente núcleos segmentados para procesar.
      NOTA: Bloques adaptados para el proceso de segmentación de objetos primarios de forma independiente para que se puedan utilizar varios bloques en la misma ejecución para comparar su eficiencia para una subestructura determinada o para segmentar diferentes tipos de subestructuras. Si el nivel de agrupación en clústeres es heterogéneo dentro del mismo conjunto de imágenes, procese objetos pequeños y altamente agrupados por separado en los bloques adaptados.
  2. Vincule la salida0 (Archivo) del bloque Seleccionar carpeta a la entrada de carpeta del bloque de segmentación elegido.
  3. Establezca los parámetros del bloque de segmentación elegido.
    1. Segmentación A: Objetos no agrupados y Segmentación C: Objetos agrupados con formas convexas
      1. En el cuadro Señal de canal (cuadro 1), establezca el canal de los objetos en segmentar.
      2. Como opción, en el cuadro Filtro gaussiano (caja 2), aumente los valores de sigma X e Y si la señal dentro de los objetos es heterogénea. El filtro gaussiano suaviza las texturas para obtener regiones más uniformes y aumenta la velocidad y la eficiencia de la segmentación de núcleos. Cuanto más pequeños son los objetos, menor es el valor sigma. Evite valores de sigma altos. Establezca los valores predeterminados en 0.
      3. En el cuadro HK-Means (cuadro 3), establezca el parámetro Intensity classes y los tamaños mínimo y máximo aproximados (en píxeles) de los objetos que se van a detectar.
        NOTA: Para las clases de intensidad, un valor de 2 clasifica los píxeles en 2 clases: fondo y primer plano. Por lo tanto, se adapta cuando el contraste entre los objetos y el fondo es alto. Si los objetos de primer plano tienen intensidades diferentes o si el contraste con el fondo es bajo, aumente el número de clases. El valor predeterminado es 2. El tamaño del objeto se puede evaluar rápidamente dibujando un ROI manualmente alrededor del objeto de interés. El tamaño del ROI (Interior en píxeles) aparece directamente en la imagen al apuntarla con el cursor o se puede acceder a ella en la ventana De estadísticas de ROI (ábrala desde la barra de búsqueda). Los parámetros óptimos detectan cada objeto en primer plano en un únicoROI. Se pueden definir manualmente en Icy (Detección y seguimiento de la tecnología de la aplicación ( HK-Means).
      4. En el cuadro Contornos activos (cuadro 4), optimice la detección de bordes de objeto. La documentación exhaustiva de este plugin está disponible en línea: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Los parámetros correctos también se pueden definir manualmente en Icy (Detección y seguimiento de la función . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Contornos activos).
      5. Durante el proceso, se crea automáticamente una carpeta para guardar imágenes de objetos segmentados. En el cuadro Texto (cuadro 6), asigne un nombre a esta carpeta (por ejemplo: Núcleos segmentados). Para establecer el formato para guardar imágenes de objetos segmentados (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), rellene el formato de cuadro de las imágenes de objetos segmentados. La carpeta se crea en la carpeta que contiene imágenes combinadas.
      6. Ejecute el flujo de trabajo (para obtener más información, consulte la parte 7).
    2. Segmentación B: Objetos mal agrupados
      1. Siga los mismos pasos que en 5.3.1 para establecer los parámetros de las cajas Señal de canal, HK-Means, Contornos activos, Extensión para guardar objetos segmentados y Texto (los rangos de cuadros no son los mismos que en el paso 5.3.1).
      2. En el cuadro Llamar al plugin IJ (cuadro 4), establezca el parámetro Rolling para controlar la resta de fondo. Establezca este parámetro en al menos el tamaño del objeto más grande que no forma parte del fondo. La reducción de este valor aumenta la eliminación de fondo, pero también puede inducir la pérdida de señal de primer plano.
      3. En el cuadro Ecualización adaptativa del histograma (cuadro 6), mejore los contrastes entre los objetos de primer plano y el fondo. Aumentar la pendiente da secuencias más contrastadas.
      4. Ejecute el flujo de trabajo (para obtener más información, consulte la parte 7).
    3. Segmentación D: Objetos agrupados con formas irregulares
      NOTA: Se aplican tres métodos diferentes de segmentación a cada imagen: en primer lugar,HK-means clusteringcombinado con elMétodo de contornos activosse aplica. Entonces, elalgoritmo clásico de cuenca(mediante el mapa de distancia euclidiana) se aplica a objetos previamente mal segmentados. Por último, unalgoritmo de cuenca hidrográfica basado en marcadoresse utiliza. Solo los métodos de cuenca hidrográfica basados en marcadores y medios HK necesitan la intervención del usuario. Para ambos métodos, se pueden aplicar los mismos parámetros para todas las imágenes (versión totalmente automatizada) o cambiarse para cada imagen (versión semiautomática). Si el usuario no está entrenado en estos métodos de segmentación, se recomienda encarecidamente el procesamiento semiautomático. Durante el procesamiento de este bloque, se necesita la intervención manual. Cuando finaliza un método de segmentación, el usuario debe quitar manualmente los objetos mal segmentados antes del comienzo del siguiente método de segmentación. Los objetos segmentados correctamente se guardan y no se consideran en los pasos siguientes. Este bloque tiene que estar conectado con el bloqueCuadro de diálogo de segmentación de objetos primarios de formas agrupadas/heterogéneaspara funcionar correctamente.
      1. Descargue la colección ImageJ MorphoLibJ en https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. La versión MorphoLibJ 1.4.0 se utiliza en este protocolo. Coloque el archivo MorphoLibJ_-1.4.0.jar en la carpeta icy/ij/plugins. Más información sobre el contenido de esta colección está disponible en https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. Siga los mismos pasos que en el paso 5.3.1 para establecer parámetros de cuadros Señal de canal, Filtro gaussiano, Contornos activos, Extensión para guardar objetos segmentados y Texto. Los rangos de las cajas no son los mismos que en el paso 5.3.1.
      3. Establezca los parámetros del cuadro Ecualización adaptativa del histograma (consulte el paso 5.3.2.3).
      4. Para activar Restar fondo, escriba sí en Aplicar fondo de resta? (cuadro 5). De lo contrario, escriba No. Si el plugin está activado, establezca el parámetro de balanceo (consulte el paso 5.3.2), en el cuadro Restar fondo parámetro (cuadro 7).
      5. Automatización de HK-means: Para aplicar los mismos parámetros para todas las imágenes (procesamiento totalmente automatizado), establezca el Nb de las clases (cuadro 11), el tamaño mínimo (cuadro 12) y el tamaño máximo (cuadro13) (consulte el paso 5.3.1). Estos parámetros deben establecerse para seleccionar un máximo de píxeles de primer plano y para optimizar la individualización de los objetos de primer plano. Para la versión de procesamiento semiautomática, no se necesita intervención.
      6. Automatización de extracciones de marcadores: para la versión totalmente automatizada, expanda la caja Extracción de marcadores internos (caja 27) y establezca el valor del parámetro "dinámico" en la línea 13 del script. Para la versión de procesamiento semiautomática, no se necesita intervención.
        NOTA: Los marcadores se extraen aplicando una transformación de mínimo extendido en una imagen de entrada controlada por un parámetro "dinámico". En el algoritmo de cuenca hidrográfica basada en marcadores, se simula la inundación de estos marcadores para realizar la segmentación de objetos. Para la segmentación correcta de objetos de primer plano, se debe extraer un único marcador por objeto de primer plano. La configuración del parámetro "dinámico" para la extracción óptima de marcadores depende principalmente de la resolución de imágenes. Por lo tanto, si no está familiarizado con este parámetro, utilice la versión semiautomática.
      7. Ejecute el flujo de trabajo (para obtener más información, consulte la parte 7).
      8. Al principio del procesamiento, los cuadros de diálogo HK-means parámetros y la cuenca hidrográfica basada en marcadores se abren sucesivamente. Para aplicar los mismos parámetros para todas las imágenes (versión totalmente automatizada), haga clic en Si. De lo contrario, haga clic en NO. Se abre un cuadro de información, que pide "Determinar ROI óptimos con el plugin HK-Means y cerrar la imagen". Haga clic en Aceptar y aplique manualmente el plugin HK-Means (Detección y seguimientode lafunción de seguimiento ( HK-Means) en la imagen, que se abre automáticamente. Seleccione la opción Exportar ROI en el cuadro del complemento HK-Means. Aplique los mejores parámetros para que los ROI contengan un máximo de píxeles de primer plano y para optimizar la individualización de los objetos en primer plano. Cuando se encuentren ROI óptimos, cierre directamente la imagen.
      9. Al final del primer método de segmentación, se abre un cuadro de información que pide "Eliminar ROI no deseados y cerrar la imagen". Estos ROI corresponden a los bordes de los objetos segmentados. Seleccione Aceptar y elimine los ROI de los objetos mal segmentados en la imagen, que se abre automáticamente. Un ROI se puede eliminar fácilmente colocando el cursor en su borde y usando el botón "Eliminar" del teclado. Cierre la imagen. Repita el mismo procedimiento después de completar el segundo paso de segmentación.
      10. En esta etapa, si se seleccionó el botón YES para la automatización completa del algoritmo de cuenca hidrográfica basado en marcadores, los parámetros establecidos anteriormente se aplicarán a todas las imágenes.
      11. Si se ha seleccionado el botón NO, se abre un cuadro de información que pide "Determinar y ajustar los marcadores internos". Haga clic en OK y dentro de la interfaz ImageJ de Icy, vaya a Plugins . MorphoLibJ ? Minima y Maxima| Extended Min & Max. En Operación, seleccione Mínimo extendido.
      12. Seleccione Vista previa para previsualizar en la imagen abierta automáticamente el resultado de la transformación. Mueva la dinámica hasta que se observen los marcadores óptimos. Los marcadores son grupos de píxeles con un valor de 255 (no necesariamente píxeles blancos). Los parámetros óptimos conducen a un marcador por objeto. Céntrese en los objetos restantes que no se han segmentado bien con los dos métodos de segmentación anteriores.
      13. Si es necesario, mejore los marcadores aplicando operaciones morfológicas adicionales como "Apertura" o "Cierre"(Plugins ? MorphoLibJ ? Filtros Morfológicos). Al obtener la imagen final de los marcadores, manténgala abierta y cierre todas las demás imágenes que terminan con la imagen utilizada inicialmente como entrada para la operación De minima extendida. Haga clic en No si un cuadro ImageJ pide guardar los cambios en esta imagen.
      14. En el cuadro Nb de imágenes con cuadro de información (cuadro 14), determine cuántas imágenes con cuadros de información deben aparecer.
    4. Segmentación E: citoplasma agrupado
      NOTA: Este bloque utiliza núcleos segmentados previamente como marcadores individuales para iniciar la segmentación del citoplasma. Asegúrese de que el bloque de segmentación de núcleos se ha procesado antes de usarlo.
      1. En la caja citoplasma de canal (caja 1), ajuste el canal de la señal citoplasma.
      2. En el cuadro Extension segmented nuclei (cuadro 2), escriba el formato utilizado para guardar imágenes de núcleos segmentados (tif, jpeg, bmp, png). El formato predeterminado es tif.
      3. En el cuadro Texto (cuadro3), escriba el nombre de la carpeta que contiene núcleos segmentados.
      4. En el cuadro Formato de imágenes de citoplasmas segmentadas (cuadro 4), establezca el formato que se utilizará para guardar imágenes de objetos segmentados (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
      5. Durante el proceso, se crea automáticamente una carpeta para guardar imágenes de citoplasmas segmentados. En el cuadro Texto (cuadro 5), asigne un nombre a esta carpeta (por ejemplo: citoplasmas segmentados). La carpeta se crea en la carpeta que contiene imágenes combinadas.
      6. Siga los mismos pasos que en el paso 5.3.1 para establecer los parámetros de los cuadros Filtro gaussiano y Contornos activos (Tenga cuidado, los rangos de caja no son los mismos que en el paso 5.3.1).
      7. Ejecute el flujo de trabajo (para obtener más información, consulte la parte 7).

6. Detección y análisis de señal fluorescente

  1. Seleccione el bloque adaptado.
    1. En el bloque Análisis de fluorescencia A: 1 Canal,realizar la detección y análisis de focos en un canal dentro de un tipo de objeto segmentado: detección de focos de bobina (canal rojo) dentro del núcleo.
    2. En el bloque Análisis de Fluorescencia B: 2 Canales en el mismo compartimiento,realizar la detección y análisis de focos en dos canales dentro de un tipo de objeto segmentado: detección de bobinado (canal rojo) y 53BP1 (canal verde) focos dentro del núcleo.
    3. En el bloque Análisis de Fluorescencia C: 2 Canales en dos compartimentos,realizar la detección y análisis de focos en uno o dos canales, específicamente dentro de los núcleos y su correspondiente citoplasma: detección de foci coilin (canal rojo) tanto dentro del núcleo como en su correspondiente citoplasma o detección de focos de Coilin (canal rojo) dentro del núcleo y foci G3BP (canal verde) dentro del citoplasma correspondiente.
    4. En el bloque Análisis de fluorescencia D: Translocación global,calcule el porcentaje de señal de un canal en dos compartimentos celulares (a y b). Por ejemplo, en un ensayo de translocación de citoplasma/núcleo, exporte porcentajes calculados de señales nucleares y citoplasmáticos para cada imagen en la hoja de cálculo final "Resultados". La fórmula utilizada para calcular el porcentaje de señal nuclear se muestra a continuación. Este bloque se puede utilizar para cualquier compartimento subcelular:
      Equation 1
    5. En el bloque Análisis de fluorescencia E: Translocación celular individual,calcule el porcentaje de señal de un canal en dos compartimentos celulares para cada celda. Este bloque está especialmente optimizado para el ensayo de translocación de núcleo/citoplasma a nivel de una sola célula.
      NOTA: Debido a que el bloque Análisis de fluorescencia E: La translocación celular individual realiza análisis a nivel de una sola célula, se necesita una segmentación eficiente del núcleo y del citoplasma.
  2. Vincule la salida0 (Archivo) del bloque Seleccionar carpeta (bloque 1) a la entrada de carpeta (flechas blancas en círculos negros) del bloque elegido.
  3. Establezca los parámetros del bloque elegido.
    1. Análisis de fluorescencia A: 1 canal, Análisis de fluorescencia B: 2 canales en el mismo compartimiento y Análisis de fluorescencia C: 2 canales en dos compartimentos
      1. En el cuadro Roi de imágenesde carpeta , escriba el nombre de la carpeta que contiene imágenes de objetos segmentados precedidos por una barra diagonal invertida. (Por ejemplo: núcleos segmentados).
      2. En el cuadro Formato de imágenes de objetos segmentados (cuadro 2), escriba el formato utilizado para guardar imágenes de objetos segmentados (tif, jpeg, bmp, png). El formato predeterminado es tif.
      3. En el cuadro Kill Borders ?, escriba Sí para eliminar objetos de borde. De lo contrario, escriba No. La instalación de la colección MorphoLibJ de ImageJ es necesaria para utilizar esta función (consulte el paso 5.3.3).
      4. En la(s) señal de puntos de canalde la caja, ajuste el canal donde se deben detectar los puntos. En las imágenes RGB clásicas, 0-Rojo, 1-Verde, y 2-Azul.
      5. En las cajas Nombre de la molécula localizada,escriba el nombre de la molécula que se localiza en las manchas. El número de campos a introducir depende del número de moléculas.
      6. En la(s) caja(s) Wavelet Spot Detector Block, establezca los parámetros de detección de punto para cada canal. Establezca la(s) escala(s) (referida(s) al tamaño del punto) y la sensibilidad de la detección (una sensibilidad menor disminuye el número de puntos detectados, el valor predeterminado es 100 y el valor mínimo es 0). La documentación exhaustiva de este plugin está disponible en línea: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Los parámetros también se pueden definir manualmente en Icy (Detección y seguimiento de la función de seguimiento ( Detector de puntos).
      7. Como opción, en el cuadro Filtrar ROI por tamaño, filtre los objetos segmentados donde se detectan puntos estableciendo un intervalo de tamaño (en píxeles). Este paso es especialmente útil para eliminar objetos subs segmentados o subs segmentados. Para estimar manualmente el tamaño de los objetos, consulte el paso 5.3.1. Los parámetros predeterminados no incluyen el filtrado de ROI por tamaño. El bloque 2 canales en dos compartimentos contiene dos cajas: núcleos de filtro por tamaño (caja 19) y citoplasma de filtro por tamaño (caja 46).
      8. Opcionalmente, en el cuadro Filtrar manchas por tamaño, filtre los puntos detectados según su tamaño (en píxeles) para eliminar artefactos no deseados. Para estimar manualmente el tamaño del spot, haga clic en Detección y seguimiento y abra el plugin Detector de spot. En Opciones de salida, seleccione Exportar a ROI. Tenga cuidado de que los parámetros predeterminados no incluyan el filtrado de puntos por tamaño y que los puntos filtrados no se tengan en cuenta para el análisis. El número de campos a introducir depende del número de canales.
      9. Opcionalmente, en la caja Puntos de filtro,aplique un filtro adicional (contraste, homogeneidad, perímetro, redondez) en las manchas detectadas. Tenga cuidado de que los parámetros predeterminados no incluyan el filtrado de puntos y que los puntos filtrados no se tengan en cuenta para el análisis. El número de campos a introducir depende del número de canales.
      10. Opcionalmente, en las casillas Umbral de tamaño de spot, establezca un umbral para el área (en píxeles) de los puntos analizados. El número de puntos contados por debajo y por encima de este umbral se exporta en la hoja de cálculo Resultados final. El número de cajas a informar depende del número de canales.
      11. Ejecute el flujo de trabajo (para obtener más información, consulte la parte 7). Los datos se exportan en una hoja de cálculo Resultados guardada en la carpeta que contiene imágenes combinadas.
    2. Análisis de fluorescencia D: Análisis global de translocación y fluorescencia E: Translocación celular individual:
      1. En los cuadros Imágenes de carpeta (cuadros 1 y 2), escriba el nombre de la carpeta que contiene imágenes de objetos segmentados. En el bloque Análisis de fluorescencia D: Translocación global, los dos tipos de ROI se identifican como ROI a y ROI b. Para el bloque Análisis de fluorescencia E: Translocación de celda individual, en imágenes de carpetas segmentadas núcleos y imágenes de carpeta segmentadas citoplasmas, escriba el nombre de la carpeta que contiene núcleos segmentados y citoplasmas, respectivamente.
      2. En la caja Señal de canal (cuadro 3), ingrese el canal de la señal.
      3. En el cuadro Formato de imágenes de objetos segmentados (cuadro 4), escriba el formato utilizado para guardar imágenes de objetos segmentados (tif, jpeg, bmp, png). El formato predeterminado es tif. La opción Matar bordes también está disponible para eliminar objetos de borde (consulte el paso 6.3.1).
      4. Opcionalmente, en los cuadros Filtrar ROI por tamaño, filtre los objetos segmentados estableciendo un intervalo de tamaño (en píxeles). Este paso podría ser útil para eliminar objetos sub-o sobres segmentados. Para estimar manualmente el tamaño del objeto, consulte el paso 5.3.1. Hay dos campos para entrar, uno por canal. Los parámetros predeterminados no incluyen el filtrado de ROI por tamaño.
      5. Ejecute el flujo de trabajo (para obtener más información, consulte la parte 7). Exportar datos en una hoja de cálculo Resultados guardados en la carpeta que contiene imágenes combinadas.

7. Ejecute el protocolo

  1. Para procesar un bloque en una ejecución, elimine la conexión entre el bloque seleccionado y el bloque Seleccionar carpeta. Coloque el bloque deseado en elrango 1. En la esquina superior izquierda del bloque deseado, haga clic en el enlace directamente a la derecha de la carpeta. En el cuadro de diálogo Abrir que aparece, haga doble clic en la carpeta que contiene las imágenes combinadas. A continuación, haga clic en Abrir. Haga clic en Ejecutar para iniciar el flujo de trabajo. El procesamiento se puede detener haciendo clic en el botón Detener.
  2. Para procesar diferentes bloques en una ejecución, mantenga las conexiones de los bloques elegidos con el bloque Seleccionar carpeta (bloque 1). Asegúrese de que su rango permite el buen procesamiento del flujo de trabajo. Por ejemplo, si un bloque específico necesita objetos segmentados para procesar, asegúrese de que el bloque de segmentación se procesa antes. Antes de ejecutar el flujo de trabajo, quite los bloques no utilizados y guarde el nuevo protocolo con otro nombre.
  3. Haga clic en Ejecutar para iniciar el flujo de trabajo. Cuando aparezca el cuadro de diálogo abierto, haga doble clic en la carpeta que contiene las imágenes combinadas. A continuación, haga clic en Abrir. El flujo de trabajo se ejecuta automáticamente. Si es necesario, detenga el procesamiento haciendo clic en el botón Detener.
  4. Al final del procesamiento, compruebe que el mensaje El flujo de trabajo ejecutado apareció correctamente en la esquina inferior derecha y que todos los bloques se marcan con un signo verde ( Figura2b). Si no es así, el bloque y el cuadro interior que presenta el signo de error indican el elemento que se va a corregir(Figura 2b).
    NOTA: Una vez que el flujo de trabajo se ejecutó correctamente, no se puede iniciar una nueva ejecución directamente y, para procesar el flujo de trabajo de nuevo, se debe marcar al menos un bloque con el signo "listo para procesar". Para cambiar el estado de un bloque, elimine y vuelva a crear un vínculo entre dos cuadros dentro de este bloque o simplemente cierre y vuelva a abrir el protocolo. Si se produce un error durante el procesamiento, se puede iniciar directamente una nueva ejecución. Durante una nueva ejecución, se procesan todos los bloques de la canalización, incluso si algunos de ellos se marcan con el signo verde.

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Representative Results

Todos los análisis descritos se han realizado en un portátil estándar (procesador de cuatro núcleos de 64 bits a 2,80 GHz con memoria de acceso aleatorio (RAM) de 16 GB que trabaja con la versión de 64 bits de Java. La memoria de acceso aleatorio es un parámetro importante a tener en cuenta, dependiendo de la cantidad y la resolución de las imágenes a analizar. El uso de la versión de 32 bits de Java limita la memoria a unos 1300 MB, lo que podría no ser adecuado para el análisis de big data, mientras que la versión de 64 bits permite aumentar la memoria asignada a Icy. La Figura 3 informa del tiempo necesario para la segmentación de diferentes tipos de imágenes y diferentes resoluciones. Confirma que la alta resolución aumenta sustancialmente el tiempo de segmentación de objetos primarios.

Los datos presentados en los párrafos siguientes demuestran que el flujo de trabajo del Analizador de Subestructuras se puede utilizar para resolver la mayoría de los problemas comunes encontrados en biología celular y molecular (recuento celular, recuento y análisis de focis, análisis de translocación).

La medición en numerosas células de la proporción precisa de moléculas concentradas dentro de un compartimiento determinado o el cambio de localización en dominios subcelulares puede ser una tarea muy engorrosa y propensa a errores, especialmente cuando se realiza manualmente. La Figura 4 ilustra la capacidad del flujo de trabajo para cuantificar rápida y precisamente la bien descrita translocación nuclear del factor de transcripción NF-B en respuesta a la estimulación TNF. Las imágenes utilizadas para el análisis fueron compiladas amablemente por Ilya Ravkin(http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm)y están disponibles públicamente en la Broad Bioimage Benchmark Collection16. Este conjunto contiene imágenes de líneas celulares MCF7 y A549 tratadas con concentraciones crecientes de TNF. El análisis se ha realizado en más de 40.000 celdas y 96 imágenes (48 imágenes para cada canal) de la línea de celda MCF7 (Figura 4a). Todo el análisis (desde la importación de imágenes hasta el ahorro de datos) tomó 26 minutos. Cada imagen corresponde a una concentración específica de TNF. Las proporciones nucleares/citoplasmáticos de NF-B fueron homogéneas en todas las células para una imagen dada. Por esta razón, para cada imagen, los valores de todos los píxeles nucleares o citoplasmáticos se sumaron para calcular las proporciones nucleares y citoplasmas de NF-B, y no se requería la individualización de los núcleos/citoplasmas tocados durante su segmentación. Las imágenes DAPI se procesaron en la segmentación C: objetos agrupados con formas convexas bloque a núcleos de segmento y el canal verde se utilizó para delinear los citoplasmas con el bloque Segmentación E: citoplasma agrupado (Figura 4b). El bloque Análisis de fluorescencia D: Translocación global se utilizó para exportar la suma de los valores de píxeles nucleares y citoplasmáticos. Los datos obtenidos se representan en una curva de dosis-respuesta (Figura 4c) e ilustran el aumento de la proporción nuclear de NF-B después de la estimulación con el aumento de las concentraciones de TNF.

El flujo de trabajo no sólo analiza la señal de intensidad global en diferentes compartimentos subcelulares, sino que también se puede utilizar para detectar focos y extraer información específica sobre sus características. La Figura 5a ilustra la detección de cuerpos P en células individuales mediante la localización del potenciador de la proteína descapping de ARNm 4 (EDC4). El bloque Segmentación A: Objetos no agrupados se utilizó para segmentar núcleos que presentan un bajo nivel de agrupación, el bloque Segmentación E: citoplasma agrupado para delinear los citoplasmas y el Análisis de Fluorescencia C: 2 canales en dos compartimentos para detectar focos EDC4. Se identifican los objetos segmentados (nuclei_0 segmentados, cytoplasms_0 segmentados) y se recopila información múltiple en la hoja de trabajo correspondiente (Información de núcleos segmentados e Información de citoplasmas segmentadas) como la intensidad media EDC4 o el número/tamaño de los cuerpos detectados en cada ROI (Figura 5b). Antes de ser analizados, los cuerpos detectados pueden filtrarse preliminarmente según su área, lo que puede ser útil para excluir objetos por debajo de la potencia de resolución del microscopio. Para estimar el tamaño de los objetos conservados, se puede introducir un umbral de área adicional. Las áreas de todos los cuerpos detectados se notifican en hojas de trabajo dedicadas (Tamaño de focos de nuclei_Distribution segmentados, Tamaño segmentado cytoplasms_Distribution focos). En este ejemplo, destacamos el análisis de dos células (nuclei_0 and_1 Segmentadas y cytoplasm_0 and_1 Segmentadas), donde se detectan focos EDC4 citoplasmáticos. Tenga en cuenta que aunque la señal de la proteína EDC4 se detecta tanto en los compartimentos nucleares como en los citoplasmáticos, sólo los focos citoplasmáticos corresponden a cuerpos P. La señal nuclear probablemente es el resultado de la reactividad cruzada del anticuerpo utilizado para realizar experimentos de inmunofluorescencia. Se da el tamaño en píxeles de cada uno de los focos.

Entonces, como aún se desconozca el efecto del estrés oxidativo (OS) en los cuerpos de Cajal, aprovechamos la versatilidad del flujo de trabajo para estudiarlo durante la cinética del tiempo (2 a 20 horas después de la inducción del sistema operativo con 500 m H2O2) (Figura 6). Los cuerpos cajales son estructuras dinámicas que nucleadoran y se disuelen dentro del nucleoplasmo bajo el control de parámetros específicos como la tasa de transcripción o la progresión del ciclo celular. Cajal Bodies se visualizaba localizando su principal componente estructural y funcional, la proteína coilin. La información sobre el número y el tamaño de los cuerpos de Cajal se recopiló mediante el estudio de 2300 celdas individuales a partir de imágenes de alta resolución (3840X3072) que contienen 3 canales: DAPI (azul), 53BP1 (verde) y bobinado (rojo) (Figura 6a). El procesamiento completo tomó menos de 1 h. Dado que los núcleos presentaban forma convexa y algunos de ellos estaban agrupados, se eligió el bloque Segmentación C: Objetos agrupados con formas convexas para realizar la segmentación. Como se sabe que el sistema operativo induce roturas de doble cadena de ADN (DDSB), la proteína de unión p53 1 (53BP1), conocida por ser un efector esencial de las vías de señalización del daño del ADN, se utilizó como un marcador para discriminar entre las células estresadas y no estresadas. De hecho, en ausencia de daños en el ADN, 53BP1 se distribuye homogéneamente dentro del nucleoplasma, mientras que después de los daños en el ADN, se concentra en DDSB, que forman focos fácilmente distinguibles en microscopía. El número y el tamaño de los focos nucleares 53BP1 y coilin en cada celda se analizaron utilizando el bloque Análisis de Fluorescencia B: 2 Canales en el mismo compartimiento. En primer lugar, el análisis de los datos de 53BP1 ayudó a determinar para cada punto de tiempo de la cinética el mejor umbral para clasificar las células de acuerdo con su estado de tensión. Entre toda la cinética, el sistema operativo induce un aumento significativo del número de focos 53BP1 con un aumento de 11 veces a 2, 4 y 8 h después de la inducción del sistema operativo(Figura S1). Este efecto es menos pronunciado a 6 h (6,5 veces) debido a un mayor nivel inicial de DSB en células no estresadas. Incluso después de 20 h, se mantiene un aumento sostenido (casi 6 veces). Estos datos reflejan la eficiencia del tratamiento para inducir el sistema operativo y establecen 53BP1 como un marcador de tensión eficiente para observaciones tempranas y tardías en microscopía. Por otro lado, se observó una pequeña proporción de células estresadas con un bajo nivel de DDSB en cada punto de tiempo de la cinética, lo que sugiere que las células no están estresadas homogéneamente, haciendo cumplir la importancia de usar un marcador de tensión en experimentos de estrés. Sobre la base del análisis ROC, se seleccionó un umbral global de 17 focos de 53BP1 para discriminar entre células estresadas y no estresadas a lo largo de la cinética (Figura S1).

A continuación, el número y el tamaño de los focos nucleares de bobina se analizaron de acuerdo con el estado de tensión de la célula. Se observó un aumento significativo en el número de focos 2, 4 y 6 h después de la inducción por estrés (Figura 6b). El efecto más sostenido se observa a 2 h, el número de células que tienen más de 10 focos aumentando de 0% en las células sin estesar a 75% en las células estresadas. Por otra parte, más del 25% de las células estresadas de ese punto de tiempo tenían más de 20 focos de bobina. Este efecto disminuye progresivamente hasta 8 h. A las 20 h, se observa un pequeño aumento del primer y del tercer cuartil, pero los datos también muestran que el 84% y el 80% de las células presentan menos de 8 focos en células no estresadas y estresadas, respectivamente. Estos datos muestran que el sistema operativo también tiene efectos tardíos en los parámetros que controlan la nucleación de los cuerpos de Cajal, que podrían ser diferentes de los efectos tempranos. Curiosamente, un análisis cuidadoso de las características de los focos nucleares coilin reveló que el aumento observado del número de focos de bobina asociados con una disminución en su tamaño (Figura 6c). Por ejemplo, 2 h después de la inducción del sistema operativo, la proporción de focos de bobina con un área por debajo de 0,2 m2 aumenta del 26% al 64%. Este efecto disminuye hasta 8 h, pero, a diferencia del número de Cuerpos de Cajal, no se observa ningún cambio significativo a 20 h. Esto podría reflejar que la redistribución nucleoplasmica temprana y tardía de los Cuerpos de Cajal son eventos diferentes.

En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que el sistema operativo cambia la potencia de nucleación de los cuerpos de Cajal, induciendo una redistribución nucleoplasmica en numerosos focos nucleares más pequeños. Dado que la nucleación de los cuerpos de Cajal es impulsada por sus componentes de proteínas y ARN, esto sugiere que el efecto OS podría cambiar la composición de los cuerpos de Cajal. Dentro de Cajal Bodies, la proteína coilin interactúa con varios socios proteicos diferentes, como componentes del complejo SMN y proteínas Sm. Estas interacciones a menudo implicaban fosfodominios de bobina, y uno puede imaginar que una modificación de la estructura de los cuerpos de Cajal podría estar vinculada a los cambios en el estado de fosforilación de la bobina. Además, trabajos recientes demostraron que los cuerpos de Cajal no están localizados aleatoriamente dentro del núcleo, y pueden afectar la expresión génica a través de la asociación proximal con el gen específico loci17. Teniendo en cuenta todos estos hechos, no sería sorprendente que un efecto en la funcionalidad de los cuerpos de Cajal acompañara los cambios en su estructura. A partir de estos resultados, también podemos preguntarnos si la remodelación de tales Cuerpos Cajales es una consecuencia pasiva del sistema operativo o participa en la respuesta interactuando con loci genéticos específicos, por ejemplo.

Para probar si un cambio en la expresión de bobina podría alterar su localización y cambiar la nucleación de Cuerpos Denos, sobreexpresamos una proteína exógena de fusión GFP-coilin. Los núcleos no se agrupaban, por lo que la segmentación se realizó con el bloque Segmentación A: Objetos no agrupados. A continuación, para cuantificar con precisión el número y el tamaño de los focos de bobina (señal roja, canal 1) de acuerdo con el nivel de GFP-coilin (señal verde, canal 2) sobreexpresión, se utilizó el bloque Análisis de fluorescencia B: 2 Canales en el mismo compartimiento. El nivel de GFP-coilin se refletió en la intensidad media de la señal GFP en el núcleo individual (Figura 7a). En células con nivel medio o alto de sobreexpresión de GFP-bobina (intensidad GFP superior a 10), el número de cuerpos de Cajal por núcleo aumenta significativamente con algunos núcleos que muestran hasta 21 focos (Figura 7b). También notamos que el brillo (intensidad media) de Los cuerpos de Cajal aumenta considerablemente en paralelo con el nivel de sobreexpresión que conduce a la saturación de intensidad. Estas regiones saturadas podrían enmascarar la presencia de focos más pequeños y más débiles. En las células que sobreexpresan un nivel medio o alto de GFP-coilin, el tamaño de los cuerpos de Cajal también aumenta significativamente, los valores medios que aumentan de 1 a 2 m2 (Figura 7c). Por otra parte, más del 25% de las células con un alto nivel de expresión de GFP-bobina presenten focos presentes con un área mayor que 2,5 m2,mientras que nunca supera los 0,8m2 en las células no transgénicas. En conclusión, la sobreexpresión de GFP-Coilin conduce a un aumento significativo tanto en el número como en el tamaño de los cuerpos de Cajal. Dado que el sistema operativo aumenta el número de cuerpos de Cajal pero reduce su tamaño, estos datos podrían reflejar que el efecto del sistema operativo en la estructura de los cuerpos de Cajal es probablemente inducido por un cambio de su composición en lugar de por un efecto en la cantidad celular de bobinado.

Figure 1
Figura 1: La canalización del analizador de subestructuras
El flujo de trabajo se desarrolla en Icy, una plataforma comunitaria abierta para la informática de bioimagen, y realiza un análisis automático de múltiples imágenes de microscopía de fluorescencia. En primer lugar, las imágenes multicanal se cargan automáticamente dentro del protocolo y se procesan previamente para mejorar, si es necesario, la relación señal-ruido y eliminar artefactos de imagen. A continuación, la segmentación de imágenes aísla las regiones de interés (ROI) del fondo. Varios métodos de segmentación están disponibles dependiendo del nivel de agrupación en clústeres y la naturaleza de los objetos de interés. Los objetos segmentados se guardan con un descriptor específico (por ejemplo, Image name_Nucleus_1) en una carpeta específica y se pueden utilizar o volver a utilizar para su posterior análisis. Las señales fluorescentes como las manchas se analizan dentro de los ROI y varias entidades (ubicación, tamaño, forma, intensidad, textura, número de punto y tamaño) se exportan a una hoja de cálculo creada automáticamente. Todas las entidades medidas, como el número de puntos detectados, se notifican al descriptor del ROI correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Interfaz gráfica del flujo de trabajo de Icy
(aa ) El flujo de trabajo se compone de 13 bloques generales, que se pueden agrupar según su función general: Seleccionar carpeta (bloque 1) permitir el acceso a las imágenes; Los canales de fusión (bloque 2) se utilizan para combinar diferentes canales de imágenes. Los bloques 3 a 8 están dedicados a la segmentación de objetos, cada uno de los que se adaptan para un contexto específico: Segmentación A: Objetos no agrupados, Segmentación B: Objetos mal agrupados, Segmentación C: Objetos agrupados con formas convexas, Segmentación D: Objetos agrupados con formas irregulares (bloque 7, obras en asociación con el bloque 6), Segmentación E: citoplasmas agrupadas. Los bloques 9 a 11 se utilizan para contar/analizar focos dentro de compartimentos subcelulares: Análisis de fluorescencia A: 1 Canal, Análisis de Fluorescencia B: 2 Canales en el mismo compartimiento y Análisis de Fluorescencia C: 2 Canales en dos compartimientos. Los bloques 12 y 13 están adaptados para el análisis de eventos de translocación: Análisis de fluorescencia D: Translocación global y Análisis de fluorescencia E: Translocación celular individual. (b) Presentación global de una arquitectura de bloques. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Tiempo necesario para la segmentación en función de la resolución de imágenes y el nivel de agrupación en clústeres de objetos
(a) Ilustración gráfica del tiempo necesario para realizar la segmentación en función de la resolución de la imagen y el nivel de agrupación en clústeres. Se han probado dos bloques de segmentación diferentes: Segmentación A (para objetos no agrupados) y Segmentación D (para objetos agrupados con formas irregulares). El tiempo de procesamiento (en segundos por imagen) se traza como una función de resolución de imagen (número de píxeles). (b) Ejemplo de imágenes analizadas con bloque Segmentación A o Segmentación D. Se indican las manchas DAPI y los núcleos segmentados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis del flujo de trabajo de un ensayo de translocación nuclear NF-B en respuesta a la estimulación de TNF
(a) Ejemplo de imágenes de células MCF7 humanas (línea celular de adenocarcinoma mamario humano) tratadas con TNF desde el conjunto de imágenes BBBC014 (Broad Bioimage Benchmark Collection)12. Se ha estudiado la localización del factor de transcripción NF-B en células tratadas con 12 concentraciones crecientes de TNF (de 0 a 10-7g/ml). Para cada concentración, se realizaron 4 réplicas. Las imágenes DAPI (canal azul) se procesaron en la segmentación C: Objetos agrupados con formas convexas bloque a núcleos de segmento, y luego se utilizó la tinción NF-B con FITC (canal verde) para delinear los citoplasmas con el bloque Desarmación E: Citoplasma agrupado. El bloque Análisis de fluorescencia D: Translocación global se utilizó para exportar la suma de los valores de píxeles nucleares y citoplasmáticos. (b) Los núcleos segmentados (grises) y los citoplasmas (blanco) se utilizan para determinar la intensidad total de la señal fluorescente NF-B en cada compartimiento. (c) La curva de dosis-respuesta obtenida a partir del análisis de datos ilustra el aumento de la proporción nuclear de NFB a medida que aumenta la concentración de TNF. Las imágenes están en formato BMP de 8 bits y el tamaño de la imagen es de 1360 x 1024 píxeles. Para cada concentración, la desviación estándar entre las 4 réplicas se calcula e ilustra como barras de error. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cuantificación de los focos EDC4 (cuerpos P) dentro del citoplasma en células individuales
(a) La su tinción con DAPI (canal azul) y Phalloidin (canal rojo) permite la segmentación e identificación de núcleos celulares y F-actina, respectivamente. La proteína EDC4 (canal verde) se utiliza como marcador para la detección de cuerpos P conocidos por ser exclusivamente citoplasmáticos. Se cuentan las focos de la barra de escala, 10 m. (b) y varias entidades (aquí su área en píxeles) se exportan a la hoja de cálculo Resultados estructurada en varias hojas. Dos hojas se dedican al análisis de núcleos y dos al análisis de citoplasmas. Cada raw incorpora la información de un ROI específico. En las hojas de información de Nucleus/Cytoplasm, se exportan las características de los objetos segmentados (ROI ID, tamaño e intensidad media), seguido del número de focos detectados dentro de cada ROI. Si es necesario, se puede agregar un umbral de tamaño (100 píxeles en este ejemplo) y el número de focos por debajo y por encima de este umbral se notifica en las dos últimas columnas. En el núcleo/Cytoplasm_Distribution de las hojas de tamaño de focos, el área (en píxeles) de todos los focos detectados se informa en la materia prima del ROI correspondiente. En este ejemplo, destacamos el análisis de dos células (segmentados cytoplasm_0 and_1), donde se han detectado focos EDC4 citoplasmáticos. También se da el tamaño en píxeles de cada uno de los focos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Cinética de la bobina y distribución nucleoplasmática 53BP1 después del estrés oxidativo
El análisis del número y tamaño de los focos se basó en más de 110 células individuales para cada punto de tiempo de 3 cinética independiente. (a) Detección de inmunofluorescencia de bobinado y focos 53BP1 en células De HeLa S3 durante todo el tratamiento cinético con 500 m H2O2. 53BP1 se concentra en los sitios de DNA Double-Strand Break y se utiliza para evaluar la eficiencia del tratamiento en cada célula. Coilin se enriquece en Cuerpos Cajales. Las células se fijaron 2, 4, 6, 8 y 20 h después de la inducción por estrés oxidativo y co-teñidas con anticuerpos anti-coilin (canal rojo) y anti-53BP1 (canal verde). Barra de escala, 10 m. (b) El número de focos nucleares de bobina después del estrés oxidativo. Los resultados se muestran como gráficas de caja, donde la marca central es la mediana, losth bordes inferior y superior de la caja son los percentiles 25th y 75. En las células tratadas con H2O2, se detecta un aumento significativo en el número de focos de bobina y es máximo después de 2 y 4 h de tratamiento. El análisis de pruebas de Wilcoxon - Mann Whitney demuestra una diferencia significativa entre las células tratadas con H2O2 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). (c) La proporción de células en función del área de los focos de bobinado (m2). La mayoría de los focos tienen un área más pequeña en puntos de tiempo de 2 h y 4 h en comparación con el control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Estudio de la nucleación de Cajal Bodies en células que sobreexpresa una proteína de fusión GFP-coilin
(a) Las células De HeLa S3 fueron transfectados transitoriamente en triplicados biológicos con 500 ng de un plásmido que expresaban una proteína de fusión GFP-Coilin utilizando un procedimiento estándar siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después de 48 h, las células se fijaron y teñiron con un anticuerpo contra la bobina. DAPI (canal azul) permite segmentar núcleos. Para estos análisis, se analizaron más de 100 células. La señal GFP refleja la localización de la proteína ectopic coilin-GFP (canal verde), mientras que la señal de bobina (canal rojo) corresponde a la localización de proteínas endógenas y exógenas. Para cada núcleo, la intensidad media de la señal GFP refleja el nivel de expresión de bobina. De acuerdo con este parámetro, las características de los focos coilin se han analizado utilizando el bloque Análisis de fluorescencia B: 2 Canales en el mismo compartimiento. Barra de escala, 10 m. (b) Relación entre el número de focos de bobina y la intensidad media de la GFP por núcleo. Los resultados se muestran como gráficas de caja, donde la marca central es la mediana, elth borde inferior y superior de la caja son los percentiles 25th y 75. El análisis de pruebas de Wilcoxon - Mann Whitney demuestra un aumento significativo del número de focos para una intensidad GFP >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). (c) Relación entre el área de los focos de bobina y la intensidad media de la GFP por núcleo. Los resultados se muestran como gráficas de caja, donde la marca central es la mediana, elth borde inferior y superior de la caja son los percentiles 25th y 75. El análisis de pruebas de Wilcoxon - Mann Whitney demuestra un aumento significativo del área de focos de bobinado para una intensidad GFP >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura S1: Cinética de la distribución nucleoplasmática 53BP1 después del estrés oxidativo
(a) Cuantificación de los focos nucleares 53BP1 en células tratadas no tratadas o H2O2 después de diferentes tiempos de incubación. Los resultados se muestran como gráficas de caja, donde la marca central es la mediana, elth borde inferior y superior de la caja son los percentiles 25th y 75. El análisis de pruebas de Wilcoxon - Mann Whitney demuestra una diferencia significativa entre las células tratadas con H2O2 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). (b) Para cada punto de tiempo de la cinética, se ha establecido una curva ROC (Característica operativa del receptor) para determinar el mejor umbral para discriminar entre celdas estresadas y no estresadas. Los parámetros de cada prueba se notifican en la tabla (Sensibilidad, especificidad, TP: verdadero positivo, TN: true negativo, FP: falso positivo, FN: falso negativo). A partir de estos datos, se determinó que un umbral global de 17 focos de 53BP1 discriminaba el estrés de las células no estresadas a través de la cinética. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Un número cada vez mayor de herramientas de software libre están disponibles para el análisis de imágenes de celdas de fluorescencia. Los usuarios deben elegir correctamente el software adecuado de acuerdo con la complejidad de su problema, a su conocimiento en el procesamiento de imágenes, y al tiempo que quieren pasar en su análisis. Icy, CellProfiler o ImageJ/Fiji son potentes herramientas que combinan facilidad de uso y funcionalidad3. Icy es una herramienta independiente que presenta una interfaz gráfica de usuario (GUI) clara, y en particular su "Protocolos" punto y interfaz de clic a través de la cual los flujos de trabajo se pueden diseñar o manipular fácilmente4. La funcionalidad de este software se mejora mediante el soporte y la utilización de plug-ins ImageJ, y una gran cantidad de documentación está disponible gracias a su gran comunidad de usuarios. Utilizamos esta fuerte combinación de usabilidad y funcionalidad del software Icy para desarrollar el flujo de trabajo de Substructure Analyzer. Su principal objetivo es proponer una solución automatizada para realizar un análisis completo de la señal fluorescente celular a partir de múltiples imágenes. El análisis abarca el preprocesamiento de imágenes, la segmentación de objetos y el análisis de señales fluorescentes.

Varios protocolos se comparten con gratitud en el sitio web de Icy y proponen utilizar funcionalidades heladas para detectar y analizar señales fluorescentes como focos celulares. Sin embargo, algunos de estos protocolos solo procesan una imagen por ejecución, no exportan los resultados en un archivo específico ni analizan un solo canal. Otros no contienen segmentación preliminar para determinar regiones de interés (ROI) ni proponen algoritmos simples como "HK-means" que no son adecuados para la segmentación de objetos altamente agrupados. Substructure Analyzer automatiza todos los pasos del análisis de imágenes, desde el preprocesamiento de imágenes hasta la segmentación de objetos y la detección/análisis de señales fluorescentes. El protocolo también propone métodos simples o más complejos para la segmentación de objetos y la exportación de los datos (nombres de los objetos segmentados, análisis de focos) se realiza en salidas optimizadas adaptadas a la problemática. CellProfiler también propone potentes canalizaciones compuestas de módulos que encapsulan funcionalidades18,,19. Las tuberías disponibles están bien adaptadas a problemas específicos. Los flujos de trabajo de icy son una red de diferentes cajas, cada una de las dos realizando una tarea específica. A través de la interfaz "Protocolos", las cajas que componen la red son intuitivas y fáciles de manipular. Substructure Analyzer se adapta a varios contextos como la simple fusión de canales, la cuantificación de la distribución de señales fluorescentes entre dos compartimentos subcelulares, el análisis de focos en uno o varios canales de uno o dos compartimentos celulares en células individuales. Varias pantallas permiten visualizar los resultados intermedios durante cada ejecución para controlar el procesamiento. Además, Icy presenta barras de iconos que agrupan los métodos por tema y a partir de las cuales las funcionalidades que se encuentran en el flujo de trabajo se pueden manipular por separado para probar manualmente parámetros específicos en algunas imágenes antes de usarlos en un conjunto de imágenes completo.

Al igual que en el campo de análisis de bioimagen, el paso más crítico de este protocolo es la segmentación de objetos. El protocolo propone la segmentación de objetos primarios, que son la mayor parte de los núcleos de celda de tiempo, y también contiene otro bloque que tarea es segmentar un segundo tipo de objetos dentro de la celda. La segmentación de núcleos puede ser difícil cuando los objetos están muy agrupados para que se toquen o se superpongan. Diferentes alternativas para la segmentación de objetos primarios están contenidas en el protocolo, de acuerdo con la forma de los objetos y el nivel de agrupación en clústeres, incluso si hasta la fecha no hay éxito de algoritmo universal en la segmentación completa de objetos altamente agrupados. El proceso de segmentación está limitado principalmente por la determinación de parámetros correctos que podrían segmentar correctamente una parte de los objetos, pero que conducen a una segmentación inferior o excesiva de otra pieza. El usuario tendría que realizar diferentes ejecuciones con diferentes parámetros para obtener una segmentación correcta final, especialmente para los objetos agrupados que presentan formas heterogéneas y no convexas.

Este protocolo está limitado principalmente por el paso de segmentación, que podría llevar mucho tiempo y necesitar una configuración informática potente para los casos más complejos. Más específicamente, cuanto más numerosas o complejas sean las imágenes (objetos agrupados para segmentar, un gran número de píxeles en las imágenes), más memoria de acceso aleatorio (RAM) necesitará el usuario. Globalmente, para cualquier problema, el usuario tendrá que ejecutar el protocolo en un entorno de ejecución Java de 64 bits (disponible libremente en el sitio web de Java) y utilizar un sistema operativo (SO) de 64 bits para aumentar la memoria disponible utilizada por Icy (la memoria está limitada a 1300 MB para JRE de 32 bits). Debido al script, el protocolo no funciona correctamente en un equipo Mac. Además, el número de parámetros aumenta con la complejidad del problema y requerirá más conocimiento en el análisis de imágenes. En cuanto a los criterios de funcionalidad, este protocolo aún no se ha adaptado para el análisis de imágenes apiladas (pilas de tiempo, pilas z) incluso si Icy realiza análisis eficientemente sobre este tipo de datos.

Las actualizaciones futuras se realizarán en particular para mejorar la segmentación de objetos agrupados complejos. Se desarrollarán bloques adicionales para adaptar la segmentación a estructuras celulares agrupadas con formas irregulares no convexas. También adaptaremos el flujo de trabajo para el análisis de tiempo y pilas z (para imágenes en vivo y datos 3D).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

G.H. fue apoyado por una beca de posgrado de la Ministére Délégué a la Recherche et aux Technologies. L.H. fue apoyado por una beca de posgrado del Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mientras que Q.T. fue apoyado por una subvención pública supervisada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) como parte del segundo programa "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (referencia: ANR-15-RHU4570004). Esta obra fue financiada por el CNRS y la Universidad de Lorena (UMR 7365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free Thermo Fisher Scientific 28908 to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific A-11008 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-21425 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A34055 fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA) euromedex 04-100-812-E
DMEM Sigma-Aldrich D5796-500ml cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040-5ML mounting medium
Human: HeLa S3 cells IGBMC, Strasbourg, France cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) Sigma-Aldrich H1009-100ml used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent Thermo Fisher Scientific 11668-019 transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin abcam ab11822 Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope Nikon epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062 transfection medium
PBS pH 7.4 (10x) gibco 70011-036 to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1 Thermo Fisher Scientific PA1-16565 53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4 Sigma-Aldrich SAB4200114 EDC4-specific antibody
Triton X-100 Roth 6683 to permeabilize the cells

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References

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Bioingeniería Número 161 Microscopía de Fluorescencia Análisis de Bioimagen Segmentación Celular Conteo de Foci Cuerpos Celulares Estrés Oxidativo Automatización Análisis de Translocación Subestructura Analyzer Icy Imagen J
Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia
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Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, … More

Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, L., Thuillier, Q., de Chaumont, F., Dallongeville, S., Behm-Ansmant, I. Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images. J. Vis. Exp. (161), e60990, doi:10.3791/60990 (2020).

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