Bioengineering

Substructure Analyzer: Ett användarvänligt arbetsflöde för snabb utforskning och korrekt analys av cellulära organ i fluorescensmikroskopi bilder

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990

Géraud Heckler¹, Christelle Aigueperse¹, Liza Hettal¹, Quentin Thuillier¹, Fabrice de Chaumont², Stéphane Dallongeville², Isabelle Behm-Ansmant¹

¹Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, ²Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

Vi presenterar ett fritt tillgängligt arbetsflöde byggt för snabb utforskning och noggrann analys av cellulära organ i specifika cellfack i fluorescensmikroskopibilder. Detta användarvänliga arbetsflöde är utformat på programvaran med öppen källkod Icy och använder även ImageJ-funktioner. Rörledningen är prisvärd utan kunskap i bildanalys.

Abstract

Det senaste årtiondet har präglats av genombrott inom fluorescensmikroskopitekniker som illustreras av rumslig upplösningsförbättring men också i live-cell imaging och hög genomströmningsmikroskopitekniker. Detta ledde till en konstant ökning av mängden och komplexiteten hos mikroskopidata för ett enda experiment. Eftersom manuell analys av mikroskopidata är mycket tidskrävande, subjektiv och förbjuder kvantitativa analyser, blir automatisering av bioimageanalys nästan oundviklig. Vi byggde ett informatikarbetsflöde kallat Substructure Analyzer för att helt automatisera signalanalys i bioimages från fluorescerande mikroskopi. Detta arbetsflöde är utvecklat på den användarvänliga plattformen med öppen källkod Icy och kompletteras med funktioner från ImageJ. Den omfattar förbehandling av bilder för att förbättra förhållandet mellan signal och bru, individuell segmentering av celler (detektion av cellgränser) och detektion/kvantifiering av cellkroppar som berikats i specifika cellfack. Den största fördelen med detta arbetsflöde är att föreslå komplexa bio-imaging funktioner för användare utan bildanalys expertis genom ett användarvänligt gränssnitt. Dessutom är den mycket modulär och anpassad till flera frågor från karakterisering av nukleär/cytoplasmatisk flyttning till jämförande analys av olika cellkroppar i olika cellulära understrukturer. Funktionaliteten i detta arbetsflöde illustreras genom studiet av Cajal (lindade) Organ under oxidativ stress (OS) villkor. Data från fluorescensmikroskopi visar att deras integritet i mänskliga celler påverkas några timmar efter induktion av OS. Denna effekt kännetecknas av en minskning av coilin kärnbildning i karakteristiska Cajal organ, i samband med en nukleoplasmic omfördelning av coilin till ett ökat antal mindre högborgar. Den centrala roll coilin i utbytet mellan CB komponenter och den omgivande nukleoplasm tyder på att OS inducerad omfördelning av coilin kan påverka sammansättning och funktionalitet Cajal organ.

Introduction

Ljusmikroskopi och, i synnerhet, fluorescensmikroskopi är robusta och mångsidiga tekniker som vanligen används inom biologiska vetenskaper. De ger tillgång till exakt lokalisering av olika biomolekyler som proteiner eller RNA genom deras specifika fluorescerande märkning. Det senaste årtiondet har präglats av snabba framsteg inom mikroskopi och bildteknik vilket framgår av 2014 års Nobelpris i kemi som tilldelas Eric Betzig, Stefan W. Hell och William E. Moerner för utveckling av super-resolved fluorescensmikroskopi (SRFM)¹. SFRM kringgår diffraktionsgränsen för traditionell optisk mikroskopi för att föra in den i nanodimensionen. Förbättring av tekniker som live-imaging eller hög genomströmning screening metoder ökar också mängden och komplexiteten i data att behandla för varje experiment. För det mesta står forskare inför höga heterogena populationer av celler och vill analysera fenotyper på encellig nivå.

Inledningsvis utfördes analyser som foci-räkning av ögat, vilket föredras av vissa forskare eftersom det ger full visuell kontroll över räkningsprocessen. Manuell analys av sådana data är dock för tidskrävande, leder till variationer mellan observatörer och ger inte tillgång till mer komplexa funktioner så att datorstödda metoder blir allmänt använda och nästan oundvikliga². Bioimageinformatikmetoder ökar avsevärt dataanalysens effektivitet och är fria från den oundvikliga operatörens subjektivitet och potentiella bias hos den manuella räkningsanalysen. Den ökade efterfrågan på detta område och förbättringen av datorkraft ledde till utvecklingen av ett stort antal bildanalysplattformar. Några av dem är fritt tillgängliga och ger tillgång till olika verktyg för att utföra analyser med persondatorer. En klassificering av open access-verktyg har nyligen etablerats³ och presenterar Icy⁴ som en kraftfull programvara som kombinerar användbarhet och funktionalitet. Dessutom har Isig fördelen av att kommunicera med ImageJ.

För användare utan bildanalys expertis, de största hindren är att välja lämpligt verktyg enligt de problematiska och korrekt ställa parametrar som ofta inte är väl förstådda. Dessutom är installationstiderna ofta långa. Icy föreslår en användarvänlig peka-och-klicka-gränssnitt som heter "Protokoll" för att utveckla arbetsflödet genom att kombinera några plugins som finns i en uttömmande samling⁴. Den flexibla modulära designen och peka-och-klicka-gränssnittet gör det möjligt för icke-programmerare att göra en analys möjlig för icke-programmerare. Här presenterar vi ett arbetsflöde som kallas Substructure Analyzer, utvecklat i Isigs gränssnitt, vars funktion är att analysera fluorescerande signaler i specifika cellulära fack och mäta olika funktioner som ljusstyrka, foci nummer, foci storlek och rumslig fördelning. Det här arbetsflödet tar upp flera problem, till exempel kvantifiering av signaltranslotering, analys av transfected celler som uttrycker en fluorescerande reporter eller analys av foci från olika cellulära understrukturer i enskilda celler. Det gör det möjligt att samtidigt bearbeta flera bilder, och utdataresultat exporteras till ett flikavgränsat kalkylblad som kan öppnas i vanliga kalkylbladsprogram.

Substructure Analyzer-rörledningen presenteras i figur 1. För det första bearbetas alla bilder i en angiven mapp för att förbättra signal- och brusförhållandet. Det här steget ökar effektiviteten i följande steg och minskar körtiden. Sedan identifieras och segmenteras de intresseområden som motsvarar de bildområden där lysrörssignalen ska upptäckas. Slutligen analyseras lysrörssignalen och resultaten exporteras till ett flikavgränsat kalkylblad.

Objektsegmentering (detektion av gränser) är det mest utmanande steget i bildanalys, och dess effektivitet avgör noggrannheten i de resulterande cellmätningarna. De första objekt som identifieras i en bild (kallas primära objekt) är ofta kärnor från DNA-färgade bilder (DAPI eller Hoechst färgning), även om primära objekt kan också vara hela celler, pärlor, prickar, tumörer, eller vad färgade objekt. I de flesta biologiska bilder, celler eller kärnor röra varandra eller överlappning orsakar enkla och snabba algoritmer att misslyckas. Hittills kan ingen universell algoritm utföra perfekt segmentering av alla objekt, främst på grund av att deras egenskaper (storlek, form eller textur) modulera effektiviteten i segmentering⁵. De segmenteringsverktyg som vanligen distribueras med mikroskopiprogramvara (till exempel MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices⁶eller NIS-Elements Advances Research software av Nikon⁷) baseras i allmänhet på standardtekniker som korrelationsmatchning, trösklar eller morfologiska operationer. Även om de är effektiva i grundläggande system presenterar dessa övergeneraliserade metoder snabbt begränsningar när de används i mer utmanande och specifika sammanhang. Segmentering är i själva verket mycket känslig för experimentella parametrar som celltyp, celldensitet eller biomarkörer, och kräver ofta upprepade justeringar för en stor datauppsättning. Arbetsflödet Substructure Analyzer integrerar både enkla och mer sofistikerade algoritmer för att föreslå olika alternativ anpassade till bildkomplexitet och användarnas behov. Det föreslår särskilt markör-baserade vattendelare^{algoritm 8} för mycket grupperade objekt. Effektiviteten i den här segmenteringsmetoden är beroende av valet av enskilda markörer för varje objekt. Dessa markörer väljs manuellt för det mesta för att få rätt parametrar för fullständig segmentering, vilket är mycket tidskrävande när användare står inför ett stort antal objekt. Substructure Analyzer föreslår en automatisk detektering av dessa markörer, vilket ger en mycket effektiv segmenteringsprocess. Segmentering är för det mesta det begränsande steget för bildanalys och kan avsevärt ändra bearbetningstiden beroende på bildens upplösning, antalet objekt per bild och nivån för klustring av objekt. Typiska rörledningar kräver några sekunder till 5 minuter per bild på en vanlig stationär dator. Analys av mer komplexa bilder kan kräva en mer kraftfull dator och vissa grundläggande kunskaper i bildanalys.

Flexibiliteten och funktionaliteten i detta arbetsflöde illustreras med olika exempel i de representativa resultaten. Fördelarna med detta arbetsflöde visas särskilt genom studiet av nukleära understrukturer under oxidativ stress (OS) förhållanden. OS motsvarar en obalans av redox homeostas till förmån för oxidanter och är associerad med höga nivåer av reaktiva syrearter (ROS). Eftersom ROS fungerar som signalering molekyler, förändringar i deras koncentration och subcellulärlokalisering påverkar positivt eller negativt en myriad av vägar och nätverk som reglerar fysiologiska funktioner, inklusive signaltransduktion, reparationsmekanismer, genuttryck, celldöd, och spridning⁹^,¹⁰. OS är alltså direkt involverat i olika patologier (neurodegenerativa och hjärt-kärlsjukdomar, cancer, diabetes, etc.), men också cellulärt åldrande. Därför är dechiffrera konsekvenserna av OS på den mänskliga cellens organisation och funktion ett avgörande steg i förståelsen av OS roller i uppkomsten och utvecklingen av mänskliga patologier. Det har fastställts att OS reglerar genuttryck genom att modulera transkription genom flera transkriptionsfaktorer (p53, Nrf2, FOXO3A)¹¹, men också genom att påverka regleringen av flera sam- och post-transkriptionsprocesser såsom alternativ splitsning (AS) av pre-RNAs¹²^,¹³^,¹⁴. Alternativ splitsning av primära kodning och icke-kodning avskrifter är en viktig mekanism som ökar kodningskapaciteten hos genomen genom genomet genom att producera transkriptisoformer. AS utförs av en enorm ribonucleoprotein komplex som kallas skarvliceosome, som innehåller nästan 300 proteiner och 5 U-rika små nukleära RNAs (UsnRNAs)¹⁵. Skarvolicoom montering och AS är tätt kontrollerade i celler och vissa steg av skarvar mognad förekommer inom membran-mindre kärnfack som heter Cajal Bodies. Dessa nukleära understrukturer kännetecknas av den dynamiska karaktären av deras struktur och deras sammansättning, som huvudsakligen utförs av multivalenta interaktioner av deras RNA och proteinkomponenter med coilin protein. Analys av tusentals celler med substructure Analyzer arbetsflödet tillåts karakterisering av aldrig beskrivna effekter av OS på Cajal Organ. Faktum är att erhållna data tyder på att OS ändrar kärnbildning av Cajal organ, inducera en nukleoplasmic omfördelning av coilin proteinet i många mindre nukleära högborgar. En sådan förändring av strukturen hos Cajal Organ kan påverka mognaden av skarvar och delta i AS modulering av OS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Användarvänliga tutorials finns på Isos webbplats http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Ladda ner Isiga och Substructure Analyzer-protokollet

Ladda ner Isig från Icy webbplats(http://icy.bioimageanalysis.org/download) och ladda ner Substructure Analyzer protokoll: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
Om du använder ett 64-bitars operativsystem ska du se till att använda 64-bitarsversionen av Java. Denna version gör det möjligt att öka det minne som tilldelats Icy (Inställningar | Allmänt | Max minne).

Öppna Is och klicka på Verktyg i menyn Meny i menyfliksområdet.
Klicka på Protokoll för att öppna gränssnittet Protokollredigerare.
Klicka på Ladda och öppna protokollet Substructure Analyzer. Protokollinläsning kan ta några sekunder. Se till att öppnandet av protokollet är klart innan du använder det.
OBS: Arbetsflödet består av 13 allmänna block som presenteras i figur 2a. Varje block fungerar som en pipeline som består av flera rutor som utför specifika underaktiviteter.

3. Interagera med arbetsflödet på Is

VARJE block eller ruta är numrerat och har en viss rangordning i arbetsflödet (bild 2b). Genom att klicka på detta nummer, den närmaste möjliga position till den första tilldelas det valda blocket / rutan då positionen för de andra block / lådor omorganiserades. Respektera den rätta ordningen på blocken när du förbereder arbetsflödet. Spot detector-blocket behöver till exempel fördefinierade ROIs så att segmenteringsblock måste köras före spotdetektorblock. Ändra inte rutornas position. Använd inte "." i bildens namn.

Genom att klicka på ikonen för det övre vänstra hörnet komprimerar, expanderar, förstorar, smalar eller tar bort blocket (Bild 2b).
Varje pipeline i arbetsflödet kännetecknas av ett nätverk av lådor som är anslutna via deras ingång och utgång (figur 2b). Om du vill skapa en anslutning klickar du på Utdata och underhåller tills markören uppnår en indata. Anslutningar kan tas bort genom att klicka på utdatataggen.

4. Sammanslagning av en bilds kanaler

Använd blocket Sammanfoga kanaler för att generera kopplade bilder. Om det behövs byter du namn på filerna så att sekvenser som ska sammanfogas har samma namns prefix följt av en avgränsare. Till exempel heter sekvenser av enskilda kanaler från en bild A: ImageA_red ImageA_blue.
För avgränsaren ska du inte använda tecken som redan finns i bildens namn.
Skapa en ny mapp per kanal i samma mapp som du vill sammanfoga. Om du till exempel vill sammanfoga röda, gröna och blå kanaler skapar du tre mappar och lagrar motsvarande sekvenser i dessa mappar.
Använd bara blocket Sammanfoga kanaler,ta bort de andra blocken och spara protokollet som sammanfoga kanaler.
1. Öppna rutorna för att ange parametrar. För varje kanal fyller du rutorna Kanalnummer X (rutorna 1, 5 eller 9), Mappkanalnummer X (rutorna 2, 6 eller 10), Avgränsningskanalnummer X (rutorna 3, 7 eller 11) och Colormap channel nb X (rutorna 4, 8 respektive 12).
  Dessa rutor är vågrätt grupperade med fyra, varje rad som motsvarar samma kanal. På varje rad finns även en display (fälten 23, 24 eller 25) för att direkt visualisera sekvensen för motsvarande kanal.
  1. I rutan Kanal nummer Xväljer du vilken kanal som ska extraheras (i klassiska RGB-bilder, 0=Röd, 1=Grön, 2=Blå). Användaren kommer snabbt åt de olika kanalerna i en bild i fönstret Inspektör i Ishalk, på fliken Sekvens. Skriv den minsta kanalens värde i den övre raden och den högsta i den nedersta raden.
  2. Skriv \Namnet på mappen som innehåller bilder av kanal X i rutan Mappkanalnummer X.
  3. Skriv den avgränsare som används för bildens namn i rutan Avgränsares kanalnummer X(i föregående exempel: "_red", "_green" och "_blue").
  4. I rutan Colormap channel nb Xanger du med ett tal vilken färgkarta modell som ska användas för att visualisera motsvarande kanal i Icy. De tillgängliga färgmapparna visas på fliken Sekvens i fönstret Inspektör.
  5. Skriv tillägget i rutan Format för sammanfogade bilder (ruta 28) för att spara sammanfogade bilder: .tif, .gif, .jpg, .bmp eller .png.
    Om du bara vill sammanfoga två kanaler fyller du inte de fyra rutor som motsvarar den tredje kanalen.
2. Klicka på länken direkt till höger om mappeni det övre vänstra hörnet av blocket Sammanfoga kanaler. I dialogrutan Öppna som visas dubbelklickar du på mappen som innehåller sekvenser för den första kanalen som har definierats i rutan Mappkanal nummer 1 (ruta 2). Klicka sedan på Öppna.
3. Kör protokollet genom att klicka på den svarta pilen i det övre vänstra hörnet av blocket Sammanfoga kanaler (se del 7 för mer information). Sammanfogade bilder sparas i en kopplingsmapp i samma katalog som mapparna i enskilda kanaler.

5. Segmentering av de regioner av intresse

OBS: Substructure Analyzer integrerar både enkla och mer sofistikerade algoritmer för att föreslå olika alternativ anpassade till bildkomplexitet och användarnas behov.

Välj det anpassade blocket.
1. Om objekt inte rör varandra eller om användaren inte behöver skilja klustrade objekt individuellt använder du blocksegmenteringen A: Icke klustrade objekt.
2. När objekt inte rör vid varandra, men vissa av dem är nära, använder du blocksegmentering B: Dåligt grupperade objekt.
3. För objekt med hög klusternivå och en konvex form använder du blocksegmentering C: Grupperade objekt med konvexa former.
4. Om objekt uppvisar en hög klusternivå och har oregelbundna former använder du blocksegmentering D: Grupperade objekt med oregelbundna former.
5. Använd blocksegmentering E: Klustrad cytoplasma för att segmentera vidröra cytoplasmor individuellt med hjälp av segmenterade kärnor som markörer. Detta block behöver imperativt segmenterade kärnor för att bearbeta.
  OBS: Block som är anpassade för primär objektsegmenteringsprocess oberoende av oberoende så att flera block kan användas i samma körning för att jämföra deras effektivitet för en viss understruktur eller för att segmentera olika typer av understrukturer. Om klusternivån är heterogen inom samma uppsättning bilder bearbetar du små och starkt grupperade objekt separat i de anpassade blocken.
Länka utdata0 (Fil) i blocket Välj mapp till mappinmatningen för det valda segmenteringsblocket.
Ange parametrar för det valda segmenteringsblocket.
1. Segmentering A: Icke klustrade objekt och segmentering C: Grupperade objekt med konvexa former
  1. I rutan Kanalsignal (ruta 1) ställer du in objektens kanal på segment.
  2. Som ett alternativ, i rutan Gaussian filter (ruta 2), öka X och Y sigma värden om signalen inuti objekt är heterogen. Det gaussiska filtret jämnar ut texturer för att få mer enhetliga regioner och ökar hastigheten och effektiviteten i kärnsegmentering. Ju mindre objekt, desto lägre är Sigma-värdet. Undvik höga sigmavärden. Ange standardvärden till 0.
  3. I rutan HK-Means (ruta 3) anger du parametern Intensitetsklasser och de ungefärliga minimi- och maximistorlekarna (i pixlar) för objekt som ska identifieras.
    För intensitetsklasser klassificerar ett värde på 2 pixlar i två klasser: bakgrund och förgrund. Den anpassas således när kontrasten mellan föremålen och bakgrunden är hög. Om förgrundsobjekt har olika intensiteter eller om kontrasten mot bakgrunden är låg ökar du antalet klasser. Standardinställningen är 2. Objektstorlek kan snabbt utvärderas genom att rita en ROI manuellt runt objektet av intresse. Roi-storleken (Invändig i bildpunkter) visas direkt på bilden när den pekar med markören eller kan nås i ROI-statistikfönstret (öppna den från sökfältet). Optimala parametrar identifierar varje förgrundsobjekt i en enda ROI. De kan definieras manuellt i Icy (Detection and Tracking | HK-Medel).
  4. Optimera identifieringen av objektkantlinjer i rutan Aktiva konturer (ruta 4). Uttömmande dokumentation för denna plugin finns tillgänglig online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Korrekta parametrar kan också definieras manuellt i Icy (Detection and Tracking | Aktiva konturer).
  5. Under processen skapas en mapp automatiskt för att spara bilder av segmenterade objekt. Namnge den här mappen (t.ex. segmenterade kärnor) i rutan Text (ruta 6). Om du vill ange formatet för att spara bilder av segmenterade objekt (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG) fyller du rutformatetför bilder av segmenterade objekt . Mappen skapas i mappen som innehåller kopplade bilder.
  6. Kör arbetsflödet (för mer information, se del 7).
2. Segmentering B: Dåligt grupperade objekt
  1. Följ samma steg som i 5.3.1 för att ställa in parametrar för rutor Kanalsignal, HK-Means, Aktiva konturer, Tillägg för att spara segmenterade objekt och Text (Rutor rankas är inte samma som i steg 5.3.1).
  2. I rutan Call IJ plugin (ruta 4), ställ in rullande parametern för att styra bakgrunden subtraktion. Ange den här parametern till minst storleken på det största objektet som inte ingår i bakgrunden. Om du minskar detta värde ökar borttagningen av bakgrunden, men den kan också leda till förlust av förgrundssignal.
  3. I rutan Adaptiv histogramutjämning (ruta 6) förbättrar du kontrasterna mellan förgrundsobjekten och bakgrunden. Att öka lutningen ger mer kontrasterade sekvenser.
  4. Kör arbetsflödet (för mer information, se del 7).
3. Segmentering D: Grupperade objekt med oregelbundna former
  OBS: Tre olika metoder för segmentering gäller för varje bild: för det förstaHK-medel klusteri kombination medMetoden Aktiva konturertillämpas. Sedan kanklassisk vattendelare algoritm(med hjälp av den euklidiska avståndskartan) tillämpas på tidigare felsegmenterade objekt. Slutligen har enmarkörbaserad vattendelare algoritmanvänds. Endast HK-medel och markörbaserade vattendelare metoder behöver användarens ingripande. För båda metoderna kan samma parametrar tillämpas för alla bilder (helt automatiserad version) eller ändras för varje bild (halvautomatisk version). Om användaren inte är utbildad i dessa segmenteringsmetoder rekommenderas den halvautomatiska bearbetningen starkt. Under bearbetningen av detta block behövs manuell intervention. När en segmenteringsmetod är klar måste användaren manuellt ta bort felsegmenterade objekt innan nästa segmenteringsmetod börjar. Segmenterade objekt sparas och beaktas inte i nästa steg. Detta block måste anslutas till blocketDialogrutan Dialogruta för segmentering av grupperade/heterogena former av primära objektatt fungera korrekt.
  1. Ladda ner ImageJ-kollektionen MorphoLibJ på https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. MorphoLibJ 1.4.0-versionen används i det här protokollet. Placera filen MorphoLibJ_-1.4.0.jar i mappen isiga / ij / plugins. Mer information om innehållet i den här samlingen finns på https://imagej.net/MorphoLibJ.
  2. Följ samma steg som i steg 5.3.1 för att ställa in parametrar för rutor Kanalsignal, Gaussiskt filter, Aktiva konturer, Tillägg för att spara segmenterade objekt och Text. Rutorna rankas inte är samma som i steg 5.3.1.
  3. Ange parametrar för rutan Adaptiv histogramutjämning (se steg 5.3.2.3).
  4. Om du vill aktivera Subtrahera bakgrundskriver du ja i Använd subtrahera bakgrund? (ruta 5). Annars skriver du Nej. Om insticksprogrammet är aktiverat ställer du in rullande parametern (se steg 5.3.2) i rutan Subtrahera bakgrundsparameter (ruta 7).
  5. Automatisering av HK-medel: Om du vill tillämpa samma parametrar för alla bilder (helt automatiserad bearbetning) ställer du in Nb för klasser (ruta 11), minsta storlek (ruta 12) och den maximala storleken (ruta13) (se steg 5.3.1). Dessa parametrar måste ställas in för att välja maximalt förgrundspixlar och för att optimera individualiseringen av förgrundsobjekt. För den halvautomatiska bearbetningsversionen behövs ingen åtgärd.
  6. Automatisering av markörextraheringar: för den helautomatiska versionen, expandera ruta InternMarkörer extrahering (ruta 27) och ange värdet för den "dynamiska" parametern i linje 13 av skriptet. För den halvautomatiska bearbetningsversionen behövs ingen åtgärd.
    Obs: Markörer extraheras genom att tillämpa en förlängd minima omvandling på en indatabild som styrs av en "dynamisk" parameter. I den markörbaserade vattendelarealgoritmen simuleras översvämning från dessa markörer för att utföra objektsegmentering. För en lyckad segmentering av förgrundsobjekt bör en enda markör per förgrundsobjekt extraheras. Inställningen av den "dynamiska" parametern för optimal utvinning av markörer beror främst på bildernas upplösning. Om du inte är bekant med den här parametern använder du den halvautomatiska versionen.
  7. Kör arbetsflödet (för mer information, se del 7).
  8. I början av bearbetningen, dialogrutor HK-betyder parametrar och Marker-baserade vattendelare successivt öppna. Om du vill tillämpa samma parametrar för alla bilder (helt automatiserad version) klickar du på JA. Annars klickar du på NEJ. En informationsruta öppnas och ber att "Bestäm optimala avkastnings- och avkastnings-institut med HK-Hjälpmedel plugin och nära bild". Klicka på OK och manuellt tillämpa HK-Means plugin(Detection and Tracking| HK-Medel) på bilden, som öppnas automatiskt. Välj alternativet Exportera ROIs i plugin-rutan HK-Means. Använd de bästa parametrarna för att ha ROIs som innehåller maximalt förgrundspixlar och för att optimera individualiseringen av förgrundsobjekt. Stäng bilden direkt när optimala ROIs hittas.
  9. I slutet av den första segmenteringsmetoden öppnas en informationsruta och "Ta bort oönskade ROM-skivor och stäng bilden". Dessa ROIs motsvarar gränserna för segmenterade objekt. Välj OK och ta bort ROIs för felsegmenterade objekt i bilden, som öppnas automatiskt. En ROI kan enkelt tas bort genom att placera markören på kantlinjen och använda "Ta bort"-knappen på tangentbordet. Stäng bilden. Upprepa samma procedur efter slutförandet av det andra segmenteringssteget.
  10. I det här skedet, om JA-knappen valdes för full automatisering av den markörbaserade vattendelarealgoritmen, tillämpas de tidigare inställda parametrarna på alla bilder.
  11. Om NO-knappen har valts öppnas en informationsruta och "Bestäm och justera interna markörer". Klicka på OK och inom ImageJ gränssnittet i Is, gå till Plugins | MorphoLibJ | Minima och Maxima| Utökad min och max. Välj Utökad Minimai Drift .
  12. Välj Förhandsgranska om du vill föra visualisera den automatiskt öppnade bilden resultatet av omformningen. Flytta den dynamiska tills optimala markörer observeras. Markörer är grupper av pixlar med värdet 255 (Inte nödvändigtvis vita pixlar). Optimala parametrar leder till en markör per objekt. Fokusera på de återstående objekten som inte har segmenterats väl med de två tidigare segmenteringsmetoderna.
  13. Om det behövs, förbättra markörer genom att tillämpa ytterligare morfologiska åtgärder som "Öppning" eller "Stängning" (Plugins | MorphoLibJ | Morfologiska filter). När du får den slutliga bilden av markörer, hålla den öppen och stänga alla andra bilder som slutar med bilden som ursprungligen användes som en ingång för Extended Minima operation. Klicka på Nej om en ImageJ-ruta ber att få spara ändringar på den här bilden.
  14. I rutan Nb av bilder med Information Box (ruta 14), bestämma hur många bilder med informationsrutor ska visas.
4. Segmentering E: Klustrad cytoplasma
  OBS: Detta block använder tidigare segmenterade kärnor som enskilda markörer för att initiera cytoplasma segmentering. Se till att blocket av kärnsegmentering har bearbetats innan du använder den.
  1. I rutan Kanal cytoplasma (ruta 1), ställa in kanalen för cytoplasmatisk signal.
  2. Skriv det format som används för att spara bilder av segmenterade kärnor (tif, jpeg, bmp, png) i rutan Extension segmenterad atomkärnor (ruta 2). Standardformatet är tif.
  3. Skriv \Namnet på mappen som innehåller segmenterade kärnor i rutan Text (ruta3).
  4. I rutan Format av bilder av segmenterade cytoplasmor (ruta 4), ställer in formatet som ska användas för att spara segmenterade objekt bilder (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
  5. Under processen skapas en mapp automatiskt för att spara bilder av segmenterade cytoplasmor. I rutan Text (ruta 5) namnger du den här mappen (t.ex. segmenterade cytoplasmor). Mappen skapas i mappen som innehåller kopplade bilder.
  6. Följ samma steg som i steg 5.3.1 för att ställa in parametrar för rutorna Gaussian filter och aktiva konturer (Var försiktig, rutan rankas är inte samma som i steg 5.3.1).
  7. Kör arbetsflödet (för mer information, se del 7).

6. Lysrörsdetektering och analys

Välj det anpassade blocket.
1. I blocket Fluorescens analys A: 1 Kanal, utföra detektion och analys av foci i en kanal inuti en typ av segmenterade objekt: detektion av coilin foci (röd kanal) inom kärnan.
2. I blocket Fluorescensanalys B: 2 Kanaler i samma fack, utföra detektion och analys av foci i två kanaler inuti en typ av segmenterat objekt: detektion av coilin (röd kanal) och 53BP1 (grön kanal) högborgar i kärnan.
3. I blocket Fluorescensanalys C: 2 Kanaler i två fack, utföra detektion och analys av foci i en eller två kanaler, särskilt inuti kärnorna och deras motsvarande cytoplasma: detektion av Coilin foci (röd kanal) både inom kärnan och dess motsvarande cytoplasma eller detektion av Coilin foci (röd kanal) inom kärnan och G3BP foci (grön kanal) inom motsvarande cytoplasma.
4. I blocket Fluorescence Analysis D: Global Translocationberäknar du signalprocenten från en kanal i två cellfack (a och b). Till exempel, i en cytoplasma/kärna translokation analys, exportera beräknade procentsatser av nukleära och cytoplasmatiska signaler för varje bild i den slutliga "Resultat" kalkylblad. Formeln som används för att beräkna kärnsignalprocenten visas nedan. Detta block kan användas för alla subcellulära fack:
5. I blocket Fluorescensanalys E: Individuell celltranslocationberäknar du signalprocenten från en kanal i två cellfack för varje cell. Detta block är speciellt optimerat för nucleus/cytoplasmatransloteringsanalys på encellig nivå.
  OBS: Eftersom block fluorescensanalys E: Individuell celltranslocation utför analys på encellig nivå behövs effektiv segmentering av kärnan och cytoplasman.
Länka utdata0 (Arkiv) för blocket Välj mapp (block 1) till mappinmatningen (vita pilar i svarta cirklar) för det valda blocket.
Ange parametrarna för det valda blocket.
1. Fluorescensanalys A: 1 kanal, fluorescensanalys B: 2 Kanaler i samma fack och fluorescensanalys C: 2 Kanaler i två fack
  1. Skriv namnet på mappen som innehåller bilder av segmenterade objekt som föregås av ett omvänt snedstreck i rutan Mappbilder. (Till exempel: \Segmenterad kärnor).
  2. I rutan Format av bilder av segmenterade objekt (ruta 2) skriver du det format som används för att spara bilder av segmenterade objekt (tif, jpeg, bmp, png). Standardformatet är tif.
  3. I rutan Kill Borders?skriver du Ja för att ta bort kantlinjeobjekt. Annars skriver du nej. Installationen av MorphoLibJ-samlingen av ImageJ krävs för att använda denna funktion (se steg 5.3.3).
  4. I rutan (er) Kanal fläckar signal, ställa in den kanal där fläckar måste upptäckas. I klassiska RGB-bilder, 0=Röd, 1=Grön och 2=Blå.
  5. Skriv namnet på molekylen som lokaliseras till fläckarna i rutorna Namn på lokaliserad molekyl. Antalet fält som ska anges beror på antalet molekyler.
  6. I rutan (er) Wavelet Spot Detector Block, ange avfläckningsparametrar för varje kanal. Ange skalan (som avses dekorstorlek) och identifieringens känslighet (en mindre känslighet minskar antalet upptäckta fläckar, standardvärdet är 100 och det lägsta värdet är 0). Uttömmande dokumentation av denna plugin finns tillgänglig online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Parametrar kan också definieras manuellt i Icy (Detection and Tracking | Spotdetektor).
  7. Som ett alternativ, i rutan Filter ROI efter storlek, filtrera segmenterade objekt där fläckar identifieras genom att ställa in ett intervall av storlek (i pixlar). Det här steget är särskilt användbart för att ta bort objekt under eller över segmenterade objekt. Om du vill uppskatta objektens storlek manuellt finns i steg 5.3.1. Standardparametrar omfattar inte filtrering av ROIs efter storlek. Blocket 2 Kanaler i två fack innehåller två lådor: Filterkärnor efter storlek (ruta 19) och Filter cytoplasma efter storlek (ruta 46).
  8. Alternativt, i rutan Filter fläckar efter storlek, filtrera de upptäckta fläckarna efter deras storlek (i pixlar) för att ta bort oönskade artefakter. För att manuellt uppskatta spotstorlek, klicka på Upptäckt och spårning och öppna Spot detector plugin. I Utdataalternativ väljer du Exportera till ROI. Var försiktig så att standardparametrar inte inkluderar filtrering av fläckar efter storlek och att filtrerade fläckar inte beaktas för analysen. Antalet fält som ska anges beror på antalet kanaler.
  9. Alternativt, i rutan Filter fläckar, tillämpa ett extra filter (kontrast, homogenitet, omkrets, rundhet) på de upptäckta fläckarna. Var försiktig så att standardparametrar inte innehåller punktfiltrering och att filtrerade fläckar inte beaktas för analysen. Antalet fält som ska anges beror på antalet kanaler.
  10. Alternativt, i rutorna Tröskelvärde för punktstorlekanger du ett tröskelvärde för området (i pixlar) för analyserade fläckar. Antalet räknade platser under och över detta tröskelvärde exporteras i det slutliga resultatkalkylbladet. Hur många rutor som ska informeras beror på antalet kanaler.
  11. Kör arbetsflödet (för mer information, se del 7). Data exporteras i ett resultatkalkylblad som sparats i mappen som innehåller kopplade bilder.
2. Fluorescensanalys D: Global transloterings- och fluorescensanalys E: Individuell celltranslotering:
  1. Skriv \Namnet på mappen som innehåller bilder av segmenterade objekt i rutorna Mappbilder (rutorna 1 och 2). I blocket Fluorescensanalys D: Global Flyttningidentifieras de två typerna av avkastning på sysselsatt kapital som ROI a och ROI b. För blocket Fluorescence Analysis E: Individuell celltranslocation, i Mappbilder segmenterade kärnor och mappbilder segmenterade cytoplasmor lådor, skriva namnet på mappen som innehåller segmenterade kärnor och cytoplasmter, respektive.
  2. I rutan Kanalsignal (ruta 3), ange kanalen på signalen.
  3. I rutan Format av bilder av segmenterade objekt (ruta 4), skriv det format som används för att spara bilder av segmenterade objekt (tif, jpeg, bmp, png). Standardformatet är tif. Alternativet Döda kantlinjer är också tillgängligt för att ta bort kantlinjeobjekt (se steg 6.3.1).
  4. I rutor Filtrera ROI efter storlekkan du filtrera segmenterade objekt genom att ange ett storleksintervall (i pixlar). Det här steget kan vara användbart för att ta bort objekt under- eller översegmenterade objekt. Om du vill uppskatta objektstorlek manuellt finns i steg 5.3.1. Det finns två fält att ange, ett per kanal. Standardparametrar inkluderar inte ROI-filtrering efter storlek.
  5. Kör arbetsflödet (för mer information, se del 7). Exportera data i ett kalkylblad Resultat som sparats i mappen som innehåller kopplade bilder.

7. Kör protokollet

Om du vill bearbeta ett block i en körning tar du bort anslutningen mellan det markerade blocket och blocket Välj mapp. Placera det önskade blocket vid^1:e rangen. Klicka på länken direkt till höger om mappeni det övre vänstra hörnet av det önskade blocket. Dubbelklicka på mappen som innehåller de kopplade bilderna i dialogrutan Öppna som visas. Klicka sedan på Öppna. Klicka på Kör för att starta arbetsflödet. Bearbetningen kan stoppas genom att klicka på stoppknappen.
Om du vill bearbeta olika block i en körning behåller du anslutningar av valda block med blocket Välj mapp (block 1). Se till att deras rang tillåter en bra bearbetning av arbetsflödet. Om ett visst block till exempel behöver segmenterade objekt för att bearbeta, se till att segmenteringsblocket bearbetas tidigare. Innan du kör arbetsflödet tar du bort oanvända block och sparar det nya protokollet med ett annat namn.
Klicka på Kör för att starta arbetsflödet. När den öppna dialogrutan visas dubbelklickar du på mappen som innehåller de kopplade bilderna. Klicka sedan på Öppna. Arbetsflödet körs automatiskt. Om det behövs, stoppa behandlingen genom att klicka på stoppknappen.
I slutet av bearbetningen kontrollerar du att meddelandet Arbetsflödet som utfördes har visats i det nedre högra hörnet och att alla block flaggas med ett grönt tecken (bild 2b). Om så inte är fallet anger blocket och den invändningsruta som visar feltecknet att elementet är korrekt (bild 2b).
Obs! Om du vill ändra tillståndet för ett block tar du antingen bort och återskapar en länk mellan två rutor i det här blocket eller stänger och öppnar protokollet igen. Om ett fel uppstår under bearbetningen kan en ny körning startas direkt. Under en ny körning bearbetas alla block av pipelinen, även om vissa av dem flaggas med det gröna tecknet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alla beskrivna analyser har utförts på en vanlig bärbar dator (64-bitars processor med fyra kärnor på 2,80 GHz med 16 GB RAM-minne (Random-Access Memory)) som arbetar med 64-bitarsversionen av Java. Random-access minne är en viktig parameter att tänka på, beroende på mängden och upplösningen av bilder att analysera. Med hjälp av 32-bitarsversionen av Java begränsar minnet till ca 1300 MB, vilket kan vara olämpligt för stordataanalys, medan 64-bitarsversionen gör det möjligt att öka minnet som allokerats till Isig. Figur 3 visar den tid som behövs för segmentering för olika typer av bilder och olika upplösningar. Det bekräftar att hög upplösning avsevärt ökar tiden för primära objekt segmentering.

De data som presenteras i nästa stycken visar att substrukturanalyserarbetsflödet kan användas för att lösa de flesta vanliga problem som påträffas inom cell- och molekylärbiologi (cellräkning, foci-räkning och analys, flyttningsanalys).

Mätning i många celler av den exakta andelen molekyler koncentrerade inom ett visst fack eller byte av lokalisering över subcellulära domäner kan vara en mycket besvärlig och felbenägen uppgift, särskilt när den utförs manuellt. Figur 4 illustrerar arbetsflödets förmåga att snabbt och exakt kvantifiera den välbeskrivna kärnomlokalisering av transkriptionsfaktorn NFκB som svar på TNFα-stimulering. Bilder som används för analysen har nådigt sammanställts av Ilya Ravkin(http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm)och är allmänt tillgängliga på Broad Bioimage Benchmark Collection¹⁶. Denna uppsättning innehåller bilder av MCF7 och A549 cellinjer behandlas med ökande koncentrationer av TNFα. Analysen har utförts på mer än 40 000 celler och 96 bilder (48 bilder för varje kanal) från MCF7-cellinjen (figur 4a). Hela analysen (från import av bilder till databesparing) tog 26 minuter. Varje bild motsvarar en specifik TNFα-koncentration. De nukleära/cytoplasmatiska proportionerna av NFκB var homogena i alla celler för en viss bild. Av denna anledning, för varje bild, var värdena för alla nukleära eller cytoplasmatiska pixlar summeras för att beräkna de nukleära och cytoplasmatiska proportionerna av NFκB, och individualisering av beröring kärnor /cytoplasmor under deras segmentering var inte nödvändigt. DAPI-bilder bearbetades i segmentering C: Klustrade objekt med konvexa former block för att segmentera kärnor och den gröna kanalen användes för att avgränsa cytoplasmorna med segmentering E: Klustrade cytoplasmablock (Figur 4b). Fluorescensanalys D: Globalt flyttningsblock användes för att exportera summan av nukleära och cytoplasmatiska pixelvärden. De erhållna uppgifterna är representerade i en dos-responskurva (figur 4c) och illustrerar ökningen av NFκB-andelen av kärnkraft efter stimulering med ökande koncentrationer av TNFα.

Arbetsflödet analyserar inte bara den globala intensitetssignalen i olika undercellulära fack utan kan också användas för att upptäcka högborgar och extrahera specifik information om deras funktioner. Figur 5a illustrerar detektionen av P-organ i enskilda celler genom att lokalisera förstärkaren av mRNA decapping 4 (EDC4) protein. Segmentering A: Icke klustrade objekt block användes för att segmentera kärnor som presenterar en låg nivå av klustring, segmentering E: Klustrade cytoplasma block för att avgränsa cytoplasmor och fluorescens analys C: 2 kanaler i två fack för att upptäcka EDC4 högborgar. Segmenterade objekt identifieras (segmenterade nuclei_0, segmenterade cytoplasms_0) och flera uppgifter samlas in i motsvarande kalkylblad (Segmenterad kärnor Information och segmenterade cytoplasmter Information) som EDC4 medelmåttig intensitet eller antalet / storleken på upptäckta organ i varje ROI (figur 5b). Innan de analyseras kan detekterade kroppar filtreras preliminärt efter sitt område, vilket kan vara användbart för att utesluta objekt under mikroskopets upplösningseffekt. Om du vill uppskatta storleken på bevarade objekt kan ytterligare ett områdeströskel införas. Områden av alla identifierade kroppar rapporteras i dedikerade kalkylblad (Segmenterad nuclei_Distribution högcistorlek, Segmenterad cytoplasms_Distribution högcistorlek). I det här exemplet lyfter vi fram analysen av två celler (segmenterad nuclei_0 and_1 och segmenterad cytoplasm_0 and_1), där cytoplasmatiska EDC4-högborgar detekteras. Observera att även om signalen från EDC4-proteinet detekteras i både de nukleära och cytoplasmatiska facken, motsvarar endast de cytoplasmatiska focina P-kroppar. Kärnsignalen är troligen ett resultat av den korsreaktivitet av den antikropp som används för att utföra immunofluorescensexperiment. Storleken i pixlarna i var och en av foci ges.

Sedan, eftersom effekten av oxidativ stress (OS) på Cajal Bodies fortfarande var okänd, drog vi nytta av mångsidigheten i arbetsflödet för att studera det under tiden kinetik (2 till 20 timmar efter OS induktion med 500 μM H₂O₂) (Figur 6). Cajal Bodies är dynamiska strukturer som kärnar ur och upplöser inom nukleoplasman under kontroll av specifika parametrar som transkriptionshastigheten eller cellcykelns progression. Cajal Organ visualiserades genom att lokalisera deras huvudsakliga strukturella och funktionella komponent, coilin protein. Information om antalet och storleken på Cajal organ samlades in genom att studera 2300 enskilda celler från högupplösta bilder (3840X3072) som innehåller 3 kanaler: DAPI (blå), 53BP1 (grön) och coilin (röd) (figur 6a). Fullständig bearbetning tog mindre än 1 h. Eftersom kärnor presenterade konvex form och några av dem var grupperade, valdes blocksegmentering C: Grupperade objekt med konvexa former för att utföra segmenteringen. Eftersom OS är känt för att inducera DNA dubbelsträngsbrott (DDSBs), användes det p53-bindande proteinet 1 (53BP1), som är känt för att vara en väsentlig effekt av DNA-skadorssignaleringsvägar, som en markör för att diskriminera mellan stressade och icke-stressade celler. I avsaknad av DNA-skador fördelas 53BP1 homogent inom nukleoplasman, medan den efter DNA-skador koncentrerar sig på DDSB, som lätt kan särskiljas i mikroskopi. Antalet och storleken på både 53BP1 och coilin nukleära högborgar i varje cell analyserades med hjälp av blocket Fluorescens Analys B: 2 Kanaler i samma fack. För det första bidrog analysen av 53BP1-data till att för varje tidpunkt av kinetiken fastställa den bästa tröskeln för att klassificera celler efter deras stressstatus. Bland hela kinetiken inducerar OS en betydande ökning av foci-numret på 53BP1 med en 11-faldig ökning vid 2, 4 och 8 timmar efter induktionen av OS (figur S1). Denna effekt är mindre uttalad vid 6 h (6,5 gånger) på grund av en högre initial nivå av DSB i icke-stressade celler. Även efter 20 h, en ihållande ökning kvarstår (nästan 6-faldig). Dessa data återspeglar effektiviteten av behandlingen för att inducera OS och etablera 53BP1 som en effektiv stress-markör för både tidiga och sena observationer i mikroskopi. Å andra sidan observerades en liten andel stressade celler med en låg nivå av DDSBs vid varje tidpunkt av kinetiken, vilket tyder på att cellerna inte är homogent stressade, vilket upprätthåller vikten av att använda en stressmarkör i stressexperiment. På grundval av ROC-analysen valdes en total tröskel på 17 53BP1 högborgar för att skilja mellan stressade och oskickade celler i hela kinetiken (figur S1).

Då antalet och storleken på nukleära högborgar av coilin analyserades enligt cellens stressstatus. En signifikant ökning av antalet högborgar observerades 2, 4 och 6 timmar efter stressinduktion (figur 6b). Den mest ihållande effekten observeras vid 2 h, antalet celler som har mer än 10 foci ökar från 0% i de oskickade cellerna till 75% i de stressade cellerna. Dessutom hade mer än 25% av stressade celler av den tiden punkt mer än 20 coilin foci. Denna effekt minskar gradvis fram till 8 h. Vid 20 h observeras en liten ökning av den första och den tredje kvartilen, men data visar också att 84% och 80% av cellerna presenterar mindre än 8 högborgar i icke-stressade och stressade celler, respektive. Dessa data visar att OS också har sena effekter på parametrar som styr kärnbildning av Cajal Organ, som kan skilja sig från tidiga effekter. Intressant nog visade noggrann analys av funktionerna i coilin nukleära högborgar att den observerade ökningen av antalet coilin foci associerar med en minskning av deras storlek (figur 6c). Till exempel, 2 h efter OS induktion, andelen coilin foci med ett område under 0,2 μm² ökar från 26% till 64%. Denna effekt minskar till 8 h, men till skillnad från Cajal Bodies antal observeras ingen signifikant förändring vid 20 h. Detta kan återspegla att tidig och sen nukleoplasmic omfördelning av Cajal Organ är olika händelser.

Sammantaget tyder dessa data starkt på att OS ändrar kärnbildningskraften hos Cajal Bodies, vilket leder till en nukleoplasmisk omfördelning till många mindre kärnfoci. Eftersom kärnbildning av Cajal Organ drivs av deras protein och RNA komponenter, detta tyder på att OS effekten kan ändra sammansättningen av Cajal Organ. Inom Cajal Bodies interagerar coilinproteinet med flera olika proteinpartners såsom komponenter i SMN-komplexet och Sm-proteiner. Dessa interaktioner involverade ofta fosfodomäner av coilin, och man kan föreställa sig att en ändring av strukturen hos Cajal Organ kan kopplas till förändringar i fosforylering status av coilin. Dessutom visade nya verk att Cajal Bodies inte är slumpmässigt lokaliserade i kärnan, och kan påverka genuttryck genom proximala samband med specifika gen loci¹⁷. Med tanke på alla dessa fakta skulle det inte vara förvånande om en effekt på Cajal organ funktionalitet skulle åtfölja förändringar i deras struktur. Av dessa resultat kan vi också fråga om sådana Cajal Bodies ombyggnad är en passiv följd av OS eller deltar i svaret genom att interagera med specifika gen lokus, till exempel.

För att testa om en förändring i coilin uttryck kunde ändra sin lokalisering och ändra kärnbildning av Cajal Organ, överuttryckt vi en exogen GFP-coilin fusion protein. Kärnor var inte klustrade, så segmentering utfördes med blocket Segmentering A: Icke klustrade objekt. Sedan, för att exakt kvantifiera antalet och storleken på coilin foci (röd signal, kanal 1) enligt nivån av GFP-coilin (grön signal, kanal 2) överuttryck, blocket Fluorescens Analys B: 2 Kanaler i samma fack användes. Nivån på GFP-coilin avspeglades av medelintensiteten hos GFP-signalen i individuell kärna (figur 7a). I celler med medelhög eller hög nivå av GFP-coilin-överuttryck (GFP-intensitet högre än 10) ökar antalet Cajal-kroppar per kärna signifikant med vissa kärnor som visar upp till 21 högar (figur 7b). Vi märkte också att ljusstyrkan (medelintensiteten) av Cajal Bodies avsevärt ökar parallellt med överuttryck nivå som leder till intensitet mättnad. Sådana mättade regioner kan således dölja förekomsten av mindre och svagare foci. I celler som överuttrycker en medelhög eller hög nivå av GFP-coilin ökar också Cajal Bodies storlek avsevärt, medianvärdena stiger från 1 till 2 μm² (figur 7c). Dessutom finns mer än 25 % av cellerna med hög GFP-coilin-uttrycksnivå foci med ett område som är större än 2,5 μm^2,medan det aldrig överstiger 0,8 μm² i icke-transfected celler. Sammanfattningsvis leder GFP-Coilin överuttryck till en betydande ökning av både antalet och storleken på Cajal organ. Eftersom OS ökar antalet Cajal organ men minskar deras storlek, dessa uppgifter kan återspegla att OS effekt på strukturen av Cajal Organ är troligen framkallas av en förändring av deras sammansättning snarare än av en effekt på den cellulära mängden coilin.

Figur 1: Pipelinen för Substructure Analyzer
Arbetsflödet är utvecklat i Icy, en öppen community-plattform för bioimageinformatik, och utför automatisk analys av flera fluorescensmikroskopibilder. För det första läses flerkanalsbilder automatiskt in i protokollet och bearbetas för att vid behov förbättra förhållandet mellan signal och brus och för att ta bort avbildningsartefakter. Sedan isolerar bildsegmentering områden av intresse (ROIs) från bakgrunden. Flera metoder för segmentering är tillgängliga beroende på klusternivån och arten av de objekt av intresse. Segmenterade objekt sparas med en specifik deskriptor (till exempel Bild name_Nucleus_1) i en viss mapp och kan användas/återanvändas för efterföljande analys. Fluorescerande signaler som fläckar analyseras sedan inom ROIs och flera funktioner (plats, storlek, form, intensitet, textur, dekornummer och storlek) exporteras till ett automatiskt skapat kalkylblad. Alla uppmätta funktioner, som antalet upptäckta fläckar, rapporteras till deskriptorn för motsvarande avkastning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 2: Grafiskt gränssnitt för det isiga arbetsflödet
(a)Arbetsflödet består av 13 allmänna block, som kan grupperas enligt deras allmänna funktion: Välj mapp (block 1) ger tillgång till bilder; Sammanfoga kanaler (block 2) används för att sammanfoga olika bildkanaler. Block 3 till 8 är dedikerade till objektsegmentering, var och en anpassas för en viss kontext: Segmentering A: Icke klustrade objekt, Segmentering B: Dåligt grupperade objekt, Segmentering C: Klustrade objekt med konvexa former, Segmentering D: Grupperade objekt med oregelbundna former (block 7, fungerar i samband med block 6), Segmentering E: Klustrade cytoplasmor. Block 9 till 11 används för att räkna/analysera högborgar inom subcellulära fack: Fluorescensanalys A: 1 Kanal, Fluorescensanalys B: 2 Kanaler i samma fack och Fluorescensanalys C: 2 Kanaler i två fack. Blocken 12 och 13 är anpassade för analys av flyttningshändelser: Fluorescensanalys D: Global translotering och fluorescensanalys E: Individuell celltranslotering. b)Global presentation av en blockarkitektur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 3: Tid som behövs för segmentering som en funktion av bildupplösning och objektklusternivå
(a)Grafisk illustration av den tid som krävs för att utföra segmentering beroende på bildupplösning och klusternivå. Två olika segmenteringsblock har testats: Segmentering A (för icke-grupperade objekt) och segmentering D (för grupperade objekt med oregelbundna former). Tidpunkten för bearbetning (i sekunder per bild) ritas som en funktion av bildupplösning (antal pixlar). (b)Exempel på bilder som analyserats med antingen segmentering A eller Segmentering D-block. DAPI-färgning och segmenterade kärnor anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Arbetsflödesanalys av en NFκB-analys av kärntranslotering av kärnladdning som svar på TNFα-stimulering
(a)Exempel på bilder av mänskliga MCF7-celler (humant bröst adenokarcinom cellinje) behandlas med TNFα från BBBC014 bilduppsättning (Broad Bioimage Benchmark Collection)¹². Lokalisering av transkriptionsfaktorn NFκB har undersökts i celler som behandlats med 12 ökande koncentrationer av TNFα (från 0 till 10^-7g/ml). För varje koncentration gjordes 4 replikat. DAPI-bilder (blå kanal) bearbetades i segmenteringen C: Grupperade objekt med konvexa former block till segment kärnor, och sedan NFκB färgning med FITC (grön kanal) användes för att avgränsa cytoplasmor med segmentering E: Klustrade cytoplasma block. Fluorescensanalys D: Globalt flyttningsblock användes för att exportera summan av nukleära och cytoplasmatiska pixelvärden. b)Segmenterade kärnor (grå) och cytoplasmter (vita) används för att bestämma den totala intensiteten hos NFκB-lysrörssignalen i varje fack. c)Den dos-responskurva som erhålls från dataanalys illustrerar ökningen av NFκB-kärnkraftsandelen i takt med att koncentrationen TNFα ökar. Bilderna är i ett 8-bitars BMP-format och bildstorleken är 1360 x 1024 pixlar. För varje koncentration beräknas standardavvikelsen mellan de 4 replikaten och illustreras som felstaplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Kvantifiering av EDC4-högborgar (P-organ) i cytoplasma i enskilda celler
a)Medfärgning med DAPI (blå kanal) och Phalloidin (röd kanal) gör det möjligt att segmentera och identifiera cellkärnor respektive F-aktin. EDC4-proteinet (grön kanal) används som en markör för detektion av P-organ som är kända för att vara uteslutande cytoplasmatiska. Skala bar, 10 μm. (b) Foci räknas, och flera funktioner (här deras område i pixlar) exporteras till resultatkalkyl kalkylbladet struktureras i flera ark. Två ark är dedikerade till analys av kärnor och två till analys av cytoplasmor. Varje rått bäddar in informationen om en specifik avkastning. I Nucleus/Cytoplasm Information sheets exporteras egenskaperna hos segmenterade objekt (ROI ID, storlek och medelintensitet), följt av antalet upptäckta högborgar inom varje avkastning på sysselsatt kapital. Om det behövs kan ett storlekströskel (100 pixlar i det här exemplet) läggas till och antalet högborgar under och över det här tröskelvärdet rapporteras i de två sista kolumnerna. I Nucleus/Cytoplasm_Distribution av högcistorleksark rapporteras området (i pixlar) för alla upptäckta högborgar i råheten i motsvarande avkastning på avkastningen. I det här exemplet lyfter vi fram analysen av två celler (segmenterad cytoplasm_0 and_1), där cytoplasmatiska EDC4-högborgar har upptäckts. Storleken i pixlarna i var och en av foci ges också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Kinetik av coilin och 53BP1 nukleoplasmic fördelning efter oxidativ stress
Analysen av antalet och storleken på foci baserades på mer än 110 enskilda celler för varje tidpunkt från 3 oberoende kinetik. a) Immunofluorescensdetektion av coilin och 53BP1 foci i HeLa S3-celler under hela behandlingskinetik med 500 μM H₂O₂. 53BP1 koncentrerar sig på DNA Double-Strand Break-platser och används för att bedöma effektiviteten av behandlingen på varje cell. Coilin är berikad i Cajal Bodies. Cellerna var fast 2, 4, 6, 8 och 20 h efter oxidativ stress induktion och co-färgade med anti-coilin (röd kanal) och anti-53BP1 (grön kanal) antikroppar. Skala bar, 10 μm. (b) Antalet coilin nukleära högborgar efter oxidativ stress. Resultaten visas som låddiagram, där mittmärket är medianen, lådans nedre och övre kanter är 25:^e och 75:^e percentilerna. I celler som behandlats med H₂O₂detekteras en signifikant ökning av antalet spoleinfoci och är maximal efter 2 och 4 h behandling. Wilcoxon - Mann Whitney testanalys visar en betydande skillnad mellan obehandlade och H₂O₂ behandlade celler (*, p<0,05; **, p<0.01; ***, p<0.001). c)Andelen celler som fungerar i spolfociområdet (μm²). De flesta högborgar har ett mindre område på 2 h och 4 h tidpunkter jämfört med kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: Studie av Cajal Bodies kärnbildning i celler som överuttrycker ett GFP-coilinfusionsprotein
(a)HeLa S3-celler transiently transfekterades i biologiska triplicates med 500 ng av en plasmid som uttrycker ett GFP-Coilin fusionsprotein med hjälp av ett standardförfarande enligt tillverkarens rekommendationer. Efter 48 h, var celler fast och färgas med en antikropp mot coilin. DAPI (blå kanal) tillåter att segmentera kärnor. För dessa analyser analyserades mer än 100 celler. GFP-signalen återspeglar ectopic coilin-GFP protein (grön kanal) lokalisering, medan coilin signal (röd kanal) motsvarar både endogena och exogena protein lokalisering. För varje kärna återspeglar den genomsnittliga intensiteten i GFP-signalen nivån på coilin-uttrycket. Enligt denna parameter har funktionerna i Coilin foci analyserats med hjälp av blocket Fluorescens Analys B: 2 Kanaler i samma fack. Skala bar, 10 μm. (b) Förhållandet mellan antalet coilin foci och medelvärdet GFP intensitet per kärna. Resultaten visas som låddiagram, där mittmärket är medianen, lådans nedre och övre kant är 25:^e och 75:e percentilerna.^th Wilcoxon - Mann Whitney testanalys visar en betydande ökning av antalet högborgar för en GFP intensitet >10 (*, p<0,05; **, p<0.01; ***, p<0.001). c) Förhållandet mellan området med spoleinfoci och genomsnittlig GFP-intensitet per kärna. Resultaten visas som låddiagram, där mittmärket är medianen, lådans nedre och övre kant är 25:^e och 75:e percentilerna.^th Wilcoxon - Mann Whitney testanalys visar en betydande ökning av området av coilin foci för en GFP intensitet >10 (*, p<0,05; **, p<0.01; ***, p<0.001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur S1: Kinetik av 53BP1 nukleoplasmic fördelning efter oxidativ stress
a)Kvantifiering av 53BP1 kärnfoci i obehandlade eller H₂O₂ behandlade celler efter olika inkubationstider. Resultaten visas som låddiagram, där mittmärket är medianen, lådans nedre och övre kant är 25:^e och 75:e percentilerna.^th Wilcoxon - Mann Whitney testanalys visar en betydande skillnad mellan obehandlade och H₂O₂ behandlade celler (*, p<0,05; **, p<0.01; ***, p<0.001). b) För varje tidpunkt på kinetiken har en ROC-kurva (receiver Operating Characteristic) fastställts för att fastställa det bästa tröskelvärdet för att skilja mellan stressade och icke-ade celler. Parametrarna för varje test rapporteras i tabellen (Känslighet, specificitet, TP: sant positivt, TN: sant negativt, FP: falskt positivt, FN: falskt negativt). Från dessa data var en global tröskel på 17 53BP1 foci fast besluten att diskriminera stressade från icke-stressade celler genom kinetiken. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Allt fler verktyg för fri programvara finns tillgängliga för analys av fluorescenscellbilder. Användare måste korrekt välja lämplig programvara beroende på komplexiteten i deras problematiska, till sin kunskap i bildbehandling, och den tid de vill spendera i sin analys. Isig, CellProfiler eller ImageJ/Fiji är kraftfulla verktyg som kombinerar både användbarhet och funktionalitet³. Isig är ett fristående verktyg som presenterar ett tydligt grafiskt användargränssnitt (GUI), och särskilt dess "Protokoll" peka och klicka gränssnitt genom vilket arbetsflöden lätt kan utformas eller manipuleras⁴. Funktionaliteten i denna programvara förbättras genom att stödja och använda ImageJ plug-ins, och en hel del dokumentation är tillgänglig tack vare sin stora gemenskap av användare. Vi använde denna starka kombination av användbarhet och funktionalitet i den isiga programvaran för att utveckla substructure Analyzer arbetsflödet. Dess främsta mål är att föreslå en automatiserad lösning för att utföra en fullständig analys av celllysrör från flera bilder. Analysen omfattar bildförbehandling, objektsegmentering och fluorescerande signalanalys.

Flera protokoll delas tacksamt på den isiga webbplatsen och föreslår att använda isiga funktioner för att upptäcka och analysera fluorescerande signaler som cellulära foci. Vissa av dessa protokoll bearbetar dock bara en avbildning per körning, exporterar inte resultaten i en viss fil eller analyserar en enda kanal. Andra innehåller inte preliminär segmentering för att bestämma regioner av intresse (ROIs) eller föreslå enkla algoritmer som "HK-medel" som inte är lämpade för segmentering av mycket klustrade objekt. Substructure Analyzer automatiserar alla steg i bildanalysen från bildförbehandling till segmentering av objekt och detektion/analys av fluorescerande signaler. Protokollet föreslår också enkla eller mer komplexa metoder för objektsegmentering och export av data (namn på segmenterade objekt, foci analys) realiseras i optimerade utgångar anpassade till det problematiska. CellProfiler föreslår också kraftfulla rörledningar som består av moduler som kapslar in funktioner¹⁸^,¹⁹. De tillgängliga rörledningarna är väl anpassade till specifika problem. Isiga arbetsflöden är ett nätverk av olika rutor, var och en av dem utför en viss uppgift. Genom gränssnittet "Protokoll" är lådor som komponerar nätverket intuitiva och lätta att manipulera. Substructure Analyzer är anpassad till flera sammanhang som enkel sammanslagning av kanaler, kvantifiering av fluorescerande signaler fördelning mellan två subcellulära fack, analys av foci i en eller flera kanaler från en eller två cellulära fack i enskilda celler. Flera bildskärmar gör det möjligt att visualisera mellanliggande resultat under varje körning för att styra bearbetningen. Dessutom presenterar Icy ikonfält som grupperar metoderna efter ämne och från vilka funktioner som finns i arbetsflödet kan manipuleras separat för att manuellt testa specifika parametrar på vissa bilder innan du använder dem på en hel bilduppsättning.

Precis som i området för analys av bioimering är det mest kritiska steget i det här protokollet objektsegmenteringen. Protokollet föreslår segmentering av primära objekt, som är de flesta av tiden cellkärnor, och innehåller också ett annat block som uppgift är att segmentera en andra typ av objekt i cellen. Kärnsegmentering kan vara svårt när objekten är mycket klustrade så att de rör vid eller överlappar varandra. Olika alternativ för segmentering av primära objekt finns i protokollet, beroende på objektens form och klusternivån, även om ingen universell algoritm lyckas i den fullständiga segmenteringen av mycket klustrade objekt. Segmenteringsprocessen begränsas huvudsakligen av bestämningen av korrekta parametrar som framgångsrikt skulle kunna segmentera en del av objekten men leda till under- eller översegmentering av en annan del. Användaren skulle behöva utföra olika körningar med olika parametrar för att få en slutlig korrekt segmentering, särskilt för grupperade objekt som presenterar heterogena och icke-konvexa former.

Det här protokollet begränsas oftast av segmenteringssteget, vilket kan vara mycket tidskrävande och behöver kraftfull datorkonfiguration för de mest komplexa fallen. Mer specifikt, ju fler eller mer komplexa bilderna är (klustrade objekt till segment, ett stort antal pixlar i bilderna), desto mer random-access minne (RAM) användaren kommer att kräva. Globalt, för alla problematiska, kommer användaren att behöva köra protokollet på en 64 bitar Java Runtime Environment (fritt tillgänglig på Java webbplats) och för att använda en 64 bitar operativsystem (OS) för att öka det tillgängliga minnet som används av Isiga (minnet är begränsat till 1300 MB för 32 bitar JRE). På grund av skriptet fungerar protokollet inte korrekt på en Mac-dator. Dessutom ökar antalet parametrar med problemets komplexitet och kommer att kräva mer kunskap i bildanalys. När det gäller funktionskriterierna har detta protokoll ännu inte anpassats för analys av staplade bilder (tidstaplar, z-stackar) även om Icy effektivt utför analyser av denna typ av data.

Framtida uppdateringar kommer att realiseras särskilt för att förbättra segmenteringen av komplexa klustrade objekt. Ytterligare block kommer att utvecklas för att anpassa segmenteringen till klustrade cellstrukturer med oregelbundna icke-konvexa former. Vi kommer också att anpassa arbetsflödet för analys av tid och z-stackar (för live imaging och 3D-data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

G.H. stöddes av en examen stipendium från Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. stöddes av ett stipendium från Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), medan Q.T. stöddes av ett offentligt bidrag som övervakades av den franska nationella forskningsbyrån (ANR) som en del av det andra "Investissements d'Avenir"-programmet FIGHT-HF (referens: ANR-15-RHU4570004). Detta arbete finansierades av CNRS och Université de Lorraine (UMR 7365).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018).
Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014).
Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).

Bioengineering

Substructure Analyzer: Ett användarvänligt arbetsflöde för snabb utforskning och korrekt analys av cellulära organ i fluorescensmikroskopi bilder

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.