Valutazione istomormetrica standardizzata dell'osteoartrite in un modello di topo chirurgico
Summary
L’attuale protocollo stabilisce un metodo rigoroso e riproducibile per la quantificazione dei cambiamenti articolari morfologici che accompagnano l’osteoartrite. L’applicazione di questo protocollo può essere utile per monitorare la progressione della malattia e valutare gli interventi terapeutici nell’osteoartrite.
Abstract
Uno dei disturbi articolari più diffusi negli Stati Uniti, l’osteoartrite (OA) è caratterizzata da una progressiva degenerazione della cartilagine articolare, principalmente nelle articolazioni dell’anca e del ginocchio, che si traduce in impatti significativi sulla mobilità del paziente e sulla qualità della vita. Ad oggi, non esistono terapie curative esistenti per l’OA in grado di rallentare o inibire la degenerazione della cartilagine. Attualmente, c’è una vasta serie di ricerche in corso per comprendere la patologia OA e scoprire nuovi approcci terapeutici o agenti che possono rallentare in modo efficiente, fermare o addirittura invertire OA. Pertanto, è fondamentale avere un approccio quantitativo e riproducibile per valutare con precisione i cambiamenti patologici associati all’OA nella cartilagine articolare, nel sinovio e nell’osso subcondrale. Attualmente, la gravità e la progressione dell’OA sono valutate principalmente utilizzando l’Osteoarthritis Research Society International (OARSI) o i sistemi di punteggio Mankin. Nonostante l’importanza di questi sistemi di punteggio, sono semiquantitativi e possono essere influenzati dalla soggettività dell’utente. Ancora più importante, non riescono a valutare con precisione sottili, ma importanti, cambiamenti nella cartilagine durante gli stati della malattia precoce o le fasi di trattamento precoce. Il protocollo qui descritto utilizza un sistema software istomorfometrico computerizzato e semiautomatizzato per stabilire una metodologia quantitativa standardizzata, rigorosa e riproducibile per la valutazione dei cambiamenti congiunti nell’OA. Questo protocollo presenta una potente aggiunta ai sistemi esistenti e consente un rilevamento più efficiente dei cambiamenti patologici nel giunto.
Introduction
Uno dei disturbi articolari più diffusi negli Stati Uniti, OA è caratterizzato da una progressiva degenerazione della cartilagine articolare, principalmente nelle articolazioni dell’anca e del ginocchio, che si traduce in impatti significativi sulla mobilità del paziente e sulla qualità della vita1,2,3. La cartilagine articolare è il tessuto connettivo specializzato delle articolazioni diartrodiali progettato per ridurre al minimo l’attrito, facilitare il movimento e sopportare la compressione articolare4. La cartilagine articolare è composta da due componenti primari: condrociti e matrice extracellulare. I condrociti sono cellule specializzate, metabolicamente attive che svolgono un ruolo primario nello sviluppo, manutenzione, e riparazione della matrice extracellulare4. L’ipertrofia condromita (CH) è uno dei principali segni patologici dello sviluppo dell’OA. È caratterizzato da un aumento delle dimensioni del cellulare, diminuzione della produzione proteoglicana e aumento della produzione di enzimi che degradano la matrice della cartilagine che alla fine portano alla degenerazione della cartilagine5,6,7. Inoltre, i cambiamenti patologici nell’osso subcondrale e nel sinovio del giunto svolgono un ruolo importante nello sviluppo e nella progressionedell’OA 8,9,10,11,12. Ad oggi, non esistono terapie curative esistenti che inibiscono la degenerazione della cartilagine1,2,3,13,14. Così, c’è una vasta ricerca in corso che mira a capire la patologia OA e scoprire nuovi approcci terapeutici che sono in grado di rallentare o addirittura fermare OA. Di conseguenza, c’è una crescente necessità di un approccio quantitativo e riproducibile che consenta una valutazione accurata dei cambiamenti patologici associati all’OA nella cartilagine, nel sinovium e nell’osso subcondrale dell’articolazione.
Attualmente, la gravità e la progressione dell’OA vengono valutate principalmente utilizzando i sistemi di punteggio OARSI o Mankin15. Tuttavia, questi sistemi di punteggio sono solo semiquantitativi e possono essere influenzati dalla soggettività dell’utente. Ancora più importante, non riescono a valutare con precisione i cambiamenti sottili che si verificano nell’articolazione durante la malattia o in risposta alla manipolazione genetica o a un intervento terapeutico. Ci sono sporadiche relazioni nella letteratura che descrivono le analisi istomormetriche della cartilagine, del sinovio o dell’osso subcondrale16,17,18,19,2020,21. Tuttavia, manca ancora un protocollo dettagliato per l’analisi istomorfometrica rigorosa e riproducibile di tutti questi componenti articolari, creando un bisogno insoddisfatto nel campo.
Per studiare i cambiamenti patologici nell’OA utilizzando l’analisi istomorfometrica, abbiamo usato un modello di topo chirurgico OA per indurre l’OA attraverso la destabilizzazione del menisco mediale (DMM). Tra i modelli consolidati di murine OA, DMM è stato selezionato per il nostro studio perché coinvolge un meccanismo meno traumatico di lesione22,23,24,25,26. Rispetto agli interventi chirurgici a imumento meniscale-ligamentoso (MLI) o alle lesioni da legamento crociato anteriore (ACLI), DMM promuove una progressione più graduale dell’OA, simile allo sviluppo di OA negli esseri umani22,24,25,26. I topi sono stati eutanasia dodici settimane dopo l’intervento chirurgico DMM per valutare i cambiamenti nella cartilagine articolare, nell’osso subcondrale e nel sinovium.
L’obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un approccio standardizzato, rigoroso e quantitativo per valutare i cambiamenti congiunti che accompagnano l’OA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recenti ricerche sull’osteoartrite hanno migliorato la nostra comprensione del crosstalk tra i diversi tessuti all’interno dell’articolazione e il ruolo di ogni tessuto nell’inizio o nella progressione della malattia8,9,10,3535,36. Di conseguenza, è diventato evidente che la valutazione dell’OA non dovrebbe limitarsi all’analisi della cartilagine, ma dovrebbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere l’assistenza del personale del Dipartimento di Medicina Comparata e del nucleo molecolare e istopatologia del Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fonti di finanziamento: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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