Summary
斧头迁移是运动神经元健康的重要机制。在该协议中，我们提供了一种使用微流体室跟踪运动神经元斧头酸性隔间和线粒体的斧头传输的详细方法。
Abstract
运动神经元 （MNs） 是具有长斧子的高度偏振细胞。Axonal 传输是 MN 健康的关键机制，有助于神经元的生长、发育和生存。我们描述了一种使用微流体室 （MfCs） 来跟踪 MN 斧子中荧光标记的细胞器的六角传输的详细方法。该方法速度快，价格相对便宜，便于在空间和时间中监测细胞内线索。我们描述了一个分步协议：1） 制造聚二甲基硅氧烷（PDMS）MFCs;2） 在MFC中电内脊髓外泄和MN分离培养的电镀;3） 线粒体和酸性隔间的标签，然后进行实时共聚焦想象;4） 手动和半自动六角运输分析。最后，我们证明了HB9：：GFP腹腔脊髓外植性强子的线粒体和酸性隔间在运输上的差异，以证明系统的有效性。总之，该协议为研究各种六角组件的斧头传输提供了一个有效的工具，以及 MFC 使用的简化手册，以帮助发现空间实验的可能性。
Introduction
MN是具有长斧子的高度极化细胞，在成年人类中达到一米长。这种现象对维护 MN 连接和功能带来了严峻的挑战。因此，MN 依赖于信息、细胞器和材料的适当传输，沿着斧子从细胞体到突触和背部。各种细胞成分，如蛋白质、RNA和细胞器，通过斧子定期穿梭。线粒体是经常在MN中运输的重要细胞器。 线粒体对于MN的正常活动和功能至关重要，负责ATP的提供、钙缓冲和信号过程11、2。2线粒体的斧子运输是一个经过深入研究的过程33，4。4有趣的是，线粒体迁移的缺陷报告涉及几个神经退行性疾病，特别是MN疾病5。酸性隔间是沿着 MN 斧子移动的内在细胞器的另一个例子。酸性隔间包括分裂体、内体、跨Golgi仪器和某些分泌囊泡6。酸性隔间的斧头运输缺陷在一些神经退行性疾病中也被发现，最近的论文强调了它们在MN疾病中的重要性。
为了有效地研究六角运输，经常使用分离体形和体素室的微流体室9,9，10。微流体系统的两大优点，以及分块化和亚克斯的分离，使得它非常适合研究亚细胞过程11。神经元细胞体和斧子之间的空间分离可用于操纵不同神经元隔间（例如，斧子与躯体）的细胞外环境。生物化学、神经元生长/退化和免疫荧光检测都受益于这个平台。MfCs还可以通过与其他细胞类型（如骨骼肌12、13、14）,13,14等神经元进行协管，帮助研究细胞与细胞之间的交流。
在这里，我们描述了一个简单而精确的协议，用于监测运动神经元中的线粒体和酸性隔间传输。通过比较逆行和逆行运动细胞器的相对百分比以及运输速度的分布，进一步展示了该方法的使用。
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Protocol
本议定书对动物的护理和治疗是在特拉维夫大学动物伦理委员会的监督和批准下进行的。
1. MFC 制备
- 初级模具中的 PDMS 铸件 （图 1）
- 按照详细的协议9购买或创建原模（晶圆）。
- 在继续涂层步骤之前，使用加压空气清除晶圆平台的任何类型的污垢。晶圆表面应看起来光滑清晰。
- 向容器中注入 50 mL 液氮。准备一个10mL注射器和23G针。
注：此步骤中的所有程序都必须在化学罩中执行。 - 在化学罩中，使用注射器和针头汇集2 mL液氮。虽然看起来空气被抽，注射器充满了氮气（图1A）。将含晶圆的板放入密封容器中。
- 拧开氯三甲基硅内瓶，使用含氮注射器刺穿橡胶盖，并将注射器的全部内容注入瓶中。不拔出针头，将瓶子倒置，并拉回2 mL氯三甲基硅烷。
注：由于注射器的压力，少量的氯三甲基硅烷被喷出针头。为避免危险，将针头指向发动机罩的内壁（图 1B）。 - 将氯三甲基硅烷均匀地扩散到容器中（从步骤1.1.4起），但不直接在晶圆或含晶圆板上。关闭容器，每片孵育5分钟。
注：如果这是晶圆首次涂有氯三甲基硅烷，则每个晶圆应允许1小时孵育。 - 请勿将晶圆和容器从化学罩中取下 30 分钟。
注意：氯三甲基硅烷是高度挥发性。 - 在 50 mL 管中称重 PDMS 底座（参见材料表），并分别以 16：1 的比例添加 PDMS 固化剂（例如，47.05 克碱基和 2.95 克固化剂）。使用低速旋转器混合 10 分钟。
- 将 PDMS 倒入每个含晶圆的板到所需的高度（图 1C）。
注：使用薄微流体室（高达 3-4 mm）可改善对培养皿的粘附性，并防止泄漏。 - 将所有板放在真空干燥器内 2 小时（图 1E）。此过程可消除 PDMS 中滞留的空气，从而消除气泡并形成清晰、均匀的模具。
- 将板放在烤箱内 3 小时（或过夜），温度为 70°C（图 1E）。
注：当放在烤箱中时，板应水平。
- 环氧模具中的 PDMS 铸造
注：由于晶圆制备成本昂贵，需要特殊设备，并可能损坏易碎的晶圆，因此可以生成晶圆环氧复制品。复制品更便宜，更耐用，可用于大量生产微流体室。- 将 PDMS（如 1.1.8-1.1.11 中所述）铸造并固化到原始晶圆中。
- 清除和切断 PDMS 的多余部分，仅留下微流体元素和加工微流体室所需的功能区域。
- 立即用厚粘胶带包裹 PDMS，以防止其积聚灰尘。
- 选择适合整个PDMS内部的组织培养级塑料盘，并在周围留出环氧树脂空间。从 PDMS 到塑料盘的距离应小于 5 mm。
- 以 10：1（基本：固化剂）的比例混合少量 PDMS 准备少量 PDMS。新鲜液体PDMS将用于将固体PDMS粘附到塑料板的底部。
- 将少量液体 PDMS 涂抹到塑料板的中心底部，然后从 PDMS 上取下粘胶带，并将其粘附在塑料盘底部。确保微流体元件朝上。
- 让 PDMS 在 70°C 烤箱中固化 30 分钟。
- 通过在试管中分别将基体和固化剂混合在100：45的比例，制备环氧树脂。不同的环氧树脂可能具有不同的混合比。普通 100 mm 板所需的体积约为 40 mL。
- 让环氧树脂在旋转器中混合10分钟，直到混合物明显均匀（即液体中没有可见的纤维样伪影）。
- 将环氧混合物在 400 x g下离心 5 分钟，以去除内部捕获的气泡。
- 在离心期间，在墙壁和培养皿的所有其他暴露塑料部分周围铺上一层薄薄的硅胶油脂。这将防止环氧树脂与盘塑料聚合，并使固化环氧树脂在协议结束时轻松去除。
- 将环氧树脂缓慢倒入盘中，直到它完全覆盖PDMS，并超越PDMS至少5毫米。将板放在安全的地方，以便在接下来的 48 小时内不会移动。
- 48小时后，环氧树脂应完全固化。将板在 80°C 下插入预热的烤箱，进行 3 小时的最终固化。
- 轻轻将固化的环氧树脂从板和原 PDMS 模具上去除，直到其断裂。然后，它应该很容易从环氧树脂中分离出来并剥落。
- 提取后，将剩余的润滑脂从新的环氧树脂副本上擦去，并将其倒置（即，将复制的微流体元素朝上）放入新的培养皿中。环氧副本现已准备好用于 PDMS 强制转换。
- 使用加压空气或 N2吹出环氧模具上的任何 PDMS 或污垢，然后用异丙醇冲洗 2 倍。第三次填充，在轨道振动板上孵育10分钟。再次用异丙醇冲洗模具 3 倍，并丢弃剩余的液体。用空气或 N2吹干，或放在 70°C 烤箱中，直到干燥。
注：使用和丢弃异丙醇时，请遵循安全程序。 - 保持模具板关闭，直到铸造。按照步骤 1.1.8.-1.1.11。
- 打孔和雕刻PDMS成MFC （图 2）
- 使用手术刀按照晶圆上的 （+） 标记从板上切割和移除 PDMS 模具。不要用力，因为模具很脆弱（图2A）。
- 按照草图上绘制的说明进行冲孔和切割腔室，具体取决于实验设置（图 2B-F）。
- 对于脊髓外植培养（图2C，E），在大MFC的远端打两口7毫米的井。找到井的位置，以便它们与通道边缘重叠。在近端，在通道中间打孔一个 7 mm，重叠最小，以便为外植留出足够的空间。在近端通道的两个边缘上打两个额外的 1 mm 孔。将 MFC 与朝上微流体元素一起转动，并使用 20 G 针在打孔 7 mm 的孔上雕刻三个小的外植洞穴。
- 对于分离的 MN 培养（图 2D，F），在小型 MFC 的两个通道的边缘打四口 6 mm 的孔。
- 对MFC进行消毒，用于组织培养
- 在长凳上铺上50厘米长的胶带带。按下并拉回造型室，以面对粘胶带（上部和下部面），并清除粗污垢。将干净的腔室放入新的 15 厘米板中。
注：当微流体元件朝上时，不要直接按压。 - 在轨道振动器上孵育70%乙醇分析级的腔室10分钟。
- 在70°C下，将乙醇处理并干燥在组织培养罩或烤箱中。
- 在长凳上铺上50厘米长的胶带带。按下并拉回造型室，以面对粘胶带（上部和下部面），并清除粗污垢。将干净的腔室放入新的 15 厘米板中。
- 将 MFC 放在玻璃底盘上
- 将造型室放在组织培养等级 35 mm/50 mm 玻璃底盘的中心，并在边缘施加轻微力，使 PDMS 和盘底粘合。为避免玻璃底部断裂，请始终在实心表面顶部施加力。
- 在70°C下孵育10分钟。按下腔室以加强对板的粘附。
- 在紫外线下孵育10分钟。
- 涂层和栽培
- 将 1.5 纳克/mL 聚-L-球类 （PLO） 添加到两个隔间中。通过在通道入口直接移移涂层介质几次，确保 PLO 通过通道运行。
- 在光显微镜下检查微流体室，放大 10 倍，检查是否存在气泡。如果气泡阻塞微槽，将 MFC 置于真空干燥器中 2 分钟。稍后，通过移液涂层介质，去除通道中捕获的多余空气。孵化过夜。
- 以同样方式将拉普洛替换为拉米宁（DDW 中的 3 μg/mL），用于过夜孵育。
- 在电镀之前，用神经元培养基清洗层蛋白。
2. 神经培养电镀
- 分离运动神经元培养
- 使用直剪刀和细钳，从E12.5 ICR-HB9：：GFP小鼠胚胎中解剖脊髓。使用 1% 青霉素链霉素 （P/S） 的 1X HBSS 解决方案（图 3A-C）。
- 使用微解剖剪刀，去除门面和背角（图3D）。
- 收集脊髓片，并转移到管 （#1） 与 1 mL HBSS = 1% P/S.
- 用弯曲的剪刀将脊髓切成小块，等待这些碎片稳定下来。
- 加入10 μL的胰蛋白酶2.5%，放入37°C水浴10分钟。5分钟后，通过敲击管混合。这些碎片应该形成一个螺旋状的团块。
- 将团块转移到含有800μL预暖L-15、100 μLBSA4%和100 μL10mg/mL DNase的新管#2中。研磨2倍，然后等待2分钟，让未分离的碎片解决。将上清液转移到新管 （#3）。
- 加入100 μL BSA 4、20 μL的10mg/mL DNase和900 μL的完整神经基础介质（CNB，见材料表和表1）。研磨8x和等待2分钟。收集上清液管#3。
- 重复步骤 2.1.7 和磨 10 倍。收集上清液管#3。少量组织应留在管的底部。
注：如果一个大团块仍然留在管#2的底部，重复步骤2.1.8。 - 在管#3底部加入 1 mL BSA 4% 缓冲。
- 在 400 x g下离心 5 分钟。丢弃上清液。
- 轻轻敲击管，然后加入1 mL的CNB介质，重新悬浮细胞颗粒。移液器 6x，加入 20 μL 10 mg/mL DNase。
- 补充额外的5 mL的CNB介质和转移3 mL到一个新的管（#4）。
- 在每个管的底部（#3和#4）中加入1 mL的10.4%密度梯度介质（见表2）。两个接口之间应出现尖锐的相位分离。
- 在室温 （RT） 下，在 775 x g下离心 20 分钟。离心机减速应设置为低水平，以避免相分离破裂。
- 细胞应该是浮动的，在介质之间显示为多云的相间。将两个管中的细胞收集到一个新的管中（#5），已经含有预热的1 mL CNB介质。
- 添加额外的 4-6 mL CNB 介质。
- 在管的底部加入 1 mL BSA 4% 垫。
- 在 RT 时以 400 x g的离心机 5 分钟，丢弃上清液，用 1 mL CNB 介质轻轻重新悬浮颗粒。
- 对单元格进行计数。每根脊髓的屈服率预计为0.75-1 x 106 MN。
注：除运动神经元（例如，神经元间）外，心腹脊髓还包含其他神经元亚型。MN 纯度主要取决于解剖过程中去除背部区域和达到 MN 富集玫瑰区的能力。为了确保图像神经元为 MN，建议使用具有内源性 MN 标记的小鼠应变，如 HB9：：GFP 小鼠。为了实现纯MN培养（但细胞产量降低），可以使用FACS纯化15。 - 在 MFC 中电镀分离的 MN 区域性
- 每腔浓缩 150，000 MN，在 400 x g时离心 5 分钟。
- 以每MFC4μL的速度吸气上清液，并轻轻重新悬浮富含神经底基介质（RNB）的细胞。RNB 是 CNB 补充额外的 2% B27 和 25 ng/mL BDNF。
- 从两个隔间中取出介质，在远端舱的井中留下相当于 ±10 μL 的低容量。它看起来像井周周中的薄介质环。
- 缓慢地将 4 μL 的细胞加载到通道中。在通道另一侧挖出4μL的井，然后缓慢地将它们直接加载回通道，以反转电流并最大化通道中的细胞密度。
- 验证细胞是否使用10倍光学显微镜进入通道，并将腔室放入培养箱30分钟，而无需添加更多介质。
- 缓慢地将RNB的±10-15μL加入近端和远端井，并将腔室放入培养箱中15分钟。
- 在此孵育后，缓慢地将RNB的+75-80μL添加到每个井中。
- 分离的 MN 区域性维护
- 电镀后一天 （DIV1）， 用 RNB 替换介质，辅以 1μM 细胞氨酸阿拉伯苷 （Ara-C）， 以抑制胶质生长。
- 在 Ara-C 应用 （DIV3） 两天后，在近端隔间（不含 Ara-C）中用新鲜的 CNB 介质替换介质。
- 为了增强通过微槽的斧子交叉，将RNB与25纳克/mL的胶质细胞衍生神经营养因子（GDNF）和25纳克/mL的大脑衍生神经营养因子（BDNF）仅应用于远端隔间。在斧子远井（较大体积）和近端井之间，保持每口井至少10 μL的体积梯度。
- 每 2 天刷新一次介质。可能需要长达 4-6 天的斧子才能交叉。
- 脊髓外植培养
- 使用直剪刀和细钳，从E12.5 ICR-HB9：：GFP小鼠胚胎中解剖脊髓。使用 1% 青霉素链霉素 （P/S） 的 1X HBSS 解决方案（图 3A-C）。
- 使用微解剖剪刀，去除门面和背角（图3D）。
- 将脊髓切成1毫米厚的横向部分（图3E）。从 MFC 的近端腔中处理所有介质。
- 用移液器在总体积为 4 μL 时拾取单个脊髓外植，将外植器注射到洞穴附近，并通过侧口（1 mm 冲孔）从近端孔中抽出任何过多的液体。外植应吸入近端通道。
- 缓慢地将150μL的脊髓外植介质（SCEX，参见材料表和表3）添加到近端井。
- 脊髓外植培养维持
- 在近端隔间中添加 SCEX 介质，在远端隔间中加入丰富的 SCEX 介质（具有 50 纳克/mL 的 BDNF 和 GDNF 的 SCEX）。在远井（较高体积）和近井之间保持每口井至少 15 μL 的体积梯度。
- 每 2 天刷新一次介质。可能需要长达 3-5 天的斧子才能交叉。
3. 斧路运输 （图 4A）
- 线粒体和酸性隔间的标签
- 准备新鲜的 SCEX 介质（或 CNB 分离 MN），其中包含 100 nM Mitotracker 深红色 FM 和 100 nM LysoTracker Red。在37°C下孵育30-60分钟。其他颜色可以使用，只要其荧光波不重叠。
- 用温暖的 CNB/SCEX 介质清洗 3 倍。这些板已准备好进行成像。
- 实时成像
- 以3秒的间隔获得100个延时图像系列的斧子传输，每部电影总共5分钟。
注：本研究中使用的成像系统包括一个带旋转圆盘共聚焦的倒置显微镜，通过适当的细胞成像软件、60 倍油透镜、NA = 1.4 和 EMCCD 摄像机进行控制。电影是在37°C和5%CO2的受控环境中获得的。2
注：可以根据实验进行更长或更短的延时短片图像。如果需要，甚至可以录制夜间电影。然而，在拍摄过程中，尝试减少曝光时间和激光功率以及图像总数，以减少光毒性和漂白至关重要。
- 以3秒的间隔获得100个延时图像系列的斧子传输，每部电影总共5分钟。
4. 图像分析（图4-5）
- 利用气象分析分析粒子传输分布和密度分析
- 在 FIJI 中打开文件。单独的通道按图像 |堆栈 |工具 |去叶。
- 通过按图像设置图像属性|属性.
- 通过右键单击线图标来选择分段线工具。通过双击线图标将宽度设置为 8-10。在整个分析过程中与相同的线宽保持一致。
- 按照从远端到近端的斧子路径标记分段线。双击以停止行标记。
- 单击t向ROI 经理添加新感兴趣的行区域 （ROI）。将其添加到电子表格分析表中。
- 单击m以测量斧子的面积和长度。将其添加到分析表中。
- 单击插件生成地震仪|凯莫工具盒 |画基莫。或者，可以使用其他可用的基墨生成插件。
- 手动计算移动（逆行或前坡）和非移动粒子，并将它们添加到正确列中的表中。
注：如果粒子的位移在特定方向上高于10μm，则被归类为移动前行（即，在kymograph中向左移动）或逆行（即向右移动）。只需用线图标标记水平线并按m即可测量位移。不可移动粒子或不符合位移条件的粒子定义为非移动粒子（图 4Figure 4B）。
- 单粒子跟踪：手动跟踪
- 从http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html下载 FIJI 软件（由 Fabrice P. Cordelére 开发）的手动跟踪插件
- 在FIJI/ImageJ中打开文件。使用"旋转"选项水平对齐 MFC 凹槽。
- 要提高信噪比（如果需要），请单击"过程 |减去背景。
- 打开手动跟踪插件。根据用于成像的特定显微镜设置参数（例如像素大小、时间间隔等）。对于此处显示的结果，显微镜和透镜的比率为 0.239 μm/像素，帧间隔为 3 秒。
- 获取轨道 X 和 Y 坐标，并通过将文本复制到电子表格来保存结果。
- 通过单击"图像" 分析多通道电影|颜色 |合并通道以合并通道，然后仅跟踪共本地化的 puncta。
- 单粒子跟踪：半自动跟踪（图 5)
- 打开分析软件。本研究使用了比特平面Imaris软件版本8.4.1。
- 切换到顶部菜单中的"超越"。
- 单击图像处理 |交换时间和 Z |好的。
- 单击"编辑" |图像属性 （Ctrl_I） |几何 |沃克斯尔大小行。根据所使用的显微镜设置设置图像属性。
注：对于此处显示的数据，显微镜和镜头比为 0.239 μm/像素。 - 单击"所有等距"并更改时间间隔。例如，使用 3 秒作为间隔。单击右底的"重置"按钮或单击Ctrl_B。
- 通过单击小黄点的图标，在左上角添加一层斑点。左下角打开用于编辑斑点的新菜单。
- 按右蓝色箭头，直到点检测开始。
注： 使用窗口左下角的过滤器筛选出某些点非常重要。检查影片几次，查看是否选择了足够数量的点。 - 验证或配置参数以满足实验需求。例如，最大距离= 12 μm（两个不同点之间的最大允许距离仍将其包含在相同的单个轨道中）;最大间隙大小= 1（允许轨道错过但仍被视为一个轨道的帧数）。
- 单击"设置"，然后单击"样式 " 关闭、点 = 球体"。
- 使用"滤镜栏"，选择不同的滤波器进行调整。例如，在此处提供的数据中，轨道持续时间= 9 删除了少于 3 帧的所有轨道。设置所有参数后，单击右绿色箭头。此步骤后无法进一步编辑。
- 单击带有点的小铅笔可手动编辑所有曲目。
- 查看影片（图 5B）。如果发生错误，有几个可能的选项：
- 要断开轨道，请单击"对象"选项并选择需要断开的两个点按住Ctrl，然后选择"断开连接"。
- 要连接轨道，请单击"对象"选项，选择需要连接的两个点（按住Ctrl）并选择"连接"。
- 要删除轨道或地点，请使用正确的选项（轨道/对象），请使用常规铅笔图标切换到屏幕，然后选择"删除"。
- 要手动添加点，请切换到常规铅笔图标屏幕。屏幕底部有一个手动跟踪标记。确保自动连接复选框为V。在影片本身上，为了添加点，请按住"移位"按钮并左键单击。
- 要向现有轨道添加点，请选择所需的轨道（黄色）和框架，切换到常规铅笔图标屏幕并手动添加点。完成整个影片后，切换到看起来像红色图形（统计信息）的图标。以后可以编辑分析的参数。要编辑，在屏幕左下角，请按瑞典键图标。例如：位置 X，位置 Y。
- 按图标，看起来像几个软盘，导出所有统计信息。
注： 电子表格输出可以直接处理，也可以使用用于此分析的已发布的代码 9 进行进一步分析，该代码将按需共享。从分析中提取以下参数：速度、轨道位移、运行长度、速度（包括方向性）、停止计数、平均停止持续时间、Alpha、方向变化和瞬时速度。格鲁斯卡等人9中详细介绍了每个参数。
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Representative Results
按照所述协议，小鼠胚胎HB9：：GFP脊髓外植在MFC中培养（图4A）。ex植物生长了7天，当斧子完全进入远端隔间。线粒体深红色和Lysotracker红色染料被添加到远端和近端隔间，以标记线粒体和酸性隔间（图4C）。对远端凹槽中的Axons进行了成像，对电影进行了分析如下：首先，我们使用kymograph分析（图4B，D）比较了一般运动分布。此分析显示，逆行方向仅在酸性隔间中存在偏差（非移动 = 77.1 = 9.5%;逆行 = 16.9 = 8.3%，前坡 = 6 ± 5%;图4E），但不在线粒体运输中（非移动=83.4= 6.8%;逆向=10.5=6.9%;前行= 6.8 ± 5.1%;图 4F。Kymograph分析用于量化颗粒密度，与HB9：GFP脊髓外植性相体（线粒体= 0.46 ± 0.13）中的酸性隔间相比，显示的线粒体颗粒数量较多;酸性隔间 = 0.3 ± 0.07 颗粒/μm 斧子，图 4G。
接下来，使用半自动软件进行单粒子传输分析，然后进行内部代码（图5A-B）。该分析表明，尽管一般具有相似的粒子速度（图5C），但在观察速度分布时（图5D），只有酸性隔间，但线粒体表现出对逆行运动的偏差。
图1：硅胶模具制备。描述氯三甲基硅烷晶圆清洗过程的原理图。（A） 首先，将 50 mL 的液氮添加到适当的容器中。在化学罩中工作，注射器和针头被用来提取8 mL的液氮。注射器的全部含量被注射到氯三甲基硅内瓶中。瓶子被转动，盖子朝下，8 mL的氯三甲基硅烷被拉回来。（B） 氯三甲基硅烷在容器中扩散（不直接在晶圆上）。容器需要关闭，然后为每个模具孵育5分钟。（C） 液体 PDMS 被倒入每个晶圆，达到所需的高度。（D） 所有板放在真空干燥器内 2 小时，随后在 70°C 烤箱中过夜 3 小时。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：MFC专用设计。（A） 使用金属手术刀从模具中取出的聚合 PDMS 模板。（B） 根据实验设置，6 mm、7 mm 或 1 mm 冲孔器用于打孔 PDMS 模板。（C） 在MFC中，使用7毫米和1毫米冲孔，并采用20G注射器制作"洞穴"，便于插入。（D） 对于分离的 MN 培养 MFC，使用 6 mm 冲孔在通道边缘创建四口井。（E-F）C和D中描述的最终 MFC 形状的插图。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：神经元培养。（A） E12.5 小鼠胚胎在头部、尾部和皮肤被移除后被放置到位，以暴露神经管。（B） 整个脊髓的解剖。（C） 使用温和的钳子，脑膜从脊髓上剥去。（D） 左面板：从腹腔脊髓上去除脊髓侧段，以产生更好的 MN 纯化。右面板：MFC 中分离 MN 区域性的代表性图像。HB9：：GFP斧子交叉到远端隔间（绿色）。Hoechst 染色表示神经元核（蓝色）。（E） 脊髓外植，由解剖腹腔脊髓的1毫米厚横向部分产生。HB9：GFP（绿色）脊髓在MFC中排泄的代表性图像。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：线粒体和酸性隔间在MN中的斧路运输。（A） 斧路运输文章的插图。Lysotracker Red 和 Mitotracker 深红色被添加到 MFC 的近端和远端隔间中，包含 HB9：：GFP 腹腔脊髓外植。（B） Kymograph分析。移动粒子被定义为在朝位移超过 10 μm 后移动前坡或逆行。旋转或不动粒子被计为非移动粒子。刻度杆 = 10 μm. （C） 显示原 HB9：：GFP 小鼠脊髓的延时膜的第一帧，用 Lysotracker 红色染色的斧头标记酸性隔间和线粒体深红色标记。刻度杆 = 10 μm. （D） 代表基莫图，显示酸性隔间和线粒体的典型斧子运动。刻度杆 = 10 μm （E） 线粒体六角线传输的Kymograph分析， \p < 0.0001， Anova 与霍尔姆-西达克校正 （n = 77 斧子）.刻度杆 = 10 μm （F） 酸性隔间六角运输的 Kymograph 分析， = p < 0.01， \p < 0.0001， Anova 与霍尔姆-西达克校正 （n = 77 安克斯）。（G） 线粒体和酸性隔间的Axonal粒子密度分析，\p < 0.0001，学生的t-test（n = 77安克斯）。错误栏表示带有 SD 的值。请单击此处查看此图形的较大版本。
图5：半自动单粒子分析，测量细胞器速度。（A） 半自动单粒子传输分析的原理图工作流程。（B） 心腹脊髓外植斧子被分析为单粒子跟踪。分析软件能够跟踪延时电影中的单个六角粒子，如线粒体（黄点、上面板）和酸性隔间（绿点、下面板）所示。（C） 线粒体和酸性隔间之间的平均速度没有变化，曼恩·惠特尼测试（n = 417 线粒体，n = 371 酸性隔间）。误差条表示具有 SD. （D） 线粒体和酸性隔间逆行和逆行速度分布的值。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 完整的神经基础中度 = 50mL | ||
| 成分 | 体积 | 浓度 |
| 神经基础 | 47mL | |
| B27 | 1 mL | 2% |
| 马血清 | 1 mL | 2% |
| 市盈率 | 0.5 mL | 1% |
| L-谷氨酰胺（谷谷） | 0.5 mL | 1% |
| β-甲乙乙醇（50mM） | 25 μL | 25μM |
| BDNF （10ug/mL） | 5 μL | 1ng/mL |
| GDNF （10ug/mL） | 5 μL | 1ng/mL |
| CNTF （10ug/mL） | 2.5 μL | 0.5ng/mL |
表1：制备完整神经基础（CNB）溶液的配方。
| Optiprep 解决方案 – 用于 10mL | ||
| 成分 | 体积 | 浓度 |
| DDW | 5.27 mL | |
| 密度梯度中等（Optiprep） 60% | 1.73 mL | 10.4%（v/v） |
| 三环 100mM | 1 mL | 2% |
| 葡萄糖 20% （v/v） | 2 mL | 2% |
表2：密度梯度介质溶液制备的配方。
| 脊髓外植介质 （SCX） = 20mL | ||
| 成分 | 体积 | 浓度 |
| 神经基础 | 19.5 mL | |
| B27 | 200 μL | 2% |
| 市盈率 | 100 μL | 1% |
| L-谷氨酰胺（谷谷） | 100 μL | 1% |
| Bdnf | 50 μL | 25ng/mL |
表3：脊髓外植（SCEX）溶液制备配方。
| MN 文化 | 脊髓外泄 |
| 电镀前的较长程序 | 短程序 = 解剖和板 |
| 在 MFC 中电镀需要格外小心 | 更容易在 MFC 中盘 |
| 无胶质细胞的运动神经元浓度高 – 更准确 | 胶质细胞和其他神经元类型的存在 - 更多的生理 |
| 在索马和斧子上无限可操作 | 细胞体的操纵可能性有限 |
| 细胞体和斧子的易于免疫染色 | 在外植体内细胞体的免疫染色过程中效率低。 |
| 病毒感染效率高 | 病毒感染效率极低 |
表4：基于速度、可行性、胶质存在、操纵可能性、免疫染色和病毒感染的周长，将脊髓外植剂与分离的MN培养基进行比较。
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Discussion
在此协议中，我们描述了一个系统，用于跟踪运动神经元中线粒体和酸性舱的斧头迁移。这种简化的体外平台允许精确控制、监测和操作亚细胞神经元隔间，从而能够对运动神经元局部功能进行实验分析。该协议可用于研究MN疾病，如ALS，专注于了解在疾病10，16,16的斧路运输功能障碍的基本机制。此外，该系统还可用于研究营养因子9,9，16，微RNA10，mRNA8的迁移，并在健康和患病的8MNs或其他神经元中标记蛋白质，如感觉9或交感斧子14。类似的方法也可以用于研究细胞器在共同培养系统中的运输，如MN培养与骨骼肌肉细胞12或交感神经元共同培养与心肌细胞14。MFC系统可用于产生主动NMJs17、18，并研究突触形成对斧路运输的影响16。17,
与其他 MFC 神经元培养协议相比，该协议具有几个优点，并且使用实时成像来分析六角传输：1） MFC 由多个制造商在商业上提供。然而，与商业替代方案相比，MFC 的自制造非常经济。单个 PDMS 晶圆可产生四个大型 MFC 或九个小晶片，而 PDMS 树脂本身只需支付数美元。2） 可以修改自产的 MFC 以满足特定的实验需求（例如，改变油井的大小和位置，增加 MFC PDMS 的厚度）。3） MFC 可以不可逆转地连接到板上（通过等离子粘接），也可以多次回收，以减少污染的可能性。4） PDMS MMC 是透明的，通过减少背景，使其成为实时成像的理想选择，这对于六角传输检测至关重要，其中信号到噪声的区分可能是一个限制因素。5）脊髓外植培养非常有效和快速。一个胚胎脊髓可以产生多达30个外植株，足够10个MfCs。这可以帮助节省时间和材料，并确保即使怀孕的小鼠胚胎很少，也能产生一个成功的实验。在表4中查看脊髓外植和分离MN培养的详细比较。
该协议相对简单且价格低廉。然而，它需要在几个技术问题方面的专门知识。MFC 的制造和处理需要准确和温和，以避免在强制性真空步骤 （1.1.10） 中出现结构缺陷和气泡。在可选的真空步骤 （1.6.2） 中，清除所有空气非常重要，否则会阻塞斧头交叉，同时保持真空短路，以避免 MFC 与玻璃分离。密切关注解剖协议步骤，因为正确去除角和背角很重要，并尝试将碎片切割到正确的尺寸，以便将其插入 MFC 的洞穴，而无需使用物理力。任何施加在MFC上的过度物理力都可以轻松分离凹槽或整个MFC，因此程序应轻轻完成。在 MFC 中培养 MN 并将其需要相对快速，因为在电镀步骤的低中等容量等压力条件下，MN 往往会快速聚合并失去生存能力。MFC 中的电镀应以低音量进行，以便适当连接 MFC 通道中的神经元，并且在不超过 30 分钟的加热介质后，应非常轻柔地添加，以防止 MN 分离。
经过几天的文化，一旦斧头延伸到远端隔间，培养物就准备进行器官染色，然后获得斧头运输电影，最后是图像分析的特定程序。分析可以通过一段时间内的单粒子跟踪或使用自动或半自动跟踪算法进行。根据我们的经验，自动化方法不太耗时，但有几个缺点。主要是，自动跟踪可靠性降低，拥挤的斧子交叉路径。此外，自动算法区分重叠粒子的能力降低。因此，建议执行手动或半自动跟踪。通常，半自动跟踪更可取，因为它不太耗时，但如果没有可用的付费软件，手动跟踪可能是一个不错的选择。在Gluska等人9中，可以彻底比较手工分析和自动分析。
总之，采用这个简单的协议可以产生重要数据，用于研究各种细胞分量的斧路传输。它可以适应各种成像设置和神经元亚型，以及神经元与其他细胞的共培养。它还允许细胞体或斧子进行不同的空间药理学操作，以了解神经元健康的基本机制，并改善改变的六角迁移疾病的药物开发。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了以色列科学基金会（ISF，561/11）和欧洲研究理事会（ERC，309377）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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