Summary
Axonal transport är en viktig mekanism för motor neuron hälsa. I detta protokoll ger vi en detaljerad metod för att spåra axonal transport av sura fack och mitokondrierna i motor neuron axons med mikrofluidic kammare.
Abstract
Motoriska nervceller (MNs) är mycket polariserade celler med mycket långa axoner. Axonal transport är en viktig mekanism för MN hälsa, bidrar till neuronal tillväxt, utveckling, och överlevnad. Vi beskriver en detaljerad metod för användning av mikrofluidiska kammare (MMF) för att spåra axonal transport av fluorescerande märkta organeller i MN axons. Denna metod är snabb, relativt billig, och möjliggör övervakning av intracellulära ledtrådar i tid och rum. Vi beskriver ett steg för steg protokoll för: 1) Tillverkning av polydimetylsiloxan (PDMS) MFC; 2) Plätering av ventrala ryggmärg explants och MN separerad kultur i MBC; 3) Märkning av mitokondrierna och sura fack följt av levande confocal fantasi; 4) Manuell och halvautomatisk axonal transportanalys. Slutligen visar vi en skillnad i transport av mitokondrierna och sura avdelningar av HB9::GFP ventrala ryggmärg explant axoner som ett bevis på systemets giltighet. Sammantaget ger detta protokoll ett effektivt verktyg för att studera axonal transport av olika axonalkomponenter, samt en förenklad handbok för MFC-användning för att hjälpa till att upptäcka rumsliga experimentella möjligheter.
Introduction
MNs är mycket polariserade celler med långa axoner, når upp till en meter lång hos vuxna människor. Detta fenomen skapar en kritisk utmaning för underhåll av MN-anslutning och funktion. Följaktligen är MNs beroende av korrekt transport av information, organeller och material längs axonerna från cellkroppen till synapsen och ryggen. Olika cellulära komponenter, såsom proteiner, RNA och organeller transporteras regelbundet genom axoner. Mitokondrierna är viktiga organeller som rutinmässigt transporteras i MNs. Mitokondrierna är nödvändiga för korrekt aktivitet och funktion av MNs, som ansvarar för ATP-tillhandahållande, kalciumbuffertning och signalprocesser1,2. Axonal transport av mitokondrierna är en väl studerad process3,4. Intressant nog rapporterades defekter i mitokondriell transport vara inblandade i flera neurodegenerativa sjukdomar och särskilt i MN-sjukdomar5. Sura fack fungerar som ett annat exempel för inneboende organeller som rör sig längs MN axoner. Sura fack inkluderar lysosomer, endosomer, trans-Golgi-apparat och vissa sekretoriska blåsor6. Defekter i axonal transport av sura avdelningar hittades i flera neurodegenerativa sjukdomar samt7, och de senaste tidningarna belysa deras betydelse i MN sjukdomar8.
För att effektivt studera axonal transport används mikrofluidiska kammare som separerar somatiska och axonala fack ofta9,,10. De två betydande fördelarna med mikrofluidiska systemet, och uppdelningen och isoleringen av axoner, gör det idealiskt för studier av subcellulära processer11. Den rumsliga separationen mellan neuronala cellkroppar och axoner kan användas för att manipulera de extracellulära miljöerna i olika neuronala fack (t.ex. axoner vs soma). Biokemiska, neuronal tillväxt/degeneration, och immunofluorescens analyser alla dra nytta av denna plattform. MBC kan också hjälpa till att studera cell-till-cell kommunikation genom att coculturing nervceller med andra celltyper, såsom skelettmuskulaturen12,13,14.
Här beskriver vi ett enkelt men exakt protokoll för övervakning mitokondrierna och sura fack transport i motor nervceller. Vi visar vidare användningen av denna metod genom att jämföra den relativa andelen bakåtsträvande och anterograde rörliga organeller, samt fördelningen av transporthastighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vård och behandling av djur i detta protokoll utfördes under överinseende och godkännande av Tel Aviv University Committee for Animal Ethics.
1. MFC förberedelse
- PDMS gjutning i primära formar (figur 1)
- Köpa eller skapa primära formar (plattor) enligt ett detaljerat protokoll9.
- Använd tryckluft för att avlägsna någon typ av smuts från wafer-plattformen innan du fortsätter till beläggningssteget. Ytan på plattorna ska se slät och klar ut.
- Fyll en behållare med 50 ml flytande kväve. Förbered en 10 ml spruta och 23 G nål.
OBS: Alla procedurer från detta steg framåt måste utföras i en kemisk huva. - I den kemiska huven, använd sprutan och nålen för att poola 2 ml flytande kväve. Även om det kan verka som luft drogs, är sprutan fylld med kväve (figur 1A). Placera den plattor som innehåller plattan i en förslutningsbar behållare.
- Skruva upp en klorotrimetylsilaneflaska, genomborra gummilocket med hjälp av den kvävefyllda sprutan och injicera hela innehållet i sprutan i flaskan. Utan att dra ut nålen, vänd flaskan upp och ner och dra tillbaka 2 ml klorotrimetylsilane.
OBS: På grund av spruttrycket sprutas en liten mängd klorotrimetylsilane ut ur nålen. För att undvika fara, rikta nålen mot huvens innervägg (bild 1B). - Sprid klorotrimetylsilane jämnt i behållaren (från steg 1.1.4), men inte direkt på plattan eller plattan som innehåller plattor. Stäng behållaren och inkubera i 5 min per wafer.
OBS: Om detta är första gången rånet är belagd med klorotrimetylsilane, bör en 1 h inkubation tillåtas för varje rån. - Ta inte ut rånen och behållaren ur den kemiska huven på 30 minuter.
VARNING: Klorotrimetylsilane är mycket flyktig. - Väg PDMS-basen (se Materialförteckning) i ett 50 ml-rör och tillsätt PDMS härdningsmedel i ett förhållande av 16:1 (t.ex. 47,05 g bas och 2,95 g härdningsmedel). Blanda i 10 min med en låghastighetsrotator.
- Häll PDMS i varje plattor som innehåller plattor till önskad höjd (bild 1C).
OBS: Användning av tunna mikrofluidiska kammare (upp till 3-4 mm) förbättrar vidhäftningen till odlingsskålen och förhindrar läckage. - Placera alla plattor i en vakuumsickator i 2 timmar (figur 1E). Denna process tar bort luften instängd i PDMS, vilket eliminerar luftbubblor och bildar en tydlig, enhetlig mögel.
- Placera plattorna i en ugn i 3 timmar (eller över natten) vid 70 °C (bild 1E).
OBS: Plattorna ska vara planta när de placeras i ugnen.
- PDMS gjutning i epoxiformar
OBS: Eftersom wafer förberedelse är dyrt, kräver särskild utrustning, och kan skada den bräckliga plattor, är det möjligt att generera epoxi kopior av plattor. Replikerna är billigare, mer hållbara, och kan användas för massproduktion av mikrofluidiska kammare.- Casta och bota PDMS (enligt beskrivningen i 1.1.8-1.1.11) i den ursprungliga wafer.
- Avlägsna och skär av överflödiga delar av PDMS och lämna endast de mikrofluidiska elementen och det funktionella område som krävs för bearbetning av dem till mikrofluidiska kammare.
- Linda omedelbart PDMS med tjock, klibbig tejp för att förhindra att den ackumuleras damm.
- Välj en vävnadskultur kvalitet plast skålen som passar hela PDMS inuti och lämna utrymme för epoxi runt den. Avståndet från PDMS till plastskålen bör vara mindre än 5 mm.
- Förbered en liten mängd PDMS blandat i ett förhållande av 10:1 (bas:härdningsmedel). Den färska flytande PDMS kommer att användas för att limma fast PDMS på botten av plastplattan.
- Applicera en minimal mängd av den flytande PDMS på mitten botten av plastplattan och ta sedan bort tejpen från PDMS och fäst den på plastskålen botten. Se till att de mikrofluidiska elementen är vända uppåt.
- Låt PDMS härda i 30 min i en 70 °C ugn.
- Förbered epoxihartsen genom att blanda basen och härdningsmedlet i ett förhållande av 100:45 respektive i ett provrör. Olika epoxihartser kan ha olika blandningsförhållanden. Den volym som krävs för en vanlig 100 mm platta är ca 40 ml.
- Låt epoxiblandningen väl blandas i 10 minuter i en rotator tills blandningen blir synligt homogen (dvs. det finns inga synliga fiberliknande artefakter i vätskan).
- Centrifugera epoxiblandningen vid 400 x g i 5 min för att avlägsna luftbubblor som fångats inuti.
- Under centrifugering, sprida ett tunt lager av silikonfett runt väggarna och alla andra exponerade plastdelar av kulturskålen. Detta förhindrar epoxi från att polymerisera med skålen plast och gör det möjligt att avlägsna den härdade epoxi lätt i slutet av protokollet.
- Häll epoxin långsamt i skålen tills den helt täcker PDMS och går utöver den med minst 5 mm. Förhindra bildandet av bubblor inom epoxi genom att hålla noll avstånd mellan röret och plattan. Placera plattan på en säker plats så att den inte kommer att flyttas under de kommande 48 h.
- Efter 48 h ska epoxin botas helt. För in plattan i en förvärmd ugn vid 80 °C i 3 timmar för slutlig härdning.
- Ta bort den härdade epoxi från plattan och den ursprungliga PDMS mögel genom att försiktigt yanking plastväggen på plattan tills den går sönder. Det bör då lätt separera från epoxi och skala av.
- När extraheras, torka av det återstående fettet från den nya epoxirepliken och infälld den upp och ner (dvs. med de replikerade mikrofluidiska elementen uppåt) till en ny odlingsskål. Epoxepliken är nu klar för PDMS-gjutning.
- Använd tryckluft eller N2 för att blåsa bort eventuella rester av PDMS eller smuts från epoxiformen och skölj den 2x med isopropanol. Fyll den en tredje gång och inkubera i 10 min på en orbital shaker platta. Skölj formen igen 3x med isopropanol och kassera den återstående vätskan. Föna med luft eller N2 eller placera i en 70 °C ugn tills den är torr.
OBS: Följ säkerhetsrutinerna när du arbetar med och kasserar isopropanol. - Håll mögelplattorna stängda tills gjutning. Följ steg 1.1.8.-1.1.11.
- Stansning och skulptering av PDMS till en MFC(figur 2)
- Klipp och ta bort PDMS mögel från plattan genom att följa (+) märken på plattor med hjälp av en skalpell. Använd inte våld, eftersom formar är ömtåliga (figur 2A).
- Följ instruktionerna som ritats på skissen för att stansa och skära kamrarna beroende på den experimentella inställningen (figur 2B-F).
- För ryggmärg explant kultur (Figur 2C, E), punsch två 7 mm brunnar i den distala sidan av en stor MFC. Leta reda på brunnarna på ett sätt som de överlappar med kanalkanterna. På den proximala sidan, stansa en 7 mm brunn i mitten av kanalen, med minimal överlappning så att tillräckligt med utrymme lämnas för explants. Stans två ytterligare 1 mm hål i de två kanterna på den proximala kanalen. Vrid MFC med de mikrofluidiska elementen uppåt, och använd en 20 G nål, hugga tre små explant grottor på stansade 7 mm väl.
- För dissocierad MN-kultur (Figur 2D,F), stans fyra 6 mm brunnar i kanterna på de två kanalerna i en liten MFC.
- Sterilisera MFC för vävnadsodling
- Bred 50 cm långa tejpband på bänken. Tryck och dra tillbaka kammaren för att möta tejpen (både övre och nedre ytor) och ta bort rå smuts. Placera de rena kamrarna i en ny 15 cm lång platta.
OBS: Tryck inte direkt på de mikrofluidiska elementen när dessa är vända uppåt. - Inkubera kamrarna i analytisk etanol av 10 % i 10 minuter på en orbitalshake.
- Kassera etanol och torka kamrarna i en vävnadsodlingshuva eller i en ugn vid 70 °C.
- Bred 50 cm långa tejpband på bänken. Tryck och dra tillbaka kammaren för att möta tejpen (både övre och nedre ytor) och ta bort rå smuts. Placera de rena kamrarna i en ny 15 cm lång platta.
- Placera MFC på en glasbotten skålen
- Placera kammaren i mitten av en vävnadskultur klass 35 mm/50 mm glas botten skålen och tillämpa mindre kraft på kanterna för att göra PDMS och skålen botten binda. För att undvika att bryta glasbotten, applicera alltid kraft ovanpå en fast yta.
- Inkubera 10 min i 70 °C. Tryck på kamrarna för att stärka vidhäftningen till plattan.
- Inkubera under UV-ljus i 10 min.
- Beläggning och odling
- Tillsätt 1,5 ng/mL poly-L-ornitin (PLO) i båda facken. Se till att PLO går genom kanalerna genom att pipettera beläggningsmediet några gånger direkt i kanalens ingång.
- Undersök mikrofluidiska kammaren under ett lätt mikroskop med 10x förstoring för att kontrollera förekomsten av luftbubblor. Om luftbubblor blockerar mikroväxterna, placera MFC i en vakuumsickator i 2 min. Senare, ta bort överflödig luft som fastnade i kanalerna genom pipettering beläggningen media genom dem. Inkubera över natten.
- Byt ut PLO mot laminin (3 μg/ml i DDW) för inkubation över natten på samma sätt.
- Före plätering, tvätta laminin med neuronal odling medium.
2. Neuronal kultur plätering
- Separerad motor neuron kultur
- Med rak sax och fina pincett, dissekera en ryggmärg ur en E12.5 ICR-HB9::GFP mus embryo. Arbeta i en 1X HBSS-lösning med 1% penicillin-streptomycin (P/S) (figur 3A-C).
- Ta bort hjärnhinnorna och dorsala hornen (figur 3D) med hjälp av mikrodissectionsaxar.
- Samla ryggmärgen bitar och överföra till röret(#1)med 1 ml HBSS + 1% P / S.
- Skär ryggmärgen till små bitar med böjda sax och vänta på bitarna att bosätta sig.
- Tillsätt 10 μl trypsin 2,5% och placera i ett 37 °C vattenbad i 10 min. Efter 5 min, blanda genom att knacka på röret. Bitarna ska bilda en spiralliknande klump.
- Överför klumpen till ett nytt rör(#2)som innehåller 800 μL förbevarad L-15, 100 μl BSA 4% och 100 μL 10 mg/ml DNase. Grind 2x, vänta sedan i 2 min för att låta odissocierade bitar lösa. Överför supernatanten till ett nytt rör (#3).
- Tillsätt 100 μl BSA 4%, 20 μL 10 mg/ml DNase och 900 μl komplett neurobasalmedium (CNB, se Tabell över material och tabell 1). Grind 8x och vänta 2 min. Samla supernatant till röret #3.
- Upprepa steg 2.1.7 och slipa 10x. Samla supernatant till röret #3. En liten mängd vävnad bör lämnas längst ner i röret.
OBS: Om en stor klump fortfarande finns kvar i botten av röret #2,upprepa steg 2.1.8. - Tillsätt 1 ml BSA 4% kudde till botten av röret #3.
- Centrifugera vid 400 x g i 5 min. Kassera supernatanten.
- Sätt tillbaka cellpelleten genom att försiktigt knacka på röret och tillsätt sedan 1 ml CNB-medium. Pipettera 6x och tillsätt 20 μL 10 mg/ml DNase.
- Komplettera med ytterligare 5 ml CNB medium och överför 3 ml till ett nytt rör (#4).
- Tillsätt 1 ml 10,4 % densitetsgradientmedium (se tabell 2) till botten av varje rör(#3 och #4). En skarp fasseparation mellan de två gränssnitten bör visas.
- Centrifugera vid 775 x g i 20 min vid rumstemperatur (RT). Centrifugretceleration bör ställas in på en låg nivå för att undvika nedbrytning av fassepareringen.
- Celler ska vara flytande och visas som en grumlig interfas mellan mediet. Samla cellerna från båda rören i ett nytt rör (#5) som redan innehåller förvärmt 1 mL CNB-medium.
- Tillsätt ytterligare 4-6 ml CNB-medium.
- Tillsätt 1 ml BSA 4% kudde till botten av röret.
- Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid RT. Kassera supernatanten och sätt försiktigt tillbaka pelleten med 1 ml CNB-medium.
- Räkna cellerna. En avkastning på 0,75-1 x 106 MN per ryggmärg förväntas.
OBS: Ventral ryggmärg innehåller också andra neuronala subtyper förutom motoriska nervceller (t.ex. interneurons). MN renhet beror främst på avlägsnande av dorsala områden under dissekering och förmågan att nå MN berikade rostrala områden. För att säkerställa att de avbildade nervcellerna är MNs rekommenderas användning av en mössstam med en endogen MN-markör, såsom HB9::GFP-möss. För att uppnå ren MN-odling (men med minskad cellavkastning) är användning av FACS rening15 möjlig. - Plätering separerade MN kultur i MFC
- Koncentrera 150 000 MNs per kammare genom centrifugering vid 400 x g i 5 min.
- Aspirera supernatanten och resuspend försiktigt cellerna i rikt neurobasalmedium (RNB) vid 4 μL per MFC. RNB kompletteras med ytterligare 2% B27 och 25 ng/mL BDNF.
- Ta bort mediet från båda facken och lämna en låg volym motsvarande ~10 μL i brunnarna i distala facket. Det verkar som en tunn ring av medium i brunnen omkretsen.
- Ladda långsamt 4 μL celler i kanalen. Ta ut 4 μL av brunnen på andra sidan kanalen och ladda dem långsamt tillbaka direkt i kanalen för att vända strömflödet och maximera celltätheten i kanalen.
- Kontrollera att cellerna har kommit in i kanalen med hjälp av ett 10x ljusmikroskop och placera kammaren i inkubatorn i 30 min utan att lägga till mer media.
- Tillsätt långsamt ~10-15 μL RNB i de proximala och distala brunnarna och placera kamrarna i inkubatorn i ytterligare 15 minuter.
- Efter denna inkubation, tillsätt långsamt ~75-80 μL RNB i varje brunn.
- Dissocierat MN-kulturunderhåll
- En dag efter plätering (DIV1), ersätta medium med RNB kompletteras med 1 μM cytosin arabinoside (Ara-C) för att hämma glial tillväxt.
- Två dagar efter appliceringen av Ara-C (DIV3) ersätter medium med färskt CNB-medium i det proximala facket (utan Ara-C).
- För att förbättra korsning av axoner genom mikrogrooverna, applicera RNB kompletterat med 25 ng/ml gliaceller-härledda neurotrofisk faktor (GDNF) och 25 ng/ml hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) endast på det distala facket. Håll en volymgradient på minst 10 μL per brunn mellan de axonala distala brunnarna (högre volym) och de proximala brunnarna.
- Uppdatera mediet varannan dag. Det kan ta axonerna upp till 4-6 dagar att korsa distally.
- Ryggmärg explant kultur
- Med rak sax och fina pincett, dissekera en ryggmärg ur en E12.5 ICR-HB9::GFP mus embryo. Arbeta i en 1X HBSS-lösning med 1% penicillin-streptomycin (P/S) (figur 3A-C).
- Ta bort hjärnhinnorna och dorsala hornen (figur 3D) med hjälp av mikrodissectionsaxar.
- Skär ryggmärgen i 1 mm tjocka tvärgående sektioner (figur 3E). Kassera allt medium från MFC:s proximala fack.
- Plocka upp en enda ryggmärgsutplant med en pipett i en total volym av 4 μL. Injicera explanten så nära grottan som möjligt och dra ut eventuella för mycket vätska från den proximala brunnen via sidouttagen (1 mm slag). Explanterna ska sugas in i den proximala kanalen.
- Tillsätt långsamt 150 μl ryggmärgsexplantmedium (SCEX, se Tabell över material och tabell 3) till den proximala brunnen.
- Ryggmärg explant kultur underhåll
- Tillsätt SCEX-medium i det proximala facket och det rika SCEX-mediet (SCEX med 50 ng/ml BDNF och GDNF) i det distala facket. Håll en volymgradient på minst 15 μL per brunn mellan de distala brunnarna (högre volym) och den proximala brunnen.
- Uppdatera mediet varannan dag. Det kan ta axonerna upp till 3-5 dagar att korsa distally.
3. Axonal transport (figur 4A)
- Märkning av mitokondrierna och sura fack
- Förbered färskt SCEX-medium (eller CNB för dissocierad MN) som innehåller 100 nM Mitotracker Deep Red FM och 100 nM LysoTracker Red. Inkubera i 30-60 min vid 37 °C. Andra färger kan användas så länge deras fluorofores inte överlappar varandra.
- Tvätta 3x med varmt CNB/SCEX medium. Plattorna är klara för avbildning.
- Live imaging
- Skaffa 100 time-lapse bildserie av axonal transport med 3 s intervaller, med totalt 5 min per film.
OBS: Bildsystemet som användes i denna studie inkluderade ett inverterat mikroskop utrustat med spinningskiva confocal, kontrolleras via anständighet cell imaging programvara, 60x oljelins, NA = 1,4, och en EMCCD kamera. Filmer förvärvades i en kontrollerad miljö vid 37 °C och 5% CO2.
Längre eller kortare timelapse-filmer kan avbildas, beroende på experimentet. Även natten filmer kan spelas in om det behövs. Det är dock viktigt att försöka minska exponeringstiden och lasereffekten, liksom antalet totala bilder, för att minska fototoxicitet och blekning under filmförvärv.
- Skaffa 100 time-lapse bildserie av axonal transport med 3 s intervaller, med totalt 5 min per film.
4. Bildanalys (figur 4-5)
- Analys av partikeltransportfördelning och partikeltäthet med hjälp av kymographanalys
- Öppna filen i FIJI. Separata kanaler som trycker på Bild | Staplar | Verktyg | Deinterleave.
- Ange bildegenskaper genom att trycka på Bild | Egenskaper.
- Välj segmenterat linjeverktyg genom att högerklicka på linjeikonen. Ställ in bredden på 8-10 genom att dubbelklicka på linjeikonen. Var konsekvent med samma linjebredd under hela analysen.
- Markera en segmenterad linje som följer axonbanan från distal till proximal. Dubbelklicka för att stoppa linjemarkeringen.
- Klicka på t om du vill lägga till ett nytt område av intresse (ROI) i ROI Manager. Lägg till detta i en kalkylbladsanalystabell.
- Klicka på m om du vill mäta axonens yta och längd. Lägg till detta i analystabellen.
- Generera en kymograph genom att klicka på Plugins | KymoToolBox | Rita Kymo. Alternativt kan andra plugins för kymograph generation användas.
- Räkna flytta manuellt (bakåtsträvande eller anterograde) och icke-rörliga partiklar och lägg till dem i tabellen i rätt kolumn.
PARTIKLAR klassificeras som rörliga anterograde (dvs. rör sig åt vänster i kymografin) eller bakåtsträvande (dvs. rör sig åt höger) om deras förskjutning är högre än 10 μm i den specifika riktningen. Det är möjligt att mäta förskjutningen genom att helt enkelt markera en horisontell linje med linjeikonen och trycka på m. Orörliga partiklar eller partiklar som inte uppfyller förskjutningskriterierna definieras som icke-rörning (figur 4B).
- Spårning av en partikel: Manuell spårning
- Ladda ner manuell spårning plugin för FIJI programvara (utvecklad av Fabrice P. Cordelière) från http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
- Öppna filen i FIJI/ImageJ. Använd alternativet Rotera för att justera MFC-spåren vågrätt.
- Om du vill förbättra förhållandet mellan signal och brus om det behövs klickar du på Process | Subtrahera bakgrund.
- Öppna plugin:en manuell spårning. Ställ in parametrarna (t.ex. pixelstorlek, tidsintervall osv.) enligt det specifika mikroskop som används för avbildning. För de resultat som visas här, mikroskop och lins förhållandet var 0,239 μm / pixel och ramen intervallet var 3 s.
- Hämta spåren X- och Y-koordinater och spara resultaten genom att kopiera texten till kalkylbladet.
- Analysera filmer med flera kanaler genom att klicka på Bild | Färg | Sammanfoga kanaler för att sammanfoga kanalerna och spåra sedan endast colocalized puncta.
- Enkel partikelspårning: Halvautomatisk spårning (Bild 5)
- Öppna analysprogramvaran. Denna studie används Bitplane Imaris programvara version 8.4.1.
- Byt till Överträffa i den övre menyn.
- Klicka på Bildbehandling | Swap Tid och Z | Ok.
- Klicka på Redigera | Bildegenskaper (Ctrl+I) | Geometri | Voxel Storlek Rad. Ange bildegenskaper enligt den mikroskopiinställning som används.
Obs: För de data som visas här var mikroskopet och linsförhållandet 0,239 μm/pixel. - Klicka på Alla efterstjämna och ändra tidsintervallet. Använd till exempel 3 s som intervall. Klicka på knappen Återställ längst ned eller klicka på Ctrl+B.
- Lägg till ett lager av fläckar längst upp till vänster genom att klicka på en ikon med små gula fläckar. Längst ner till vänster öppnas en ny meny för redigering av fläckar.
- Tryck på den högra blå pilen tills spotidentifieringen startar.
Det är viktigt att filtrera bort några av punkterna med hjälp av filtret längst ned till vänster i fönstret. Kontrollera filmen några gånger för att se att ett tillräckligt antal punkter är markerat. - Verifiera eller konfigurera parametrarna så att de passar de experimentella behoven. Till exempel Max Avstånd = 12 μm (Det maximala tillåtna avståndet mellan två olika fläckar för att fortfarande inkludera dem i samma enda spår); Max mellanrumsstorlek = 1 (Antalet bildrutor som ett spår tillåts att missa och fortfarande betraktas som ett spår).
- Klicka på Inställningar och sedan spåra format = Av, Punkter = Sfär.
- Välj olika filter för justering med filterfältet. I de data som anges här tog till exempel Spårvaraktighet = 9 bort alla spår med färre än 3 bildrutor. När alla parametrar är inställda klickar du på den gröna högerpilen. Ytterligare redigering är inte möjligt efter detta steg.
- Klicka på den lilla pennan med punkter om du vill redigera alla spår manuellt.
- Visa filmen (Bild 5B). Om ett fel uppstår finns det flera möjliga alternativ:
- Om du vill koppla från ett spår klickar du på alternativet Objekt och väljer de två platser som måste kopplas från hållna Ctrloch väljer Koppla från.
- Om du vill ansluta ett spår klickar du på alternativet Objekt, väljer de två platser som måste anslutas för att hålla Ctrl och väljer Anslut.
- Om du vill ta bort ett spår eller en plats växlar du till skärmen med ikonen Vanlig pennamed rätt alternativ (Spår/objekt)och väljer Ta bort.
- Om du vill lägga till fläckar manuellt växlar du till den vanliga pennikonskärmen. Längst ner på skärmen finns en manuell spårningsmarke. Kontrollera att kryssrutan Koppla automatiskt är V. Håll knappen Skift och Vänsterklicka påsjälva filmen för att lägga till en plats.
- Om du vill lägga till en plats i ett befintligt spår väljer du ett önskat spår (gul) och ram, växlar till den vanliga pennikonskärmen och lägger till en dekor manuellt. När hela filmen är klar växlar du till ikonen som ser ut som ett rött diagram (statistik). Det är möjligt att redigera de analyserade parametrarna senare. Om du vill redigera trycker du längst ned till vänster på skärmen på den svenska nyckelikonen. Till exempel: Position X, Position Y.
- Tryck på ikonen som ser ut som flera disketter, exportera all statistik.
Kalkylbladsutdata kan antingen hanteras direkt eller analyseras ytterligare med hjälp av den publicerade kod9 som används för den här analysen, som delas på begäran. Följande parametrar extraheras från analysen: Hastighet, Spårförskjutning, Körlängd, Hastighet (inklusive riktning), Stoppantal, Genomsnittlig stopptid, Alfa, riktningsändringar och momentan hastighet. En detaljerad förklaring av varje parameter beskrivs i Gluska et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter det beskrivna protokollet odlades mus embryonala HB9::GFP ryggmärgsexplants i MFC (figur 4A). Explants odlades i 7 dagar, när axoner helt korsade in i distala facket. Mitotracker Deep Red och Lysotracker Röda färgämnen tillsattes de distala och proximala facken för att märka mitokondrierna och sura facken (figur 4C). Axoner i de distala spåren avbildades, och filmerna analyserades på följande sätt: För det första jämförde vi den allmänna rörelsefördelningen med hjälp av kymograph-analys (Figur 4B,D). Denna analys visade en bias i bakåtsträvande riktning endast i sura avdelningar (nonmoving = 77,1 ± 9,5%; bakåtsträvande = 16,9 ± 8,3%, anterograde = 6 ± 5%; Figur 4E) men inte i mitokondriell transport (nonmoving = 83,4 ± 6,8 %; bakåtsträvande = 10,5 ± 6,9 %; anterograde = 6,8 ± 5,1 %; Bild 4F). Kymograph analys användes för att kvantifiera partikeldensiteten, avslöjar ett högre antal mitokondriella partiklar jämfört med sura fack i HB9:: GFP ryggmärg explant axoner (Mitokondrierna = 0,46 ± 0,13; Sura fack = 0,3 ± 0,07 partiklar/μm axon, figur 4G).
Därefter genomfördes enanalys av partikeltransporter med halvautomatisk programvara följt av intern kod (figur 5A-B). Denna analys visade att trots liknande partikelhastighet i allmänhet (figur 5C), när man observerar fördelningen av hastigheter (figur 5D) endast sura avdelningar men inte mitokondrierna visas en bias mot bakåtsträvande rörelse.
Figur 1: Silikonformberedning. Schematisk ritning som beskriver förfarandet för klorotrimetylsilane wafer rengöring. (A)Först tillsattes 50 ml flytande kväve i en lämplig behållare. Arbeta i en kemisk huva, en spruta och nål användes för att dra 8 ml flytande kväve. Hela innehållet i sprutan injicerades i klorotrimetylsilaneflaskan. Flaskan vändes med locket nedåt och 8 ml klortrimetylsilane drogs tillbaka. B)Klorotrimetylsilan sprids i behållaren (inte direkt på rånet). Behållaren måste stängas, följt av 5 min inkubation för varje mögel. (C)Flytande PDMS hälldes i varje rån upp till önskad höjd. (D)Alla plattor placerades tillsammans inuti en vakuumsickator i 2 timmar, följt av 3 h-över natten i en 70 °C ugn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: MFC specialiserad design. (A)Polymeriserad PDMS mall tas ur formen med hjälp av en metall skalpell. (B) Beroende på försöksinställningen användes antingen 6 mm, 7 mm eller 1 mm stansare för stansning av PDMS-mallarna. (C)För explant kultur i MFC, 7 mm och 1 mm stansmaskiner användes, och en 20 G spruta användes för att göra "grottor" för enkel explant insättning. (D)För dissocierade MN kultur MFC, en 6 mm puncher användes för att skapa fyra brunnar vid kanalen kanter. (E-F) Illustrationer av de slutliga MFC-formerna som beskrivs i C respektive D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Neuronal kultur. (A)E12.5 mus embryo placerades på plats efter huvudet, svansen och huden togs bort för att exponera neuralröret. (B)Dissekering av hela ryggmärgen. (C)Med hjälp av mjuka pincett skalades hjärnhinnorna bort från ryggmärgen. (D)Vänster panel: Borttagning av ryggmärgen laterala segment från ventrala ryggmärgen för att ge bättre MN rening. Högerpanel: Representativ bild av dissocierade MN kultur i MFC. HB9::GFP-axoner korsade till distala facket (grön). Hoechst färgning indikerar neuronala kärnor (blå). (E)Ryggmärg explants genereras genom dissekera 1 mm tjocka tvärgående delar av ventrala ryggmärgen. Representativ bild av HB9::GFP (grön) ryggmärg explant axoner i en MFC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Axonal transport av mitokondrierna och det sura utrymmet i MNs. (A)Illustration av axonal transport uppsats. Lysotracker Red och Mitotracker Deep Red lades till både proximala och distala fack i MFC, som innehåller HB9::GFP ventrala ryggmärg explant. ( B)Kymograph analys. Rörliga partiklar definierades som rörliga anterograde eller bakåtsträvande efter förskjutning av mer än 10 μm i den riktningen. Roterande eller orörliga partiklar räknades som nonmoving. Skala bar = 10 μm.(C) Första ramen för en time-lapse film som visar primära HB9:: GFP mus ryggmärg explant axoner färgade med Lysotracker röd för att märka sura fack och Mitotracker Deep Red att märka mitokondrierna. Skalans stång = 10 μm.(D)Representativa kymografier som visar en typisk axonal rörelse av sura fack och mitokondrierna. Skalan stång = 10 μm.(E) Kymograph analys av mitokondriell axonal transport, ****p < 0.0001, Anova med Holm-Sidak korrigering (n = 77 axons). Skalan stång = 10 μm(F)Kymograph analys av surt utrymme axonal transport, ** p < 0,01, ****p < 0.0001, Anova med Holm-Sidak korrigering (n = 77 axoner). (G)Axonal partikeldensitetsanalys av mitokondrierna och sura fack, ****p < 0,0001, Students t-test (n = 77 axoner). Felstaplar representerar värden med SD. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Halvautomatisk enpartikelanalys för att mäta organellhastigheten. (A)Schematiskt arbetsflöde för halvautomatisk analys av enpartikeltransport. (B) Ventral ryggmärg explant axoner analyserades för enstaka partikel spårning. Analysprogramvaran kan spåra enstaka axonalpartiklar i timelapse-filmer, vilket anges för mitokondrierna (gula prickar, övre panelen) och sura fack (gröna prickar, nedre panelen). C)Den genomsnittliga hastigheten förändrades inte mellan mitokondrierna och sura avdelningar, Mann Whitney-testet (n = 417 mitokondrierna, n = 371 sura avdelningar). Felstaplar representerar värden med SD. (D) Fördelning av mitokondriella och sura fack bakåtsträvande och anterograde hastigheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komplett Neurobasal Medium – för 50mL | ||
| Ingrediens | Volym | Koncentration |
| Neurobasal | 47mL | |
| B27 | 1 ml | 2% |
| Häst serum | 1 ml | 2% |
| P/S | 0,5 mL | 1% |
| L-glutamin (glutamax) | 0,5 mL | 1% |
| Beta-Mercaptoetanol (50mM) | 25 μl | 25 μm |
| BDNF (10ug/mL) | 5 μl | 1ng/ml |
| GDNF (10ug/mL) | 5 μl | 1ng/ml |
| CNTF (10ug/mL) | 2,5 μl | 0.5ng/ml |
Tabell 1: Recept för beredning av fullständig neurobasallösning (CNB).
| Optiprep Lösning – för 10mL | ||
| Ingrediens | Volym | Koncentration |
| DDW (på andra) | 5,27 mL | |
| Densitet Gradient Medium (Optiprep) 60% | 1,73 mL | 10.4% (w/v) |
| Tricine 100mM | 1 ml | 2% |
| Glukos 20% (w /v) | 2 ml | 2% |
Tabell 2: Recept för beredning av densitet gradient medium lösning.
| Ryggmärg Explant Medium (SCX) – för 20mL | ||
| Ingrediens | Volym | Koncentration |
| Neurobasal | 19,5 mL | |
| B27 | 200 μl | 2% |
| P/S | 100 μl | 1% |
| L-glutamin (glutamax) | 100 μl | 1% |
| BDNF (BDNF) | 50 μl | 25ng/ml |
Tabell 3: Recept för beredning av ryggmärgsutexplant (SCEX) lösning.
| MN Kultur | Ryggmärg Explants |
| Längre förfarande före plätering | Kort procedur – Dissekera och platta |
| Extra försiktighet behövs för plätering i MFC | Lättare att plattan i MFC |
| Hög koncentration av motoriska nervceller utan gliaceller – mer exakt | Förekomst av gliaceller och andra neuronala typer – mer fysiologiska |
| Obegränsade manipulationsmöjligheter på både Soma och axons | Begränsade manipulationsmöjligheter på cellkroppar |
| Enkel immunbehållande för både cellkroppar och axoner | Låg effektivitet vid immunfärgning av cellkroppar inom explanten. |
| Hög verkningsgrad av virusinfektion | Mycket låg verkningsgrad av virusinfektion |
Tabell 4: Jämförelse mellan ryggmärg explants och dissociated MN kultur baserat på omkrets av hastighet, genomförbarhet, glial närvaro, manipulation möjligheter, immunstaining och virusinfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi ett system för att spåra axonal transport av mitokondrierna och sura fack i motoriska nervceller. Denna förenklade in vitro-plattform möjliggör exakt kontroll, övervakning och manipulering av subcellulära neuronala fack, vilket möjliggör experimentell analys av motor neuron lokala funktioner. Detta protokoll kan vara användbart för att studera MN-sjukdomar som ALS, att fokusera på att förstå den underliggande mekanismen för axonal transport dysfunktion i sjukdomen10,16. Dessutom kan detta system också tillämpas för att studera transport av trofiska faktorer9,16, microRNA10, mRNA8, och märkta proteiner i friska och sjuka MNs eller i andra nervceller, såsom sensoriska9 eller sympatiska axoner14. En liknande metod kan också tillämpas för att studera organell transport i ett coculture system, såsom MNs odlade med skelettmuskulaturceller12 eller sympatiska nervceller cocultured med kardiomyocyter14. MFC-systemet kan användas för att generera aktiva NMJs17,18 och studera effekten av synapsbildning på axonal transport16.
Detta protokoll har flera fördelar jämfört med andra protokoll för odling av nervceller i MFC och använda levande bildbehandling för att analysera axonal transport: 1) MPC är kommersiellt tillgängliga av flera tillverkare. Självtillverkning av multi-MFC är dock extremt kostnadseffektivt jämfört med det kommersiella alternativet. En enda PDMS wafer ger fyra stora MMFC eller nio små på minimal bekostnad av flera amerikanska dollar för PDMS harts själv. 2) De egentillverkade MMFC kan modifieras för att svara på specifika experimentella behov (t.ex. ändra storlek och placering av brunnarna, vilket ökar tjockleken på MFC PDMS). 3) MFC kan oåterkalleligen fästas på en platta (via plasmabindning) men kan också återvinnas flera gånger för att minska risken för kontaminering. 4) PDMS MPC är transparenta, vilket gör dem idealiska för levande bildbehandling genom att ha minskad bakgrund, vilket är avgörande för axonal transportanalyser där signal-till-buller-skillnad kan vara en begränsande faktor. 5) Ryggmärg explant kultur är mycket effektiv och snabb. En embryonal ryggmärg kan ge upp till 30 explants, tillräckligt för 10 MFC. Detta kan bidra till att spara tid och material, och säkerställer att även en gravid mus med få embryon kan producera ett framgångsrikt experiment. Se en detaljerad jämförelse av ryggmärgsexplant och dissocierad MN-kultur i tabell 4.
Detta protokoll är relativt enkelt och billigt. Det kräver dock expertis i flera tekniska frågor. Tillverkningen och hanteringen av MFC måste vara noggrann och skonsam, för att undvika strukturella defekter och skapande av luftbubblor i det obligatoriska vakuumsteget (1.1.10), till exempel. Under det valfria vakuumsteget (1.6.2) är det viktigt att rensa all luft, annars blockerar den axonalkorsningen, men också håller vakuumet kort för att undvika att MFC lossnar från glaset. Var uppmärksam på dissekering protokoll steg, eftersom det är viktigt att korrekt ta bort hjärnhinnor och horn, samt att försöka skära bitarna till rätt storlek för att infoga dem till MFC grotta utan att använda fysiskt våld. Varje överdriven fysisk kraft som appliceras på MFC kan enkelt lossa spåren eller hela MFC, vilket innebär att proceduren bör göras försiktigt. Odling av MNs och plätering dem i MFC måste vara relativt snabb, som MNs tenderar att aggregera och förlora lönsamhet snabbt under stressförhållanden såsom den låga medelhöga volymen av plätering steg. Plätering i MFC bör göras i låg volym för att möjliggöra korrekt fastsättning av nervceller i MFC-kanalen, och efter inte mer än 30 min värmde medium bör läggas mycket försiktigt för att förhindra avlossning av MNs.
Efter flera dagar i kultur, och när axoner har utvidgats till den distala facket, kulturerna är redo att genomgå organell färgning följt av förvärv av axonal transport filmer och slutligen ett specifikt förfarande för bildanalys. Analysen kan utföras antingen genom enkel partikelspårning över tid eller genom att använda en automatiserad eller halvautomatiserad spårningsalgoritm. Enligt vår erfarenhet är automatiserade metoder mindre tidskrävande, men har flera nackdelar. Främst minskar automatiserad spårningstillförlitlighet, med trånga axoner som korsar vägar. Dessutom har automatiserade algoritmer en minskad förmåga att skilja mellan överlappande partiklar. Följaktligen rekommenderas manuell eller halvautomatad spårning. I allmänhet är halvautomatad spårning att föredra eftersom det är mindre tidskrävande, men manuell spårning kan vara ett bra alternativ när det inte finns någon tillgänglig betald programvara. En grundlig jämförelse mellan manuell och automatisk analys finns i Gluska et al.9.
Sammanfattningsvis kan anta detta enkla protokoll ger viktiga data för studier av axonal transport av olika cellulära komponenter. Det kan anpassas för att passa en mångfald av bildframställning och neuronala subtyper, samt till cocultures av nervceller med andra celler. Det tillåter också distinkt rumslig farmakologisk manipulation av antingen cellkroppar eller axoner för att förstå grundläggande mekanismer för neuronal hälsa och för att förbättra läkemedelsutveckling för sjukdomar med förändrad axonal transport.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Israel Science Foundation (ISF, 561/11) och Europeiska forskningsrådet (ERC, 309377).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
