Summary
Axonal transport er en avgjørende mekanisme for motor neuron helse. I denne protokollen gir vi en detaljert metode for sporing av aksonaltransport av sure rom og mitokondrier i motorneuronaksoner ved hjelp av mikrofluidiske kamre.
Abstract
Motorneuroner (MN) er svært polariserte celler med svært lange aksoner. Axonal transport er en avgjørende mekanisme for MN helse, bidrar til nevronal vekst, utvikling, og overlevelse. Vi beskriver en detaljert metode for bruk av mikrofluidiske kamre (MfCer) for sporing av aksonal transport av fluorescerende merkede organeller i MN-aksoner. Denne metoden er rask, relativt billig, og gjør det mulig å overvåke intracellulære signaler i rom og tid. Vi beskriver en trinnvis protokoll for: 1) Fabrikasjon av polydimethylsiloxane (PDMS) MfCer; 2) Plating av ventral ryggmarg eksplanter og MN dissosiert kultur i MfCer; 3) Merking av mitokondrier og sure rom etterfulgt av live confocal imagining; 4) Manuell og halvautomatisk aksonal transportanalyse. Til slutt viser vi en forskjell i transport av mitokondrier og sure rom av HB9::GFP ventral ryggmargutplante aksoner som et bevis på systemets gyldighet. Til sammen gir denne protokollen et effektivt verktøy for å studere aksonaltransport av ulike aksonale komponenter, samt en forenklet håndbok for MFC-bruk for å bidra til å oppdage romlige eksperimentelle muligheter.
Introduction
MN er svært polariserte celler med lange aksoner, og når opptil en meter lang hos voksne mennesker. Dette fenomenet skaper en kritisk utfordring for vedlikehold av MN-tilkobling og funksjon. Følgelig er MN-er avhengige av riktig transport av informasjon, organeller og materialer langs aksonene fra cellekroppen til synapse og tilbake. Ulike cellulære komponenter, som proteiner, RNA og organeller blir transportert regelmessig gjennom aksonene. Mitokondrier er viktige organeller som rutinemessig transporteres i MN. Mitokondrier er avgjørende for riktig aktivitet og funksjon av MN, ansvarlig for ATP-bestemmelse, kalsiumbufring og signalprosesser1,2. Aksonaltransport en mitokondrier er en godt studert prosess3,4. Interessant, feil i mitokondrietransport ble rapportert å være involvert i flere nevrodegenerative sykdommer og spesielt i MN sykdommer5. Sure rom tjener som et annet eksempel for iboende organeller som beveger seg langs MN-aksoner. Sure rom inkluderer lysosomer, endosomer, trans-Golgi apparat, og visse sekretoriske vesikler6. Defekter i aksonal transport av sure rom ble funnet i flere nevrodegenerative sykdommer samt7, og nyere papirer fremhever deres betydning i MN sykdommer8.
For å effektivt studere aksonal transport, mikrofluidiske kamre som skiller somatiske og aksonale rom er ofte brukt9,,10. De to betydelige fordelene med det mikrofluidiske systemet, og compartmentalization og isolering av aksoner, gjør det ideelt for studiet av subcellulære prosesser11. Den romlige separasjonen mellom nevronale cellelegemer og aksoner kan brukes til å manipulere de ekstracellulære miljøene i forskjellige nevronale rom (f.eks. aksoner vs. soma). Biokjemisk, nevronal vekst/degenerasjon, og immunofluorescens analyser er alle fordeler fra denne plattformen. MfCer kan også hjelpe til med å studere celle-til-celle-kommunikasjon ved å coculturing nevroner med andre celletyper, for eksempel skjelettmuskler12,,13,14.
Her beskriver vi en enkel, men presis protokoll for overvåking av mitokondrier og sur romtransport i motornevroner. Vi viser videre bruken av denne metoden ved å sammenligne den relative prosentandelen av retrograd og anterograde bevegelige organeller, samt fordelingen av transporthastighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Omsorg og behandling av dyr i denne protokollen ble utført under tilsyn og godkjenning av Tel Aviv University Committee for Animal Ethics.
1. MFC forberedelse
- PDMS støping i primære former (Figur 1)
- Kjøp eller opprett primære former (wafers) etter en detaljert protokoll9.
- Bruk trykkluft for å fjerne alle typer smuss fra wafer-plattformen før du går videre til beleggtrinnet. Overflaten av wafers bør se glatt og klar.
- Fyll en beholder med 50 ml flytende nitrogen. Forbered en 10 ml sprøyte og 23 G kanyle.
MERK: Alle prosedyrer fra dette trinnet fremover må utføres i en kjemisk hette. - I den kjemiske hetten, bruk sprøyten og nålen til å samle 2 ml flytende nitrogen. Selv om det kan virke som luft ble trukket, er sprøyten fylt med nitrogen (Figur 1A). Plasser den waferholdige platen i en forseglet beholder.
- Skru en klortylacetilaneflaske, stikk hull i gummihetten ved hjelp av den nitrogenfylte sprøyten, og injiser hele innholdet i sprøyten i flasken. Uten å trekke ut nålen, snu flasken opp ned og trekke tilbake 2 ml kloretemetylsilane.
MERK: På grunn av sprøytetrykket sprøytesprøytes en liten mengde kloretemetylsilane sprøytes ut av nålen. For å unngå fare, pek nålen mot den indre veggen av hetten (Figur 1B). - Spreklortrimetylsilane jevnt i beholderen (fra trinn 1.1.4), men ikke direkte på wafer- eller wafer-holdige plate. Lukk beholderen og inkuber i 5 min per wafer.
MERK: Hvis dette er første gang waferen er belagt med klorotrimetylsilane, bør en 1 h inkubasjon tillates for hver wafer. - Ikke ta wafers og beholder ut av den kjemiske hetten i 30 min.
FORSIKTIG: Klorotrimetylsilane er svært flyktig. - Vei PDMS-basen (se materialtabellen) i et 50 ml rør og legg til PDMS-herdingsmiddel med et forhold på henholdsvis 16:1 (f.eks. 47,05 g base og 2,95 g herdingsmiddel). Bland i 10 minutter ved hjelp av en lav hastighet rotator.
- Hell PDMS i hver wafer-holdige plate til ønsket høyde (figur 1C).
MERK: Bruk av tynne mikrofluidiske kamre (opptil 3-4 mm) forbedrer tilslutningen til kulturfatet og forhindrer lekkasje. - Plasser alle platene sammen inne i en vakuumtørkemiddel i 2 timer (Figur 1E). Denne prosessen fjerner luften fanget i PDMS, og eliminerer dermed luftbobler og danner en klar, jevn form.
- Plasser platene i ovnen i 3 timer (eller over natten) ved 70 °C (figur 1E).
MERK: Platene skal være flate når de plasseres i ovnen.
- PDMS støping i epoxy former
MERK: Fordi wafer forberedelse er dyrt, krever spesialutstyr, og kan skade de skjøre wafers, er det mulig å generere epoxy kopier av wafers. Kopiene er billigere, mer holdbare, og kan brukes til masseproduksjon av mikrofluidiske kamre.- Kast og kurere PDMS (som beskrevet i 1.1.8-1.1.11) inn i den opprinnelige wafer.
- Fjern og kutt av overstore deler av PDMS og la bare de mikrofluidiske elementene og funksjonsområdet som kreves for behandling av dem i mikrofluidiske kamre.
- Pakk umiddelbart PDMS med tykt, klebrig tape for å hindre at det samler støv.
- Velg en vevkulturklasse plastfat som passer til hele PDMS inne og la rom for epoksy rundt den. Avstanden fra PDMS til plastfatet bør være mindre enn 5 mm.
- Forbered en liten mengde PDMS blandet i et forhold på 10:1 (base:herdingagent). Den friske flytende PDMS vil bli brukt til å lime den faste PDMS på bunnen av plastplaten.
- Påfør en minimal mengde av den flytende PDMS til midtbunnen av plastplaten og fjern deretter klebrig tape fra PDMS og fest den til plastparabolbunnen. Pass på at mikrofluidiske elementer vender oppover.
- La PDMS kur i 30 min i en 70 °C ovn.
- Forbered epoksyharpiksen ved å blande basen og herdingsmiddelet i et forhold på henholdsvis 100:45 i et reagensrør. Ulike epoxy harpikser kan ha forskjellige blandeforhold. Det nødvendige volumet for en vanlig 100 mm plate er ca. 40 ml.
- La epoxy blande godt i 10 min i en rotator til blandingen blir synlig homogen (dvs. det er ingen synlige fiberlignende gjenstander i væsken).
- Sentrifuge epoxy blandingen på 400 x g i 5 min for å fjerne luftbobler fanget inne.
- Under sentrifugering spredte du et tynt lag med silikonfett rundt veggene og alle andre eksponerte plastdeler av kulturretten. Dette vil hindre epoxy fra polymerisering med parabolen plast og vil muliggjøre fjerning av herdet epoxy lett på slutten av protokollen.
- Hell epoxy sakte inn i parabolen til den helt dekker PDMS og går utover det med minst 5 mm. Unngå dannelse av bobler i epoxy ved å holde null avstand mellom røret og platen. Plasser platen på et sikkert sted slik at den ikke flyttes for de neste 48 t.
- Etter 48 timer skal epoxy en helt herdet. Sett platen inn i en forvarmet ovn ved 80 °C i 3 timer for endelig herding.
- Fjern den herdede epoxyen fra platen og den originale PDMS-formen ved å forsiktig trekke plastveggen på platen til den bryter. Det bør da lett skille fra epoxy og skrelle av.
- Når den er ekstrahert, tørk det gjenværende fettet av den nye epoxy-replikaen og innfelt den opp ned (dvs. med de replikerte mikrofluidiske elementene vendt opp) i en ny kulturrett. Epoxy kopien er nå klar for PDMS støping.
- Bruk trykkluft eller N2 til å blåse eventuelle rester av PDMS eller smuss av epoxy mold og skyll den 2x med isopropanol. Fyll den en tredje gang og inkuber i 10 minutter på en orbital shaker plate. Skyll formen igjen 3x med isopropanol og kast den gjenværende væsken. Føn med luft eller N2 eller legg i ovnen 70 °C til den er tørr.
MERK: Følg sikkerhetsprosedyrene når du arbeider med og kaster isopropanol. - Hold muggplatene lukket til støping. Følg trinn 1.1.8.-1.1.11.
- Punching og sculpting PDMS i en MFC (Figur 2)
- Klipp og fjern PDMS-formen fra platen ved å følge (+) merkene på wafers ved hjelp av en skalpell. Ikke bruk makt, da formene er skjøre (figur 2A).
- Følg instruksjonene som er tegnet på skissen for å slå og kutte kamrene avhengig av det eksperimentelle oppsettet (Figur 2B-F).
- For ryggmargsutplantekultur (Figur 2C,E), punch to 7 mm brønner i distale siden av en stor MFC. Finn brønnene på en måte som de vil overlappe med kanalkantene. På den proksimale siden, slå en 7 mm brønn i midten av kanalen, med minimal overlapping slik at tilstrekkelig plass vil bli igjen for plantene. Punch to ekstra 1 mm hull i de to kantene av den proksimale kanalen. Snu MFC med mikrofluidiske elementer vendt oppover, og ved hjelp av en 20 G nål, skjære tre små explant grotter på punched 7 mm godt.
- For dissosiert MN kultur (Figur 2D, F), punch fire 6 mm brønner i kantene av de to kanalene i en liten MFC.
- Sterilisering av MFC for bruk av vevskultur
- Spre sidinavisten på benken. Trykk og trekk tilbake kammeret for å møte klebrig tape (både øvre og nedre ansikter) og fjern råoljesmuss. Plasser de rene kamrene i en ny 15 cm plate.
MERK: Ikke trykk direkte på mikrofluidiske elementer når disse vender oppover. - Inkuber kamrene i analytisk grad 70% etanol i 10 minutter på en orbital shaker.
- Kast etanol og tørk kamrene i en vevskulturhette eller i en ovn ved 70 °C.
- Spre sidinavisten på benken. Trykk og trekk tilbake kammeret for å møte klebrig tape (både øvre og nedre ansikter) og fjern råoljesmuss. Plasser de rene kamrene i en ny 15 cm plate.
- Plassere MFC på en glassbunnsfat
- Plasser kammeret i midten av en vevskultur klasse 35 mm / 50 mm glass bunnfat og påfør mindre kraft på kantene for å gjøre PDMS og parabolen bunnbinde. For å unngå å bryte glassbunnen, bruk alltid kraft på toppen av en solid overflate.
- Inkuber 10 min i 70 °C. Trykk på kamrene for å styrke tilslutningen til platen.
- Inkuber under UV-lys i 10 min.
- Belegg og kuling
- Tilsett 1,5 ng/ml poly-L-ornithine (PLO) i begge rommene. Kontroller at PLO kjører gjennom kanalene ved å sende belegget med et par ganger direkte i kanalinngangen.
- Undersøk mikrofluidisk kammer under et lett mikroskop med 10x forstørrelse for å se etter tilstedeværelse av luftbobler. Hvis luftbobler blokkerer mikrosporene, plasserer du MFC i en vakuumtørkesator i 2 min. Senere, fjern overflødig luft som ble fanget i kanalene ved å pipetting belegget media gjennom dem. Inkuber over natten.
- Erstatt PLO med laminin (3 μg/ml i DDW) for overnattinginkubasjon på samme måte.
- Før plating, vask laminin med nevronal kultur medium.
2. Nevronal kultur plating
- Dissosiert motor neuron kultur
- Ved hjelp av rett saks og fine tang, dissekere en ryggmarg ut av et E12.5 ICR-HB9::GFP-museembryo. Strikk i en 1X HBSS-oppløsning med 1 % penicillin-streptomycin (P/S) (figur 3A-C).
- Bruk mikrodisseksjonsaks, fjern meningene og dorsalhornene (Figur 3D).
- Samle ryggmargsdelene og overfør til rør(#1) med 1 ml HBSS + 1 % p/s.
- Skjær ryggmargene i små biter ved hjelp av buet saks og vent på at bitene skal bosette seg.
- Tilsett 10 μL trypsin 2,5% og plasser i et 37 °C vannbad i 10 min. Etter 5 min, bland ved å trykke på røret. Brikkene skal danne en helix-lignende klump.
- Overfør klumpen til et nytt rør (#2) som inneholder 800 μL av førvormed L-15, 100 μL BSA 4 %og 100 μL på 10 mg/ml DNase. Grind 2x, og vent deretter i 2 min for å la uomsosierte stykker bosette seg. Overfør supernatanten til et nytt rør (#3).
- Tilsett 100 μL BSA 4%, 20 μL av 10 mg/ml DNase og 900 μL komplett nevrobasalmedium (CNB, se materialtabell og tabell 1). Grind 8x og vent 2 min. Samle supernatant til tube #3.
- Gjenta trinn 2.1.7 og slip 10x. Samle supernatant til tube #3. En liten mengde vev bør stå på bunnen av røret.
MERK: Hvis en stor klump fortsatt forblir nederst på røret #2, gjentar du trinn 2.1.8. - Tilsett 1 ml BSA 4% pute til bunnen av røret #3.
- Sentrifuge på 400 x g i 5 min. Kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten igjen ved å trykke forsiktig på røret, og tilsett deretter 1 ml CNB-medium. Pipette 6x og tilsett 20 μL av 10 mg/ml DNase.
- Tillegg med ytterligere 5 ml CNB medium og overføre 3 ml til et nytt rør(#4).
- Tilsett 1 ml 10,4 % graderingsmedium for tetthet (se tabell 2) nederst på hvert rør (#3 og #4). Det skal vises en skarp faseseparasjon mellom de to grensesnittene.
- Sentrifuge ved 775 x g i 20 min ved romtemperatur (RT). Sentrifugeretardasjon bør settes til et lavt nivå for å unngå nedbrytning av faseseparasjonen.
- Celler skal flyte, vises som en overskyet interphase mellom media. Samle cellene fra begge rørene i et nytt rør(#5) som allerede inneholder førvarmet 1 ml CNB-medium.
- Legg til ytterligere 4-6 ml CNB-medium.
- Tilsett 1 ml BSA 4% pute til bunnen av røret.
- Sentrifuge på 400 x g i 5 min ved RT. Kast supernatanten og resuspend pelletforsiktig med 1 ml CNB medium.
- Tell cellene. Det forventes en avkastning på 0,75-1 x 106 MN per ryggmarg.
MERK: Ventral ryggmarg inneholder også andre nevronale undertyper i tillegg til motornevroner (f.eks. interneuroner). MN renhet avhenger hovedsakelig av fjerning av dorsalområder under disseksjon og evnen til å nå MN beriket rostral områder. For å sikre at de avbildede nevronene er MN-er, anbefales bruk av musstamme med en endogen MN-markør, for eksempel HB9::GFP-mus. For å oppnå ren MN-kultur (men med redusert celleutbytte), er bruk av FACS rensing15 mulig. - Plating dissosiert MN kultur i MFC
- Konsentrat 150.000 MN per kammer ved sentrifuging på 400 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspendcellene forsiktig i rikt nevrobasalmedium (RNB) ved 4 μL per MFC. RNB er CNB supplert med ytterligere 2% B27 og 25 ng/ ml BDNF.
- Fjern mediet fra begge rommene, og la et lavt volum tilsvarende ~ 10 μL i brønnene i det distale rommet. Det ser ut som en tynn ring av medium i brønnen omkretsen.
- Last sakte 4 μL celler inn i kanalen. Ta ut 4 μL av brønnen i den andre siden av kanalen, og sakte laste dem tilbake direkte inn i kanalen for å reversere gjeldende flyt og maksimere celletettheten i kanalen.
- Kontroller at cellene har kommet inn i kanalen ved hjelp av et 10x lysmikroskop og plasser kammeret i inkubatoren i 30 minutter uten å legge til flere medier.
- Tilsett sakte ~ 10-15 μL RNB i de proksimale og distale brønnene og plasser kamrene i inkubatoren i ytterligere 15 min.
- Etter denne inkubasjonen, legg sakte ~ 75-80 μL av RNB i hver brønn.
- Dissosiert MN kultur vedlikehold
- En dag etter plating (DIV1), erstatte medium med RNB supplert med 1 μM cytosin arabinoside (Ara-C) for å hemme glial vekst.
- To dager etter Ara-C-applikasjon (DIV3) erstattes medium med frisk CNB-medium i det proksimale rommet (uten Ara-C).
- For å forbedre kryssing av aksoner gjennom mikrosporene, bruk RNB supplert med 25 ng/ml glial celleavledet nevrotrofisk faktor (GDNF) og 25 ng/ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) bare til det distale rommet. Oppretthold en volumgradient på minst 10 μL per brønn mellom aksonale distale brønner (høyere volum) og de proksimale brønnene.
- Oppdater mediet annenhver dag. Det kan ta aksonene opptil 4-6 dager å krysse distally.
- Ryggmargsutplantekultur
- Ved hjelp av rett saks og fine tang, dissekere en ryggmarg ut av et E12.5 ICR-HB9::GFP-museembryo. Strikk i en 1X HBSS-oppløsning med 1 % penicillin-streptomycin (P/S) (figur 3A-C).
- Bruk mikrodisseksjonsaks, fjern meningene og dorsalhornene (Figur 3D).
- Skjær ryggmargen i 1 mm tykke tverrgående seksjoner (Figur 3E). Kast alt medium fra det proksimale rommet på MFC.
- Plukk opp en enkelt ryggmargsutplant med en pipette i et totalt volum på 4 μL. Injiser eksplanten så nært som mulig til hulen og trekk ut eventuell overdreven væske fra den proksimale brønnen via sideuttakene (1 mm slag). Eksplantene skal suges inn i den proksimale kanalen.
- Tilsett langsomt 150 μL ryggmargsplantemedium (SCEX, se Material- og tabell 3)til den proksimale brønnen.
- Ryggmargen utplante kultur vedlikehold
- Legg Til SCEX-medium i det proksimale rommet og rikt SCEX-medium (SCEX med 50 ng/ml BDNF og GDNF) i det distale rommet. Oppretthold en volumgradient på minst 15 μL per brønn mellom de distale brønnene (høyere volum) og den proksimale brønnen.
- Oppdater mediet annenhver dag. Det kan ta aksonene opptil 3-5 dager å krysse distally.
3. Aksonal transport (Figur 4A)
- Merking av mitokondrier og sure rom
- Forbered fersk SCEX medium (eller CNB for dissosiert MN) som inneholder 100 nM Mitotracker Deep Red FM og 100 nM LysoTracker Red. Inkuber i 30-60 min ved 37 °C. Andre farger kan brukes så lenge deres fluorophores ikke overlapper.
- Vask 3x med varmt CNB/SCEX-medium. Platene er klare for bildebehandling.
- Live bildebehandling
- Erverve 100 time-lapse bildeserie av aksonal transport med 3 s intervaller, med totalt 5 min per film.
MERK: Bildesystemet som ble brukt i denne studien inkluderte et invertert mikroskop utstyrt med roterende platekonfokal, kontrollert via proprietær celleavbildningsprogramvare, 60x oljelinse, NA = 1.4 og et EMCCD-kamera. Filmer ble kjøpt i et kontrollert miljø ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: Lengre eller kortere tidsforløpsfilmer kan avbildes, avhengig av eksperimentet. Selv over natten filmer kan tas opp om nødvendig. Det er imidlertid avgjørende å prøve å redusere eksponeringstid og laserkraft, samt antall totale bilder, for å redusere fototoksisitet og bleking under filmoppkjøp.
- Erverve 100 time-lapse bildeserie av aksonal transport med 3 s intervaller, med totalt 5 min per film.
4. Bildeanalyse (Figur 4-5)
- Analyse av partikkeltransportdistribusjon og tetthet ved hjelp av kymograph analyse
- Åpne filen i FIJI. Separate kanaler som trykker på Bilde | Stabler | Verktøy | Deinterleave.
- Angi bildeegenskaper ved å trykke bilde | Egenskaper.
- Velg segmented linjeverktøyet ved å høyreklikke linjeikonet. Sett Bredde til 8-10 ved å dobbeltklikke på linjeikonet. Vær i samsvar med samme linjebredde gjennom hele analysen.
- Merk en segmentert linje etter aksonbanen fra distale til proksimal. Dobbeltklikk for å stoppe linjemerkingen.
- Klikk t for å legge til et nytt linjeområde av interesse (ROI) i ROI Manager. Legg til dette i en regnearkanalysetabell.
- Klikk m for å måle området og lengden på aksonen. Legg til dette i analysetabellen.
- Generer en kymograph ved å klikke plugins | KymoToolBox | Tegn Kymo. Alternativt kan andre kymograph generasjon plugins tilgjengelig brukes.
- Telle bevegelige (retrograd eller anterograde) og ikke-bevegelige partikler manuelt og legge dem til i tabellen i riktig kolonne.
MERK: Partikler klassifiseres som bevegelige anterograde (dvs. flytting til venstre i kymografen) eller retrograd (dvs. flytte til høyre) hvis deres forskyvning er høyere enn 10 μm i bestemt retning. Det er mulig å måle forskyvningen bare ved å markere en horisontal linje med linjeikonet og trykke m. Immobile partikler eller de som ikke oppfyller forskyvningskriteriene, defineres som ikke-bevegelige (figur 4B).
- Enkel partikkelsporing: Manuell sporing
- Last ned manuell sporing plugin for FIJI programvare (utviklet av Fabrice P. Cordelière) fra http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
- Åpne filen i FIJI/ImageJ. Bruk alternativet Roter til å justere MFC-sporene horisontalt.
- Hvis du vil forbedre signal-til-støy-forholdet om nødvendig, klikker du på Prosess | Trekk fra bakgrunn.
- Åpne plugin-modulen Manuell sporing. Angi parametrene (f.eks. pikselstørrelse, tidsintervall osv.) i henhold til det spesifikke mikroskopet som brukes til bildebehandling. For resultatene som ble vist her, var mikroskopet og objektivet forholdet 0,239 μm/piksel, og rammeintervallet var 3 s.
- Få tak i sporene X- og Y-koordinatene og lagre resultatene ved å kopiere teksten til regnearket.
- Analyser filmer med flere kanaler ved å klikke bilde | Farge | Slå sammen kanaler for å slå sammen kanalene og deretter spore bare kolokalisert punktspill.
- Enkelt partikkelsporing: Halvautomatisk sporing (Figur 5)
- Åpne analyseprogramvaren. Denne studien brukte Bitplane Imaris programvare versjon 8.4.1.
- Bytt til Overgå i toppmenyen.
- Klikk på Bildebehandling | Bytt tid og Z | Ok.
- Klikk på Rediger | Bildeegenskaper (Ctrl+I) | Geometri | Voxel Størrelse Rad. Angi bildeegenskaper i henhold til mikroskopioppsettet som brukes.
MERK: For dataene som vises her, var mikroskopet og objektivforholdet 0,239 μm/piksel. - Klikk All Like fjern, og endre tidsintervallet. Bruk for eksempel 3 s som intervall. Klikk Tilbakestill-knappen nederst til høyre, eller klikk Ctrl+B.
- Legg til et lag med flekker øverst til venstre ved å klikke på et ikon med små gule flekker. Nederst til venstre åpnes en ny meny for redigering av flekker.
- Trykk på høyre blå pil til spotgjenkjenningen starter.
MERK: Det er viktig å filtrere ut noen av prikkene ved hjelp av filteret nederst til venstre i vinduet. Kontroller filmen noen ganger for å se at et tilstrekkelig antall prikker er valgt. - Kontroller eller konfigurer parameterne slik at de passer til de eksperimentelle behovene. For eksempel, Max Distance = 12 μm (Den maksimale tillatte avstanden mellom to forskjellige flekker for å fortsatt inkludere dem i samme enkelt spor); Maks gapstørrelse = 1 (antall rammer som et spor har lov til å gå glipp av og fortsatt betraktes som ett spor).
- Klikk Innstillinger og deretter Spor stil = Av, Poeng = Sfære.
- Bruk filterlinjentil å velge forskjellige filtre for justering. I dataene som er oppgitt her, fjernet for eksempel Spor varighet = 9 alle spor med færre enn 3 bilder. Når alle parameterne er angitt, klikker du høyre grønn pil. Videre redigering er ikke mulig etter dette trinnet.
- Klikk på Liten blyant med prikker for å redigere alle sporene manuelt.
- Vis filmen (Figur 5B). Hvis det oppstår en feil, finnes det flere mulige alternativer:
- Hvis du vil koble fra et spor, klikker du alternativet Objekt og velger de to stedene som må kobles fra holding Ctrl, og velger Koble fra.
- Hvis du vil koble til et spor, klikker du alternativet Objekt, velger de to flekkene som må kobles til, og velger Koble til.
- Hvis du vil slette et sporTrack/Objecteller et punkt, bytter du til skjermen med ikonet for vanlig blyant med vanlig blyant,og velger Slett.
- Hvis du vil legge til flekker manuelt, bytter du til skjermbildet vanlig blyantikon. Nederst på skjermen er det et manuelt sporingsmerke. Kontroller at avmerkingsboksen Automatisk tilkobling er V. Hold nede Skift-knappen og Venstreklikki selve filmen for å legge til et sted.
- Hvis du vil legge til et sted i et eksisterende spor, velger du et ønsket spor (gult) og ramme, bytter til skjermbildet vanlig blyantikon og legger til et sted manuelt. Når hele filmen er ferdig, bytter du til ikonet som ser ut som en rød graf (statistikk). Det er mulig å redigere de analyserte parametrene senere. Hvis du vil redigere, trykker du på det svenske tasteikonetnederst til venstre på skjermen . For eksempel: Posisjon X, Posisjon Y.
- Trykk på ikonet som ser ut som flere disketter, eksporter all statistikk.
MERK: Regnearkutdataene kan enten håndteres direkte eller analyseres ytterligere ved hjelp av den publiserte koden9 som brukes til denne analysen, som vil bli delt ved behov. Følgende parametere hentes ut fra analysen: Hastighet, Sporforskyvning, Kjørelengde, Hastighet (inkludert retningslinje), Stopptelling, Gjennomsnittlig stoppvarighet, Alfa, Retningsendringer og Øyeblikkelig hastighet. En detaljert forklaring av hver parameter er beskrevet i Gluska et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter den beskrevne protokollen ble musembryonale HB9::GFP ryggmargsutplanter dyrket i MFC (Figur 4A). Explants ble dyrket i 7 dager, da aksoner fullt krysset inn i det distale rommet. Mitotracker Deep Red og Lysotracker Red fargestoffer ble lagt til distale og proksimale rom for å merke mitokondrier og sure rom (Figur 4C). Axons i distale spor ble avbildet, og filmene ble analysert som følger: Først sammenlignet vi den generelle bevegelsesfordelingen ved hjelp av kymograph analyse (Figur 4B, D). Denne analysen viste en skjevhet i retrograd retning bare i sure rom (nonmoving = 77,1 ± 9,5%; retrograd = 16,9 ± 8,3%, anterograde = 6 ± 5%; Figur 4E) men ikke i mitokondrietransport (ikke-bevegelig = 83,4 ± 6,8 %; retrograd = 10,5 ± 6,9 %; anterograde = 6,8 ± 5,1 %; Figur 4F). Kymograph analyse ble brukt til å kvantifisere partikkeltettheten, avslører et høyere antall mitokondriepartikler sammenlignet med sure rom i HB9::GFP ryggmargsplanteaksoner (Mitokondrier = 0,46 ± 0,13; Sure rom = 0,3 ± 0,07 partikler/μm akson, figur 4G).
Deretter ble enkelt partikkeltransportanalyse utført ved hjelp av halvautomatisk programvare etterfulgt av intern kode (Figur 5A-B). Denne analysen viste at til tross for å ha lignende partikkelhastighet generelt (Figur 5C), når du observerer fordelingen av hastigheter (Figur 5D) bare sure rom, men ikke mitokondrier viste en skjevhet mot retrograd bevegelse.
Figur 1: Silikon mold forberedelse. Skjematisk tegning som beskriver prosedyren for klorotrimetylsilane wafer rensing. (A) Først ble 50 ml flytende nitrogen tilsatt til en passende beholder. Arbeid i en kjemisk hette, en sprøyte og nål ble brukt til å tegne 8 ml flytende nitrogen. Hele innholdet i sprøyten ble injisert i kloretemetylsilaneflasken. Flasken ble slått med hetten vendt ned og 8 ml kloretemetylsilane ble trukket tilbake. (B) Kloretretylsilane spredt i beholderen (ikke direkte på wafer). Beholderen må lukkes, etterfulgt av 5 min inkubasjon for hver mugg. (C) Flytende PDMS ble strømmet inn i hver wafer opp til ønsket høyde. (D) Alle platene ble plassert sammen inne i en vakuumtørkeovn i 2 timer, etterfulgt av 3 h-over natten i en 70 °C ovn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MFC spesialisert design. (A) Polymerisert PDMS mal tatt ut av formen ved hjelp av en metall skalpell. (B) Avhengig av eksperimentelt oppsett ble enten 6 mm, 7 mm eller 1 mm punchers brukt til å slå PDMS-malene. (C) For eksplantkultur i MFC ble det brukt 7 mm og 1 mm punchers, og en 20 G sprøyte ble benyttet for å lage "grotter" for enkel utgraving. (D) For dissosiert MN kultur MFC, en 6 mm puncher ble brukt til å lage fire brønner på kanalkantene. - Jeg har ikke noe åsi. Illustrasjoner av de endelige MFC-figurene som er beskrevet i henholdsvis C og D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Nevronal kultur. (A) E12.5 mus embryo ble plassert i posisjon etter at hodet, halen, og huden ble fjernet for å utsette nevrale røret. (B) Disseksjon av hele ryggmargen. (C) Ved hjelp av milde tang ble meningene skrelles bort fra ryggmargen. (D) Venstre panel: Fjerning av ryggmargen sidesegmenter fra ventralryggmargen for å gi bedre MN rensing. Høyre panel: Representativt bilde av dissosiert MN kultur i MFC. HB9::GFP-aksoner krysset til det distale rommet (grønn). Hoechst flekker indikerer nevronale kjerner (blå). (E) Ryggmargsutplanter generert ved dissekering av 1 mm tykke tverrgående deler av ventralryggmargen. Representativt bilde av HB9::GFP (grønn) ryggmargsutplantaksoner i en MFC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Aksonal transport av mitokondrier og surt rom i MN. (A) Illustrasjon av aksonal transport essay. Lysotracker Red og Mitotracker Deep Red ble lagt til både de proksimale og distale rommene i MFC, som inneholder HB9::GFP ventral ryggmargsutplant. (B) Kymograph analyse. Bevegelige partikler ble definert som bevegelig anterograd eller retrograd etter forskyvning på mer enn 10 μm i den retningen. Roterende eller immobile partikler ble regnet som ikke-bevegelige. Skala bar = 10 μm. (C) Første bilde av en time-lapse film som viser primære HB9::GFP mus ryggmargen explant aksoner fargelagt med Lysotracker rød å tagge sure rom og Mitotracker Deep Red å tagg mitokondrier. Skalastang = 10 μm. (D) Representative kymographs som viser en typisk aksonal bevegelse av sure rom og mitokondrier. Skala bar = 10 μm. (E) Kymograph analyse av mitokondrie aksonal transport, ****p < 0.0001, Anova med Holm-Sidak korreksjon (n = 77 aksoner). Skalabar = 10 μm (F) Kymograph analyse av sur trom aksonal transport, ** p < 0,01, ****p < 0,0001, Anova med Holm-Sidak korreksjon (n = 77 aksoner). (G) Axonal partikkel tetthet analyse av mitokondrier og sure rom, ****p < 0,0001, Studentens t-test (n = 77 aksoner). Feilfelt representerer verdier med SD. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Halvautomatisk enkeltpartikkelanalyse for å måle organellehastighet. (A) Skjematisk arbeidsflyt for halvautomatisert enkeltpartikkeltransportanalyse. (B) Ventral ryggmargsplanteaksoner ble analysert for enkelt partikkelsporing. Analyseprogramvaren er i stand til å spore enkelt aksonale partikler i tidsforløpsfilmer, som angitt for mitokondrier (gule prikker, øvre panel) og sure rom (grønne prikker, nedre panel). (C) Den gjennomsnittlige hastigheten endret seg ikke mellom mitokondrier og sure rom, Mann Whitney test (n = 417 mitokondrier, n = 371 sure rom). Feilfelt representerer verdier med SD. (D) Fordeling av mitokondrie- og sure rom retrograd og anterograde hastigheter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komplett Neurobasal Medium – for 50ml | ||
| Ingrediensen | Volum | Konsentrasjon |
| Neurobasal (nær Neurobasal) | 47 ml | |
| B27 (andre er i seg selv) | 1 ml | 2% |
| Hest serum | 1 ml | 2% |
| P /S (andre sidene) | 0,5 ml | 1% |
| L-Glutamin (Glutamax) | 0,5 ml | 1% |
| Beta-Merkaptoetanol (50mM) | 25 μL (25 μL) | 25μM (andre er i seg selv) |
| BDNF (10ug/ml) | 5 μL (5 μL) | 1ng/ml |
| GDNF (10ug/ml) | 5 μL (5 μL) | 1ng/ml |
| Cntf (10ug/ml) | 2,5 μL | 0,5 ng/ml |
Tabell 1: Oppskrift på fremstilling av komplett nevrobasal (CNB)-løsning.
| Optiprep Løsning – for 10ml | ||
| Ingrediensen | Volum | Konsentrasjon |
| DDW (andre er i seg selv | 5,27 ml | |
| Tetthet Gradient Medium (Optiprep) 60% | 1,73 ml | 10,4 % (m/v) |
| Tricine 100mM | 1 ml | 2% |
| Glukose 20 % (m/v) | 2 ml | 2% |
Tabell 2: Oppskrift på tilberedning av tetthetgradientmediumløsning.
| Ryggmargen Explant Medium (SCX) – for 20ml | ||
| Ingrediensen | Volum | Konsentrasjon |
| Neurobasal (nær Neurobasal) | 19,5 ml | |
| B27 (andre er i seg selv) | 200 μL (200 μL) | 2% |
| P /S (andre sidene) | 100 μL | 1% |
| L-Glutamin (Glutamax) | 100 μL | 1% |
| BDNF (andre er i norge) | 50 μL (50 μL) | 25ng/ml |
Tabell 3: Oppskrift på fremstilling av ryggmargsutplant (SCEX)-løsning.
| MN kultur | Ryggmargen Eksplanter |
| Lengre prosedyre før plating | Kort prosedyre – Disseker & Plate |
| Ekstra forsiktighet som er nødvendig for plating i MFC | Lettere å plate i MFC |
| Høy konsentrasjon av motoriske nevroner uten glialceller – mer nøyaktig | Tilstedeværelse av glialceller og andre nevronale typer – mer fysiologisk |
| Ubegrensede manipulasjonsmuligheter på både Soma og aksoner | Begrensede manipulasjonsmuligheter på cellelegemer |
| Enkel immunfarging for både cellelegemer og aksoner | Lav effektivitet under immunfarging av cellelegemer i eksplanten. |
| Høy effektivitet av virusinfeksjon | Svært lav effektivitet av virusinfeksjon |
Tabell 4: Sammenligning mellom ryggmargseksplanter og dissosiert MN-kultur basert på omkretser av hastighet, gjennomførbarhet, glial tilstedeværelse, manipulasjonsmuligheter, immunfarging og virusinfeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi et system for å spore aksonal transport av mitokondrier og sure rom i motoriske nevroner. Denne forenklede in vitro-plattformen tillater nøyaktig kontroll, overvåking og manipulering av subcellulære nevronale rom, noe som muliggjør eksperimentell analyse av motorneuron lokale funksjoner. Denne protokollen kan være nyttig for å studere MN sykdommer som ALS, for å fokusere på å forstå den underliggende mekanismen for aksonal transport dysfunksjon i sykdommen10,16. Videre kan dette systemet også brukes til å studere transport av trofiske faktorer9,,16,microRNA10,mRNA8,og merkede proteiner hos friske og syke MN-er eller i andre nevroner, for eksempel sensoriske9 eller sympatiske aksoner14. En lignende metode kan også brukes til å studere organelletransport i et kokultursystem, for eksempel MN dyrket med skjelettmuskelceller12 eller sympatiske nevroner cocultured med kardiomyocytter14. MFC-systemet kan benyttes til å generere aktive NMJs17,18 og studere effekten av synapsedannelse på aksonal transport16.
Denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med andre protokoller for kuling av nevroner i MFC og bruke live imaging for å analysere aksonal transport: 1) MfCer er kommersielt tilgjengelig av flere produsenter. Selvproduksjon av MfCene er imidlertid svært kostnadseffektiv sammenlignet med det kommersielle alternativet. En enkelt PDMS wafer gir fire store MfCer eller ni små på minimal bekostning av flere amerikanske dollar for PDMS harpiks selv. 2) De selvproduserte MfCene kan endres for å svare på spesifikke eksperimentelle behov (f.eks. endre størrelsen og plasseringen av brønnene, noe som øker tykkelsen på MFC PDMS). 3) MfCer kan være irreversibelt festet til en plate (via plasmaliming), men kan også resirkuleres flere ganger for å redusere muligheten for forurensning. 4) PDMS MFCer er gjennomsiktige, noe som gjør dem ideelle for live imaging ved å ha redusert bakgrunn, noe som er avgjørende for aksonal transport analyser der signal-til-støy-skillet kan være en begrensende faktor. 5) Ryggmargen explant kultur er svært effektiv og rask. En embryonisk ryggmarg kan gi opptil 30 eksplanter, nok til 10 MfCer. Dette kan bidra til å spare tid og materialer, og sikrer at selv en gravid mus med få embryoer kan produsere et vellykket eksperiment. Se en detaljert sammenligning av spinalmargsutplantog dissosiert MN-kultur i tabell 4.
Denne protokollen er relativt enkel og billig. Det krever imidlertid kompetanse i flere tekniske saker. Produksjon og håndtering av MFC må være nøyaktig og skånsom, for å unngå strukturelle defekter og opprettelse av luftbobler i det obligatoriske vakuumtrinnet (1.1.10), for eksempel. Under det valgfrie vakuumtrinnet (1.6.2) er det viktig å fjerne all luften, eller den vil blokkere aksonal kryssing, men også holde vakuumet kort for å unngå avløsning av MFC fra glasset. Vær oppmerksom på disseksjonsprotokollens trinn, da det er viktig å fjerne meninges og dorsal horn, samt å prøve å kutte brikkene til riktig størrelse for å sette dem inn i MFC hule uten å bruke fysisk kraft. Enhver overdreven fysisk kraft som påføres MFC kan enkelt løsne sporene eller hele MFC, og dermed prosedyren bør gjøres forsiktig. Kuling av MN og plating dem i MFC må være relativt rask, som MN har en tendens til å aggregere og miste levedyktighet raskt under stressforhold som det lave middels volumet av plating trinn. Plating i MFC bør gjøres i lavt volum for å tillate riktig feste av nevronene i MFC-kanalen, og etter ikke mer enn 30 min oppvarmet medium bør legges veldig forsiktig for å hindre løsrivelse av MN.
Etter flere dager i kulturen, og når aksoner har utvidet seg til det distale rommet, er kulturene klare til å gjennomgå organellefarging etterfulgt av oppkjøp av aksonale transportfilmer og til slutt en spesifikk prosedyre for bildeanalyse. Analysen kan utføres enten ved enkelt partikkelsporing over tid, eller ved hjelp av en automatisert eller halvautomatisk sporingsalgoritme. Etter vår erfaring er automatiserte metoder mindre tidkrevende, men har flere ulemper. Hovedsakelig reduseres automatisert sporingspålitelighet, med overfylte aksoner som krysser stier. Videre har automatiserte algoritmer en redusert evne til å skille mellom overlappende partikler. Det anbefales derfor å utføre manuell eller halvautomatisk sporing. Generelt er semiautomatisert sporing å foretrekke som det er mindre tidkrevende, men manuell sporing kan være et godt alternativ når det ikke er tilgjengelig betalt programvare. En grundig sammenligning mellom manuell og automatisk analyse finnes i Gluska et al.9.
Til slutt kan vedta denne enkle protokollen gi viktige data for studiet av aksonal transport av ulike cellulære komponenter. Det kan tilpasses for å passe et mangfold av bildeoppsett og nevronale undertyper, samt til kokulturer av nevroner med andre celler. Det tillater også distinkt romlig farmakologisk manipulering av enten cellelegemer eller aksoner for å forstå grunnleggende mekanismer for nevronal helse og for å forbedre narkotikautviklingen for sykdommer med endret aksonal transport.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Israel Science foundation (ISF, 561/11) og Det europeiske forskningsrådet (ERC, 309377).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
