Summary
Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van motorneuronen. In dit protocol bieden we een gedetailleerde methode voor het bijhouden van het axonale transport van zure compartimenten en mitochondriën in motorneuron axonen met behulp van microfluïdische kamers.
Abstract
Motorneuronen (MNs) zijn sterk gepolariseerde cellen met zeer lange axonen. Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van MN, bij te dragen aan neuronale groei, ontwikkeling en overleving. We beschrijven een gedetailleerde methode voor het gebruik van microfluïdische kamers (MPC's) voor het bijhouden van axonal transport van fluorescerend gelabelde organellen in MN axons. Deze methode is snel, relatief goedkoop, en zorgt voor de monitoring van intracellulaire signalen in ruimte en tijd. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor: 1) Fabricage van polydimethylsiloxane (PDMS) MFP's; 2) Plating van ventrale ruggenmergexplanten en MN gescheiden cultuur in MPC's; 3) Etikettering van mitochondriën en zure compartimenten, gevolgd door live confocale verbeelding; 4) Handmatige en semi-geautomatiseerde axonale transportanalyse. Ten slotte tonen we een verschil aan in het transport van mitochondriën en zure compartimenten van HB9::GFP ventrale ruggenmerg explant axonen als een bewijs van de geldigheid van het systeem. Al met al biedt dit protocol een efficiënt hulpmiddel voor het bestuderen van het axonale transport van verschillende axonale componenten, evenals een vereenvoudigde handleiding voor MFC-gebruik om ruimtelijke experimentele mogelijkheden te helpen ontdekken.
Introduction
MNs zijn sterk gepolariseerde cellen met lange axonen, die tot een meter lang zijn bij volwassen mensen. Dit fenomeen vormt een cruciale uitdaging voor het onderhoud van MN-connectiviteit en -functie. Bijgevolg zijn MN's afhankelijk van een goed transport van informatie, organellen en materialen langs de axonen van hun cellichaam naar de synaps en terug. Verschillende cellulaire componenten, zoals eiwitten, RNA en organellen worden regelmatig door de axonen geshuttled. Mitochondriën zijn belangrijke organellen die routinematig worden vervoerd in MNs. Mitochondriën zijn essentieel voor de juiste activiteit en functie van MN's, verantwoordelijk voor ATP-voorziening, calciumbuffering en signaleringsprocessen1,2. Het axonale transport van mitochondriën is een goed bestudeerd proces3,4. Interessant is dat defecten in mitochondriaal transport betrokken waren bij verschillende neurodegeneratieve ziekten en specifiek bij MN-ziekten5. Zure compartimenten dienen als een ander voorbeeld voor intrinsieke organellen die langs MN axonen bewegen. Zure compartimenten zijn lysosomen, endosomen, trans-Golgi apparaat, en bepaalde secretoire blaasjes6. Gebreken in het axonale transport van zure compartimenten werden gevonden in verschillende neurodegeneratieve ziekten en7, en recente papers benadrukken hun belang in MN ziekten8.
Om axonaal transport efficiënt te bestuderen, worden microfluïdische kamers die somatische en axonale compartimenten scheiden vaak9,10gebruikt. De twee belangrijke voordelen van het microfluïdische systeem, en de compartimentering en de isolatie van axonen, maken het ideaal voor de studie van subcellulaire processen11. De ruimtelijke scheiding tussen de neuronale cellichamen en axonen kan worden gebruikt om de extracellulaire omgevingen van verschillende neuronale compartimenten te manipuleren (bijvoorbeeld axonen versus soma). Biochemische, neuronale groei/ degeneratie, en immunofluorescentie testen profiteren allemaal van dit platform. MPC's kunnen ook helpen bij het bestuderen van cel-naar-cel communicatie door coculturing neuronen met andere celtypes, zoals skeletspieren12,13,14.
Hier beschrijven we een eenvoudig maar nauwkeurig protocol voor het monitoren van mitochondriën en zuur compartimenttransport in motorneuronen. We tonen verder het gebruik van deze methode door het relatieve percentage retrograde en anterograde bewegende organellen te vergelijken, evenals de verdeling van de transportsnelheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De verzorging en behandeling van dieren in dit protocol werd uitgevoerd onder toezicht en goedkeuring van het Universiteitscomité voor dierethiek van Tel Aviv.
1. Voorbereiding van het MFC
- PDMS gieten in primaire mallen (Figuur 1)
- Koop of maak primaire mallen (wafers) volgens een gedetailleerd protocol9.
- Gebruik lucht onder druk om elk type vuil van het waferplatform te verwijderen voordat u overgaat tot de coatingstap. Het oppervlak van de wafers moet er glad en helder uitzien.
- Vul een container met 50 mL vloeibare stikstof. Bereid een 10 mL spuit en 23 G naald.
LET OP: Alle procedures vanaf deze stap voorwaarts moeten worden uitgevoerd in een chemische kap. - In de chemische kap, gebruik maken van de spuit en naald te bundelen 2 mL vloeibare stikstof. Hoewel het lijkt alsof lucht werd getrokken, is de spuit gevuld met stikstof(figuur 1A). Plaats de waferbevattende plaat in een afsluitbare container.
- Schroef een chlorotrimethylsilane-fles open, doorboor de rubberen dop met de met stikstof gevulde spuit en injecteer de volledige inhoud van de spuit in de fles. Zonder de naald eruit te trekken, draait u de fles ondersteboven en trekt u 2 mL chlorotrimethylsilane terug.
OPMERKING: Vanwege de spuitdruk wordt een kleine hoeveelheid chloortrimethylsilane uit de naald gespoten. Om gevaar te voorkomen, richt u de naald naar de binnenwand van de kap(figuur 1B). - Verdeel chloortrimethylsilane gelijkmatig in de container (vanaf stap 1.1.4), maar niet rechtstreeks op de wafer- of waferbevattende plaat. Sluit de container en incubeer gedurende 5 min per wafer.
OPMERKING: Als dit de eerste keer is dat de wafer is bedekt met chlorotrimethylsilane, moet voor elke wafer een incubatie van 1 uur worden toegestaan. - Haal de wafers en de container niet 30 min uit de chemische kap.
LET OP: Chlorotrimethylsilane is zeer vluchtig. - Weeg de PDMS-basis (zie Materiaaltafel)in een buis van 50 mL en voeg PDMS-uithardingsmiddel toe met een verhouding van respectievelijk 16:1 (bijvoorbeeld 47,05 g basis en 2,95 g uithardingsmiddel). Meng gedurende 10 min met behulp van een lage snelheid rotator.
- Giet PDMS in elke wafer-bevattende plaat naar de gewenste hoogte(figuur 1C).
OPMERKING: Het gebruik van dunne microfluïdische kamers (tot 3-4 mm) verbetert de hechting aan de kweekschaal en voorkomt lekkage. - Plaats alle platen samen in een vacuümdroogcanor gedurende 2 uur (figuur 1E). Dit proces verwijdert de lucht gevangen in de PDMS, waardoor luchtbellen worden geëlimineerd en een duidelijke, uniforme mal wordt gevormd.
- Plaats de platen in een oven voor 3 uur (of 's nachts) op 70 °C (Figuur 1E).
LET OP: De platen moeten vlak zijn wanneer ze in de oven worden geplaatst.
- PDMS gieten in epoxy mallen
OPMERKING: Omdat wafer voorbereiding is duur, vereist speciale apparatuur, en kan schade toebrengen aan de fragiele wafers, is het mogelijk om epoxy replica's van wafers te genereren. De replica's zijn goedkoper, duurzamer, en kan worden gebruikt voor massaproductie van microfluïdische kamers.- Cast en cure PDMS (zoals beschreven in 1.1.8-1.1.11) in de originele wafer.
- Verwijder en snijd overtollige delen van PDMS weg, waardoor alleen de microfluïdische elementen en het functionele gebied dat nodig is om ze te verwerken tot microfluïdische kamers, worden verwijderd.
- Wikkel de PDMS onmiddellijk met dikke, plakband om te voorkomen dat het stof ophoopt.
- Kies een tissue cultuur kwaliteit plastic schotel die de hele PDMS binnen past en laat ruimte voor epoxy eromheen. De afstand van de PDMS tot de kunststof schaal moet minder dan 5 mm bedragen.
- Bereid een kleine hoeveelheid PDMS gemengd in een verhouding van 10:1 (base:curing agent). De verse vloeibare PDMS zal worden gebruikt om de vaste PDMS op de bodem van de kunststof plaat te lijmen.
- Breng een minimale hoeveelheid van de vloeibare PDMS aan op de middelste bodem van de plastic plaat en verwijder vervolgens de plakband uit de PDMS en plak deze aan de plastic afwasbodem. Zorg ervoor dat de microfluïdische elementen naar boven gericht zijn.
- Laat de PDMS 30 min genezen in een oven van 70 °C.
- Bereid de epoxyhars voor door de basis en het uithardingsmiddel te mengen in een verhouding van respectievelijk 100:45 in een reageerbuis. Verschillende epoxyharsen kunnen verschillende mengverhoudingen hebben. Het vereiste volume voor een gewone plaat van 100 mm is ongeveer 40 mL.
- Laat de epoxy goed mengen gedurende 10 minuten in een rotator totdat het mengsel zichtbaar homogeen wordt (dat wil zeggen, er zijn geen zichtbare vezelachtige artefacten in de vloeistof).
- Centrifugeer het epoxymengsel op 400 x g gedurende 5 min om de gevangen luchtbellen binnen te verwijderen.
- Tijdens de centrifugatie, verspreid een dunne laag siliconen vet rond de muren en alle andere blootgestelde plastic delen van de cultuur schotel. Dit voorkomt dat de epoxy polymeriseert met het afdeikmiddel en maakt het mogelijk om de uitgeharde epoxy gemakkelijk aan het einde van het protocol te verwijderen.
- Giet de epoxy langzaam in de schotel totdat deze de PDMS volledig bedekt en gaat er met ten minste 5 mm overheen. Voorkom de vorming van eventuele bellen in de epoxy door nul afstand tussen de buis en de plaat te houden. Plaats de plaat op een veilige plaats, zodat deze niet wordt verplaatst voor de komende 48 uur.
- Na 48 uur moet de epoxy volledig worden uitgehard. Plaats de plaat in een voorverwarmde oven op 80 °C gedurende 3 uur voor het uiteindelijk uitharden.
- Verwijder de uitgeharde epoxy van de plaat en de originele PDMS-mal door de plastic wand van de plaat voorzichtig te trekken tot deze breekt. Het moet dan gemakkelijk scheiden van de epoxy en afpellen.
- Eenmaal geëxtraheerd, veeg het resterende vet uit de nieuwe epoxy replica en zet het ondersteboven (dat wil zeggen, met de gerepliceerde microfluïdische elementen naar boven) in een nieuwe cultuur schotel. De epoxy replica is nu klaar voor PDMS casting.
- Gebruik onder druk staande lucht of N2 om eventuele resten van PDMS of vuil van de epoxy mal blazen en spoel het 2x met isopropanol. Vul het een derde keer en incubeer gedurende 10 min op een orbitale shakerplaat. Spoel de mal opnieuw 3x met isopropanol en gooi de resterende vloeistof. Föhn met lucht of N2 of plaats in een oven van 70 °C tot het droog is.
LET OP: Volg veiligheidsprocedures bij het werken met en weggooien isopropanol. - Houd de schimmelplaten gesloten tot het gieten. Volg de stappen 1.1.8.-1.1.11.
- Ponsen en beeldhouwen van de PDMS in een MFC (Figuur 2)
- Snijd en verwijder de PDMS mal van de plaat door het volgen van de (+) markeringen op de wafers met behulp van een scalpel. Gebruik geen geweld, omdat de mallen fragiel zijn(figuur 2A).
- Volg de instructies die op de schets zijn getekend om de kamers te slaan en te snijden, afhankelijk van de experimentele opstelling(figuur 2B-F).
- Voor ruggenmerg explant cultuur (Figuur 2C, E), punch twee 7 mm putten in de distale kant van een de grote MFC. Zoek de putten op een manier die ze overlappen met de kanaalranden. Aan de proximale kant, punch een 7 mm goed in het midden van het kanaal, met minimale overlap, zodat er voldoende ruimte overblijft voor de explants. Punch twee extra 1 mm gaten in de twee randen van het proximale kanaal. Draai de MFC met de microfluïdische elementen naar boven gericht, en met behulp van een 20 G naald, carve drie kleine uitplant grotten op de geponste 7 mm goed.
- Voor gescheiden MN cultuur (Figuur 2D, F), punch vier 6 mm putten in de randen van de twee kanalen van een kleine MFC.
- Steriliseren van het MFC voor weefselkweekgebruik
- Verspreid 50 cm lange plakbandbanden op de bank. Druk en trek de kamer terug om de plakband (zowel boven- als onderzijde) onder ogen te zien en ruw vuil te verwijderen. Plaats de schone kamers in een nieuwe plaat van 15 cm.
LET OP: Druk niet rechtstreeks op de microfluïdische elementen wanneer deze naar boven gericht zijn. - Incubeer de kamers in analytische kwaliteit 70% ethanol gedurende 10 min op een orbitale shaker.
- Gooi de ethanol weg en droog de kamers in een weefselkweekkap of in een oven op 70 °C.
- Verspreid 50 cm lange plakbandbanden op de bank. Druk en trek de kamer terug om de plakband (zowel boven- als onderzijde) onder ogen te zien en ruw vuil te verwijderen. Plaats de schone kamers in een nieuwe plaat van 15 cm.
- Het plaatsen van de MFC op een glazen bodemschaal
- Plaats de kamer in het midden van een weefselcultuur graad 35 mm/50 mm glazen bodem schotel en kleine kracht op de randen toe te passen aan de PDMS en schotel bodem binden. Om te voorkomen dat de glazen bodem wordt gebroken, moet u altijd kracht uitoefenen op een vast oppervlak.
- Incubeer 10 min in 70 °C. Druk op de kamers om de hechting aan de plaat te versterken.
- Incubeer onder UV-licht gedurende 10 min.
- Coating en kweek
- Voeg 1,5 ng/mL poly-L-ornithine (PLO) toe aan beide compartimenten. Zorg ervoor dat de PLO door de kanalen loopt door de coatingmedia een paar keer direct in de kanaalingang te pipetteren.
- Bestudeer de microfluïdische kamer onder een lichtmicroscoop met 10x vergroting om te controleren op de aanwezigheid van luchtbellen. Als luchtbellen de microgroeven blokkeren, plaatst u de MFC gedurende 2 min in een vacuümdroog. Verwijder later de overtollige lucht die in de kanalen terecht kwam door de coatingmedia erdoorheen te paien. 's nachts uitte.
- Vervang PLO door laminine (3 μg/mL in DDW) voor nachtelijke incubatie op dezelfde manier.
- Voorafgaand aan plating, was de laminine met neuronale cultuur medium.
2. Neuronale cultuur beplating
- Gescheiden motorneuron cultuur
- Ontleed met behulp van een rechte schaar en fijne tangen een ruggenmerg uit een E12.5 ICR-HB9::GFP-muisembryo. Werk in een 1X HBSS-oplossing met 1% penicilline-streptomycine (P/S) (Figuur 3A-C).
- Verwijder met behulp van microdissectieschaar de hersenvliezen en de rughoorns(figuur 3D).
- Verzamel de ruggenmergstukken en breng over op de buis(#1) met 1 mL HBSS + 1% P/S.
- Snijd de ruggenmerg in kleine stukjes met behulp van gebogen schaar en wacht tot de stukken te vestigen.
- Voeg 10 μL trypsine 2,5% toe en plaats in een waterbad van 37 °C gedurende 10 min. Na 5 min, meng door te tikken op de buis. De stukken moeten een helix-achtige klomp vormen.
- Breng de klomp over in een nieuwe buis (#2) met 800 μL voorverwarmde L-15, 100 μL BSA 4% en 100 μL van 10 mg/mL DNase. Maal 2x, dan wachten tot 2 min te laten ongesocieerde stukken vestigen. Breng de supernatant over op een nieuwe buis(#3).
- Voeg 100 μL BSA 4%, 20 μL van 10 mg/mL DNase en 900 μL compleet neurobasaal medium (CNB, zie Materiaaltafel en Tabel 1). Grind 8x en wacht 2 min. Verzamel supernatant aan buis #3.
- Herhaal stap 2.1.7 en maal 10x. Verzamel supernatant aan buis #3. Een kleine hoeveelheid weefsel moet worden achtergelaten aan de onderkant van de buis.
LET OP: Als er nog steeds een grote klomp aan de onderkant van de buis #2,herhaal stap 2.1.8. - Voeg 1 mL BSA 4% kussen toe aan de onderkant van de buis #3.
- Centrifugeer op 400 x g voor 5 min. Gooi de supernatant weg.
- Resuspend de cel pellet door zachtjes te tikken op de buis, voeg dan 1 mL van CNB medium. Pipetteer 6x en voeg 20 μL van 10 mg/mL DNase toe.
- Vul aan met een extra 5 mL CNB medium en breng 3 mL over op een nieuwe buis(#4).
- Voeg 1 mL van 10,4% dichtheidsgradiënt medium (zie tabel 2)toe aan de onderkant van elke buis(#3 en #4). Er moet een scherpe fasescheiding tussen de twee interfaces verschijnen.
- Centrifugeer op 775 x g gedurende 20 min bij kamertemperatuur (RT). De vertraging van de centrifuge moet op een laag niveau worden ingesteld om afbraak van de fasescheiding te voorkomen.
- Cellen moeten zweven en verschijnen als een bewolkte interfase tussen de media. Verzamel de cellen van beide buizen in een nieuwe buis(#5) die al voorwarm 1 mL CNB medium bevatten.
- Voeg een extra 4-6 mL cnb medium.
- Voeg 1 mL BSA 4% kussen toe aan de onderkant van de buis.
- Centrifugeer op 400 x g voor 5 min bij RT. Gooi de supernatant weg en laat de pellet voorzichtig met 1 mL CNB-medium opschorten.
- Tel de cellen. Een opbrengst van 0,75-1 x 106 MN per ruggenmerg wordt verwacht.
OPMERKING: Ventrale ruggenmerg bevat naast motorneuronen ook andere neuronale subtypes (bijv. interneurons). MN zuiverheid hangt meestal af van de verwijdering van dorsale gebieden tijdens dissectie en de mogelijkheid om MN verrijkte rostral gebieden te bereiken. Om ervoor te zorgen dat de afgebeelde neuronen MN's zijn, wordt het gebruik van een muizenstam met een endogene MN-marker, zoals HB9::GFP-muizen, aanbevolen. Om een zuivere MN-cultuur te bereiken (maar met een verminderde celopbrengst), is het gebruik van FACS zuivering15 mogelijk. - Plating scheidde MN cultuur in het MFC
- Concentraat 150.000 MN's per kamer door centrifugeren op 400 x g voor 5 min.
- Trek de supernatant aan en stouw de cellen voorzichtig op in rijk neurobasaal medium (RNB) bij 4 μL per MFC. RNB is CNB aangevuld met extra 2% B27 en 25 ng/mL BDNF.
- Verwijder het medium uit beide compartimenten, waardoor een laag volume gelijk is aan ~ 10 μL in de putten van het distale compartiment. Het verschijnt als een dunne ring van medium in de put omtrek.
- Laad langzaam 4 μL cellen in het kanaal. Neem 4 μL van de put aan de andere kant van het kanaal en laad ze langzaam rechtstreeks terug in het kanaal om de stroom om te keren en de celdichtheid in het kanaal te maximaliseren.
- Controleer of de cellen met een 10x-lichtmicroscoop in het kanaal zijn gekomen en plaats de kamer gedurende 30 min in de couveuse zonder meer media toe te voegen.
- Voeg langzaam ~10-15 μL RNB toe aan de proximale en distale putten en plaats de kamers nog 15 min in de couveuse.
- Na deze incubatie, langzaam toe te voegen ~ 75-80 μL RNB in elke put.
- Gescheiden MN cultuuronderhoud
- Een dag na beplating (DIV1), vervang medium met RNB aangevuld met 1 μM cytosine arabinoside (Ara-C) om de groei van de glial te remmen.
- Twee dagen na ara-C toepassing (DIV3) vervangen medium met verse CNB medium in de proximale compartiment (zonder Ara-C).
- Om het oversteken van axonen door de microgroeven te verbeteren, past u RNB aangevuld met 25 ng/mL van gliacel-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) en 25 ng/mL van hersen-afgeleide neurotrofe factor (BDNF) alleen toe op het distale compartiment. Houd een volumegradiënt van ten minste 10 μL per put tussen de axonale distale putten (hoger volume) en de proximale putten.
- Vernieuw het medium elke 2 dagen. Het kan tot 4-6 dagen duren voordat de axonen niet goed zijn.
- Ruggenmerg explant cultuur
- Ontleed met behulp van een rechte schaar en fijne tangen een ruggenmerg uit een E12.5 ICR-HB9::GFP-muisembryo. Werk in een 1X HBSS-oplossing met 1% penicilline-streptomycine (P/S) (Figuur 3A-C).
- Verwijder met behulp van microdissectieschaar de hersenvliezen en de rughoorns(figuur 3D).
- Snijd het ruggenmerg in 1 mm dikke dwarse delen(figuur 3E). Gooi alle medium uit het proximale compartiment van het MFC.
- Pak een enkele ruggenmergexplant met een pipet in een totaal volume van 4 μL. Injecteer de uitplant zo dicht mogelijk bij de grot en trek eventuele overtollige vloeistof uit de proximale put via de laterale uitlaten (1 mm stoten). De explants moeten in het proximale kanaal worden gezogen.
- Voeg langzaam 150 μL ruggenmergexplantmedium (SCEX, zie Materiaaltafel en Tabel 3)toe aan de bronput.
- Ruggenmerg explant cultuur onderhoud
- Voeg SCEX medium in het proximale compartiment, en rijke SCEX medium (SCEX met 50 ng/mL van BDNF en GDNF) in het distale compartiment. Houd een volumegradiënt van ten minste 15 μL per put tussen de distale putten (hoger volume) en de proximale put.
- Vernieuw het medium elke 2 dagen. Het kan de axonen tot 3-5 dagen duren om distally over te steken.
3. Axonal vervoer (figuur 4A)
- Etikettering van mitochondriën en zure compartimenten
- Bereid vers SCEX medium (of CNB voor gescheiden MN) met 100 nM Mitotracker Deep Red FM en 100 nM LysoTracker Red. Incubeer 30-60 min bij 37 °C. Andere kleuren kunnen worden gebruikt zolang hun fluorophoren elkaar niet overlappen.
- Was 3x met warm CNB/SCEX medium. De platen zijn klaar voor beeldvorming.
- Live beeldvorming
- Verwerf 100 time-lapse beeldreeksen van axonal transport met intervallen van 3 s, met een totaal van 5 min per film.
OPMERKING: Het imaging systeem gebruikt in deze studie opgenomen een omgekeerde microscoop uitgerust met draaiende schijf confocale, gecontroleerd via propriety cell imaging software, 60x olielens, NA = 1,4, en een EMCCD camera. Films werden verworven in een gecontroleerde omgeving bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Langere of kortere time-lapse-films kunnen worden weergegeven, afhankelijk van het experiment. Zelfs 's nachts films kunnen worden opgenomen indien nodig. Het is echter van cruciaal belang om te proberen de belichtingstijd en laserkracht, evenals het aantal totale beelden, te verminderen om fototoxiciteit en bleken tijdens filmacquisitie te verminderen.
- Verwerf 100 time-lapse beeldreeksen van axonal transport met intervallen van 3 s, met een totaal van 5 min per film.
4. Beeldanalyse (cijfers 4-5)
- Analyse van de verdeling en dichtheid van deeltjestransport met behulp van kymograafanalyse
- Open het bestand in FIJI. Afzonderlijke kanalen die op Afbeelding drukken | Stapels | Instrumenten | Deinterleave.
- Afbeeldingseigenschappen instellen door op Afbeelding te drukken | Eigenschappen.
- Kies het gereedschap Gesegmenteerde lijn door met de rechtermuisknop op het lijnpictogramte klikken . Stel Breedte in op 8-10 door op het lijnpictogramte dubbelklikken . In overeenstemming zijn met dezelfde lijnbreedte gedurende de gehele analyse.
- Markeer een gesegmenteerde lijn die het axonpad volgt van distaal naar proximal. Dubbelklik om de lijnmarkering te stoppen.
- Klik op t om een nieuw regelgebied (ROI) toe te voegen aan de ROI Manager. Voeg dit toe aan een spreadsheetanalysetabel.
- Klik op m om het gebied en de lengte van de axon te meten. Voeg dit toe aan de analysetabel.
- Een kymograaf genereren door op Plug-ins te klikken | KymoToolBox | Teken Kymo. Als alternatief kunnen andere kymograph generatie plugins beschikbaar worden gebruikt.
- Tel handmatig bewegende (retrograde of anterograde) en niet-bewegende deeltjes en voeg ze toe aan de tabel in de juiste kolom.
OPMERKING: Deeltjes worden geclassificeerd als bewegende anterograde (d.w.z. naar links bewegen in de kymograaf) of retrograde (d.w.z. naar rechts bewegen) als hun verplaatsing hoger is dan 10 μm in de specifieke richting. Het is mogelijk om de verplaatsing te meten door simpelweg een horizontale lijn met het lijnpictogram te markeren en op mte drukken. Onbeweeglijke deeltjes of deeltjes die niet aan de verplaatsingscriteria voldoen, worden gedefinieerd als niet-bewegend (figuur 4B).
- Single particle tracking: Handmatig bijhouden
- Download de handmatige tracking plugin voor FIJI software (ontwikkeld door Fabrice P. Cordelière) van http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
- Open het bestand in FIJI/ImageJ. Gebruik de optie Roteren om de MFC-groeven horizontaal uit te lijnen.
- Als u de signaal-ruisverhouding indien nodig wilt verbeteren, klikt u op Proces | Achtergrond aftrekken.
- Open de plug-in Handmatig bijhouden. Stel de parameters (bijvoorbeeld pixelgrootte, tijdsinterval, enz.) in op basis van de specifieke microscoop die wordt gebruikt voor beeldvorming. Voor de hier getoonde resultaten was de microscoop en lens de verhouding 0,239 μm/pixel en het frameinterval 3 s.
- Verkrijg de tracks X- en Y-coördinaten en sla de resultaten op door de tekst naar spreadsheet te kopiëren.
- Meerderekanaals films analyseren door op Afbeelding te klikken | Kleur | Kanalen samenvoegen om de kanalen samen te voegen en vervolgens alleen colocaliseerde puncta bij te houden.
- Single particle tracking: Semi-geautomatiseerde tracking (Figuur 5)
- Open de analysesoftware. Deze studie gebruikt Bitplane Imaris software versie 8.4.1.
- Schakel over naar Overtreffen in het bovenste menu.
- Klik op Beeldverwerking | Wisseltijd en Z | Ok.
- Klik op Bewerken | Afbeeldingseigenschappen (Ctrl+I) | Geometrie | Voxel Grootte Rij. Beeldeigenschappen instellen op basis van de gebruikte microscopie-instelling.
OPMERKING: Voor de hier weergegeven gegevens was de microscoop- en lensverhouding 0,239 μm/pixel. - Klik op Alle Equidistant en wijzig het tijdsinterval. Gebruik bijvoorbeeld 3 s als interval. Klik op de knop Opnieuw instellen rechtsonder of klik op Ctrl+B.
- Voeg linksboven een laag vlekken toe door op een pictogram van kleine gele vlekken teklikken. Linksonder wordt een nieuw menu voor het bewerken van de spots geopend.
- Druk op de rechterblauwe pijl totdat de detectie van de plek wordt gestart.
OPMERKING: Het is belangrijk om een aantal puntjes uit te filteren met behulp van het filter linksonder in het venster. Controleer de film een paar keer om te zien dat er voldoende punten zijn geselecteerd. - Controleer of configureer de parameters op de experimentele behoeften. Max Distance = 12 μm (De maximale afstand tussen twee verschillende plekken om ze nog steeds in dezelfde single track op te nemen); Max Gap Grootte = 1 (Het aantal frames dat een track mag missen en nog steeds beschouwd als een track).
- Klik op Instellingen en vervolgens op Stijl bijhouden = Uit, Punten = Bol.
- Kies met de filterbalkverschillende filters voor aanpassing. In de hier verstrekte gegevens heeft Track Duration = 9 bijvoorbeeld alle tracks met minder dan 3 frames verwijderd. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, klikt u op de pijl-rechts . Verdere bewerking is na deze stap niet mogelijk.
- Klik op het kleine potlood met stippen om alle nummers handmatig te bewerken.
- Bekijk de film (Figuur 5B). Als er een fout optreedt, zijn er verschillende mogelijke opties:
- Als u een track wilt loskoppelen, klikt u op de optie Object en kiest u de twee plekken die moeten worden losgekoppeld terwijl Ctrlingedrukt moet worden en kiest u Verbinding verbreken.
- Als u een track wilt aansluiten, klikt u op de optie Object, kiest u de twee plekken die moeten worden verbonden met Ctrl en kiest u Verbinding maken.
- Als u een track of spot wilt verwijderen, met de juiste optie(Track/Object),schakelt u naar het scherm met het pictogram Normaal potlooden kiest u Verwijderen.
- Als u vlekken handmatig wilt toevoegen, schakelt u over naar het scherm met normaal potloodpictogram. Aan de onderkant van het scherm is er een Manual Tracking Mark. Controleer of het selectievakje Automatisch verbinden Vis. Houd op de film zelf de Shift-knopen Linksklikken ingedrukt om een vlek toe te voegen. Shift
- Als u een spot wilt toevoegen aan een bestaand spoor, kiest u een gewenst track (geel) en frame, schakelt u over naar het gewone potloodpictogramscherm en voegt u handmatig een vlek toe. Wanneer de hele film klaar is, schakelt u over naar het pictogram dat eruitziet als een rode grafiek (statistieken). Het is mogelijk om de geanalyseerde parameters later te bewerken. Als u wilt bewerken, drukt u linksonder op het scherm op het Zweedse sleutelpictogram. Bijvoorbeeld: Positie X, Positie Y.
- Druk op het pictogram dat lijkt op verschillende diskettes, exporteer alle statistieken.
OPMERKING: De spreadsheetuitvoer kan direct of verder worden geanalyseerd met behulp van de gepubliceerde code9 die voor deze analyse wordt gebruikt, die op aanvraag wordt gedeeld. De volgende parameters worden uit de analyse gehaald: Snelheid, Spoorverplaatsing, Run length, Velocity (inclusief Directionaliteit), Stop Count, Gemiddelde Stop Duur, Alpha, Richtingswisselingen en Momentane Snelheid. Een gedetailleerde uitleg van elke parameter wordt beschreven in Gluska et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het beschreven protocol werden de embryonale HB9::GFP-ruggenmergexplanten gekweekt in MFC (figuur 4A). Explants werden gekweekt voor 7 dagen, toen axonen volledig gekruist in de distale compartiment. Mitotracker Deep Red en Lysotracker Rode kleurstoffen werden toegevoegd aan de distale en proximale compartimenten om de mitochondriën en zure compartimenten(figuur 4C)te labelen. Axonen in de distale groeven werden in beeld gebracht, en de films werden als volgt geanalyseerd: Ten eerste vergeleken we de algemene bewegingsverdeling met behulp van kymograafanalyse (Figuren 4B,D). Deze analyse bracht een bias in de retrograde richting alleen in zure compartimenten (niet-bewegende = 77,1 ± 9,5%; retrograde = 16,9 ± 8,3%, anterograde = 6 ± 5%; Figuur 4E) maar niet in mitochondriaal vervoer (niet-bewegend = 83,4 ± 6,8%; retrograde = 10,5 ± 6,9%; anterograde = 6,8 ± 5,1%; Figuur 4F). Kymograafanalyse werd gebruikt om de deeltjesdichtheid te kwantificeren, waarbij een hoger aantal mitochondriale deeltjes werd onthuld in vergelijking met zure compartimenten in HB9::GFP-ruggenmerg explant axonen (Mitochondriën = 0,46 ± 0,13; Zure compartimenten = 0,3 ± 0,07 deeltjes/μm axon, figuur 4G).
Vervolgens werd single particle transport analyse uitgevoerd met behulp van semi-geautomatiseerde software, gevolgd door in-house code (Figuur 5A-B). Deze analyse toonde aan dat ondanks het feit dat vergelijkbare deeltjessnelheid in het algemeen (Figuur 5C), bij het observeren van de verdeling van snelheden (Figuur 5D) alleen zure compartimenten, maar niet mitochondriën toonde een bias in de richting van retrograde beweging.
Figuur 1: Siliconen schimmel voorbereiding. Schematische tekening die de procedure van chlorotrimethylsilane wafer reiniging beschrijft. (A) Ten eerste werd 50 mL vloeibare stikstof toegevoegd aan een geschikte container. Werken in een chemische kap, een spuit en naald werden gebruikt om 8 mL vloeibare stikstof te trekken. De volledige inhoud van de spuit werd geïnjecteerd in de chlorotrimethylsilane fles. De fles werd gedraaid met de dop naar beneden en 8 mL van chlorotrimethylsilane werden teruggetrokken. bB) chlorotrimethylsilane verspreid in de container (niet rechtstreeks op de wafer). De container moet worden gesloten, gevolgd door 5 min incubatie voor elke mal. (C) Vloeibare PDMS werd gegoten in elke wafer tot de gewenste hoogte. (D) Alle platen werden samen geplaatst in een vacuümdesiccator gedurende 2 uur, gevolgd door 3 uur 's nachts in een 70 °C oven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: MFC gespecialiseerd ontwerp. (A) Gepolymeriseerde PDMS sjabloon genomen uit de mal met behulp van een metalen scalpel. (B) Afhankelijk van de experimentele opstelling werden 6 mm, 7 mm of 1 mm punchers gebruikt voor het ponsen van de PDMS-sjablonen. (C) Voor de explant cultuur in de MFC, 7 mm en 1 mm punchers werden gebruikt, en een 20 G spuit werd gebruikt voor het maken van "grotten" voor eenvoudige explant inbrengen. (D) Voor gescheiden MN cultuur MFC, een 6 mm puncher werd gebruikt om vier putten te creëren aan de kanaalranden. (E-F) Illustraties van de laatste MFC-vormen beschreven in respectievelijk C en D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Neuronale cultuur. (A) E12.5 muis embryo werd geplaatst in positie na de kop, staart, en de huid werden verwijderd om de neurale buis bloot te leggen. (B) Dissectie van het gehele ruggenmerg. (C) Met behulp van zachte tangen, werden de hersenvliezen afgepeld uit de buurt van het ruggenmerg. (D) Linker paneel: Verwijdering van het ruggenmerg laterale segmenten van de ventrale ruggenmerg om een betere MN zuivering opleveren. Rechterpanel: Representatief beeld van gescheiden MN-cultuur in het MFC. HB9::GFP axons gekruist naar het distale compartiment (groen). Hoechst kleuring geeft neuronale kernen (blauw). ( E) Ruggenmergexplants gegenereerd door het ontleden van 1 mm dikke dwarse delen van het ventrale ruggenmerg. Representatief beeld van HB9::GFP (groen) ruggenmerg explant axonen in een MFC. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Axonal transport van mitochondriën en zuurcompartiment in MN's. (A) Illustratie van het axonale transport essay. Lysotracker Red en Mitotracker Deep Red werden toegevoegd aan zowel de proximale als de distale compartimenten van het MFC, met HB9::GFP ventrale ruggenmergexplant. bB) Kymograafanalyse. Bewegende deeltjes werden gedefinieerd als bewegende anterograde of retrograde na verplaatsing van meer dan 10 μm in die richting. Roterende of onbeweeglijke deeltjes werden geteld als niet-bewegende. Schaalbalk = 10 μm. (C) Eerste frame van een time-lapse film met primaire HB9::GFP muis ruggenmerg explant axonen geverfd met Lysotracker rood om zure compartimenten te taggen en Mitotracker Deep Red om mitochondriën te taggen. Schaalbalk = 10 μm. (D) Representatieve kymografen die een typische axonale beweging van zure compartimenten en mitochondriën weergeven. Schaalbalk = 10 μm. (E) Kymograafanalyse van mitochondriaal axonal transport, ****p < 0,0001, Anova met Holm-Sidak correctie (n = 77 axonen). Schaalbalk = 10 μm (F) Kymograafanalyse van zuur compartiment axonal transport, ** p < 0,01, ****p < 0,0001, Anova met Holm-Sidak correctie (n = 77 axonen). (G) Axonale deeltjesdichtheidsanalyse van mitochondriën en zure compartimenten, ****p < 0,0001, Student's t-test (n = 77 axonen). Foutbalken vertegenwoordigen waarden met SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Semi-geautomatiseerde analyse van enkele deeltjes om de organellesnelheid te meten. (A) Schematische workflow voor semi-geautomatiseerde analyse van enkeldeeltjestransport. (B) Ventrale ruggenmerg explant axonen werden geanalyseerd voor enkele deeltjes tracking. De analysesoftware is in staat om enkele axonale deeltjes in time-lapse-films te volgen, zoals aangegeven voor mitochondriën (gele stippen, bovenste paneel) en zure compartimenten (groene stippen, onderste paneel). (C) De gemiddelde snelheid veranderde niet tussen mitochondriën en zure compartimenten, Mann Whitney-test (n = 417 mitochondriën, n = 371 zure compartimenten). Foutbalken vertegenwoordigen waarden met SD. (D) Verdeling van mitochondriale en zure compartimenten retrograde en anterograde snelheden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Compleet Neurobasal Medium – voor 50mL | ||
| Ingrediënt | Volume | Concentratie |
| Neurobasaal | 47mL | |
| B27 | 1 mL | 2% |
| Het serum van het paard | 1 mL | 2% |
| P/S | 0,5 mL | 1% |
| L-Glutamine (Glutamax) | 0,5 mL | 1% |
| Bèta-Mercaptoethanol (50mM) | 25 μL | 25μM |
| BDNF (10ug/mL) | 5 μL | 1ng/mL |
| GDNF (10ug/mL) | 5 μL | 1ng/mL |
| CNTF (10ug/mL) | 2,5 μL | 0,5 ng/mL |
Tabel 1: Recept voor de bereiding van volledige neurobasale (CNB) oplossing.
| Optiprep-oplossing – voor 10mL | ||
| Ingrediënt | Volume | Concentratie |
| Ddw | 5,27 mL | |
| Dichtheidsgradiënt Gemiddeld (Optiprep) 60% | 1,73 mL | 10,4% (w/v) |
| Tricine 100mM | 1 mL | 2% |
| Glucose 20% (w/v) | 2 mL | 2% |
Tabel 2: Recept voor de bereiding van dichtheidgradiënt medium oplossing.
| Ruggenmerg Explant Medium (SCX) – voor 20mL | ||
| Ingrediënt | Volume | Concentratie |
| Neurobasaal | 19,5 mL | |
| B27 | 200 μL | 2% |
| P/S | 100 μL | 1% |
| L-Glutamine (Glutamax) | 100 μL | 1% |
| BDNF BDNF | 50 μL | 25ng/mL |
Tabel 3: Recept voor de bereiding van spinale explant (SCEX) oplossing.
| MN Cultuur | Ruggenmerg explants |
| Langere procedure voorafgaand aan beplating | Korte procedure – Ontleden en plaat |
| Extra voorzichtigheid nodig voor beplating in MFC | Gemakkelijker te borden in het MFC |
| Hoge concentratie van motorneuronen zonder gliacellen – nauwkeuriger | Aanwezigheid van gliacellen en andere neuronale types – meer fysiologische |
| Onbeperkte manipulatiemogelijkheden op zowel Soma als axonen | Beperkte manipulatiemogelijkheden op cellichamen |
| Eenvoudige immunokleuring voor zowel cellichamen als axonen | Lage efficiëntie tijdens immunostaining van cellichamen in de explant. |
| Hoge efficiëntie van virale infectie | Zeer lage efficiëntie van virale infectie |
Tabel 4: Vergelijking tussen ruggenmergexplants en gescheiden MN-cultuur op basis van snelheden, haalbaarheid, gliale aanwezigheid, manipulatiemogelijkheden, immunostaining en virale infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een systeem om axonaltransport van mitochondriën en zure compartimenten in motorneuronen te volgen. Dit vereenvoudigde in vitro platform maakt nauwkeurige controle, monitoring en manipulatie van subcellulaire neuronale compartimenten mogelijk, waardoor experimentele analyse van lokale functies van motorneuron mogelijk is. Dit protocol kan nuttig zijn voor het bestuderen van MN-ziekten zoals ALS, om zich te concentreren op het begrijpen van het onderliggende mechanisme van axonale transportdisfunctie bij de ziekte10,16. Bovendien kan dit systeem ook worden toegepast voor het bestuderen van transport van trofische factoren9,16, microRNA10, mRNA8, en gelabelde eiwitten in gezonde en zieke MN's of in andere neuronen, zoals zintuiglijke9 of sympathische axonen14. Een soortgelijke methode kan ook worden toegepast om organelle vervoer te bestuderen in een cocultuur systeem, zoals MN's gekweekt met skeletspiercellen12 of sympathische neuronen cocultured met cardiomyocyten14. Het MFC-systeem kan worden gebruikt om actieve NMJ's17,18 te genereren en het effect van synapsvorming op axonal transport te bestuderen16.
Dit protocol heeft verschillende voordelen in vergelijking met andere protocollen voor het kweken van neuronen in MFC en het gebruik van live imaging om axonale transport te analyseren: 1) MPC's zijn commercieel beschikbaar door verschillende fabrikanten. De zelfproductie van de MPC's is echter uiterst kosteneffectief in vergelijking met het commerciële alternatief. Een enkele PDMS wafer levert vier grote MPC's of negen kleine tegen de minimale kosten van verschillende Amerikaanse dollars voor de PDMS hars zelf. 2) De zelf vervaardigde MPC's kunnen worden aangepast om te voldoen aan specifieke experimentele behoeften (bijvoorbeeld het veranderen van de grootte en de locatie van de putten, waardoor de dikte van de MFC PDMS toeneemt). 3) De MPC's kunnen onomkeerbaar aan een plaat worden bevestigd (via plasmabinding), maar kunnen ook meerdere keren worden gerecycled om de kans op besmetting te verminderen. 4) De PDMS MPC's zijn transparant, waardoor ze ideaal zijn voor live beeldvorming door een verminderde achtergrond, wat van cruciaal belang is voor axonale transporttests waar signaal-ruis onderscheid een beperkende factor zou kunnen zijn. 5) Spinale koord explant cultuur is zeer efficiënt en snel. Eén embryonaal ruggenmerg kan tot 30 explanten opleveren, genoeg voor 10 MPC's. Dit kan helpen om tijd en materialen te besparen, en zorgt ervoor dat zelfs een zwangere muis met weinig embryo's een succesvol experiment kan produceren. Zie een gedetailleerde vergelijking van ruggenmerg explant en gescheiden MN cultuur in tabel 4.
Dit protocol is relatief eenvoudig en goedkoop. Het vereist echter expertise op verschillende technische gebieden. De productie en behandeling van het MFC moet nauwkeurig en zacht zijn, bijvoorbeeld om structurele defecten en het ontstaan van luchtbellen in de verplichte vacuümstap (1.1.10) te voorkomen. Tijdens de optionele vacuümtrap (1.6.2) is het belangrijk om alle lucht te zuiveren, of het zal axonale kruising blokkeren, maar ook het vacuüm kort houden om loslating van de MFC van het glas te voorkomen. Besteed veel aandacht aan de dissectie protocol stappen, want het is belangrijk om goed te verwijderen van de hersenvliezen en rughoorns, evenals om te proberen en snijd de stukken op de juiste grootte om ze in te voegen in de grot van de MFC zonder gebruik te maken van fysieke kracht. Elke overmatige fysieke kracht toegepast op de MFC kan gemakkelijk los de groeven of de gehele MFC, dus de procedure moet voorzichtig worden gedaan. Het kweken van MN's en het platen ervan in het MFC moet relatief snel zijn, omdat MN's de neiging hebben om samen te voegen en snel levensvatbaar te zijn onder stressomstandigheden zoals het lage gemiddelde volume van de beplatingsstap. De beplating in de MFC moet worden gedaan in een laag volume om een goede bevestiging van de neuronen in het MFC-kanaal mogelijk te maken, en na niet meer dan 30 min opgewarmd medium moet zeer voorzichtig worden toegevoegd om loslating van de MN's te voorkomen.
Na enkele dagen in de cultuur, en zodra axonen hebben uitgebreid tot de distale compartiment, de culturen zijn klaar om organelle kleuring ondergaan gevolgd door de aankoop van axonale transport films en ten slotte een specifieke procedure voor beeldanalyse. De analyse kan worden uitgevoerd door middel van single particle tracking na verloop van tijd, of met behulp van een geautomatiseerd of semi-geautomatiseerd tracking algoritme. In onze ervaring zijn geautomatiseerde methoden minder tijdrovend, maar hebben verschillende nadelen. Voornamelijk, geautomatiseerde tracking betrouwbaarheid is afgenomen, met drukke axonen die paden kruisen. Bovendien hebben geautomatiseerde algoritmen een verminderd vermogen om onderscheid te maken tussen overlappende deeltjes. Daarom wordt het uitvoeren van handmatige of semi-geautomatiseerde tracking aanbevolen. In het algemeen heeft semigeautomatiseerde tracking de voorkeur omdat het minder tijdrovend is, maar handmatig bijhouden kan een goede optie zijn wanneer er geen beschikbare betaalde software is. Een grondige vergelijking tussen handmatige en automatische analyse is te vinden in Gluska et al.9.
Tot slot kan de goedkeuring van dit eenvoudige protocol belangrijke gegevens opleveren voor de studie van axonal transport van verschillende cellulaire componenten. Het kan worden aangepast aan een diversiteit aan beeldvormingsopstellingen en neuronale subtypes, evenals aan coculturen van neuronen met andere cellen. Het maakt ook verschillende ruimtelijke farmacologische manipulatie van cellichamen of axonen mogelijk om basismechanismen van neuronale gezondheid te begrijpen en de ontwikkeling van geneesmiddelen voor ziekten met veranderd axonaal transport te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (ISF, 561/11) en de European Research Council (ERC, 309377).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
