Summary
Der axonale Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die Gesundheit des motorischen Neurons. In diesem Protokoll bieten wir eine detaillierte Methode zur Verfolgung des axonalen Transports von sauren Kompartimenten und Mitochondrien in motorischen Neuronaxonen mit mikrofluidischen Kammern.
Abstract
Motorneuronen (MNs) sind hochpolarisierte Zellen mit sehr langen Axonen. Axonaler Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die MN-Gesundheit und trägt zu neuronalen Wachstum, Entwicklung und Überleben bei. Wir beschreiben eine detaillierte Methode zur Verwendung von mikrofluidischen Kammern (MFCs) zur Verfolgung des axonalen Transports von fluoreszierend markierten Organellen in MN-Axonen. Diese Methode ist schnell, relativ kostengünstig und ermöglicht die Überwachung intrazellulärer Hinweise in Raum und Zeit. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für: 1) Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) MFCs; 2) Beschichtung von ventralen Rückenmarksexaten und MN dissoziierte Kultur in MFCs; 3) Kennzeichnung von Mitochondrien und sauren Kompartimenten, gefolgt von einer lebendigen konfokalen Vorstellung; 4) Manuelle und halbautomatische axonale Transportanalyse. Schließlich zeigen wir einen Unterschied im Transport von Mitochondrien und sauren Kompartimenten von HB9::GFP ventrale Rückenmarks-Explantationsaxone als Beweis für die Systemgültigkeit. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung des axonalen Transports verschiedener axonaler Komponenten sowie ein vereinfachtes Handbuch für die MFC-Nutzung, um räumliche experimentelle Möglichkeiten zu entdecken.
Introduction
MNs sind hochpolarisierte Zellen mit langen Axonen, die bei erwachsenen Menschen bis zu einem Meter lang sind. Dieses Phänomen stellt eine kritische Herausforderung für die Aufrechterhaltung der MN-Konnektivität und -Funktion dar. Folglich sind MNs auf den richtigen Transport von Informationen, Organellen und Materialien entlang der Axone von ihrem Zellkörper zur Synapse und zurück angewiesen. Verschiedene zelluläre Komponenten, wie Proteine, RNA und Organellen werden regelmäßig durch die Axone transportiert. Mitochondrien sind wichtige Organellen, die routinemäßig in MNs transportiert werden. Mitochondrien sind essentiell für die richtige Aktivität und Funktion von MNs, verantwortlich für ATP-Versorgung, Kalziumpufferung und Signalisierungsprozesse1,2. Der axonale Transport von Mitochondrien ist ein gut untersuchter Prozess3,4. Interessanterweise wurden Defekte im mitochondrialen Transport berichtet, dass sie an mehreren neurodegenerativen Erkrankungen und speziell an MN-Erkrankungen beteiligt waren5. Saure Fächer dienen als weiteres Beispiel für intrinsische Organellen, die sich entlang von MN-Axonen bewegen. Saure Kompartimente umfassen Lysosomen, Endosomen, Trans-Golgi-Apparate und bestimmte sekretole Vesikel6. Defekte im axonalen Transport von sauren Kompartimenten wurden bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen sowie7gefunden, und neuere Papiere unterstreichen ihre Bedeutung bei MN-Erkrankungen8.
Zur effizienten Untersuchung des axonalen Transports werden häufig mikrofluidische Kammern verwendet, die somatische und axonale Kompartimente trennen9,10. Die beiden wesentlichen Vorteile des mikrofluidischen Systems und die Abschottung und Isolierung von Axonen machen es ideal für die Untersuchung subzellulärer Prozesse11. Die räumliche Trennung zwischen den neuronalen Zellkörpern und Axonen kann verwendet werden, um die extrazellulären Umgebungen verschiedener neuronaler Kompartimente (z. B. Axone vs. Soma) zu manipulieren. Biochemische, neuronale Wachstum/Degeneration und Immunfluoreszenz-Assays profitieren alle von dieser Plattform. MFCs können auch bei der Untersuchung der Zell-zu-Zell-Kommunikation helfen, indem sie Neuronen mit anderen Zelltypen kokultieren, wie Skelettmuskeln12,13,14.
Hier beschreiben wir ein einfaches, aber präzises Protokoll zur Überwachung von Mitochondrien und sauren Kompartimententransporten in motorischen Neuronen. Wir zeigen die Anwendung dieser Methode weiter, indem wir den relativen Prozentsatz der retrograden und anterogradbewegten Organellen sowie die Verteilung der Transportgeschwindigkeit vergleichen.
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Protocol
Die Pflege und Behandlung von Tieren in diesem Protokoll wurden unter der Aufsicht und Genehmigung des Tel Aviv University Committee for Animal Ethics durchgeführt.
1. MFC-Vorbereitung
- PDMS-Guss in Primärformen (Abbildung 1)
- Kauf oder Erstellung von Primärformen (Wafern) nach einem detaillierten Protokoll9.
- Verwenden Sie Druckluft, um jede Art von Schmutz von der Waferplattform zu entfernen, bevor Sie mit dem Beschichtungsschritt fortfahren. Die Oberfläche der Wafer sollte glatt und klar aussehen.
- Füllen Sie einen Behälter mit 50 ml flüssigem Stickstoff. Bereiten Sie eine 10 ml Spritze und 23 G Nadel vor.
HINWEIS: Alle Eingriffe nach diesem Schritt müssen in einer chemischen Haube durchgeführt werden. - Verwenden Sie in der chemischen Haube die Spritze und die Nadel, um 2 ml flüssigen Stickstoff zu bündeln. Obwohl es so aussieht, als ob Luft gezogen wurde, ist die Spritze mit Stickstoff gefüllt (Abbildung 1A). Legen Sie die waferhaltige Platte in einen verschließbaren Behälter.
- Eine Chlorotrimethylsilanflasche öffnen, die Gummikappe mit der mit Stickstoff gefüllten Spritze durchbohren und den gesamten Inhalt der Spritze in die Flasche injizieren. Ohne die Nadel herauszuziehen, drehen Sie die Flasche auf den Kopf und ziehen Sie 2 ml Chlorotrimethylsilan zurück.
HINWEIS: Aufgrund des Spritzendrucks wird eine kleine Menge Chlorotrimethylsilan aus der Nadel gesprüht. Um eine Gefahr zu vermeiden, richten Sie die Nadel auf die Innenwand der Haube (Abbildung 1B). - Chlorotrimethylsilan gleichmäßig im Behälter verteilen (ab Schritt 1.1.4), jedoch nicht direkt auf dem Wafer oder der waferhaltigen Platte. Schließen Sie den Behälter und brüten Sie für 5 min pro Wafer.
HINWEIS: Wenn der Wafer zum ersten Mal mit Chlorotrimethylsilan beschichtet wird, sollte für jeden Wafer eine Inkubation von 1 h zulässig sein. - Nehmen Sie die Wafer und den Behälter nicht 30 min lang aus der chemischen Haube.
VORSICHT: Chlorotrimethylsilan ist sehr flüchtig. - Wiegen Sie die PDMS-Basis (siehe Materialtabelle) in einem 50 ml-Rohr und fügen Sie PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 16:1 hinzu (z. B. 47,05 g Basis und 2,95 g Härtungsmittel). Mischen Sie für 10 min mit einem Low-Speed-Rotator.
- Gießen Sie PDMS in jede waferhaltige Platte auf die gewünschte Höhe (Abbildung 1C).
HINWEIS: Die Verwendung dünner mikrofluidischer Kammern (bis 3-4 mm) verbessert die Haftung an der Kulturschale und verhindert Leckagen. - Alle Platten für 2 h in einem Vakuum-Austrocknungor zusammenlegen (Abbildung 1E). Dieser Prozess entfernt die im PDMS eingeschlossene Luft, wodurch Luftblasen eliminiert und eine klare, gleichmäßige Form entsteht.
- Legen Sie die Platten in einen Ofen für 3 h (oder über Nacht) bei 70 °C(Abbildung 1E).
HINWEIS: Die Platten sollten gleich sein, wenn sie in den Ofen gelegt werden.
- PDMS-Guss in Epoxidformen
HINWEIS: Da die Wafer-Vorbereitung teuer ist, spezielle Ausrüstung erfordert und die zerbrechlichen Wafer beschädigen kann, ist es möglich, Epoxid-Replikate von Wafern zu erzeugen. Die Repliken sind billiger, langlebiger und können für die Massenproduktion von mikrofluidischen Kammern verwendet werden.- PDMS (wie in 1.1.8-1.1.11 beschrieben) in den Originalwafer gießen und aushärten.
- Entfernen und abschneiden Sie überschüssige Teile von PDMS, sodass nur die mikrofluidischen Elemente und der für die Verarbeitung in mikrofluidische Kammern erforderliche Funktionsbereich übrig bleiben.
- Wickeln Sie das PDMS sofort mit dickem Klebeband, um zu verhindern, dass es sich staubt.
- Wählen Sie eine Kunststoffschale in Gewebekulturqualität, die zum gesamten PDMS passt und Raum für Epoxid um sie herum lässt. Der Abstand vom PDMS zur Kunststoffschale sollte weniger als 5 mm betragen.
- Bereiten Sie eine kleine Menge pdMS gemischt in einem Verhältnis von 10:1 (Basis: Härtungsmittel). Die frische Flüssigkeit PDMS wird verwendet, um das feste PDMS auf den Boden der Kunststoffplatte zu kleben.
- Tragen Sie eine minimale Menge des flüssigen PDMS auf den mittleren Boden der Kunststoffplatte auf und entfernen Sie dann das Klebeband vom PDMS und kleben Sie es an der Kunststoffschale unten. Stellen Sie sicher, dass die mikrofluidischen Elemente nach oben zeigen.
- Lassen Sie das PDMS 30 min in einem 70 °C-Ofen aushärten.
- Bereiten Sie das Epoxidharz vor, indem Sie die Basis und das Härtungsmittel im Verhältnis 100:45 in einem Reagenzglas mischen. Verschiedene Epoxidharze können unterschiedliche Mischungsverhältnisse aufweisen. Das benötigte Volumen für eine normale 100 mm Platte beträgt ca. 40 ml.
- Lassen Sie das Epoxid 10 min im Rotator gut mischen, bis die Mischung sichtbar homogen wird (d.h. es gibt keine sichtbaren faserähnlichen Artefakte in der Flüssigkeit).
- Zentrifugieren Sie das Epoxid-Gemisch bei 400 x g für 5 min, um im Inneren gefangene Luftblasen zu entfernen.
- Während der Zentrifugation eine dünne Schicht Silikonfett um die Wände und alle anderen freiliegenden Kunststoffteile der Kulturschale verteilen. Dadurch wird verhindert, dass das Epoxid mit dem Schalenkunststoff polymerisiert wird und ermöglicht die einfache Entfernung des ausgehärteten Epoxids am Ende des Protokolls.
- Gießen Sie das Epoxid langsam in die Schale, bis es das PDMS vollständig bedeckt und um mindestens 5 mm darüber hinausgeht. Verhindern Sie die Bildung von Blasen innerhalb des Epoxids, indem Sie null Abstand zwischen Rohr und Platte halten. Legen Sie die Platte an einem sicheren Ort, damit sie nicht für die nächsten 48 h bewegt wird.
- Nach 48 h sollte das Epoxid vollständig ausgehärtet werden. Die Platte bei 80 °C für 3 h für die endgültige Aushärtung in einen vorgeheizten Ofen geben.
- Entfernen Sie das ausgehärtete Epoxid von der Platte und die ursprüngliche PDMS-Form, indem Sie die Kunststoffwand der Platte sanft yanking, bis sie bricht. Es sollte dann leicht vom Epoxid trennen und abziehen.
- Wischen Sie das restliche Fett nach dem Extrahieren ab und stellen Sie es auf den Kopf (d. h. mit den nachgebildeten mikrofluidischen Elementen nach oben) in eine neue Kulturschale ein. Das Epoxid-Replikat ist nun für den PDMS-Guss bereit.
- Verwenden Sie Druckluft oder N2, um Reste von PDMS oder Schmutz aus der Epoxidform zu blasen und spülen Sie es 2x mit Isopropanol. Füllen Sie es ein drittes Mal und inkubieren Sie für 10 min auf einer Orbital-Shaker-Platte. Spülen Sie die Form wieder 3x mit Isopropanol und entsorgen Sie die restliche Flüssigkeit. Mit Luft oder N2 trocken blasen oder in einen 70 °C-Ofen stellen, bis sie trocken sind.
HINWEIS: Befolgen Sie die Sicherheitsverfahren beim Arbeiten mit isopropanol und dem Endeswerfen. - Halten Sie die Formplatten bis zum Gießen geschlossen. Befolgen Sie die Schritte 1.1.8.-1.1.11.
- Stanzen und Formen des PDMS in eine MFC (Abbildung 2)
- Schneiden und entfernen Sie die PDMS-Form von der Platte, indem Sie die (+) Markierungen auf den Wafern mit einem Skalpell befolgen. Verwenden Sie keine Gewalt, da die Formen zerbrechlich sind (Abbildung 2A).
- Folgen Sie den Anweisungen auf der Skizze, um die Kammern je nach Versuchsaufbau zu stanzen und zu schneiden (Abbildung 2B-F).
- Für die Rückenmarksexplantationskultur (Abbildung 2C,E), schlagen Sie zwei 7 mm Brunnen in die distale Seite eines großen MFC. Suchen Sie die Brunnen so, dass sie sich mit den Kanalkanten überlappen. Auf der proximalen Seite, stanzen Sie einen 7 mm gut in der Mitte des Kanals, mit minimaler Überlappung, so dass genügend Platz für die Explants bleibt. Stanzen Sie zwei zusätzliche 1 mm Löcher in die beiden Kanten des proximalen Kanals. Drehen Sie den MFC mit den nach oben gerichteten mikrofluidischen Elementen und schnitzen Sie mit einer 20 G Nadel drei kleine Explant-Höhlen auf dem gestanzten 7 mm Brunnen.
- Für dissoziierte MN-Kultur (Abbildung 2D,F), schlagen Sie vier 6 mm Bohrungen in die Ränder der beiden Kanäle eines kleinen MFC.
- Sterilisieren des MFC für den Einsatz in der Gewebekultur
- Verteilen Sie 50 cm lange Klebebandbänder auf der Bank. Drücken und ziehen Sie die Kammer zurück, um dem Klebeband (obere und untere Seiten) zu begegnen und entfernen Sie groben Schmutz. Legen Sie die Sauberen Kammern in eine neue 15 cm Platte.
HINWEIS: Drücken Sie nicht direkt auf die mikrofluidischen Elemente, wenn diese nach oben zeigen. - Inkubieren Sie die Kammern in analytischem Grad 70% Ethanol für 10 min auf einem Orbital-Shaker.
- Das Ethanol entsorgen und die Kammern in einer Gewebekulturhaube oder im Ofen bei 70 °C trocknen.
- Verteilen Sie 50 cm lange Klebebandbänder auf der Bank. Drücken und ziehen Sie die Kammer zurück, um dem Klebeband (obere und untere Seiten) zu begegnen und entfernen Sie groben Schmutz. Legen Sie die Sauberen Kammern in eine neue 15 cm Platte.
- Platzieren des MFC auf einer Glasbodenschale
- Legen Sie die Kammer in die Mitte einer Gewebekultur Grade 35 mm/ 50 mm Glas Bodenschale und wenden Sie geringfügige Kraft auf die Ränder, um die PDMS und Tellerboden binden. Um zu vermeiden, dass der Glasboden bricht, wenden Sie immer Kraft auf eine feste Oberfläche an.
- 10 min in 70 °C inkubieren. Drücken Sie die Kammern, um die Haftung an der Platte zu stärken.
- Unter UV-Licht für 10 min inkubieren.
- Beschichtung und Kultivierung
- 1,5 ng/ml Poly-L-Ornithin (PLO) in beide Fächer geben. Stellen Sie sicher, dass der PLO durch die Kanäle läuft, indem Sie die Beschichtungsmedien ein paar Mal direkt im Kanaleingang pipetieren.
- Untersuchen Sie die mikrofluidische Kammer unter einem Lichtmikroskop mit 10-facher Vergrößerung, um das Vorhandensein von Luftblasen zu überprüfen. Wenn Luftblasen die Mikrorillen blockieren, legen Sie den MFC 2 min in einen Vakuum-Austrocknungsor. Entfernen Sie später die überschüssige Luft, die in den Kanälen gefangen wurde, indem Sie die Beschichtungsmedien durch sie pfeifen. Über Nacht inkubieren.
- Ersetzen Sie PLO durch Laminin (3 g/ml in DDW) für die nächtliche Inkubation auf die gleiche Weise.
- Waschen Sie das Laminin vor der Beschichtung mit einem neuronalen Kulturmedium.
2. Neuronale Kulturbeschichtung
- Dissoziierte motorische Neuronenkultur
- Sezieren Sie mit gerader Schere und feiner Zange ein Rückenmark aus einem E12.5 ICR-HB9::GFP-Mausembryon. Arbeiten Sie in einer 1X HBSS-Lösung mit 1% Penicillin-Streptomycin (P/S) (Abbildung 3A-C).
- Entfernen Sie mit einer Mikrodissektionsschere die Meningen und die Dorsalhörner (Abbildung 3D).
- Sammeln Sie die Rückenmarksstücke und übertragen Sie auf Rohr (#1) mit 1 ml HBSS + 1% P/S.
- Schneiden Sie die Rückenmarkse mit einer gebogenen Schere in kleine Stücke und warten Sie, bis sich die Stücke absetzen.
- Fügen Sie 10 l Trypsin 2,5% hinzu und in ein 37 °C-Wasserbad für 10 min. Nach 5 min, mischen, indem Sie das Rohr. Die Stücke sollten einen helixartigen Klumpen bilden.
- Übertragen Sie den Klumpen in ein neues Röhrchen (#2), das 800 l vorgewärmte L-15, 100 l BSA 4% und 100 l mit 10 mg/ml DNase enthält. 2x schleifen, dann 2 min warten, um unzisoziierte Stücke absetzen zu lassen. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre (#3).
- Fügen Sie 100 l BSA 4%, 20 l mit 10 mg/ml DNase und 900 l vollständiges neurobasales Medium hinzu (CNB, siehe Tabelle der Materialien und Tabelle 1). Schleifen Sie 8x und warten Sie 2 min. Sammeln Überstand zu Rohr #3.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1.7 und schleifen Sie 10x. Sammeln Überstand zu Rohr #3. Eine kleine Menge Gewebe sollte an der Unterseite des Rohres gelassen werden.
HINWEIS: Wenn ein großer Klumpen immer noch an der Unterseite des Rohrs #2bleibt, wiederholen Sie Schritt 2.1.8. - Fügen Sie 1 ml BSA 4% Kissen auf den Boden der Rohr#3.
- Zentrifuge bei 400 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Zellpellet wieder auf, indem Sie vorsichtig auf das Rohr tippen, und fügen Sie dann 1 ml CNB-Medium hinzu. Pipette 6x und fügen Sie 20 l von 10 mg/ml DNase hinzu.
- Ergänzung mit zusätzlichen 5 ml CNB Medium und Transfer 3 ml auf ein neues Rohr (#4).
- Fügen Sie 1 ml mit 10,4 % Dichtegradientenmedium (siehe Tabelle 2) an den Boden jedes Rohres(#3 und #4) hinzu. Es sollte eine scharfe Phasentrennung zwischen den beiden Schnittstellen angezeigt werden.
- Zentrifuge bei 775 x g für 20 min bei Raumtemperatur (RT). Die Zentrifugenverzögerung sollte auf ein niedriges Niveau eingestellt werden, um einen Zusammenbruch der Phasentrennung zu vermeiden.
- Zellen sollten schwebend sein und als trübe Interphase zwischen den Medien erscheinen. Sammeln Sie die Zellen aus beiden Röhren in ein neues Rohr (#5) bereits mit vorgewärmten 1 ml CNB Medium.
- Fügen Sie weitere 4-6 ml CNB Medium hinzu.
- Fügen Sie 1 ml BSA 4% Kissen an der Unterseite des Rohres hinzu.
- Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet vorsichtig mit 1 ml CNB-Medium wieder auf.
- Zählen Sie die Zellen. Es wird eine Ausbeute von 0,75-1 x 106 MN pro Rückenmark erwartet.
HINWEIS: Das Ventralrückenmark enthält neben motorischen Neuronen (z. B. Interneurons) auch andere neuronale Subtypen. MN Reinheit hängt vor allem von der Entfernung von dorsalen Bereichen während der Zerlegung und die Fähigkeit, MN angereicherte rostrale Bereiche zu erreichen. Um sicherzustellen, dass es sich bei den abgebildeten Neuronen um MNs handelt, wird die Verwendung eines Mäusestamms mit einem endogenem MN-Marker, wie HB9::GFP-Mäuse, empfohlen. Um eine reine MN-Kultur zu erreichen (aber mit verringerter Zellausbeute), ist die Verwendung von FACS-Reinigung15 möglich. - Plating dissoziierte MN-Kultur im MFC
- Konzentrat 150.000 MN pro Kammer durch Zentrifugieren bei 400 x g für 5 min.
- Den Überstand ansaugen und die Zellen im reichen neurobasalen Medium (RNB) vorsichtig bei 4 l pro MFC wieder aufsetzen. RNB wird CNB durch zusätzliche 2% B27 und 25 ng/mL BDNF ergänzt.
- Entfernen Sie das Medium aus beiden Fächern, so dass in den Brunnen des distalen Fachs ein geringes Volumen von 10 l bleibt. Es erscheint als dünner Ring von Medium im Brunnenumfang.
- Laden Sie langsam 4 L Zellen in den Kanal. Nehmen Sie 4 L des Brunnens auf der anderen Seite des Kanals heraus und laden Sie sie langsam direkt wieder in den Kanal, um den Stromfluss umzukehren und die Zelldichte im Kanal zu maximieren.
- Überprüfen Sie, ob die Zellen mit einem 10-fachen Lichtmikroskop in den Kanal eingedrungen sind, und legen Sie die Kammer 30 min lang im Inkubator auf, ohne weitere Medien hinzuzufügen.
- Fügen Sie die proximalen und distalen Brunnen langsam mit 10-15 l und rnB ein und legen Sie die Kammern für weitere 15 min in den Inkubator.
- Nach dieser Inkubation fügen Sie jedem Bohrgut langsam 75-80 L RNB hinzu.
- Dissoziierte MN-Kulturpflege
- Einen Tag nach der Beschichtung (DIV1) ersetzen Sie Medium durch RNB, ergänzt durch 1 M Cytosin-Arabinosid (Ara-C), um das Gliawachstum zu hemmen.
- Zwei Tage nach Ara-C Anwendung (DIV3) ersetzen Medium mit frischem CNB Medium im proximalen Fach (ohne Ara-C).
- Um die Kreuzung von Axonen durch die Mikrogrooves zu verbessern, wenden Sie RNB, ergänzt mit 25 ng/ml des glialen zellabgeleiteten neurotrophen Faktors (GDNF) und 25 ng/ml des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF), nur auf das distale Fach an. Halten Sie einen Volumengradienten von mindestens 10 l pro Brunnen zwischen den axonalen distalen Brunnen (höheres Volumen) und den proximalen Brunnen aufrecht.
- Erfrischen Sie das Medium alle 2 Tage. Es kann bis zu 4-6 Tage dauern, bis die Axone distally überquert werden.
- Rückenmark-Explantationskultur
- Sezieren Sie mit gerader Schere und feiner Zange ein Rückenmark aus einem E12.5 ICR-HB9::GFP-Mausembryon. Arbeiten Sie in einer 1X HBSS-Lösung mit 1% Penicillin-Streptomycin (P/S) (Abbildung 3A-C).
- Entfernen Sie mit einer Mikrodissektionsschere die Meningen und die Dorsalhörner (Abbildung 3D).
- Schneiden Sie das Rückenmark in 1 mm dicke Querprofile (Abbildung 3E). Entsorgen Sie das gesamte Medium aus dem proximalen Fach des MFC.
- Nehmen Sie eine einzelne Rückenmarksexplantation mit einer Pipette in einem Gesamtvolumen von 4 l auf. Injizieren Sie das Explant so nah wie möglich an die Höhle und ziehen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem proximalen Brunnen über die seitlichen Auslässe (1 mm Schläge). Die Explants sollten in den proximalen Kanal gesaugt werden.
- Fügen Sie langsam 150 l Rückenmarksexplantationsmedium (SCEX, siehe Tabelle der Materialien und Tabelle 3) zum proximalen Brunnen hinzu.
- Spinalmark-Explantationskultur Pflege
- Fügen Sie SCEX-Medium im proximalen Fach und reiches SCEX-Medium (SCEX mit 50 ng/ml BDNF und GDNF) in das distale Fach ein. Halten Sie einen Volumengradienten von mindestens 15 l pro Brunnen zwischen den distalen Brunnen (höheres Volumen) und dem proximalen Brunnen aufrecht.
- Erfrischen Sie das Medium alle 2 Tage. Es kann bis zu 3-5 Tage dauern, bis die Axone distally überquert werden.
3. Axonaltransport (Abbildung 4A)
- Kennzeichnung von Mitochondrien und sauren Fächern
- Bereiten Sie frisches SCEX-Medium (oder CNB für dissoziiertes MN) mit 100 nM Mitotracker Deep Red FM und 100 nM LysoTracker Red vor. 30-60 min bei 37 °C inkubieren. Andere Farben können verwendet werden, solange sich ihre Fluorophore nicht überlappen.
- 3x mit warmem CNB/SCEX Medium waschen. Die Platten sind bildbereit.
- Live-Bildgebung
- Erfassen Sie 100 Zeitraffer-Bildserien des axonalen Transports in 3 s Intervallen, mit insgesamt 5 min pro Film.
HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Bildgebungssystem umfasste ein invertiertes Mikroskop, das mit einem konfokalen Spinnscheiben-Konfokal ausgestattet war und über eine Anstandszellen-Bildgebungssoftware, eine 60-fache Öllinse, NA = 1,4 und eine EMCCD-Kamera gesteuert wurde. Filme wurden in einer kontrollierten Umgebung bei 37 °C und 5%CO2erworben.
HINWEIS: Längere oder kürzere Zeitrafferfilme können je nach Experiment abgebildet werden. Bei Bedarf können auch Übernachtungsfilme aufgenommen werden. Es ist jedoch wichtig, zu versuchen, die Belichtungszeit und Laserleistung sowie die Anzahl der Gesamtbilder zu reduzieren, um phototoxizität und Bleichen während der Filmaufnahme zu verringern.
- Erfassen Sie 100 Zeitraffer-Bildserien des axonalen Transports in 3 s Intervallen, mit insgesamt 5 min pro Film.
4. Bildanalyse (Abbildungen 4-5)
- Analyse der Partikeltransportverteilung und -dichte mittels Kymographenanalyse
- Öffnen Sie die Datei in FIJI. Separate Kanäle drücken Bild | Stapel | Werkzeuge | Deinterleave.
- Festlegen von Bildeigenschaften durch Drücken von Bild | Eigenschaften.
- Wählen Sie das Segmentierte Linienwerkzeug aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Liniensymbolklicken. Legen Sie die Breite auf 8-10 fest, indem Sie auf das Liniensymboldoppelklicken. Seien Sie während der gesamten Analyse mit der gleichen Linienbreite konsistent.
- Markieren Sie eine segmentierte Linie, die dem Axonpfad von distal zu proximal folgt. Doppelklicken Sie, um die Linienmarkierung zu beenden.
- Klicken Sie auf t, um dem ROI Managereine neue Zielregion von Interesse (ROI) hinzuzufügen. Fügen Sie diese einer Tabellenkalkulationsanalysetabelle hinzu.
- Klicken Sie auf m, um Fläche und Länge des Axons zu messen. Fügen Sie diese der Analysetabelle hinzu.
- Generieren Sie einen Kymographen, indem Sie auf Plugins klicken | KymoToolBox | Zeichnen Kymo. Alternativ können auch andere verfügbare Kymograph-Generierungs-Plugins verwendet werden.
- Zählen Sie manuell bewegliche (retrograde oder anterograde) und nicht bewegte Partikel und fügen Sie sie der Tabelle in der richtigen Spalte hinzu.
HINWEIS: Partikel werden als sich bewegender Anterograde (d. h. sich links im Kymograph) oder retrograde (d. h. nach rechts bewegend) klassifiziert, wenn ihre Verschiebung in der spezifischen Richtung höher als 10 m ist. Es ist möglich, die Verschiebung einfach zu messen, indem Sie eine horizontale Linie mit dem Liniensymbol markieren und mdrücken. Immobile Partikel oder solche, die die Verschiebungskriterien nicht erfüllen, werden als nicht bewegend definiert (Abbildung 4B).
- Einzelpartikelverfolgung: Manuelle Segverfolgung
- Laden Sie das manuelle Tracking-Plugin für die FIJI-Software (entwickelt von Fabrice P. Cordeliére) von http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
- Öffnen Sie die Datei in FIJI/ImageJ. Verwenden Sie die Option Drehen, um die MFC-Nuten horizontal auszurichten.
- Um das Signal-Rausch-Verhältnis bei Bedarf zu verbessern, klicken Sie auf Prozess | Hintergrund subtrahieren.
- Öffnen Sie das Manual Tracking Plugin. Stellen Sie die Parameter (z. B. Pixelgröße, Zeitintervall usw.) entsprechend dem für die Bildgebung verwendeten Mikroskop ein. Für die hier gezeigten Ergebnisse betrug das Verhältnis von Mikroskop und Linse 0,239 m/Pixel und das Rahmenintervall 3 s.
- Rufen Sie die Spuren X- und Y-Koordinaten ab, und speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie den Text in die Kalkulationstabelle kopieren.
- Analysieren von Filmen mit mehreren Kanälen, indem Sie auf Bild | Farbe | Merge Channels, um die Kanäle zusammenzuführen und dann nur kolokalisierte Punktzeichen zu verfolgen.
- Einzelpartikelverfolgung: Halbautomatisches Tracking (Abbildung 5)
- Öffnen Sie die Analysesoftware. Diese Studie verwendete Bitplane Imaris Software Version 8.4.1.
- Wechseln Sie im oberen Menü zu Surpass.
- Klicken Sie auf Bildverarbeitung | Swap-Zeit und Z | Ok.
- Klicken Sie auf Bearbeiten | Bildeigenschaften (Strg+I) | Geometrie | Voxel Größe Reihe. Legen Sie die Bildeigenschaften entsprechend dem verwendeten Mikroskopie-Setup fest.
HINWEIS: Für die hier angezeigten Daten betrug das Verhältnis von Mikroskop und Objektiv 0,239 m/Pixel. - Klicken Sie auf Alle Äquidistanten, und ändern Sie das Zeitintervall. Verwenden Sie beispielsweise 3 s als Intervall. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen rechts unten oder auf Strg+B.
- Fügen Sie Spots oben links einen Fleck-Layer hinzu, indem Sie auf ein Symbol mit kleinen gelben Fleckenklicken. Unten links wird ein neues Menü zum Bearbeiten der Spots geöffnet.
- Drücken Sie den rechten blauen Pfeil, bis die Spoterkennung beginnt.
HINWEIS: Es ist wichtig, einige der Punkte mit dem Filter unten links im Fenster herauszufiltern. Überprüfen Sie den Film mehrmals, um festzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von Punkten ausgewählt ist. - Überprüfen oder konfigurieren Sie die Parameter, um den experimentellen Anforderungen gerecht zu werden. Zum Beispiel Max Distance = 12 'm (Der maximal zulässige Abstand zwischen zwei unterschiedlichen Punkten, um sie weiterhin in eingleisig einzuschließen); Max Gap Size = 1 (Die Anzahl der Frames, die eine Spur verpassen darf und immer noch als eine Spur betrachtet wird).
- Klicken Sie auf Einstellungen und dann Aufspurstil = Aus, Punkte = Kugel.
- Wählen Sie mit der Filterleisteverschiedene Filter für die Anpassung aus. In den hier angegebenen Daten wurden z. B. Track Duration = 9 alle Spuren mit weniger als 3 Frames entfernt. Wenn alle Parameter festgelegt sind, klicken Sie auf den rechten grünen Pfeil. Eine weitere Bearbeitung ist nach diesem Schritt nicht mehr möglich.
- Klicken Sie auf den Kleinen Bleistift mit Punkten, um alle Spuren manuell zu bearbeiten.
- Sehen Sie sich den Film an (Abbildung 5B). Wenn ein Fehler auftritt, gibt es mehrere mögliche Optionen:
- Um eine Spur zu trennen, klicken Sie auf die Option Objekt, und wählen Sie die beiden Punkte aus, die getrennt werden müssen, undwählen Sie Trennen.
- Um eine Spur zu verbinden, klicken Sie auf die Option Objekt, wählen Sie die beiden Punkte aus, die verbunden werden müssen, und wählen Sie Verbindenaus.
- Um eine Spur oder einen Spot mit der rechten Option (Spur/Objekt) zu löschen, wechseln Sie mit dem regulären Bleistiftsymbolzum Bildschirm, und wählen Sie Löschenaus.
- Um Flecken manuell hinzuzufügen, wechseln Sie zum Regulären Bleistiftsymbolbildschirm. Am unteren Rand des Bildschirms befindet sich ein manuelles Tracking-Zeichen. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Auto-Connect Vist. Halten Sie auf dem Film selbst die Umschalttaste gedrückt, um einen Punkt hinzuzufügen, und klicken Sie auflinks klicken.
- Um einer vorhandenen Spur einen Punkt hinzuzufügen, wählen Sie eine gewünschte Spur (gelb) und einen Rahmen aus, wechseln Sie zum regulären Bleistiftsymbolbildschirm und fügen Sie manuell einen Spot hinzu. Wenn der gesamte Film fertig ist, wechseln Sie zum Symbol, das wie ein roter Graph aussieht (Statistik). Es ist möglich, die analysierten Parameter später zu bearbeiten. Um zu bearbeiten, drücken Sie unten links auf dem Bildschirm das schwedische Schlüsselsymbol. Beispiel: Position X, Position Y.
- Drücken Sie auf das Symbol, das wie mehrere Disketten aussieht, Exportieren Sie alle Statistiken.
HINWEIS: Die Tabellenkalkulationsausgabe kann entweder direkt verarbeitet oder mit dem für diese Analyse verwendeten veröffentlichten Code9 weiter analysiert werden, der auf Anfrage geteilt wird. Die folgenden Parameter werden aus der Analyse extrahiert: Geschwindigkeit, Spurverschiebung, Lauflänge, Geschwindigkeit (einschließlich Richtungseinstellung), Stoppanzahl, durchschnittliche Stoppdauer, Alpha, Richtungsänderungen und Sofortige Geschwindigkeit. Eine detaillierte Erklärung der einzelnen Parameter ist in Gluska et al.9beschrieben.
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Representative Results
Nach dem beschriebenen Protokoll wurden Mausembryonale HB9::GFP Rückenmarksexplantationen in MFC kultiviert (Abbildung 4A). Die Explants wurden 7 Tage lang angebaut, als Axone vollständig in das distale Fach gelangten. Mitotracker Deep Red und Lysotracker Rote Farbstoffe wurden den distalen und proximalen Fächern hinzugefügt, um die Mitochondrien und sauren Fächer zu kennzeichnen (Abbildung 4C). Axone in den distalen Grooves wurden abgebildet, und die Filme wurden wie folgt analysiert: Zuerst verglichen wir die allgemeine Bewegungsverteilung mit Kymographenanalyse (Abbildungen 4B,D). Diese Analyse ergab eine Verzerrung in retrograde Randrichtung nur in sauren Kompartimenten (nicht bewegend = 77,1 x 9,5 %; retrograde = 16,9 x 8,3 %, Anterograde = 6 x 5 %; Abbildung 4E), jedoch nicht im mitochondrialen Verkehr (nicht bewegt = 83,4 x 6,8 %; retrograde = 10,5 x 6,9 %; Anterograde = 6,8 x 5,1 %; Abbildung 4F). Die Kymographenanalyse wurde verwendet, um die Partikeldichte zu quantifizieren und eine höhere Anzahl von mitochondrialen Partikeln im Vergleich zu sauren Kompartimenten in HB9::GFP Spinalmark-Explantationsaxonen (Mitochondrien = 0,46 x 0,13; Saure Kompartimente = 0,3 x 0,07 Partikel/Axt, Abbildung 4G).
Als nächstes wurde eine Einzelpartikeltransportanalyse mit halbautomatischer Software durchgeführt, gefolgt von internem Code (Abbildung 5A-B). Diese Analyse ergab, dass trotz ähnlicher Partikelgeschwindigkeit im Allgemeinen (Abbildung 5C), bei der Beobachtung der Geschwindigkeitenverteilung (Abbildung 5D) nur saure Kompartimente, aber keine Mitochondrien eine Verzerrung gegenüber retrograder Bewegung zeigten.
Abbildung 1: Herstellung von Silikonform. Schematische Zeichnung, die das Verfahren der Chlorotrimethylsilan-Waferreinigung beschreibt. (A) Zunächst wurden einem geeigneten Behälter 50 ml flüssiger Stickstoff zugesetzt. In einer chemischen Haube wurden eine Spritze und eine Nadel verwendet, um 8 ml flüssigen Stickstoff zu ziehen. Der gesamte Inhalt der Spritze wurde in die Chlorotrimethylsilanflasche injiziert. Die Flasche wurde mit der Kappe nach unten gedreht und 8 ml Chlorotrimethylsilan wurden zurückgezogen. (B) Chlorotrimethylsilan im Behälter (nicht direkt auf dem Wafer) verteilt. Der Behälter muss geschlossen werden, gefolgt von 5 min Inkubation für jede Form. (C) Flüssiges PDMS wurde bis zur gewünschten Höhe in jeden Wafer gegossen. (D) Alle Platten wurden für 2 h in einem Vakuum-Ausweichtrockner zusammengelegt, gefolgt von 3 h-Übernachtung in einem 70 °C-Ofen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: MFC-Spezialdesign. (A) Polymerisierte PDMS-Schablone aus der Form mit einem Metallskalpell. (B) Je nach Versuchsaufbau wurden zum Stanzen der PDMS-Vorlagen entweder 6 mm, 7 mm oder 1 mm Stanzer verwendet. (C) Für die Explant-Kultur im MFC wurden 7 mm und 1 mm Stanzer verwendet, und eine 20 G Spritze wurde für die Herstellung von "Höhlen" für einfaches Einsetzen von Explanten verwendet. (D) Für die dissoziierte MN-Kultur MFC wurde ein 6-mm-Stanzer verwendet, um vier Bohrungen an den Kanalkanten zu erstellen. (E-F) Abbildungen der endgültigen MFC-Shapes, die in C bzw. Dbeschrieben sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Neuronale Kultur. (A) E12.5 Mausembryon wurde in Position gebracht, nachdem Kopf, Schwanz und Haut entfernt wurden, um das Neuralrohr freizulegen. (B) Zerlegung des gesamten Rückenmarks. (C) Mit sanften Zangen wurden die Meninges vom Rückenmark abgezogen. (D) Linkes Panel: Entfernung der seitlichen Rückenmarkssegmente aus dem ventralen Rückenmark, um eine bessere MN-Reinigung zu erzielen. Rechtes Panel: Repräsentatives Bild der dissoziierten MN-Kultur im MFC. HB9::GFP Axone kreuzten sich ins distale Fach (grün). Hoechst Färbung zeigt neuronale Kerne (blau). (E) Rückenmarksexplantationen, die durch Sezieren von 1 mm dicken Querabschnitten des ventralen Rückenmarks erzeugt werden. Repräsentatives Bild von HB9::GFP (grün) Rückenmarksexplantaxone in einem MFC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Axonaler Transport von Mitochondrien und sauren Fächern in MNs. (A) Abbildung des axonalen Transportes. Lysotracker Red und Mitotracker Deep Red wurden sowohl zu den proximalen als auch in den distalen Fächern des MFC hinzugefügt, die HB9::GFP ventrales Rückenmarksexplantation enthalten. (B) Kymographenanalyse. Bewegliche Teilchen wurden definiert als sich nach einer Verschiebung von mehr als 10 m in diese Richtung zu bewegenantem oder retrogradem. Rotierende oder unbewegliche Partikel wurden als nicht bewegend gezählt. Maßstabsbalken = 10 m . (C) Erster Rahmen eines Zeitrafferfilms, der primäre HB9::GFP-Maus-Rückenmarks-Explantationsaxone zeigt, die mit Lysotracker rot gefärbt sind, um saure Fächer und Mitotracker Deep Red zu markieren, um Mitochondrien zu markieren. Skala bar = 10 m . (D) Repräsentative Kymographen, die eine typische axonale Bewegung von sauren Kompartimenten und Mitochondrien zeigen. Skala bar = 10 m. (E) Kymographenanalyse des mitochondrialen axonalen Transports, ****p < 0.0001, Anova mit Holm-Sidak-Korrektur (n = 77 Axone). Skala bar = 10 m (F) Kymographenanalyse des sauren Kompartiment-Axontransports, ** p < 0,01, ****p < 0,0001, Anova mit Holm-Sidak-Korrektur (n = 77 Axone). (G) Axonale Partikeldichteanalyse von Mitochondrien und sauren Kompartimenten, ****p < 0,0001, Schüler-T-Test (n = 77 Axone). Fehlerbalken stellen Werte mit SD dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Halbautomatische Einzelpartikelanalyse zur Messung der Organelle-Geschwindigkeit. (A) Schematischer Workflow für die halbautomatische Einzelpartikeltransportanalyse. (B) Ventralrücken-Explantationsaxone wurden auf Einzelpartikelverfolgung analysiert. Die Analysesoftware ist in der Lage, einzelne axonale Partikel in Zeitrafferfilmen zu verfolgen, wie für Mitochondrien (gelbe Punkte, Oberteil) und saure Fächer (grüne Punkte, unteres Panel) angegeben. (C) Die durchschnittliche Geschwindigkeit änderte sich nicht zwischen Mitochondrien und sauren Kompartimenten, Mann Whitney Test (n = 417 Mitochondrien, n = 371 saure Kompartimente). Fehlerbalken stellen Werte mit SD. (D) Verteilung der mitochondrialen und sauren Fächer retrograde und anterograde Geschwindigkeiten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Komplettes neurobasales Medium – für 50ml | ||
| Zutat | Volumen | Konzentration |
| Neurobasal | 47ml | |
| B27 | 1 ml | 2% |
| Pferdeserum | 1 ml | 2% |
| P/S | 0,5 ml | 1% |
| L-Glutamin (Glutamax) | 0,5 ml | 1% |
| Beta-Mercaptoethanol (50mM) | 25 l | 25 M |
| BDNF (10ug/ml) | 5 l | 1ng/mL |
| GDNF (10ug/ml) | 5 l | 1ng/mL |
| CNTF (10ug/ml) | 2,5 l | 0,5ng/ml |
Tabelle 1: Rezept für die Herstellung einer kompletten neurobasalen (CNB) Lösung.
| Optiprep-Lösung – für 10 ml | ||
| Zutat | Volumen | Konzentration |
| Ddw | 5,27 ml | |
| Dichtegradient Medium (Optiprep) 60% | 1,73 ml | 10,4% (mit/v) |
| Tricine 100mM | 1 ml | 2% |
| Glukose 20% (w/v) | 2 mL | 2% |
Tabelle 2: Rezept für die Herstellung der Dichte Gradienten mittlere Lösung.
| Spinal Cord Explant Medium (SCX) – für 20ml | ||
| Zutat | Volumen | Konzentration |
| Neurobasal | 19,5 ml | |
| B27 | 200 l | 2% |
| P/S | 100 l | 1% |
| L-Glutamin (Glutamax) | 100 l | 1% |
| Bdnf | 50 l | 25ng/ml |
Tabelle 3: Rezept für die Herstellung von Rückenmarksexplantation (SCEX) Lösung.
| MN-Kultur | Spinal Cord Explants |
| Längeres Verfahren vor der Beschichtung | Kurzes Verfahren – Sezieren & Platte |
| Zusätzliche Vorsicht bei der Beschichtung in MFC erforderlich | Einfacher es, im MFC zu verblechen |
| Hohe Konzentration von motorischen Neuronen ohne Gliazellen – genauer | Vorhandensein von Gliazellen und anderen neuronalen Typen – physiologischer |
| Unbegrenzte Manipulationsmöglichkeiten auf Soma und Axonen | Begrenzte Manipulationsmöglichkeiten an Zellkörpern |
| Einfache Immunfärbung für Zellkörper und Axone | Geringer Wirkungsgrad bei der Immunfärbung von Zellkörpern innerhalb der Explantation. |
| Hohe Effizienz der Virusinfektion | Sehr geringe Effizienz der Virusinfektion |
Tabelle 4: Vergleich zwischen Rückenmarksexplantationen und dissoziierter MN-Kultur basierend auf Geschwindigkeitsperimetern, Machbarkeit, Gliapräsenz, Manipulationsmöglichkeiten, Immunfärbung und Virusinfektion.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir ein System zur Verfolgung des axonalen Transports von Mitochondrien und sauren Kompartimenten in motorischen Neuronen. Diese vereinfachte In-vitro-Plattform ermöglicht eine präzise Steuerung, Überwachung und Manipulation subzellulärer neuronaler Kompartimente und ermöglicht eine experimentelle Analyse der lokalen Funktionen des motorischen Neurons. Dieses Protokoll kann nützlich sein, um MN-Erkrankungen wie ALS zu studieren, um sich auf das Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus der axonalen Transportfunktionsstörung bei der Krankheit10,16zu konzentrieren. Darüber hinaus kann dieses System auch für die Untersuchung des Transports von trophischen Faktoren9,16, microRNA10, mRNA8, und markierten Proteinen in gesunden und kranken MNs oder in anderen Neuronen, wie sensorische9 oder sympathische Axone14, angewendet werden. Eine ähnliche Methode kann auch angewendet werden, um Organelle Transport in einem Cokultursystem zu studieren, wie MNs mit Skelettmuskelzellenkultiviert 12 oder sympathische Neuronen mit Kardiomyozyten14kokultiviert. Das MFC-System kann verwendet werden, um aktive NMJs17,18 zu erzeugen und die Wirkung der Synapsenbildung auf den axonalen Transport16zu untersuchen.
Dieses Protokoll hat mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen Protokollen für die Kultivierung von Neuronen in MFC und die Verwendung von Live-Bildgebung zur Analyse des axonalen Transports: 1) MFCs sind von mehreren Herstellern kommerziell erhältlich. Die Selbstfertigung der MFCs ist jedoch im Vergleich zur kommerziellen Alternative äußerst kostengünstig. Ein einzelner PDMS-Wafer liefert vier große MFCs oder neun kleine zu einem minimalen Aufwand von mehreren US-Dollar für das PDMS-Harz selbst. 2) Die selbst gefertigten MFCs können modifiziert werden, um spezifische experimentelle Bedürfnisse zu erfüllen (z. B. Änderung der Größe und Lage der Brunnen, Erhöhung der Dicke des MFC PDMS). 3) Die MFCs können irreversibel an einer Platte befestigt werden (über Plasmabindung), können aber auch mehrfach recycelt werden, um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren. 4) Die PDMS-MFCs sind transparent, was sie ideal für Live-Bildgebung macht, da sie einen reduzierten Hintergrund haben, was für axonale Transporttests, bei denen die Unterscheidung zwischen Signal und Rauschen ein begrenzender Faktor sein könnte, von entscheidender Bedeutung ist. 5) Rückenmarksexplantationskultur ist sehr effizient und schnell. Ein embryonales Rückenmark kann bis zu 30 Explantationen ergeben, genug für 10 MFCs. Dies kann helfen, Zeit und Materialien zu sparen, und stellt sicher, dass auch eine schwangere Maus mit wenigen Embryonen ein erfolgreiches Experiment produzieren kann. Siehe einen detaillierten Vergleich von Rückenmarksexplantation und dissoziierter MN-Kultur in Tabelle 4.
Dieses Protokoll ist relativ einfach und kostengünstig. Es erfordert jedoch Fachwissen in verschiedenen technischen Fragen. Die Herstellung und Handhabung des MFC muss präzise und schonend sein, um beispielsweise strukturelle Defekte und die Bildung von Luftblasen im obligatorischen Vakuumschritt (1.1.10) zu vermeiden. Während des optionalen Vakuumschritts (1.6.2) ist es wichtig, die gesamte Luft zu löschen, oder es blockiert die axonale Überquerung, aber auch das Vakuum kurz halten, um eine Ablösung des MFC vom Glas zu vermeiden. Achten Sie genau auf die Sezierprotokollschritte, da es wichtig ist, die Meningen und Rückenhörner richtig zu entfernen, sowie zu versuchen, die Stücke auf die richtige Größe zu schneiden, um sie in die MFC-Höhle zu setzen, ohne physikalische Gewalt zu verwenden. Jede übermäßige physikalische Kraft, die auf den MFC angewendet wird, kann die Rillen oder den gesamten MFC leicht lösen, daher sollte das Verfahren schonend durchgeführt werden. Die Kultivierung von MNs und deren Beschichtung im MFC müssen relativ schnell erfolgen, da MNs dazu neigen, sich unter Stressbedingungen wie dem geringen mittleren Volumen des Beschichtungsschritts schnell zu aggregieren und ihre Lebensfähigkeit zu verlieren. Die Beschichtung im MFC sollte in geringem Volumen erfolgen, um eine ordnungsgemäße Befestigung der Neuronen im MFC-Kanal zu ermöglichen, und nach nicht mehr als 30 min erwärmtem Medium sollte sehr sanft hinzugefügt werden, um eine Ablösung der MNs zu verhindern.
Nach mehreren Tagen in der Kultur, und sobald Axone bis zum distalen Fach erweitert haben, sind die Kulturen bereit, Organellenfärbung gefolgt von der Erfassung von axonalen Transportfilmen und schließlich ein spezifisches Verfahren für die Bildanalyse zu unterziehen. Die Analyse kann entweder durch einzelne Partikelverfolgung im Laufe der Zeit oder durch verwendung eines automatisierten oder halbautomatischen Tracking-Algorithmus durchgeführt werden. Unserer Erfahrung nach sind automatisierte Methoden weniger zeitaufwändig, haben aber mehrere Nachteile. Hauptsächlich wird die zuverlässigkeit der automatischen Nachverfolgung verringert, mit überfüllten Axonen, die Pfade kreuzen. Darüber hinaus haben automatisierte Algorithmen eine verringerte Fähigkeit, zwischen überlappenden Partikeln zu unterscheiden. Daher wird die manuelle oder halbautomatische Nachverfolgung empfohlen. Im Allgemeinen ist halbautomatisches Tracking vorzuziehen, da es weniger zeitaufwändig ist, aber manuelles Tracking kann eine gute Option sein, wenn keine kostenpflichtige Software verfügbar ist. Einen gründlichen Vergleich zwischen manueller und automatischer Analyse finden Sie in Gluska et al.9.
Zusammenfassend kann die Annahme dieses einfachen Protokolls wichtige Daten für die Untersuchung des axonalen Transports verschiedener zellulärer Komponenten liefern. Es kann angepasst werden, um eine Vielzahl von bildgebenden Setups und neuronalen Subtypen, sowie kokulturen von Neuronen mit anderen Zellen anzupassen. Es ermöglicht auch eine ausgeprägte räumliche pharmakologische Manipulation von Zellkörpern oder Axonen, um grundlegende Mechanismen der neuronalen Gesundheit zu verstehen und die Arzneimittelentwicklung bei Krankheiten mit verändertem axonalen Transport zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Israel Science Foundation (ISF, 561/11) und des Europäischen Forschungsrates (ERC, 309377) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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