Summary
Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé des neurones moteurs. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode détaillée pour suivre le transport axonal des compartiments acides et des mitochondries dans les axones des neurones moteurs à l’aide de chambres microfluidiques.
Abstract
Les neurones moteurs (MNs) sont des cellules fortement polarisées avec de très longs axones. Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé de MN, contribuant à la croissance neuronale, au développement, et à la survie. Nous décrivons une méthode détaillée pour l’utilisation des chambres microfluidiques (MFC) pour le suivi du transport axonal des organites étiquetés fluorescents dans les axones MN. Cette méthode est rapide, relativement peu coûteuse, et permet la surveillance des indices intracellulaires dans l’espace et le temps. Nous décrivons un protocole étape par étape pour : 1) Fabrication de MFC en polydiméthylsiloxane (PDMS); 2) Le plating des explantations ventrales de moelle épinière et de la culture dissociée de MN dans les CFC ; 3) Étiquetage des mitochondries et des compartiments acides suivis de l’imagination confocale vivante; 4) Analyse de transport axonal manuelle et semi-automatique. Enfin, nous démontrons une différence dans le transport des mitochondries et des compartiments acides de HB9::GFP ventrale moelle épinière explant axones comme une preuve de la validité du système. Au total, ce protocole fournit un outil efficace pour étudier le transport axonal de divers composants axonaux, ainsi qu’un manuel simplifié pour l’utilisation de MFC pour aider à découvrir les possibilités expérimentales spatiales.
Introduction
Les MN sont des cellules fortement polarisées avec de longs axones, atteignant jusqu’à un mètre de long chez les humains adultes. Ce phénomène crée un défi critique pour le maintien de la connectivité et de la fonction MN. Par conséquent, les MN dépendent d’un bon transport d’informations, d’organites et de matériaux le long des axones de leur corps cellulaire à la synapse et au dos. Divers composants cellulaires, tels que les protéines, l’ARN et les organites, sont transportés régulièrement à travers les axones. Les mitochondries sont des organites importants qui sont systématiquement transportés dans les MN. Les mitochondries sont essentielles pour une activité et une bonne fonction des MN, responsables de la fourniture de l’ATP, de la mise en mémoire tampon du calcium et des processus de signalisation1,,2. Le transport axonal des mitochondries est un processus bien étudié3,4. Intéressant, des défauts dans le transport mitochondrial ont été rapportés pour être impliqués dans plusieurs maladies neurodégénératives et spécifiquement dans les maladies de MN5. Les compartiments acides servent d’autre exemple pour les organites intrinsèques qui se déplacent le long des axones MN. Les compartiments acides comprennent les lysosomes, les endosomes, l’appareil trans-Golgi, et certaines vésicules sécrétrices6. Des défauts dans le transport axonal des compartiments acides ont été trouvés dans plusieurs maladies neurodégénératives aussi bien7, et les articles récents soulignent leur importance dans les maladies de MN8.
Pour étudier efficacement le transport axonal, les chambres microfluidiques qui séparent les compartiments somatiques et axonaux sont fréquemment utilisées9,10. Les deux avantages significatifs du système microfluidique, et la compartimentation et l’isolement des axones, le rendent idéal pour l’étude des processus subcellulaires11. La séparation spatiale entre les corps des cellules neuronales et les axones peut être utilisée pour manipuler les environnements extracellulaires de différents compartiments neuronaux (p. ex., axones vs soma). Les essais biochimiques, neuronaux de croissance/dégénérescence et d’immunofluorescence bénéficient tous de cette plate-forme. Les IMF peuvent également aider à étudier la communication de cellule à cellule en cocultant des neurones avec d’autres types de cellules, tels que les muscles squelettiques12,13,14.
Ici, nous décrivons un protocole simple mais précis pour surveiller les mitochondries et le transport de compartiment acide dans les neurones moteurs. Nous montrons en outre l’utilisation de cette méthode en comparant le pourcentage relatif d’organites mobiles rétrogrades et antérgrades, ainsi que la répartition de la vitesse de transport.
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Protocol
Les soins et le traitement des animaux dans ce protocole ont été effectués sous la supervision et l’approbation du Comité universitaire d’éthique animale de l’Université de Tel Aviv.
1. Préparation MFC
- PDMS coulé dans les moules primaires (Figure 1)
- Acheter ou créer des moules primaires (gaufrettes) suivant un protocole détaillé9.
- Utilisez de l’air pressurisé pour enlever tout type de saleté de la plate-forme de gaufrettes avant de passer à l’étape de revêtement. La surface des gaufrettes doit sembler lisse et claire.
- Remplir un contenant de 50 ml d’azote liquide. Préparer une seringue de 10 ml et une aiguille de 23 G.
REMARQUE : Toutes les procédures de ce pas en avant doivent être effectuées dans une hotte chimique. - Dans le capot chimique, utilisez la seringue et l’aiguille pour mettre en commun 2 ml d’azote liquide. Bien qu’il puisse sembler que l’air a été tiré, la seringue est remplie d’azote(figure 1A). Placer la plaque contenant des gaufrettes dans un contenant étanche.
- Visez une bouteille de chlorotrimethylsilane, percer le bouchon en caoutchouc à l’aide de la seringue remplie d’azote et injecter tout le contenu de la seringue dans la bouteille. Sans retirer l’aiguille, tourner la bouteille à l’envers et retirer 2 ml de chlorotrimethylsilane.
REMARQUE : En raison de la pression de la seringue, une petite quantité de chlorotrimethylsilane est pulvérisée hors de l’aiguille. Pour éviter un danger, pointez l’aiguille vers la paroi intérieure du capot(figure 1B). - Étendre le chlorotrimethylsilane uniformément dans le récipient (à partir de l’étape 1.1.4), mais pas directement sur la plaque de gaufrettes ou de plaque contenant des gaufrettes. Fermer le récipient et incuber pendant 5 min par gaufrette.
REMARQUE : Si c’est la première fois que la plaquette est recouverte de chlorotrimethylsilane, une incubation de 1 h devrait être autorisée pour chaque gaufrette. - Ne prenez pas les gaufrettes et le récipient hors du capot chimique pendant 30 min.
CAUTION: Le chlorotrimethylsilane est très volatil. - Peser la base PDMS (voir Tableau des matériaux) dans un tube de 50 ml et ajouter l’agent de durcissement PDMS à un ratio de 16:1 respectivement (p. ex., 47,05 g de base et 2,95 g d’agent de durcissement). Mélanger pendant 10 minutes à l’aide d’un rotateur à basse vitesse.
- Verser PDMS dans chaque plaque contenant des gaufrettes à la hauteur désirée(figure 1C).
REMARQUE : L’utilisation de chambres microfluidiques minces (jusqu’à 3-4 mm) améliore l’adhésion au plat de culture et prévient les fuites. - Placez toutes les plaques ensemble à l’intérieur d’un desiccateur à vide pendant 2 h (figure 1E). Ce processus enlève l’air emprisonné dans le PDMS, éliminant ainsi les bulles d’air et formant un moule clair et uniforme.
- Placer les assiettes à l’intérieur d’un four pendant 3 h (ou toute la nuit) à 70 oC(figure 1E).
REMARQUE : Les assiettes doivent être de niveau lorsqu’elles sont placées au four.
- PDMS coulé dans des moules époxy
REMARQUE : Étant donné que la préparation des gaufrettes est coûteuse, nécessite un équipement spécial et peut endommager les plaquettes fragiles, il est possible de générer des répliques époxy de gaufrettes. Les répliques sont moins chères, plus durables, et peuvent être utilisées pour la production de masse de chambres microfluidiques.- Cast et guérir PDMS (tel que décrit dans 1.1.8-1.1.11) dans la plaquette originale.
- Retirez et coupez les parties excédentaires du PDMS en ne laissant que les éléments microfluidiques et la zone fonctionnelle nécessaire pour les traiter en chambres microfluidiques.
- Enveloppez immédiatement le PDMS de ruban adhésif épais pour l’empêcher d’accumuler de la poussière.
- Choisissez un plat en plastique de qualité de culture tissulaire qui s’adapte à l’ensemble de PDMS à l’intérieur et laissez de la place pour l’époxy autour d’elle. La distance entre le PDMS et le plat en plastique doit être inférieure à 5 mm.
- Préparer une petite quantité de PDMS mélangé dans un rapport de 10:1 (base: agent de guérison). Le PDMS liquide frais sera utilisé pour coller le PDMS solide sur le fond de la plaque en plastique.
- Appliquer une quantité minimale de PDMS liquide sur le fond central de la plaque en plastique, puis retirer le ruban collant du PDMS et l’adhérer au fond du plat en plastique. Assurez-vous que les éléments microfluidiques sont orientés vers le haut.
- Laisser le SOP guérir pendant 30 min dans un four à 70 oC.
- Préparer la résine d’époxy en mélangeant la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 100:45 respectivement dans un tube à essai. Différentes résines époxy peuvent avoir des rapports de mélange différents. Le volume requis pour une plaque régulière de 100 mm est d’environ 40 ml.
- Laissez l’époxy bien mélanger pendant 10 min dans un rotateur jusqu’à ce que le mélange devienne visiblement homogène (c.-à-d., il n’y a pas d’artefacts visibles ressemblant à des fibres dans le liquide).
- Centrifugez le mélange d’époxy à 400 x g pendant 5 minutes pour enlever les bulles d’air prises à l’intérieur.
- Pendant la centrifugation, étendre une fine couche de graisse de silicone autour des murs et toutes les autres parties en plastique exposées du plat de culture. Cela empêchera l’époxy de polymériser avec le plastique du plat et permettra d’enlever l’époxy guéri facilement à la fin du protocole.
- Verser l’époxy lentement dans le plat jusqu’à ce qu’il couvre complètement le PDMS et va au-delà d’au moins 5 mm. Empêcher la formation de toutes les bulles dans l’époxy en gardant zéro distance entre le tube et la plaque. Placez la plaque dans un endroit sûr afin qu’elle ne soit pas déplacée pour les 48 h suivants.
- Après 48 h, l’époxy doit être complètement guéri. Insérer la plaque dans un four préchauffé à 80 oC pendant 3 h pour le durcissement final.
- Retirer l’époxy durci de l’assiette et le moule PDMS d’origine en secouant doucement la paroi en plastique de la plaque jusqu’à ce qu’elle se brise. Il devrait alors facilement se séparer de l’époxy et décoller.
- Une fois extraite, essuyez la graisse restante de la nouvelle réplique époxy et encartez-la à l’envers (c.-à-d., avec les éléments microfluidiques répliqués face vers le haut) dans un nouveau plat de culture. La réplique époxy est maintenant prête pour le casting PDMS.
- Utilisez de l’air pressurisé ou N2 pour souffler les restes de PDMS ou de saleté sur le moule époxy et le rincer 2x avec de l’isopropanol. Remplissez-le une troisième fois et incuber pendant 10 minutes sur une plaque de shaker orbital. Rincer le moule à nouveau 3x avec l’isopropanol et jeter le liquide restant. Sécher à l’air ou N2 ou placer dans un four à 70 oC jusqu’à ce qu’il soit sec.
REMARQUE : Suivez les procédures de sécurité lorsque vous travaillez avec l’isopropanol et le rejet. - Gardez les plaques de moule fermées jusqu’à la coulée. Suivez les étapes 1.1.8.-1.1.11.
- Poinçonnage et sculpture du PDMS en MFC (Figure 2)
- Couper et retirer le moule PDMS de la plaque en suivant les marques () sur les gaufrettes à l’aide d’un scalpel. Ne pas utiliser la force, car les moisissures sont fragiles(figure 2A).
- Suivez les instructions dessinées sur l’esquisse pour poinçonner et couper les chambres en fonction de la configuration expérimentale(figure 2B-F).
- Pour la culture de l’explantation de la moelle épinière(figure 2C,E), poinçonner deux puits de 7 mm dans le côté distal d’un grand MFC. Localiser les puits d’une manière qu’ils se chevauchent avec les bords du canal. Sur le côté proximale, poinçonner un puits de 7 mm au milieu du canal, avec un chevauchement minimal de sorte qu’il reste suffisamment d’espace pour les explants. Percer deux trous supplémentaires de 1 mm dans les deux bords du canal proximal. Tourner le MFC avec les éléments microfluidiques orientés vers le haut, et à l’aide d’une aiguille de 20 G, sculpter trois petites grottes explantées sur le poinçonné 7 mm bien.
- Pour la culture MN dissociée (figure 2D,F), poinçonner quatre puits de 6 mm dans les bords des deux canaux d’un petit MFC.
- Stériliser le MFC pour l’utilisation de la culture tissulaire
- Étendre les bandes de ruban collant de 50 cm de long sur le banc. Appuyez et retirez la chambre pour faire face au ruban adhésif (faces supérieures et inférieures) et enlever la saleté brute. Placer les chambres propres dans une nouvelle assiette de 15 cm.
REMARQUE : Ne pressez pas directement sur les éléments microfluidiques lorsque ceux-ci sont orientés vers le haut. - Incuber les chambres dans l’éthanol analytique de grade 70% pendant 10 min sur un shaker orbital.
- Disposer de l’éthanol et sécher les chambres dans une hotte de culture tissulaire ou dans un four à 70 oC.
- Étendre les bandes de ruban collant de 50 cm de long sur le banc. Appuyez et retirez la chambre pour faire face au ruban adhésif (faces supérieures et inférieures) et enlever la saleté brute. Placer les chambres propres dans une nouvelle assiette de 15 cm.
- Placer le MFC sur un plat de fond de verre
- Placez la chambre au centre d’un plat de fond en verre de qualité 35 mm/50 mm et appliquez une force mineure sur les bords pour faire lier le PDMS et le fond du plat. Pour éviter de casser le fond de verre, appliquez toujours la force sur une surface solide.
- Incubate 10 min en 70 oC. Appuyez sur les chambres pour renforcer l’adhésion à la plaque.
- Incuber sous la lumière UV pendant 10 min.
- Revêtement et culte
- Ajouter 1,5 ng/mL poly-L-ornithine (PLO) aux deux compartiments. Assurez-vous que l’OLP traverse les canaux en parcourant le support de revêtement à quelques reprises directement dans l’entrée du canal.
- Examinez la chambre microfluidique sous un microscope léger avec un grossissement 10x pour vérifier la présence de bulles d’air. Si les bulles d’air bloquent les microgrooves, placez le MFC dans un desiccateur de vide pendant 2 min. Plus tard, retirez l’excès d’air qui s’est fait prendre dans les canaux en parcourant les supports de revêtement à travers eux. Incuber toute la nuit.
- Remplacer l’OLP par de laminine (3 g/mL dans DDW) pour l’incubation pendant la nuit de la même manière.
- Avant le placage, laver le laminin avec le milieu de la culture neuronale.
2. Placage de la culture neuronale
- Culture dissociée de neurone moteur
- À l’aide de ciseaux droits et de forceps fins, disséquez une moelle épinière d’un embryon de souris E12.5 ICR-HB9::GFP. Travaillez dans une solution 1X HBSS avec 1% de pénicilline-streptomycine (P/S) (figure 3A-C).
- À l’aide de ciseaux de microdissection, retirez les méninges et les cornes dorsales(figure 3D).
- Recueillir les morceaux de moelle épinière et le transférer au tube (#1) avec 1 mL HBSS - 1% P/S.
- Couper la moelle épinière en petits morceaux à l’aide de ciseaux incurvés et attendre que les morceaux se déposent.
- Ajouter 10 L de trypsine 2,5% et placer dans un bain d’eau de 37 oC pendant 10 min. Après 5 min, mélanger en tapant sur le tube. Les pièces doivent former un bouquet en forme d’hélice.
- Transférer l’amas dans un nouveau tube(#2) contenant 800 L de L-15 pré-réenchaîné, 100 L de BSA 4%, et 100 L de 10 mg/mL DNase. Grind 2x, puis attendre 2 min pour laisser les pièces non-dissociées s’installer. Transférer le supernatant dans un nouveau tube(#3).
- Ajoutez 100 L de BSA 4 %, 20 ll de DNase de mg/mL, et 900 l de milieu neurobasal complet (CNB, voir Tableau des matériaux et tableau 1). Grind 8x et attendre 2 min. Recueillir supernatant à tube #3.
- Répétez l’étape 2.1.7 et broyez 10x. Recueillir supernatant à tube #3. Une petite quantité de tissu doit être laissée au fond du tube.
REMARQUE : Si un gros bouquet reste encore au bas du tube #2,répétez l’étape 2.1.8. - Ajouter 1 ml de coussin BSA de 4 % au fond du tube #3.
- Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant.
- Résuspendez la pastille cellulaire en tapant doucement le tube, puis ajoutez 1 ml de CNB moyen. Pipette 6x et ajouter 20 L de 10 mg/mL DNase.
- Supplément avec un supplément de 5 mL de CNB moyen et transférer 3 ml dans un nouveau tube(#4).
- Ajouter 1 ml de milieu de gradient de densité de 10,4 % (voir tableau 2) au fond de chaque tube(#3 et #4). Une séparation de phase nette entre les deux interfaces doit apparaître.
- Centrifugeuse à 775 x g pendant 20 min à température ambiante (RT). La décélération des centrifugeuses doit être réglée à un niveau bas pour éviter la rupture de la séparation de phase.
- Les cellules doivent flotter, apparaissant comme un interphase nuageux entre les médias. Recueillir les cellules des deux tubes dans un nouveau tube (#5) contenant déjà pré-réchauffer 1 mL CNB milieu.
- Ajouter 4 à 6 ml de CNB de moyenne supplémentaire.
- Ajouter 1 ml de coussin BSA de 4 % au fond du tube.
- Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à RT. Jeter le supernatant et réutiliser délicatement le granule avec 1 ml de CNB moyen.
- Comptez les cellules. Un rendement de 0,75-1 x 106 MN par moelle épinière est attendu.
REMARQUE : La moelle épinière ventrale contient également d’autres sous-types neuronaux en plus des neurones moteurs (p. ex., les interneurs). La pureté de MN dépend principalement de l’élimination des zones dorsales pendant la dissection et de la capacité d’atteindre les zones rostrales enrichies de MN. Pour s’assurer que les neurones photographiés sont des MNs, l’utilisation d’une souche de souris avec un marqueur MN endogène, comme les souris HB9::GFP, est recommandée. Pour atteindre la culture MN pure (mais avec le rendement cellulaire diminué), l’utilisation de facS purification15 est possible. - Placage de la culture MN dissociée dans le MFC
- Concentrez 150 000 MN par chambre en centrifugant à 400 x g pendant 5 min.
- Aspirez le supernatant et réutilisez doucement les cellules dans le milieu neurobasal riche (RNB) à 4 ll par MFC. RNB est CNB complété par 2% supplémentaires B27 et 25 ng/mL BDNF.
- Retirer le milieu des deux compartiments, en laissant un faible volume équivalent à 10 ll dans les puits du compartiment distal. Il apparaît comme un mince anneau de milieu dans le périmètre du puits.
- Chargez lentement 4 L de cellules dans le canal. Retirez 4 L du puits de l’autre côté du canal, et chargez-les lentement directement dans le canal pour inverser le flux actuel et maximiser la densité cellulaire dans le canal.
- Vérifiez que les cellules sont entrées dans le canal à l’aide d’un microscope lumineux 10x et placez la chambre dans l’incubateur pendant 30 minutes sans ajouter plus de supports.
- Ajoutez lentement 10-15 L de RNB dans les puits proximales et distal et placez les chambres dans l’incubateur pendant encore 15 minutes.
- Suite à cette incubation, ajouter lentement 75-80 L de RNB dans chaque puits.
- Entretien de la culture MN dissocié
- Un jour après le placage (DIV1), remplacer le milieu par RNB complété par 1 m cytosine arabinoside (Ara-C) pour inhiber la croissance gliale.
- Deux jours après l’application Ara-C (DIV3) remplacer le milieu par un milieu CNB frais dans le compartiment proximal (sans Ara-C).
- Afin d’améliorer le croisement des axones à travers les microgrooves, appliquer RNB complété par 25 ng/mL de facteur neurotrophique né aux cellules gliales (GDNF) et 25 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) seulement au compartiment distal. Maintenir un gradient de volume d’au moins 10 ll par puits entre les puits distal axonaux (volume plus élevé) et les puits proximales.
- Rafraîchir le support tous les 2 jours. Il peut prendre les axones jusqu’à 4-6 jours pour traverser distally.
- Culture d’explant de moelle épinière
- À l’aide de ciseaux droits et de forceps fins, disséquez une moelle épinière d’un embryon de souris E12.5 ICR-HB9::GFP. Travaillez dans une solution 1X HBSS avec 1% de pénicilline-streptomycine (P/S) (figure 3A-C).
- À l’aide de ciseaux de microdissection, retirez les méninges et les cornes dorsales(figure 3D).
- Couper la moelle épinière en sections transversales de 1 mm d’épaisseur(figure 3E). Disposer de tout le milieu du compartiment proximal du MFC.
- Ramassez une seule épinière explantée avec une pipette dans un volume total de 4 L. Injectez l’explant le plus près possible de la grotte et retirez tout liquide excessif du puits proximal par les prises latérales (1 mm de poinçons). Les explants doivent être aspirés dans le canal proximale.
- Ajoutez lentement 150 L de milieu d’explant de moelle épinière (SCEX, voir Tableau des matériaux et tableau 3)au puits proximal.
- Entretien de la culture de la moelle épinière
- Ajouter le milieu SCEX dans le compartiment proximale, et le milieu SCEX riche (SCEX avec 50 ng/mL de BDNF et GDNF) dans le compartiment distal. Maintenir un gradient de volume d’au moins 15 ll par puits entre les puits distal (volume plus élevé) et le puits proximale.
- Rafraîchir le support tous les 2 jours. Il peut prendre les axones jusqu’à 3-5 jours pour traverser distally.
3. Transport Axonal(figure 4A)
- Étiquetage des mitochondries et des compartiments acides
- Préparer le milieu SCEX frais (ou CNB pour le MN dissocié) contenant 100 nM Mitotracker Deep Red FM et 100 nM LysoTracker Red. Incuber pendant 30-60 min à 37 oC. D’autres couleurs peuvent être utilisées tant que leurs fluorophores ne se chevauchent pas.
- Laver 3x avec le milieu chaud CNB/SCEX. Les plaques sont prêtes pour l’imagerie.
- Imagerie en direct
- Acquérir 100 séries d’images time-lapse de transport axonal à intervalles de 3 s, avec un total de 5 minutes par film.
REMARQUE : Le système d’imagerie utilisé dans cette étude comprenait un microscope inversé équipé d’un disque de rotation confocal, contrôlé par l’intermédiaire d’un logiciel d’imagerie cellulaire de convenance, d’une lentille d’huile de 60x, de NA 1,4 et d’une caméra EMCCD. Les films ont été acquis dans un environnement contrôlé à 37 oC et 5% de CO2.
REMARQUE : Des films en time-lapse plus ou plus courts peuvent être photographiés, dépendant de l’expérience. Même les films de nuit peuvent être enregistrés si nécessaire. Cependant, il est essentiel d’essayer de réduire le temps d’exposition et la puissance laser, ainsi que le nombre d’images totales, pour diminuer la phototoxicité et le blanchiment lors de l’acquisition du film.
- Acquérir 100 séries d’images time-lapse de transport axonal à intervalles de 3 s, avec un total de 5 minutes par film.
4. Analyse d’images (Figures 4-5)
- Analyse de la distribution et de la densité du transport de particules à l’aide de l’analyse kymographique
- Ouvrez le fichier dans FIJI. Chaînes séparées pressant Image (fr) Piles Outils Deinterleave.
- Définissez les propriétés de l’image en appuyant sur Image ( Propriétés.
- Choisissez l’outil de ligne segmenté en cliquant à droite sur l’icône de ligne. Définissez la largeur à 8-10 en cliquant doublement sur l’icône de ligne. Soyez compatible avec la même largeur de ligne tout au long de l’analyse.
- Marquez une ligne segmentée suivant le chemin d’axone de distal à proximal. Double-clic pour arrêter le marquage de ligne.
- Cliquez sur t pour ajouter une nouvelle ligne de région d’intérêt (ROI) au gestionnaire de retour sur investissement. Ajoutez ceci à un tableau d’analyse de feuille de calcul.
- Cliquez m pour mesurer la zone et la longueur de l’axone. Ajoutez ceci à la table d’analyse.
- Générer un kymographe en cliquant sur Plugins ( KymoToolBox - France Dessiner Kymo. Alternativement, d’autres plugins de génération de kymographe disponibles peuvent être utilisés.
- Comptez manuellement les particules mobiles (rétrogrades ou antérgrades) et les particules non mobiles et ajoutez-les à la table dans la colonne correcte.
REMARQUE : Les particules sont classées comme antitétilgrades mobiles (c.-à-d. se déplaçant à gauche dans le kymographe) ou rétrogrades (c.-à-d. se déplaçant à droite) si leur déplacement est supérieur à 10 m dans la direction spécifique. Il est possible de mesurer le déplacement simplement en marquant une ligne horizontale avec l’icône de ligne et en appuyant m. Les particules immobiles ou celles qui ne répondent pas aux critères de déplacement sont définies comme non-cylindants (figure 4B).
- Suivi des particules simples : suivi manuel
- Téléchargez le plugin de suivi manuel pour le logiciel FIJI (développé par Fabrice P. Cordelière) à partir de http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
- Ouvrez le fichier dans FIJI/ImageJ. Utilisez l’option Rotate pour aligner horizontalement les rainures MFC.
- Pour améliorer le rapport signal-bruit si nécessaire, cliquez sur Processus Soustrayez l’arrière-plan.
- Ouvrez le plugin de suivi manuel. Définissez les paramètres (p. ex., la taille des pixels, l’intervalle de temps, etc.) selon le microscope spécifique utilisé pour l’imagerie. Pour les résultats présentés ici, le microscope et la lentille le rapport était de 0,239 m/pixel et l’intervalle de cadre était de 3 s.
- Obtenez les coordonnées des pistes X et Y et enregistrez les résultats en copiant le texte à la feuille de calcul.
- Analyser les films multicanaux en cliquant sur Image ( Couleur Fusionner les canaux pour fusionner les canaux, puis suivre seulement puncta colocalisé.
- Suivi des particules simples : suivi semi-automatisé (Figure 5)
- Ouvrez le logiciel d’analyse. Cette étude a utilisé bitplane Imaris version logicielle 8.4.1.
- Passez à Surpass dans le menu supérieur.
- Cliquez sur traitement d’image (fr) Swap Time et Z Ok.
- Cliquez sur Edit (fr) Propriétés d’image (Ctrl-I) Géométrie Voxel Taille Row. Définir les propriétés d’image en fonction de la configuration de microscopie utilisée.
REMARQUE : Pour les données affichées ici, le rapport microscope et objectif était de 0,239 m/pixel. - Cliquez sur Tous les équidistants et modifiez l’intervalle de temps. Par exemple, utilisez 3 s comme l’intervalle. Cliquez sur le bouton Reset en bas droit ou cliquez sur Ctrl B.
- Ajoutez une couche de taches en haut à gauche en cliquant sur une icône de petites taches jaunes. En bas à gauche, un nouveau menu pour l’édition des spots est ouvert.
- Appuyez sur la flèche bleue droite jusqu’à ce que la détection ponctuelle commence.
REMARQUE : Il est important de filtrer certains des points à l’aide du filtre en bas à gauche de la fenêtre. Vérifiez le film à quelques reprises pour voir qu’un nombre suffisant de points est sélectionné. - Vérifier ou configurer les paramètres pour répondre aux besoins expérimentaux. Par exemple, la distance maximale de 12 m (le maximum a permis à la distance entre deux endroits distincts de les inclure encore dans la même voie unique); Max Gap Taille 1 (Le nombre de cadres qu’une piste est autorisé à manquer et toujours considéré comme une seule piste).
- Cliquez sur Paramètres, puis Suivez le style - Off, Points et Sphère.
- À l’aide de la barre de filtre,choisissez différents filtres pour l’ajustement. Par exemple, dans les données fournies ici, Track Duration 9 a supprimé toutes les pistes avec moins de 3 images. Lorsque tous les paramètres sont définis, cliquez sur la flèche verte droite. D’autres modifications ne sont pas possibles après cette étape.
- Cliquez sur le petit crayon avec dots pour modifier manuellement toutes les pistes.
- Voir le film (Figure 5B). En cas d’erreur, il existe plusieurs options possibles :
- Pour déconnecter une piste, cliquez sur l’option Objet et choisissez les deux taches qui doivent être déconnectées en tenant Ctrl, et choisissez Disconnect.
- Pour connecter une piste, cliquez sur l’option Objet, choisissez les deux endroits qui doivent être connectés en tenant Ctrl et choisissez Connect.
- Pour supprimer une piste ou un spot, avec la bonne option (Track/Object), passez à l’écran avec l’icône crayon ordinaire, et choisissez Supprimer.
- Pour ajouter des taches manuellement, passez à l’écran ordinaire d’icône de crayon. Au bas de l’écran il ya une marque de suivi manuel. Assurez-vous que la boîte de contrôle Auto-Connect est V. Sur le film lui-même, afin d’ajouter une place, maintenez le bouton Shift et Left-Click.
- Pour ajouter une place à une piste existante, choisissez une piste désirée (jaune) et un cadre, passez à l’écran ordinaire d’icône de crayon et ajoutez une tache manuellement. Lorsque l’ensemble du film est terminé, passez à l’icône qui ressemble à un graphique rouge (statistiques). Il est possible de modifier les paramètres analysés plus tard. Pour éditer, en bas à gauche de l’écran, appuyez sur l’icône de clé suédoise. Par exemple : Position X, Position Y.
- Appuyez sur l’icône qui ressemble à plusieurs disques disquettes, Exporter toutes les statistiques.
REMARQUE : La sortie de la feuille de calcul peut être traitée directement ou analysée plus en utilisant le code9 publié utilisé pour cette analyse, qui sera partagé sur demande. Les paramètres suivants sont extraits de l’analyse : Vitesse, déplacement de la piste, longueur d’exécution, vitesse (y compris directionnalité), compte d’arrêt, durée moyenne d’arrêt, Alpha, changements de direction et vitesse instantanée. Une explication détaillée de chaque paramètre est décrite dans Gluska et coll.9.
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Representative Results
Suivant le protocole décrit, souris embryonnaire HB9::GFP épidullaires explants ont été cultivés dans MFC (figure 4A). Les explantations ont été cultivées pendant 7 jours, quand les axones ont complètement traversé dans le compartiment distal. Mitotracker Deep Red et Lysotracker Des colorants rouges ont été ajoutés aux compartiments distal et proximal afin d’étiqueter les mitochondries et les compartiments acides(figure 4C). Les axones dans les rainures distales ont été photographiés, et les films ont été analysés comme suit : Tout d’abord, nous avons comparé la distribution générale de mouvement utilisant l’analyse kymographique (Figures 4B,D). Cette analyse a révélé un biais dans la direction rétrograde seulement dans les compartiments acides (non-détection de 77,1 à 9,5 %; rétrograde , 16,9 à 8,3 %, antétélé et 6 à 5 %; Figure 4E) mais pas dans le transport mitochondrial (non-analyse de 83,4 à 6,8 %; rétrograde , 10,5 à 6,9 %; antétéligrade , 6,8 à 5,1 %; Figure 4F). L’analyse kymographe a été utilisée pour quantifier la densité des particules, révélant un nombre plus élevé de particules mitochondriales par rapport aux compartiments acides dans HB9::GFP axones explants de moelle épinière (Mitochondria - 0.46 - 0.13 ; Compartiments acides : 0,3 à 0,07 particule/m axone, figure 4G.
Ensuite, l’analyse du transport de particules simples a été effectuée à l’aide d’un logiciel semi-automatique suivi d’un code interne(figure 5A-B). Cette analyse a révélé que, bien qu’ayant une vitesse de particules similaire en général(figure 5C), lors de l’observation de la répartition des vitesses(figure 5D) seulement compartiments acides, mais pas les mitochondries ont montré un biais vers le mouvement rétrograde.
Figure 1 : Préparation de moule en silicone. Dessin schématique décrivant la procédure du nettoyage de gaufrettes de chlorotrimethylsilane. (A) Tout d’abord, 50 ml d’azote liquide ont été ajoutés à un contenant approprié. Travaillant dans une hotte chimique, une seringue et une aiguille ont été utilisées pour extraire 8 ml d’azote liquide. Le contenu entier de la seringue a été injecté dans la bouteille de chlorotrimethylsilane. La bouteille a été retournée avec le bouchon vers le bas et 8 ml de chlorotrimethylsilane ont été tirés en arrière. (B) Chlorotrimethylsilane répartie dans le récipient (pas directement sur la plaquette). Le récipient doit être fermé, suivi de l’incubation de 5 min pour chaque moule. (C) Le PDMS liquide a été versé dans chaque plaquette jusqu’à la hauteur désirée. (D) Toutes les plaques ont été placées ensemble à l’intérieur d’un desiccateur à vide pendant 2 h, suivie de 3 h-nuit dans un four à 70 oC. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Conception spécialisée MFC. (A) Modèle PDMS polymérisé sorti du moule à l’aide d’un scalpel métallique. (B) Selon la configuration expérimentale soit 6 mm, 7 mm, ou 1 mm poinçonneurs ont été utilisés pour poinçonner les modèles PDMS. (C) Pour la culture explantée dans le MFC, 7 mm et 1 mm poinçonneurs ont été utilisés, et une seringue de 20 G a été utilisé pour faire des «caves» pour l’insertion facile d’explant. (D) Pour la culture MN dissociée MFC, un poinçonneur de 6 mm a été utilisé pour créer quatre puits sur les bords du canal. (E-F) Illustrations des formes MFC finales décrites dans C et D, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Culture neuronale. (A) L’embryon de souris E12.5 a été placé en position après que la tête, la queue, et la peau aient été enlevées afin d’exposer le tube neural. (B) Dissection de toute la moelle épinière. (C) Utilisant des forceps doux, les méninges ont été épluchées loin de la moelle épinière. (D) Panneau gauche : Enlèvement des segments latéraux de moelle épinière de la moelle épinière ventrale pour donner une meilleure purification de MN. Panel de droite : Image représentative de la culture MN dissociée dans le MFC. HB9::Axons GFP traversé au compartiment distal (vert). La coloration de Hoechst indique les noyaux neuronaux (bleu). EE) Explants de moelle épinière générés par disséquer des sections transversales de 1 mm d’épaisseur de la moelle épinière ventrale. Image représentative de HB9 : : GFP (vert) axone d’explant de moelle épinière dans un MFC. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Transport axonal des mitochondries et du compartiment acide dans les MNs. (A) Illustration de l’essai de transport axonal. Lysotracker Red et Mitotracker Deep Red ont été ajoutés aux compartiments proximales et distal du MFC, contenant LB9:GFP épinière ventrale explant. (B) Analyse kymographe. Les particules mobiles ont été définies comme étant des antéttomes ou rétrogrades en mouvement après le déplacement de plus de 10 m dans cette direction. Les particules tournantes ou immobiles ont été comptées comme non-munitions. Barre d’échelle de 10 m . (C) Première image d’un film en time-lapse affichant le HB9 primaire : : les axones épidémiques de souris GFP teints avec le rouge Lysotracker pour marquer les compartiments acides et le Mitotracker Deep Red pour marquer les mitochondries. Barre d’échelle de 10 m. (D) les kymographes représentatifs affichant un mouvement axonal typique des compartiments acides et des mitochondries. Barre d’échelle de 10 m. (E) Analyse kymographique du transport axonal mitochondrial, 'p 'lt; 0.0001, Anova avec correction de Holm-Sidak (n ' 77 axons). Barre d’échelle de 10 m (F) Analyse kymographique du transport axonal de compartiment acide, p 'lt ; 0,01, 'p 'lt; 0.0001, Anova avec correction de Holm-Sidak (n ' 77 axons). (G) Analyse de la densité des particules axonales des mitochondries et des compartiments acides, 'p 'lt; 0.0001, le t-test de l’étudiant (n ' 77 axones). Les barres d’erreur représentent des valeurs avec SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse semi-automatisée des particules uniques pour mesurer la vitesse des organelles. (A) Flux de travail schématique pour l’analyse semi-automatique du transport de particules simples. (B) Les axones d’explentère ventrale de moelle épinière ont été analysés pour le suivi simple de particule. Le logiciel d’analyse est capable de suivre les particules axonales uniques dans les films en time-lapse, comme indiqué pour les mitochondries (points jaunes, panneau supérieur) et les compartiments acides (points verts, panneau inférieur). (C) La vitesse moyenne n’a pas changé entre les mitochondries et les compartiments acides, test Mann Whitney (n - 417 mitochondries, n - 371 compartiments acides). Les barres d’erreur représentent des valeurs avec SD. (D) Distribution des compartiments mitochondriaux et acides rétrogrades et des vitesses antégrades. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Moyenne neurobasal complète pour 50mL | ||
| Ingrédient | Volume | Concentration |
| Neurobasal (Neurobasal) | 47mL | |
| B27 B27 | 1 mL | 2% |
| Sérum de cheval | 1 mL | 2% |
| P/S | 0,5 mL | 1% |
| L-Glutamine (Glutamax) | 0,5 mL | 1% |
| Bêta-Mercaptoethanol (50mM) | 25 ll | 25 m |
| BDNF (10ug/mL) | 5 ll | 1ng/mL |
| GDNF (10ug/mL) | 5 ll | 1ng/mL |
| CNTF (10ug/mL) | 2,5 l | 0.5ng/mL |
Tableau 1 : Recette pour la préparation d’une solution neurobasal complète (CNB).
| Solution Optiprep - pour 10mL | ||
| Ingrédient | Volume | Concentration |
| DDW DDW | 5,27 ml | |
| Densité Gradient Medium (Optiprep) 60% | 1,73 ml | 10,4% (w/v) |
| Tricine 100mM | 1 mL | 2% |
| Glucose 20% (w/v) | 2 ml | 2% |
Tableau 2 : Recette pour la préparation de la solution moyenne de gradient de densité.
| Spinal Cord Explant Medium (SCX) - pour 20mL | ||
| Ingrédient | Volume | Concentration |
| Neurobasal (Neurobasal) | 19,5 ml | |
| B27 B27 | 200 l | 2% |
| P/S | 100 l | 1% |
| L-Glutamine (Glutamax) | 100 l | 1% |
| Bdnf | 50 l | 25ng/mL |
Tableau 3 : Recette pour la préparation de la solution d’explant de moelle épinière (SCEX).
| MN Culture | Explants de moelle épinière |
| Procédure plus longue avant le placage | Procédure courte - Dissect et Plaque |
| Une prudence supplémentaire est nécessaire pour le placage dans MFC | Plus facile à plaquer dans le MFC |
| Forte concentration de neurones moteurs sans cellules gliales - plus précis | Présence de cellules gliales et d’autres types neuronaux - plus physiologique |
| Possibilités de manipulation illimitées sur Soma et axones | Possibilités limitées de manipulation sur les corps cellulaires |
| Immunostaining facile pour les corps cellulaires et les axones | Faible efficacité pendant l’immunostachation des corps cellulaires dans l’explant. |
| Haute efficacité de l’infection virale | Très faible efficacité de l’infection virale |
Tableau 4 : Comparaison entre les explants de la moelle épinière et la culture MN dissociée basée sur des périmètres de vitesse, de faisabilité, de présence gliales, de possibilités de manipulation, d’immunostaining et d’infection virale.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons un système pour suivre le transport axonal des mitochondries et des compartiments acides dans les neurones moteurs. Cette plate-forme in vitro simplifiée permet un contrôle précis, la surveillance et la manipulation des compartiments neuronaux subcellulaires, permettant l’analyse expérimentale des fonctions locales des neurones moteurs. Ce protocole peut être utile pour étudier les maladies de MN telles que la SLA, pour se concentrer sur la compréhension du mécanisme sous-jacent du dysfonctionnement de transport axonal dans la maladie10,16. En outre, ce système peut également être appliqué pour étudier le transport des facteurs trophiques9,16, microARN10, mRNA8, et étiqueté protéines dans les MN sains et malades ou dans d’autres neurones, tels que sensoriel9 ou axones sympathiques14. Une méthode similaire peut également être appliquée pour étudier le transport d’organelle dans un système de coculture, tels que les MNs cultivés avec des cellules musculaires squelettiques12 ou des neurones sympathiques cocultured avec des cardiomyocytes14. Le système MFC peut être utilisé pour générer des NMJ actifs17,18 et étudier l’effet de la formation de synapse sur le transport axonal16.
Ce protocole présente plusieurs avantages par rapport à d’autres protocoles de culture des neurones dans MFC et utilisant l’imagerie en direct pour analyser le transport axonal : 1) Les MFC sont disponibles dans le commerce par plusieurs fabricants. Cependant, l’auto-fabrication des MFC est extrêmement rentable par rapport à l’alternative commerciale. Une seule plaquette PDMS donne quatre grandes CME ou neuf petites au coût minimal de plusieurs dollars américains pour la résine PDMS elle-même. 2) Les MFC auto-fabriqués peuvent être modifiés pour répondre à des besoins expérimentaux spécifiques (p. ex., changer la taille et l’emplacement des puits, ce qui augmente l’épaisseur du SDP MFC). 3) Les MFC peuvent être irrémédiablement attachés à une plaque (via la liaison plasmatique) mais peuvent également être recyclés plusieurs fois pour réduire la possibilité de contamination. 4) Les MFC PDMS sont transparentes, ce qui les rend idéales pour l’imagerie en direct en ayant un arrière-plan réduit, ce qui est essentiel pour les essais de transport axonal où la distinction signal-bruit pourrait être un facteur limitant. 5) La culture de l’explant de la moelle épinière est très efficace et rapide. Une moelle épinière embryonnaire peut produire jusqu’à 30 explants, assez pour 10 MFC. Cela peut aider à gagner du temps et des matériaux, et garantit que même une souris enceinte avec peu d’embryons peut produire une expérience réussie. Voir une comparaison détaillée de l’explantation de la moelle épinière et de la culture MN dissociée dans le tableau 4.
Ce protocole est relativement simple et peu coûteux. Toutefois, elle exige une expertise dans plusieurs domaines techniques. La fabrication et la manipulation du MFC doivent être précises et douces, afin d’éviter les défauts structurels et la création de bulles d’air dans l’étape de vide obligatoire (1.1.10), par exemple. Pendant l’étape à vide facultative (1.6.2), il est important de dégager tout l’air, ou il bloquera la traversée axonale, mais aussi garder le vide court pour éviter le détachement du MFC du verre. Portez une attention particulière aux étapes du protocole de dissection, car il est important d’enlever correctement les méninges et les cornes dorsales, ainsi que d’essayer de couper les morceaux à la bonne taille afin de les insérer dans la grotte du MFC sans utiliser la force physique. Toute force physique excessive appliquée au MFC peut facilement détacher les rainures ou l’ensemble du MFC, de ce fait la procédure doit être faite doucement. La culture des MN et leur placage dans le MFC doivent être relativement rapides, car les MN ont tendance à agréger et à perdre rapidement leur viabilité dans des conditions de stress telles que le faible volume moyen de l’étape de placage. Le placage dans le MFC doit être fait en faible volume pour permettre l’attachement approprié des neurones dans le canal MFC, et après pas plus de 30 minutes de milieu réchauffé doit être ajouté très doucement pour empêcher le détachement des MNs.
Après plusieurs jours de culture, et une fois que les axones se sont étendus au compartiment distal, les cultures sont prêtes à subir des taches d’organelle suivies de l’acquisition de films de transport axonal et enfin d’une procédure spécifique pour l’analyse d’image. L’analyse peut être effectuée soit par un seul suivi des particules au fil du temps, soit par l’utilisation d’un algorithme de suivi automatisé ou semi-automatique. D’après notre expérience, les méthodes automatisées prennent moins de temps, mais présentent plusieurs inconvénients. Principalement, la fiabilité du suivi automatisé est diminuée, avec des axones bondés qui se croisent. En outre, les algorithmes automatisés ont une capacité diminuée de distinguer entre les particules qui se chevauchent. Par conséquent, il est recommandé d’effectuer un suivi manuel ou semi-automatique. En général, le suivi semi-automatique est préférable car il prend moins de temps, mais le suivi manuel peut être une bonne option lorsqu’il n’existe pas de logiciel payant disponible. Une comparaison approfondie entre l’analyse manuelle et l’analyse automatique peut être trouvée dans Gluska et al.9.
En conclusion, l’adoption de ce protocole simple peut produire des données importantes pour l’étude du transport axonal de divers composants cellulaires. Il peut être adapté pour s’adapter à une diversité de configurations d’imagerie et de sous-types neuronaux, ainsi que pour cocultures de neurones avec d’autres cellules. Il permet également une manipulation pharmacologique spatiale distincte des corps cellulaires ou des axones afin de comprendre les mécanismes de base de la santé neuronale et d’améliorer le développement de médicaments pour les maladies avec le transport axonal altéré.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation israélienne pour la science (ISF, 561/11) et du Conseil européen de recherches (ERC, 309377).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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