Summary
El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de las neuronas motoras. En este protocolo proporcionamos un método detallado para el seguimiento del transporte axonal de compartimentos ácidos y mitocondrias en axons de neuronas motoras utilizando cámaras microfluídicas.
Abstract
Las neuronas motoras (MN) son células altamente polarizadas con axones muy largos. El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de la MN, contribuyendo al crecimiento neuronal, desarrollo, y la supervivencia. Describimos un método detallado para el uso de cámaras microfluídicas (MFC) para el seguimiento del transporte axonal de orgánulos etiquetados fluorescentemente en axones MN. Este método es rápido, relativamente barato, y permite el monitoreo de señales intracelulares en el espacio y el tiempo. Describimos un protocolo paso a paso para: 1) Fabricación de MFC de polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimiento de explantes de la médula espinal ventral y cultivo disociado MN en MFC; 3) Etiquetado de mitocondrias y compartimentos ácidos seguidode de imaginación confocal viva; 4) Análisis manual y semiautomatizado del transporte axonal. Por último, demostramos una diferencia en el transporte de mitocondrias y compartimentos ácidos de HB9::GFP de la médula espinal ventral explantó axons como prueba de la validez del sistema. En conjunto, este protocolo proporciona una herramienta eficaz para estudiar el transporte axonal de varios componentes axonales, así como un manual simplificado para el uso de MFC para ayudar a descubrir posibilidades experimentales espaciales.
Introduction
Las MN son células altamente polarizadas con axones largos, alcanzando hasta un metro de largo en humanos adultos. Este fenómeno crea un desafío crítico para el mantenimiento de la conectividad y la función MN. En consecuencia, los MN dependen del transporte adecuado de información, orgánulos y materiales a lo largo de los axones desde su cuerpo celular hasta la sinapsis y la espalda. Varios componentes celulares, como proteínas, ARN y orgánulos, se transportan regularmente a través de los axones. Las mitocondrias son orgánulos importantes que se transportan rutinariamente en MNs. Mitocondrias son esenciales para la actividad adecuada y el funcionamiento de los MN, responsables de la provisión de ATP, amortiguación de calcio, y procesos de señalización1,2. El transporte axonal de mitocondrias es un proceso bien estudiado3,4. Curiosamente, se informó que los defectos en el transporte mitocondrial estaban implicados en varias enfermedades neurodegenerativas y específicamente en enfermedades MN5. Los compartimentos ácidos sirven como otro ejemplo para los orgánulos intrínsecos que se mueven a lo largo de los axones MN. Los compartimentos ácidos incluyen lysososomes, endosomas, aparatos trans-Golgi, y ciertas vesículas secretoras6. Los defectos en el transporte axonal de compartimentos ácidos se encontraron en varias enfermedades neurodegenerativas, así como7,y los documentos recientes destacan su importancia en las enfermedades MN8.
Para estudiar eficientemente el transporte axonal, las cámaras microfluídicas que separan los compartimentos somáticos y axonales se utilizan con frecuencia9,10. Las dos ventajas significativas del sistema microfluídico, y la compartimentación y el aislamiento de los axons, lo hacen ideal para el estudio de procesos subcelulares11. La separación espacial entre los cuerpos celulares neuronales y los axons se puede utilizar para manipular los entornos extracelulares de diferentes compartimentos neuronales (por ejemplo, axones vs. soma). Los ensayos bioquímicos, de crecimiento/degeneración neuronal e inmunofluorescencia se benefician de esta plataforma. Las MFC también pueden ayudar a estudiar la comunicación de célula a célula cocultando neuronas con otros tipos de células, como los músculos esqueléticos12,,13,,14.
Aquí, describimos un protocolo simple pero preciso para monitorear las mitocondrias y el transporte del compartimiento ácido en las neuronas motoras. Además, mostramos el uso de este método comparando el porcentaje relativo de orgánulos en movimiento retrógrados y anterogrados, así como la distribución de la velocidad de transporte.
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Protocol
El cuidado y tratamiento de los animales en este protocolo se llevó a cabo bajo la supervisión y aprobación del Comité Universitario de Ética Animal de Tel Aviv.
1. Preparación MFC
- Fundición PDMS en moldes primarios (Figura 1)
- Comprar o crear moldes primarios (wafers) siguiendo un protocolo detallado9.
- Utilice aire presurizado para eliminar cualquier tipo de suciedad de la plataforma de obleas antes de proceder al paso de recubrimiento. La superficie de las obleas debe verse lisa y clara.
- Llene un recipiente con 50 ml de nitrógeno líquido. Prepare una jeringa de 10 ml y una aguja de 23 G.
NOTA: Todos los procedimientos de este paso adelante deben realizarse en una campana química. - En la campana química, utilice la jeringa y la aguja para agrupar 2 ml de nitrógeno líquido. Aunque parezca que se extrajo aire, la jeringa se llena de nitrógeno(Figura 1A). Coloque la placa que contiene obleas en un recipiente elable.
- Atornille un frasco de clorotrimetilsilano, perfore la tapa de goma con la jeringa llena de nitrógeno e inyecte todo el contenido de la jeringa en el frasco. Sin sacar la aguja, gire el frasco boca abajo y tire hacia atrás 2 ml de clorotrimetilsilano.
NOTA: Debido a la presión de la jeringa, se rocía una pequeña cantidad de clorotrimetilsilano fuera de la aguja. Para evitar un peligro, apunte la aguja hacia la pared interior del capó(Figura 1B). - Extienda el clorotrimetilsilano uniformemente en el recipiente (del paso 1.1.4), pero no directamente sobre la oblea o la placa que contiene la oblea. Cierre el recipiente e incubar durante 5 min por oblea.
NOTA: Si es la primera vez que la oblea está recubierta con clorotrimetilsilano, se debe permitir una incubación de 1 h para cada oblea. - No saque las obleas y el recipiente de la campana química durante 30 minutos.
ADVERTENCIA: El clorotrimetilsilano es altamente volátil. - Pesar la base pdmS (ver Tabla de Materiales) en un tubo de 50 ml y añadir agente de curado PDMS en una relación de 16:1 respectivamente (por ejemplo, 47,05 g de base y 2,95 g de agente de curado). Mezclar durante 10 minutos con un rotador de baja velocidad.
- Vierta PDMS en cada placa que contenga obleas a la altura deseada(Figura 1C).
NOTA: El uso de cámaras microfluídicas delgadas (hasta 3-4 mm) mejora la adherencia a la placa de cultivo y evita fugas. - Coloque todas las placas juntas dentro de un desecador al vacío durante 2 h(Figura 1E). Este proceso elimina el aire atrapado dentro del PDMS, eliminando así las burbujas de aire y formando un molde claro y uniforme.
- Colocar las placas dentro de un horno durante 3 h (o durante la noche) a 70 oC(Figura 1E).
NOTA: Las placas deben estar nivelada cuando se colocan en el horno.
- Fundición PDMS en moldes epoxi
NOTA: Debido a que la preparación de obleas es costosa, requiere equipo especial y puede dañar las obleas frágiles, es posible generar réplicas epóxicos de obleas. Las réplicas son más baratas, más duraderas y se pueden utilizar para la producción en masa de cámaras microfluídicas.- Convertir y curar PDMS (como se describe en 1.1.8-1.1.11) en la oblea original.
- Retire y corte las partes excesivas de PDMS dejando solo los elementos microfluídicos y el área funcional necesaria para procesarlos en cámaras microfluídicas.
- Envuelva inmediatamente el PDMS con cinta adhesiva gruesa para evitar que acumule polvo.
- Elija un plato de plástico de grado de cultivo de tejido que se adapte a todo el PDMS en su interior y deje espacio para epoxi a su alrededor. La distancia desde el PDMS hasta la placa de plástico debe ser inferior a 5 mm.
- Prepare una pequeña cantidad de PDMS mezclado en una proporción de 10:1 (base:agente de curado). El líquido fresco PDMS se utilizará para pegar el PDMS sólido en la parte inferior de la placa de plástico.
- Aplique una cantidad mínima de LOS PDMS líquidos en la parte inferior central de la placa de plástico y, a continuación, retire la cinta adhesiva del PDMS y adpítela a la parte inferior de la placa de plástico. Asegúrese de que los elementos microfluídicos estén orientados hacia arriba.
- Deje que el PDMS se cure durante 30 minutos en un horno de 70 oC.
- Preparar la resina epoxi mezclando la base y el agente de curado en una proporción de 100:45 respectivamente en un tubo de ensayo. Diferentes resinas epoxi pueden tener diferentes proporciones de mezcla. El volumen requerido para una placa regular de 100 mm es de aproximadamente 40 ml.
- Deje que el epoxi se mezcle bien durante 10 minutos en un rotador hasta que la mezcla se vuelva visiblemente homogénea (es decir, no hay artefactos visibles similares a la fibra en el líquido).
- Centrifugar la mezcla epoxi a 400 x g durante 5 min para eliminar las burbujas de aire atrapadas en el interior.
- Durante la centrifugación, esparza una fina capa de grasa de silicona alrededor de las paredes y todas las demás partes de plástico expuestas del plato de cultivo. Esto evitará que el epoxi se polimerice con el plástico del plato y permitirá la eliminación del epoxi curado fácilmente al final del protocolo.
- Vierta el epoxi lentamente en el plato hasta que cubra completamente el PDMS y vaya más allá de él por lo menos 5 mm. Evitar la formación de cualquier burbuja dentro del epoxi manteniendo la distancia cero entre el tubo y la placa. Coloque la placa en un lugar seguro para que no se mueva durante las próximas 48 horas.
- Después de 48 h el epoxi debe curarse por completo. Inserte la placa en un horno precalentado a 80 oC durante 3 h para un curado final.
- Retire el epoxi curado de la placa y el molde PDMS original tirando suavemente la pared de plástico de la placa hasta que se rompa. A continuación, debe separarse fácilmente del epoxi y despegarse.
- Una vez extraída, limpie la grasa restante de la nueva réplica epoxi e intégrela al revés (es decir, con los elementos microfluidos replicados hacia arriba) en un nuevo plato de cultivo. La réplica epoxi ya está lista para la conversión de PDMS.
- Utilice aire presurizado o N2 para soplar cualquier resto de PDMS o suciedad del molde epoxi y enjuáguelo 2 veces con isopropanol. Llénalo por tercera vez e incuba durante 10 minutos en una placa de agitador orbital. Enjuague el molde de nuevo 3veces con isopropanol y deseche el líquido restante. Seque con aire o N2 o colóquelo en un horno de 70oC hasta que se seque.
NOTA: Siga los procedimientos de seguridad al trabajar y desechar el isopropanol. - Mantenga las placas de molde cerradas hasta la fundición. Siga los pasos 1.1.8.-1.1.11.
- Perforación y escultura de PDMS en un MFC(Figura 2)
- Corte y retire el molde PDMS de la placa siguiendo las marcas (+) en las obleas utilizando un bisturí. No utilice la fuerza, ya que los moldes son frágiles(Figura 2A).
- Siga las instrucciones extraídas en el boceto para perforar y cortar las cámaras en función de la configuración experimental(Figura 2B-F).
- Para el cultivo explanta de la médula espinal(Figura 2C,E),perforar dos pozos de 7 mm en el lado distal de un MFC grande. Localice los pozos de manera que se superpongan con los bordes del canal. En el lado proximal, perforar un pozo de 7 mm en el centro del canal, con una superposición mínima para que quede suficiente espacio para los explantes. Perforar dos orificios adicionales de 1 mm en los dos bordes del canal proximal. Gire el MFC con los elementos microfluídicos mirando hacia arriba, y usando una aguja de 20 G, talla tres pequeñas cuevas explantar en el pozo perforado de 7 mm.
- Para la cultura MN disociada(figura 2D,F), perforar cuatro pozos de 6 mm en los bordes de los dos canales de un MFC pequeño.
- Esterilización de MFC para el uso de cultivos de tejidos
- Esparza 50 cm de largo cintas pegajosas en el banco. Presione y tire hacia atrás de la cámara para mirar hacia la cinta adhesiva (tanto en la cara superior como en la inferior) y retire la suciedad bruta. Coloque las cámaras limpias en una placa nueva de 15 cm.
NOTA: No presione directamente sobre los elementos microfluídicos cuando estén orientados hacia arriba. - Incubar las cámaras en grado analítico 70% etanol durante 10 min en un agitador orbital.
- Deseche el etanol y seque las cámaras en una campana de cultivo de tejido o en un horno a 70 oC.
- Esparza 50 cm de largo cintas pegajosas en el banco. Presione y tire hacia atrás de la cámara para mirar hacia la cinta adhesiva (tanto en la cara superior como en la inferior) y retire la suciedad bruta. Coloque las cámaras limpias en una placa nueva de 15 cm.
- Colocar el MFC en un plato de fondo de vidrio
- Coloque la cámara en el centro de un plato inferior de vidrio de grado de cultivo de tejido de 35 mm/50 mm y aplique una fuerza menor en los bordes para hacer que el PDMS y la parte inferior del plato se unan. Para evitar romper el fondo de cristal, aplique siempre fuerza en la parte superior de una superficie sólida.
- Incubar 10 min en 70oC. Presione las cámaras para fortalecer la adherencia a la placa.
- Incubar bajo luz UV durante 10 min.
- Recubrimiento y cultivo
- Añadir 1.5 ng/mL poli-L-ornitina (PLO) a ambos compartimentos. Asegúrese de que la OLP está corriendo a través de los canales pipeteando el medio de recubrimiento varias veces directamente en la entrada del canal.
- Examine la cámara microfluídica bajo un microscopio de luz con aumento de 10x para comprobar la presencia de burbujas de aire. Si las burbujas de aire están bloqueando las microgrooves, coloque el MFC en un desecador al vacío durante 2 min. Más tarde, retire el exceso de aire que quedó atrapado en los canales pipeteando el medio de recubrimiento a través de ellos. Incubar durante la noche.
- Sustituya la OLP por laminina (3 g/ml en DDW) para la incubación durante la noche de la misma manera.
- Antes del enchapado, lave el laminino con medio de cultivo neuronal.
2. Revestimiento de cultivo neuronal
- Cultivo de neuronas motoras disociados
- Usando tijeras rectas y fórceps finos, disecciona una médula espinal de un embrión de ratón E12.5 ICR-HB9::GFP. Trabajar en una solución de 1X HBSS con 1% penicilina-estreptomicina (P/S)(Figura 3A-C).
- Usando tijeras de microdisección, retire las meninges y los cuernos dorsales(Figura 3D).
- Recoger las piezas de la médula espinal y transferir a tubo (#1) con 1 mL HBSS + 1% P / S.
- Corta las médulas espinales en trozos pequeños usando tijeras curvas y espera a que las piezas se asienten.
- Añadir 10 s de trippsina 2,5% y colocar en un baño de agua de 37 oC durante 10 minutos. Después de 5 min, mezcle tocando el tubo. Las piezas deben formar un grupo similar a una hélice.
- Transfiera el grupo a un tubo nuevo (#2) que contenga 800 ml de L-15 precalentado, 100 ml de BSA 4% y 100 ml de 10 mg/ml de DNase. Moler 2x, luego esperar 2 minutos para dejar que las piezas no disociadas se asienten. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo (#3).
- Añadir 100 l de BSA 4%, 20 l de 10 mg/ml de DNase y 900 l de medio neurobasal completo (CNB, ver Tabla de materiales y Tabla 1). Moler 8x y esperar 2 min. Recoger sobrenadante a tubo #3.
- Repita el paso 2.1.7 y muele 10x. Recoger sobrenadante a tubo #3. Se debe dejar una pequeña cantidad de tejido en la parte inferior del tubo.
NOTA: Si un grupo grande sigue en la parte inferior del tubo #2, repita el paso 2.1.8. - Añadir 1 mL de bsa 4% cojín a la parte inferior del tubo #3.
- Centrífuga a 400 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Resuspenda el pellet celular tocando suavemente el tubo, luego agregue 1 ml de medio CNB. Pipetear 6x y añadir 20 ml de 10 mg/ml de DNase.
- Suplemento con 5 ml adicionales de medio CNB y transferencia de 3 ml a un tubo nuevo (#4).
- Añadir 1 mL de 10,4% de medio de gradiente de densidad (ver Tabla 2) a la parte inferior de cada tubo(#3 y #4). Debe aparecer una separación de fase nítida entre las dos interfaces.
- Centrífuga a 775 x g durante 20 min a temperatura ambiente (RT). La desaceleración de la centrífuga debe ajustarse a un nivel bajo para evitar la ruptura de la separación de fase.
- Las celdas deben estar flotantes, apareciendo como una interfase turbia entre los medios. Recoger las células de ambos tubos en un tubo nuevo (#5) que ya contiene un medio CNB de 1 ml precalentado.
- Añadir 4-6 ml adicionales de medio CNB.
- Añadir 1 ml de cojín BSA 4% en la parte inferior del tubo.
- Centrífuga a 400 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet suavemente con 1 ml de medio CNB.
- Cuente las celdas. Se espera un rendimiento de 0.75-1 x 106 MN por médula espinal.
NOTA: La médula espinal ventral también contiene otros subtipos neuronales además de las neuronas motoras (por ejemplo, interneuronas). La pureza de la MN depende principalmente de la eliminación de las áreas dorsales durante la disección y de la capacidad de llegar a las áreas rostral enriquecidas con MN. Para asegurarse de que las neuronas con imágenes son MN, se recomienda el uso de una cepa de ratones con un marcador de MN endógeno, como los ratones HB9::GFP. Para lograr un cultivo MN puro (pero con un rendimiento celular disminuido), es posible el uso de la purificación FACS15. - Plating disociado cultura MN en el MFC
- Concentrar 150.000 MN s por cámara centrifugando a 400 x g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender suavemente las células en un medio neurobasal rico (RNB) a 4 oL por MFC. RNB se complementa con CNB adicional con 2% B27 adicional y 25 ng/mL BDNF.
- Retire el medio de ambos compartimentos, dejando un volumen bajo equivalente a 10 l en los pozos del compartimiento distal. Aparece como un anillo delgado de medio en el perímetro del pozo.
- Cargue lentamente 4 s de células en el canal. Saque 4 ml del pozo en el otro lado del canal y cárguelos lentamente directamente en el canal para invertir el flujo de corriente y maximizar la densidad celular en el canal.
- Verifique que las células hayan entrado en el canal usando un microscopio de luz 10x y coloque la cámara en la incubadora durante 30 minutos sin agregar más medios.
- Añadir lentamente 10-15 l de RNB en los pozos proximales y distales y colocar las cámaras en la incubadora durante otros 15 minutos.
- Después de esta incubación, agregue lentamente 75-80 s de RNB en cada poca.
- Mantenimiento disociado de la cultura MN
- Un día después del chapado (DIV1), reemplace el medio por el RNB complementado con 1 m de citosina arabinósido (Ara-C) para inhibir el crecimiento glial.
- Dos días después de la aplicación Ara-C (DIV3) sustituir el medio por medio CNB fresco en el compartimiento proximal (sin Ara-C).
- Con el fin de mejorar el cruce de axons a través de los microgrooves, aplicar RNB complementado con 25 ng/ml de factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) y 25 ng/ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) sólo al compartimento distal. Mantener un gradiente de volumen de al menos 10 ml por pocal entre los pozos distales axonales (volumen más alto) y los pozos proximales.
- Actualice el medio cada 2 días. Puede tomar los axons hasta 4-6 días para cruzar discadamente.
- Cultivo explant de la médula espinal
- Usando tijeras rectas y fórceps finos, disecciona una médula espinal de un embrión de ratón E12.5 ICR-HB9::GFP. Trabajar en una solución de 1X HBSS con 1% penicilina-estreptomicina (P/S)(Figura 3A-C).
- Usando tijeras de microdisección, retire las meninges y los cuernos dorsales(Figura 3D).
- Cortar la médula espinal en secciones transversales de 1 mm de espesor(Figura 3E). Deseche todo el medio del compartimiento proximal del MFC.
- Recoger una sola explanta de la médula espinal con una pipeta en un volumen total de 4 l. Inyectar el explantar lo más cerca posible de la cueva y extraer cualquier líquido excesivo del pozo proximal a través de las salidas laterales (1 mm punzones). Los explantes deben aspirarse en el canal proximal.
- Añadir lentamente 150 l de medio explanta de la médula espinal (SCEX, ver Tabla de materiales y Tabla 3)al pozo proximal.
- Mantenimiento del cultivo explanta de la médula espinal
- Agregue el medio SCEX en el compartimiento proximal y el medio SCEX rico (SCEX con 50 ng/ml de BDNF y GDNF) en el compartimiento distal. Mantener un gradiente de volumen de al menos 15 ml por pozo entre los pozos distales (volumen más alto) y el pozo proximal.
- Actualice el medio cada 2 días. Puede tomar los axones hasta 3-5 días para cruzar discadamente.
3. Transporte axonal(Figura 4A)
- Etiquetado de mitocondrias y compartimentos ácidos
- Prepare el medio SCEX fresco (o CNB para MN disociado) que contenga 100 nM Mitotracker Deep Red FM y 100 nM LysoTracker Red. Incubar durante 30-60 min a 37oC. Otros colores se pueden utilizar siempre y cuando sus fluoróforos no se superpongan.
- Lavar 3x con medio cnB/SCEX caliente. Las placas están listas para la toma de imágenes.
- Imágenes en vivo
- Adquirir 100 series de imágenes de lapso de tiempo de transporte axonal a intervalos de 3 s, con un total de 5 min por película.
NOTA: El sistema de imágenes utilizado en este estudio incluía un microscopio invertido equipado con disco giratorio confocal, controlado a través de un software de imagen celular de propiedad, lente de aceite 60x, NA 1.4 y una cámara EMCCD. Las películas se adquirieron en un entorno controlado a 37oC y 5% deCO2.
NOTA: Se pueden crear imágenes de películas de lapso de tiempo más largas o más cortas, dependiendo del experimento. Incluso las películas durante la noche se pueden grabar si es necesario. Sin embargo, es fundamental tratar de reducir el tiempo de exposición y la potencia del láser, así como el número de imágenes totales, para disminuir la fototoxicidad y el blanqueo durante la adquisición de la película.
- Adquirir 100 series de imágenes de lapso de tiempo de transporte axonal a intervalos de 3 s, con un total de 5 min por película.
4. Análisis de imagen (Figuras 4-5)
- Análisis de la distribución y densidad del transporte de partículas mediante el análisis de kymograph
- Abra el archivo en FIJI. Canales separados pulsando Imagen ? Pilas ? Herramientas ? Desentrelazar.
- Establezca las propiedades de la imagen pulsando Imagen ? Propiedades.
- Elija la herramienta Línea segmentada haciendo clic con el botón derecho en el icono de línea. Establezca Anchura en 8-10 haciendo doble clic en el Icono de línea. Sea coherente con el mismo ancho de línea a lo largo de todo el análisis.
- Marque una línea segmentada siguiendo la ruta de axón de distal a proximal. Haga doble clic para detener el marcado de línea.
- Haga clic en t para agregar una nueva región de línea de interés (ROI) al administrador de ROI. Agregue esto a una tabla de análisis de hoja de cálculo.
- Haga clic en m para medir el área y la longitud del axón. Agregue esto a la tabla de análisis.
- Generar un kymograph haciendo clic en Plugins ( Plugins) KymoToolBox ( KymoToolBox) Dibuja Kymo. Alternativamente, se pueden utilizar otros plugins de generación de kymograph disponibles.
- Cuente manualmente las partículas en movimiento (retrógradas o anterogradas) y no móviles y agréguelas a la tabla en la columna correcta.
NOTA: Las partículas se clasifican como anterogradas móviles (es decir, moviéndose a la izquierda en el kymograph) o retrógradas (es decir, moviéndose a la derecha) si su desplazamiento es superior a 10 m en la dirección específica. Es posible medir el desplazamiento simplemente marcando una línea horizontal con el icono de línea y presionando m. Las partículas inmóviles o aquellas que no cumplen los criterios de desplazamiento se definen como no móviles(Figura 4B).
- Seguimiento de partículas únicas: Seguimiento manual
- Descargue el plugin de seguimiento manual para el software FIJI (desarrollado por Fabrice P. Cordeliére) de http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
- Abra el archivo en FIJI/ImageJ. Utilice la opción Rotar para alinear las ranuras MFC horizontalmente.
- Para mejorar la relación señal-ruido si es necesario, haga clic en Procesar ( Process) Resta fondo.
- Abra el plugin De seguimiento manual. Establezca los parámetros (por ejemplo, tamaño de píxel, intervalo de tiempo, etc.) de acuerdo con el microscopio específico utilizado para la creación de imágenes. Para los resultados que se muestran aquí, el microscopio y la lente la relación fue de 0,239 m/píxel y el intervalo de fotogramas fue de 3 s.
- Obtenga las coordenadas X e Y de las pistas y guarde los resultados copiando el texto en la hoja de cálculo.
- Analice las películas de varios canales haciendo clic en Imagen . Color ( Color ) Combinar canales para combinar los canales y, a continuación, realizar un seguimiento de solo puncta colocalizado.
- Seguimiento de partículas únicas: Seguimiento semiautomático (Figura 5)
- Abra el software de análisis. Este estudio utilizó la versión 8.4.1 del software Bitplane Imaris.
- Cambie a Superar en el menú superior.
- Haga clic en Procesamiento de imágenes (Image Processing) Intercambiar tiempo y Z ? Ok.
- Haga clic en Editar (Editar) Propiedades de la imagen (Ctrl+I) Geometría ? Voxel Size Row. Establezca Propiedades de imagen de acuerdo con la configuración de microscopía utilizada.
NOTA: Para los datos que se muestran aquí, la relación entre el microscopio y la lente fue de 0,239 m/píxel. - Haga clic en Todo Equidistante y cambie el Intervalo de tiempo. Por ejemplo, utilice 3 s como intervalo. Haga clic en el botón Restablecer en la parte inferior derecha o haga clic en Ctrl+B.
- Añade una capa de Puntos en la parte superior izquierda haciendo clic en un Icono de Puntos Amarillos Pequeños. En la parte inferior izquierda se abre un nuevo menú para editar los puntos.
- Pulse la flecha azul derecha hasta que se inicie la detección de puntos.
NOTA: Es importante filtrar algunos de los puntos usando el filtro en la parte inferior izquierda de la ventana. Compruebe la película varias veces para ver que se ha seleccionado un número suficiente de puntos. - Verifique o configure los parámetros para adaptarse a las necesidades experimentales. Por ejemplo, Distancia máxima a 12 m (La distancia máxima permitida entre dos puntos distintos todavía los incluye en la misma pista única); Tamaño máximo de la brecha 1 (El número de fotogramas que una pista puede fallar y todavía se considera una pista).
- Haga clic en Configuración y, a continuación, en Estilo de pista , Desactivado, Puntos > Esfera.
- Con la barra de filtros, elija diferentes filtros para el ajuste. Por ejemplo, en los datos que se proporcionan aquí, Track Duration - 9 eliminó todas las pistas con menos de 3 fotogramas. Cuando se establezcan todos los parámetros, haga clic en la flecha verde derecha. No es posible realizar más edición después de este paso.
- Haga clic en el Lápiz pequeño con puntos para editar manualmente todas las pistas.
- Ver la película(Figura 5B). Si se produce un error, hay varias opciones posibles:
- Para desconectar una pista, haga clic en la opción Objeto y elija los dos puntos que deben desconectarse manteniendo presionada la tecla Ctrly elija Desconectar.
- Para conectar una pista, haga clic en la opción Objeto, elija los dos puntos que deben estar conectados manteniendo Ctrl y elija Conectar.
- Para eliminar una pista o un punto, con la opción derecha (Pista/Objeto), cambie a la pantalla con el icono de lápiz normaly elija Eliminar.
- Para añadir puntos manualmente, cambie a la pantalla de icono de lápiz normal. En la parte inferior de la pantalla hay una marca de seguimiento manual. Asegúrese de que la casilla de verificación Conexión automática es V. En la propia película, para agregar un lugar, mantenga presionado el botón Mayús y el botón izquierdo-clic.
- Para añadir un punto a una pista existente, elija una pista (amarillo) y un marco deseados, cambie a la pantalla de icono de lápiz normal y agregue un punto manualmente. Cuando finalice toda la película, cambie al icono que parece un gráfico rojo (estadísticas). Es posible editar los parámetros analizados más adelante. Para editar, en la parte inferior izquierda de la pantalla, pulse el icono de tecla sueca. Por ejemplo: Posición X, Posición Y.
- Pulse en el icono que se parece a varios disquetes, Exportar todas las estadísticas.
NOTA: La salida de la hoja de cálculo se puede manejar directamente o analizarse más a fondo utilizando el código publicado9 utilizado para este análisis, que se compartirá a petición. Los siguientes parámetros se extraen del análisis: Velocidad, Desplazamiento de pista, Longitud de carrera, Velocidad (incluida la direccionalidad), Recuento de detención, Duración media de parada, Alfa, Cambios de dirección y Velocidad instantánea. Una explicación detallada de cada parámetro se describe en Gluska et al.9.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo descrito, los explantes de la médula espinal embrionario de ratón HB9::GFP se cultivaron en MFC(Figura 4A). Los explantas se cultivaron durante 7 días, cuando los axons se cruzaron completamente en el compartimiento distal. Se añadieron colores rojos Mitotracker Deep Red y Lysotracker a los compartimentos distales y proximales para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos(Figura 4C). Se crearon axónes en las ranuras distales, y las películas se analizaron de la siguiente manera: En primer lugar, comparamos la distribución general del movimiento mediante el análisis de kymograph(Figuras 4B,D). Este análisis reveló un sesgo en la dirección retrógrada sólo en los compartimentos ácidos (no móvil es 77,1 a 9,5%; retrógrado a 16,9 a 8,3%, anterogrado a 6 o 5 %; Figura 4E) pero no en el transporte mitocondrial (no móvil 83,4 á 6,8%; retrógrado a 10,5 a 6,9%; anterogrado a 6,8 a 5,1%; Figura 4F). El análisis de Kymograph se utilizó para cuantificar la densidad de partículas, revelando un mayor número de partículas mitocondriales en comparación con los compartimentos ácidos de los axónicos explantados de la médula espinal HB9::GFP (Mitocondria a 0,46 a 0,13; Compartimentos ácidos a 0,3 x 0,07 partículas/axón, Figura 4G).
A continuación, el análisis de transporte de partículas individuales se llevó a cabo utilizando software semiautomatizado seguido de código interno(Figura 5A-B). Este análisis reveló que a pesar de tener una velocidad de partícula similar en general(Figura 5C),al observar la distribución de las velocidades(Figura 5D)sólo los compartimentos ácidos, pero no las mitocondrias, mostraban un sesgo hacia el movimiento retrógrado.
Figura 1: Preparación del molde de silicona. Dibujo esquemático que describe el procedimiento de limpieza de obleas de clorotrimetilsilano. (A) En primer lugar, se añadieron 50 ml de nitrógeno líquido a un recipiente adecuado. Trabajando en una campana química, se utilizó una jeringa y una aguja para extraer 8 ml de nitrógeno líquido. Se inyectó todo el contenido de la jeringa en el frasco de clorotrimetilsio. La botella se volvió con la tapa hacia abajo y 8 mL de clorotrimetilsilano fueron arrastrados hacia atrás. (B) Clorotrimetilsilano difundido en el recipiente (no directamente sobre la oblea). El recipiente debe cerrarse, seguido de 5 min de incubación para cada molde. (C) Liquid PDMS se vierte en cada oblea hasta la altura deseada. (D) Todas las placas se colocaron juntas dentro de un desecador al vacío durante 2 h, seguidas de 3 h de noche en un horno de 70oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diseño especializado de MFC. (A) Plantilla PDMS polimerizada sacada del molde utilizando un bisturí metálico. ( B ) Dependiendodela configuración experimental, se utilizaron perforadores de 6 mm, 7 mm o 1 mm para perforar las plantillas PDMS. (C) Para el cultivo explantaente en mfc, se utilizaron perforadores de 7 mm y 1 mm, y se utilizó una jeringa de 20 G para hacer "cuevas" para facilitar la inserción de explantas. (D) Para MFC de la referencia cultural MN disociada, se utilizó un punzante de 6 mm para crear cuatro pozos en los bordes del canal. (E-F) Ilustraciones de las formas MFC finales descritas en C y D, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cultivo neuronal. (A) El embrión del ratón E12.5 se colocó en posición después de que la cabeza, la cola y la piel se retiraron para exponer el tubo neural. (B) Disección de toda la médula espinal. (C) Con fórceps suaves, las meninges se despegaron de la médula espinal. (D) Panel izquierdo: Extracción de los segmentos laterales de la médula espinal de la médula espinal ventral para obtener una mejor purificación de MN. Panel derecho: imagen representativa de la referencia cultural MN disociada en mfc. HB9::GFP axons cruzados al compartimiento distal (verde). La tinción de Hoechst indica núcleos neuronales (azul). (E) Explantes de la médula espinal generados por la disección de secciones transversales de 1 mm de espesor de la médula espinal ventral. Imagen representativa de HB9::GFP (verde) axón espinal explantar axons en un MFC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Transporte axonal de mitocondrias y compartimento ácido en MNs. (A) Ilustración del ensayo de transporte axonal. Lysotracker Red y Mitotracker Deep Red se añadieron a los compartimentos proximal y distal del MFC, que contiene HB9::GFP de la médula espinal ventral explant. (B) Análisis de Kymograph. Las partículas en movimiento se definieron como anterogradas en movimiento o retrógradas después de un desplazamiento de más de 10 m en esa dirección. Las partículas giratorias o inmóviles se contaron como no en movimiento. Barra de escala a 10 m. (C) Primer fotograma de una película de lapso de tiempo que muestra los axones principales de la médula espinal del ratón HB9::GFP temiendo los axones rojos para etiquetar compartimentos ácidos y Mitotracker Deep Red para etiquetar mitocondrias. Barra de escala a 10 m.(D) Kymographs representativos que muestran un movimiento axonal típico de los compartimentos ácidos y las mitocondrias. Barra de escala a 10 m. (E) Análisis Kymograph del transporte axonal mitocondrial, ****p < 0.0001, Anova con corrección Holm-Sidak (n a 77 axons). Barra de escala a 10 m(F) Análisis de Kymograph del transporte axonal del compartimiento ácido, ** p < 0.01, ****p < 0.0001, Anova con corrección Holm-Sidak (n a 77 axons). (G) Análisis de densidad de partículas axonales de mitocondrias y compartimentos ácidos, ****p < 0.0001, Prueba t del estudiante (n a 77 axons). Las barras de error representan valores con SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis semiautomático de partículas simples para medir la velocidad de los orgánulos. (A) Flujo de trabajo esquemático para análisis semiautomáticos de transporte de partículas únicas. (B) Se analizaron los axónicos explantados de la médula espinal ventral para el seguimiento de partículas únicas. El software de análisis es capaz de rastrear partículas axonales individuales en películas de lapso de tiempo, como se indica para las mitocondrias (puntos amarillos, panel superior) y compartimentos ácidos (puntos verdes, panel inferior). (C) La velocidad media no cambió entre las mitocondrias y los compartimentos ácidos, prueba Mann Whitney (n a 417 mitocondrias, n a 371 compartimentos ácidos). Las barras de error representan valores con sD. (D) Distribución de los compartimentos mitocondriales y ácidos velocidades retrógradas y anterógradas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio Neurobasal completo – para 50mL | ||
| Ingrediente | Volumen | Concentración |
| Neurobasal | 47mL | |
| B27 | 1 mL | 2% |
| Suero de caballo | 1 mL | 2% |
| P/S | 0,5 ml | 1% |
| L-glutamina (Glutamax) | 0,5 ml | 1% |
| Beta-Mercaptoetanol (50mM) | 25 l | 25m |
| BDNF (10ug/mL) | 5 l | 1ng/ml |
| GDNF (10ug/mL) | 5 l | 1ng/ml |
| CNTF (10ug/mL) | 2,5 l | 0.5ng/mL |
Tabla 1: Receta para la preparación de una solución completa de neurobasal (CNB).
| Solución Optiprep – para 10mL | ||
| Ingrediente | Volumen | Concentración |
| Ddw | 5.27 mL | |
| Medio de Gradiente de Densidad (Optiprep) 60% | 1,73 ml | 10,4% (p/v) |
| Tricine 100mM | 1 mL | 2% |
| Glucosa 20% (p/v) | 2 ml | 2% |
Tabla 2: Receta para la preparación de la solución media de gradiente de densidad.
| Media Explanta de la médula espinal (SCX) – para 20 ml | ||
| Ingrediente | Volumen | Concentración |
| Neurobasal | 19,5 ml | |
| B27 | 200 l | 2% |
| P/S | 100 l | 1% |
| L-glutamina (Glutamax) | 100 l | 1% |
| Bdnf | 50 l | 25ng/mL |
Tabla 3: Receta para la preparación de la solución explanta de la médula espinal (SCEX).
| Cultura MN | Explantes de la médula espinal |
| Procedimiento más largo antes del enchapado | Procedimiento corto – Diseccione y placa |
| Se necesita precaución adicional para el chapado en MFC | Más fácil de placar en el MFC |
| Alta concentración de neuronas motoras sin células gliales – más precisa | Presencia de células gliales y otros tipos neuronales – más fisiológica |
| Posibilidades ilimitadas de manipulación tanto en Soma como en axons | Posibilidades limitadas de manipulación en cuerpos celulares |
| Inmunomanchado fácil tanto para cuerpos celulares como para axones | Baja eficiencia durante la inmunomanchación de cuerpos celulares dentro de la explantación. |
| Alta eficiencia de la infección viral | Muy baja eficiencia de infección viral |
Tabla 4: Comparación entre los explantes de la médula espinal y el cultivo de MN disociado basado en perímetros de velocidad, viabilidad, presencia glial, posibilidades de manipulación, inmunomancha e infección viral.
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Discussion
En este protocolo, describimos un sistema para rastrear el transporte axonal de mitocondrias y compartimentos ácidos en las neuronas motoras. Esta plataforma in vitro simplificada permite un control, monitoreo y manipulación precisos de los compartimentos neuronales subcelulares, lo que permite el análisis experimental de las funciones locales de las neuronas motoras. Este protocolo puede ser útil para el estudio de enfermedades MN como la ELA, para centrarse en la comprensión del mecanismo subyacente de la disfunción del transporte axonal en la enfermedad10,16. Por otra parte, este sistema también se puede aplicar para el estudio del transporte de factores tróficos9,16, microARN10, ARNm8, y proteínas etiquetadas en MNs sanos y enfermos o en otras neuronas, como9 sensoriales o axones simpáticos14. Un método similar también se puede aplicar para estudiar el transporte de orgánulos en un sistema de cocultivo, como las MN cultivadas con células musculares esqueléticas12 o las neuronas simpáticas cocultivadas con cardiomiocitos14. El sistema MFC se puede utilizar para generar NMJs activos17,18 y estudiar el efecto de la formación de sinapsis en el transporte axonal16.
Este protocolo tiene varias ventajas en comparación con otros protocolos para el cultivo de neuronas en MFC y el uso de imágenes en vivo para analizar el transporte axonal: 1) Los MFC están disponibles comercialmente por varios fabricantes. Sin embargo, la autofabricación de los Mfc es extremadamente rentable en comparación con la alternativa comercial. Una sola oblea PDMS produce cuatro MFC grandes o nueve pequeñas a expensas mínimas de varios dólares estadounidenses para la propia resina PDMS. 2) Los MFC autofabricados se pueden modificar para responder a necesidades experimentales específicas (por ejemplo, cambiar el tamaño y la ubicación de los pozos, aumentando el grosor de los PDMS de MFC). 3) Los MFC se pueden conectar irreversiblemente a una placa (a través de la unión por plasma), pero también se pueden reciclar varias veces para reducir la posibilidad de contaminación. 4) Los MFC PDMS son transparentes, por lo que son ideales para imágenes en vivo al tener un fondo reducido, lo cual es fundamental para ensayos de transporte axonal donde la distinción señal-ruido podría ser un factor limitante. 5) El cultivo explanta de la médula espinal es muy eficiente y rápido. Una médula espinal embrionaria puede producir hasta 30 explantas, suficientes para 10 MFC. Esto puede ayudar a ahorrar tiempo y materiales, y asegura que incluso un ratón embarazada con pocos embriones pueda producir un experimento exitoso. Vea una comparación detallada del cultivo de MN disociado y disociado en la Tabla 4.
Este protocolo es relativamente simple y barato. Sin embargo, requiere experiencia en varios asuntos técnicos. La fabricación y manipulación de MFC debe ser precisa y suave, para evitar defectos estructurales y la creación de burbujas de aire en el paso de vacío obligatorio (1.1.10), por ejemplo. Durante el paso de vacío opcional (1.6.2) es importante limpiar todo el aire, o bloqueará el cruce axonal, pero también mantendrá el vacío corto para evitar el desprendimiento de la MFC del vidrio. Preste mucha atención a los pasos del protocolo de disección, ya que es importante eliminar correctamente las meninges y los cuernos dorsales, así como para tratar de cortar las piezas al tamaño correcto con el fin de insertarlos en la cueva de MFC sin usar la fuerza física. Cualquier fuerza física excesiva aplicada a la MFC puede separar fácilmente las ranuras o todo el MFC, por lo que el procedimiento debe realizarse suavemente. El cultivo de MNylos y el enchapado en el MFC debe ser relativamente rápido, ya que los MN tienden a agregar y perder viabilidad rápidamente en condiciones de estrés como el bajo volumen medio del paso de chapado. El revestimiento en el MFC debe hacerse en bajo volumen para permitir la fijación adecuada de las neuronas en el canal MFC, y después de no más de 30 minutos medio calentado debe agregarse muy suavemente para evitar el desprendimiento de los MN.
Después de varios días en cultivo, y una vez que los axones se han extendido al compartimiento distal, los cultivos están listos para someterse a manchas de organelina seguido de la adquisición de películas de transporte axonal y finalmente un procedimiento específico para el análisis de imágenes. El análisis se puede realizar mediante el seguimiento de partículas únicas a lo largo del tiempo o mediante un algoritmo de seguimiento automatizado o semiautomático. En nuestra experiencia, los métodos automatizados consumen menos tiempo, pero tienen varias desventajas. Principalmente, la fiabilidad de seguimiento automatizado se reduce, con axons llenos de gente que se cruzan. Además, los algoritmos automatizados tienen una capacidad disminuida para distinguir entre partículas superpuestas. Por lo tanto, se recomienda realizar un seguimiento manual o semiautomático. En general, el seguimiento semiautomatizado es preferible, ya que consume menos tiempo, pero el seguimiento manual puede ser una buena opción cuando no hay software de pago disponible. Una comparación exhaustiva entre el análisis manual y automático se puede encontrar en Gluska et al.9.
En conclusión, la adopción de este protocolo simple puede producir datos importantes para el estudio del transporte axonal de varios componentes celulares. Se puede adaptar para adaptarse a una diversidad de configuraciones de imágenes y subtipos neuronales, así como a cocultivos de neuronas con otras células. También permite una clara manipulación farmacológica espacial de cuerpos celulares o axones con el fin de entender los mecanismos básicos de la salud neuronal y mejorar el desarrollo de fármacos para enfermedades con transporte axonal alterado.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Israel Science (ISF, 561/11) y del Consejo Europeo de Investigación (ERC, 309377).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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